Science - 27.08.2026.pdf

美国科学促进会《科学》杂志 (AAAS Science)

假结 RNA

生成式人工智能在 RNA 设计领域与人类专家相媲美 第 859 页与第 931 页

27 AUGUST 2026

获得奖金 在《科学》系列期刊发表论文 获得国际认可

通过与慷慨赞助商的合作，“科学奖项与奖金” (Science Awards and Prizes) 正在庆祝今年迄今为止五个国际奖项计划的获奖论文。这些奖项旨在表彰卓越的早期职业研究人员，他们的开创性工作正在推进知识，并在各自领域产生深远影响。

通过“科学奖项与奖金”计划，每年将颁发超过 $300,000 的奖金，为获奖者提供关键资源，以推动其研究进展、建立独立实验室、开展雄心勃勃的新研究方向，并为他们科学职业生涯的下一阶段奠定基础。

大奖得主

卫星数据可助力食品系统转型 Published 5 February 2026

改变早期妊娠丢失患者的实践与政策 Published 1 April 2026

大奖得主 法比奥·F·罗萨 (Fábio F. Rosa) 让肿瘤反噬自身 Published 2 April 2 2026

谢尔盖·斯塔维斯基 (Sergey Stavisky) 找回你的声音 Published 16 July 16 2026

简·伊莱恩·索里亚诺 (Jan Elaine Soriano) 重新布线瘫痪身体的虚假警报 Published 30 July 2026

854

27 AUGUST 2026 VOLUME 393 / ISSUE 6814

目录

从 Varda 太空工业公司 (Varda Space Industries) 胶囊舱内部看到的景象。该胶囊舱旨在轨道上处理药物，并于 2025 年 5 月返回地球。

社论

845 全球最糟糕的能源政策 —P. Mahdavi 和 M. L. Ross

新闻

846 珊瑚记录表明全球变暖正在增强厄尔尼诺现象 研究结果预示太平洋气候周期将带来更严重的天气扰动 ——J. Vaz J. COLE 等人的研究论文，10.1126 / SCIENCE.ADY2660

848 致命的蜱传病毒在欧洲蔓延 科索沃的监测经验可帮助其他国家在出现人类病例前做好准备 ——R. Stone

849 NASA 的罗马望远镜准备好对宇宙进行全面观测

凭借哈勃望远镜的锐利视野和 100 倍更大的观测范围，该天文台将快速扫描宇宙，寻找遥远的世界以及暗能量的线索 ——D. Clery

851 儿童健康研究所新任负责人与 MAHA 有联系 约翰·盖塔尼斯（John Gaitanis）的任命引发了人们对政治驱动领导层选择的担忧 ——J. Kaiser

852 全球疾病研究获得历史性资金注入 盖茨基金会向一个经常因缺乏透明度而受批评的项目承诺捐赠 5.4亿美元 ——G. Vogel

特写

854 轨道炼金术 日益成熟的太空实验室和更低廉的发射成本，推动了在轨道上制造药物和组织的梦想 ——M. Greshko 播客

评论

观点

859 RNA 结构预测的棘手问题 人工智能实现了 RNA 假结的设计 ——A. M. Mustoe 和 J. Guo 研究论文 第 931 页

860 在弱相互作用上排列原子

范德华相互作用引导单晶金属在二维半导体上的生长 ——J.-C. Shin 和 J. Kim 研究论文 第 938 页

862 重新思考货物，重新思考载体 新型转运 RNA 药物需要重新设计的脂质纳米颗粒进行递送 ——J. W. Myerson 和 D. Weissman 研究论文 第 881 页

863 超越皱纹 皮肤微生物组能否塑造健康老龄化？ ——S. Jalili 和 J. Oh

书评等

866 镰状细胞病的历史与未来 前景光明的基因疗法已经到来，但现在宣布医疗胜利还为时过早 ——A. Woolfson

信函

867 深海采矿速度超过了科学研究与法律制定 ——A. Olivera 等

868 沙漠洪水凸显了气候变化适应中的关键缺口 ——J.-X. Gao 等

868 为饱受战争蹂躏的苏丹埃尔奥贝德（El Obeid）寻求公共卫生支持的恳求 ——E. E. Siddig

分析

政策文章

869 修正 2026 年美国车辆排放标准回撤背后的逻辑 对选择性假设和证据不一致解读的修正将推翻该政策的合理性 ——A. M. Bento 等

研究

亮点 872 来自《科学》及其他期刊

研究摘要

875 细胞生物学 一种从坏死性凋亡到细胞凋亡的信号轴是炎症性肠病的底层机制 ——J. Pang 等

880

876 神经科学

如澳大利亚瘤尾壁虎（Nephrurus levis）等壁虎表现出显著的性染色体变异。

斑马鱼类丘脑皮层样电路中的分级感觉处理 ——A.-T. Trinh 等

877 蛋白质相互作用 自闭症突变重塑蛋白质相互作用网络，从而驱动神经发育病理 ——B. Wang 等

878 诱发地震

375 诱发地震 加拿大西部的注入诱发地震中的前震生产率与破裂成核 ——B. Wang 等

879 基因渗入 利用祖先重组图恢复古人类基因渗入的特征 —— Y. Zhang 等

880 进化 基因组易感性与性染色体进化的方向相关 ——Y. Zhou 等

881 基因治疗 化学修饰 tRNA 的非病毒递送可挽救囊性纤维化的无义突变 ——J. Chen 等 观点 第 862 页

研究论文

882 光电子学 高效、长寿命的无铅钙钛矿发光二极管 —W. Bai 等

888 计算机工程 Hypervision：一种用于在线视频速率计算成像的片上高光谱微系统 —L. Bian 等

895 代谢 SGLT2 抑制剂激活人类心脏中的泛酸激酶 —N. Forelli 等

903 植物遗传学 三方遗传冲突系统控制水稻的杂种不育 —X. He 等

910 有机化学 通过酯与两个卡宾的顺序偶联实现铁催化的 $[1+1+1]$ 环丙烷化 —L. Kong 等

917 器件技术 表现出超越 Boltzmann 热发射极限性能的隧道场效应晶体管 —Z. Wu 等

923 铁电体 热循环诱导的氮化增加了钛酸盐铁电薄膜的储能密度 —J. Yi 等

931 RNA 利用深度学习从头设计 RNA 假结 —J. Townley 等 观点 p. 859

938 二维半导体 用于二维半导体的单晶金属接触直接蒸发法 —Y. Zhang 等 观点 p. 860

封面报道

每个图表都是一个设计的 RNA 假结，这是一种环路与同一分子的远端部分配对的结构。在公民科学平台 Eterna 上，人工智能方法在发明能折叠成这些形状的序列方面与人类专家玩家旗鼓相当，这为从零开始自动设计 RNA 治疗药物、传感器和催化剂开辟了道路。详见第 859 页和第 931 页。 图片：J. Townley 等，Science 393, 931 (2026)；由 N. Jessup / Science 改编

播客内容 在太空中制造药物、喂养印度的人，以及独角鲸能教会我们关于海洋变化的什么

职业生活

946 在照顾他人的同时照顾好自己 —B. Griffin

944 AAAS 新闻与笔记 945 Science 职业发展

全球最糟糕的能源政策

Paasha Mahdavi 和 Michael L. Ross

伊朗战争可能会成为加速全球摆脱化石燃料转型的转折点：油气价格每维持高位一天，未来供应每增加一分不确定性，风能和太阳能——其成本比以往任何时候都更低且更具可扩展性——就变得越发具有吸引力。然而，全球近半数国家采取了紧急补贴措施，研究表明，这将使这一转型变得更慢、更昂贵且更不公平。

消费者燃料补贴是最糟糕的一种能源政策。它们通过一种浪费且难以撤销的政策，推动了污染最严重的能源——化石燃料。除了增加消费外，补贴还加剧了空气污染，耗尽政府预算，抑制可再生能源投资，并不成比例地支持富裕的城市居民。这些补贴的成本也高得惊人；根据国际能源署（IEA）的数据，全球化石燃料消费补贴在 2022. 达到了创纪录的 1万亿美元。但其最令人担忧的特性是其持久性。补贴一旦实施，就极其难以取消。

研究表明，自 2003, 以来，尽管各界广泛呼吁取消燃料补贴，但全球在终止燃料补贴方面几乎没有取得进展。自 2015, 《巴黎协定》签署以来，各国政府比以往任何时候都更努力地试图遏制燃料补贴，但失败率惊人。在 2016 至 2023, 期间，补贴规模最大的 21 个国家尝试了大约 130 项补贴改革，其中 70% 在一年内崩溃。超过 90% 在 3 年内消失。

一些改革被明确撤销。这种情况往往发生在抗议活动之后，而蓄意提高价格通常会引发抗议。全球许多政府动荡事件的核心，最初都是围绕每升汽油几美分的差价而展开的斗争。

其他改革则悄然夭折。通货膨胀上升或货币贬值会逐月侵蚀改革的价值，直到补贴实际上被恢复。政府可以维持新的泵端价格不变，而无需采取任何其他行动，只要精炼燃料的采购成本高于固定零售价，补贴就会随之重新出现。这种“无声的侵蚀”目前是改革失败的最大单一原因。

最大胆的改革最为脆弱。那些允许国内价格随国际市场成本同步上涨的领导者，面临着最大的调头压力。而那些将适度的税收减免作为临时措施的人，很少会让其到期；下一次选举、下一次石油危机或下一次抗议，都会悄悄地将临时救济转化为永久政策。2009 年 20 国集团承诺逐步取消“低效的化石燃料补贴”，但几乎没有改变任何事情。2021 年格拉斯哥气候峰会上的类似承诺情况也同样糟糕。

为什么政府的努力总是达不到预期？对于许多消费者来说，汽油价格是经济中最直观的一个数字。与电费单或面包价格不同，油价每天都呈现在驾驶员面前，且通常张贴在公共场所。对于政治家来说，很少有政策杠杆比这更容易触及——而且证据表明，也很少有杠杆比这更难放回。

应对化石燃料价格波动有更好的方法。在巴基斯坦、印度尼西亚和埃及，公务员每周必须居家办公至少 1 天；在智利、立陶宛和菲律宾，巴士票价现已降低或免费；西班牙则在资助节能房屋改造和太阳能设备安装。

那 68 个没有采取紧急措施来补贴或监管

燃油成本的上涨不应在此时开始。那些面临压力要求实施临时燃油税假期（fuel tax holidays）的人应当意识到研究结果：大部分收益流向了富人而非穷人，而且一旦实施，这些临时措施通常会变成永久性的。为了帮助受高能源价格影响的低收入家庭，各国政府应采取国际货币基金组织（International Monetary Fund）所称的“临时、定向、及时且量身定制”的措施。这些措施包括现金转移支付、针对低收入家庭的定向援助以及对公共交通的补贴。此类工具可以在不延长危机本身的情况下，帮助弱势公民摆脱危机。

伊朗战争代表了一个一代仅有一次的机会，可以加速摆脱对化石燃料的依赖。但各国政府为了帮助公民应对汽油和柴油价格上涨而采取的短期措施，将产生长期影响。现在降低化石燃料的价格，将在未来造成灾难性的后果。

气候科学

珊瑚记录表明全球变暖正在增强厄尔尼诺现象

寻找太平洋气候周期引发更大规模天气扰动的证据

朱莉娅·瓦兹 (JULIA VAZ)

研究人员使用钻机从加拉帕戈斯群岛的水下化石珊瑚中采集岩芯。

加拉帕戈斯群岛充满活力的生物多样性，曾帮助从查尔斯·达尔文 (Charles Darwin) 开始的生物学家们揭开了进化的奥秘。现在，生长在热带太平洋该群岛周围的珊瑚，正为另一个持久的谜题提供线索：全球变暖是否正在改变厄尔尼诺 (El Niño)——这一驱动全球极端天气的周期性太平洋气候循环。

到目前为止，气候模型给出的答案相互矛盾。历史上的厄尔尼诺记录太短，无法揭示出明确的趋势。而且，厄尔尼诺现象本身巨大的自然波动，使得人们难以理清其中任何人类影响。

但在加拉帕戈斯化石珊瑚中保存的 1000 年档案，提供了迄今为止最强有力的证据，表明全球变暖已经在增强厄尔尼诺。在本周发表于《科学》杂志的报告中，研究人员发现，在厄尔尼诺信号强烈的加拉帕戈斯珊瑚中记录的温度波动，在过去 4 个十年中增强了 36%，远超此前几个世纪所见的任何情况。布朗大学的气候科学家金·科布 (Kim Cobb) 表示，结合太平洋其他地区的珊瑚研究结果，这些发现表明“这个重要的气候极端来源在近几十年已经发生了某种变化”，而她并未参与这项研究。

该研究并未证明气候变化就是罪魁祸首。但由于这种增强与工业化后的快速变暖相吻合，且超过了厄尔尼诺的自然变率，作者认为人类驱动的变暖是最主要的解释。领导这项研究的密歇根大学古气候学家朱莉娅·科尔 (Julia Cole) 表示：“这是在那段时间里发生变化的东西。所以，如果有人对此提出异议，我想知道替代解释是什么。”

其影响是巨大的，科尔在 1989 年首次访问加拉帕戈斯时亲眼见证了这一点，她看到了 1982–83 年厄尔尼诺期间海洋温度飙升给该群岛珊瑚礁带来的毁灭性打击。除了生态破坏，大型厄尔尼诺事件期间的极端天气可能导致数万亿美元的经济损失。随着预报员警告今年的厄尔尼诺可能会成为近一个世纪以来最强的一次，理解气候变化本身是否在加强这些事件已变得极其紧迫。

“这个系统是我们星球上最大的气候极端来源，”科布说，“如果它本身变得更加极端，这将对社会产生非常严重的后果，而这是我们应该采取行动的信息。”

厄尔尼诺事件每 2 到 7 年发生一次，当时较弱的信风允许西太平洋的暖水向东流动并在加拉帕戈斯附近堆积。通过大气中的“遥相关”，这些事件产生深远的影响，例如导致南美洲洪水泛滥以及非洲部分地区出现毁灭性干旱。

诊断这些事件如何变化已被证明十分困难。厄尔尼诺取决于风、洋流和海面温度之间微妙的相互作用，而气候模型难以重现这些作用。在许多模拟中，热带东太平洋的初始温度过低。这类误差会通过产生厄尔尼诺的反馈机制产生连锁反应，导致模型在这一现象将如何响应温室变暖的问题上产生分歧。世界气候研究计划的气候科学家阿古斯·桑托索 (Agus Santoso) 表示：“这些因素可能会产生不确定性。”

历史记录也未能给出明确的结论。厄尔尼诺现象的记录仅延续了一个多世纪，而对于监测事件演变至关重要的太平洋卫星观测数据则只能追溯到 20 世纪 80 年代。但在古代珊瑚中，科学家可以追踪该现象在数个世纪间的演变。“珊瑚是研究厄尔尼诺现象的最佳途径之一，”德克萨斯大学奥斯汀分校的地球物理学家贾德森·帕廷（Judson Partin）说道，他一直在从瓦努阿图（位于西南太平洋的一个群岛）的珊瑚中提取厄尔尼诺信号。

珊瑚利用周围水域中沉淀的碳酸钙构建骨骼，每年增加一层新生长带。在加拉帕戈斯群岛，科尔（Cole）及其同事钻取了海滩上和水下的珊瑚芯。回到实验室后，研究人员测量了每个碳酸盐层中捕获的微量锶。在厄尔尼诺事件期间，当加拉帕戈斯水域变暖时，碳酸盐从水中捕获的大型锶原子较少。

研究人员还测量了碳酸盐中重氧 $\mathrm{O}^{18}$ 与普通 $\mathrm{O}^{16}$ 的比例。较暖的水有利于轻氧的结合，从而降低该比例。厄尔尼诺期间降落在加拉帕戈斯群岛的大雨会进一步降低该比例，因为雨水中的 $\mathrm{O}^{18}$ 含量较低。这些信号共同提供了一份可追溯至数世纪前的、由厄尔尼诺驱动的温度波动记录。团队发现，在全球变暖开始后，这些波动显著增强——其强度远超自然变率所能解释的范围。

这一新发现与科布（Cobb）及其同事在 2019 年报道的关于中太平洋基里巴斯（Kirimati）化石珊瑚的分析结果相呼应，该分析发现厄尔尼诺的变率增加了 25%。但在加拉帕戈斯群岛，由于厄尔尼诺带来的变暖效应最为极端，信号甚至更加强烈。

这项研究不太可能彻底解决这场争论。但桑托索（Santoso）表示，更新的气候模型也支持变暖与厄尔尼诺现象之间的联系。他指出，最新的模型将为政府间气候变化专门委员会（IPCC）的下一份报告提供参考，这些模型倾向于表明，随着地球变暖，厄尔尼诺事件将变得更强且更频繁。“模型、古记录和现代观测这三种独立的分析得出了相同的结果，这一事实令人鼓舞，”桑托索说。

IPCC 在 2023 年发布的上一份报告中，避免就全球变暖如何影响厄尔尼诺发表声明。但参与起草前一份报告的科布表示，预计在 2029 年发布的下一份报告可能会传达更明确的信息。“我们正接近于得出结论：气候变化已经对厄尔尼诺的强度产生了相当大的影响。” □

聚焦

一种预测树木死亡的空中工具

在西澳大利亚的茂密森林中，2023年和24年的严重干旱导致贾拉树（jarrah）、万杜树（wandoo）和卡里树（karri）死亡，留下了一片片由褐色、脆弱且易燃的林立树木组成的斑块景观。这一事件促使研究人员思考，他们是否能够预测未来此类死亡事件可能发生的位置。现在，在本项目月发表于《地球物理研究快报》（Geophysical Research Letters）的一篇论文中，该团队揭晓了一个令人惊讶的新工具：伽马射线。科学家们通过驾驶一台名为伽马射线光谱仪的机器在森林上空飞行来测量辐射。这些伽马射线源自富含花岗岩基岩的土壤中钾-40同位素的自然衰变，可作为土壤深度的代理指标，进而预示在雨水稀少时树木能够获取多少水分。这种新方法可应用于具有类似土壤的其他地区，包括东南亚和撒哈拉以南非洲，以识别那些对干旱特别脆弱的树木。——Hannah Richter

与许多蜱虫不同，硬蜱（Hyalomma）会主动追逐潜在宿主。

传染病

致命的蜱传病毒在欧洲蔓延

科索沃的监测经验可帮助其他国家在出现人类病例前做好准备

理查德·斯通（RICHARD STONE） 发自科索沃普里什蒂纳

在库尔特什·谢里菲（Kurtesh Sherifi）的实验室里，显示器上放大的一只长 6 毫米、带有甲壳的雄性边缘边蜱（Hyalomma marginatum）看起来十分可怕。普里什蒂纳大学的兽医寄生虫学家谢里菲表示，更令人不安的是，这种蜱虫是猎手。谢里菲说，与那些在植被上等待宿主经过的蜱虫不同，作为引起克里米亚-刚果出血热（CCHF）病毒的主要媒介，边蜱可以行进数百米以寻找牛或其他动物。“如果我们身在野外，边蜱会追着我们跑。”

长期以来，科索沃一直是欧洲 CCHF 的热点地区。这种人类疾病可从发烧和肌肉疼痛进展为肝衰竭、严重出血乃至死亡。从 2013 年到 16 年，这里约有三十多人在医院就诊，其中约三分之一死亡。但数十年来与 CCHF 的抗争，也使科索沃这个欧洲最年轻的国家，成为该地区在检测和监测该疾病方面经验最丰富的国家之一。

现在，随着该病毒在整个欧洲大陆蔓延，病毒学家建议其他欧洲国家借鉴这一专业经验。约翰霍普金斯大学的传染病专家玛丽亚姆·凯什特卡尔-贾赫罗米（Maryam Keshtkar-Jahromi）表示：“人们应该感到担忧，尤其是考虑到气候变化。”她共同撰写并于 6 月发表在《中国病毒学杂志》（Virologica Sinica）上的一篇综述得出结论，CCHF 可能会在此前未受影响的地区引起严重的爆发。西班牙至少从 2013 年起就记录到了本地感染的 CCHF 案例，且持续出现零星感染，包括今年至今的 3 例，其中 1 例死亡。葡萄牙在 2024 年确认了首例病例，患者随后死亡。而在 2023 年，CCHF 病毒首次在法国的蜱虫中被发现，不过法国尚未报告本地感染的人类病例。

“我的怀疑是，我们将在许多意想不到的地方发现 CCHF，”独立病毒学家延斯·库恩（Jens Kuhn）说道，他曾担任美国国家过敏和传染病研究所综合研究设施的病毒学负责人。

几十年来，边蜱一直搭乘迁徙的鸟类进入北欧。但直到最近，这些蜱虫遇到的环境条件通常过于恶劣，无法完成其生命周期。瑞典兽医局的环境科学家穆罕默德·帕瓦格（Mohammed Parvage）表示，欧洲气候的变暖正在改变这一现状：更高的温度和更长的夏季现在使得未成熟的蜱虫更有可能发育成为成年蜱，并可能建立起本地种群。

一项 2025 年的综述发现，至少有 40 个欧洲国家报告过边蜱。发现边蜱并不一定意味着存在 CCHF 病毒。但整个欧洲对其监测仍然零散，导致情况不完整。库恩说：“那些认为自己没有某种特定病毒的国家，通常不会检测该病毒。”

库恩表示，科学家往往倾向于在病原体引起明显疾病后才关注它们，而不是在它们在动物和媒介中悄悄传播时就关注。在欧洲部分地区，研究人员已经发现 CCHF 病毒在蜱虫或动物中传播的证据，但近期并未出现人类病例。一旦 CCHF 进入一个国家的监测视野，诊断面板可能会扩大——随后突然检测出更多病例。

科索沃花费了数十年时间学习如何寻找 CCHF。科索沃国家公共卫生研究所的微生物学家谢瓦特·雅库皮（Xhevat Jakupi）表示，在 2013 年爆发之前，其国家公共卫生实验室就已经在进行抗体和聚合酶链式反应（PCR）检测，且通常在当天就能返回结果。从那时起，其诊断和测序能力得到了扩展。他表示，同样重要的是积累的经验：“我们知道什么有效，什么无效。”

Keshtkar-Jahromi 表示，已经建立监测系统的科索沃、阿尔巴尼亚和保加利亚可以帮助构建一个区域性的诊断网络。Kuhn 指出，这可能涉及对蜱虫及其携带病原体更广泛的监测，同时配合更好的蜱虫鉴定以及提高医生的意识。

在其他国家应对 CCHF 风险之际，科索沃的人类病例已减少至零星病例。Hyalomma 属蜱虫依然常见，且病毒仍出现在蜱虫中：在 2024 年的一项调查中，Sherifi 及其同事在全国范围内采集的 1301 只蜱虫中，有 16 只检测出 CCHF 病毒 RNA。然而，从 2016 年到 2025 年，科索沃仅记录了 5 例人类病例。Jakupi 表示：“与往年相比，我们感到更加放松，但我们不确定这种情况能持续多久。”

在 2013 年的疫情爆发后，当局加强了对农民的教育，使用杀蜱剂处理牲畜，改进了诊断方法，并扩大了蜱虫监测。Sherifi 认为这些措施有助于降低人类病例数。他表示，现在从事小规模农场手工劳作的科索沃人减少了，而机械化意味着更少的人会接触到被蜱虫感染的牲畜。（牲畜似乎不会因该病毒而生病。）农民们也更加意识到用裸手从动物身上拔除蜱虫的危险性。

另一种可能性是，病毒简单地进入了潜伏期——或者它仍在继续循环，而许多人类感染未被检测到。2012 年的一项调查发现，在 1105 名没有感染症状的科索沃人中，有 4% 携带 CCHF 抗体，这表明许多感染未被识别。Keshtkar-Jahromi 表示，被诊断出该病的人员中异常高的死亡率，可能反映了对轻症或无症状人群的统计不足。她说，“他们不会来医院”，因此确诊病例可能仅代表“冰山一角”。

感染可能未被检测到的前景，增加了对加强监测呼吁的紧迫性。Parvage 表示：“第一个被诊断出的人类病例可能并不是故事的开始，而可能仅仅是我们第一次注意到它。” □

天文学

NASA 的 Roman 望远镜准备好对宇宙进行全面观测

凭借与哈勃相当的锐利视力以及大 100 倍的视野，该天文台将快速扫描宇宙，寻找遥远的世界以及暗能量的线索

DANIEL CLERY

近年来，天文学已成为一门大数据科学，巡天望远镜在单次观测中即可捕捉数千个天体。最快在 8 月 30 日，NASA 将通过发射耗资 43 亿美元 billion 的南希·格雷斯·罗曼（Nancy Grace Roman）空间望远镜，将这种方法引入太空。Roman 望远镜拥有哈勃空间望远镜的锐利视力，但视野大 100 倍，它将快速巡天，以解决天文学中一些最重大的问题——从暗能量的本质到其他恒星周围行星的人口统计学。

在 NASA 的巨型红外天文台 JWST 运行 5 年后，这台 2.4 米口径的望远镜将发现大量有趣的候选目标，以便 JWST 随后进行详细审查。Roman 将跨越时间。目前的测量依赖于少于 2000 个距离银河系较近的超新星。马里兰大学巴尔的摩县的超新星巡天共同负责人 Rebekah Hounsell 表示：“这是一个巨大的飞跃。”

更多的线索将来自宇宙学巡天，该巡天将绘制超过 10 亿美元 个星系的图谱，以探测暗能量在宇宙时间尺度上对星系集群的影响。它还将衡量由暗物质引力引起的星系形状的细微变化，暗物质是构成宇宙大部分质量的不可见宇宙成分。这些形状将揭示暗物质所在的位置，并且由于暗物质同样对宇宙加速敏感，这将为研究暗能量提供第三个切入点。

“它能够测量那些无法通过任何其他方式测量的行星人口统计学特征。”

Scott Gaudi 俄亥俄州立大学

加州大学圣克鲁兹分校（UC Santa Cruz）的天体物理学家 Garth Illingworth 表示，这将“产生极佳的科学成果，并为詹姆斯·韦伯空间望远镜（JWST）提供一些重要输入”。

其前 5 年的大部分时间将用于三项大规模巡天调查：一项专注于超新星，一项专注于宇宙学，第三项则专注于系外行星。前两个项目旨在锁定暗能量，即驱动宇宙加速膨胀的神秘力量。在去年一项地面巡天调查发现迹象，表明这种力量在宇宙历史中可能发生了变化，而非像宇宙学标准模型预测的那样保持恒定之后，这项任务变得更加紧迫。

第一项调查将通过产生数万颗遥远的超新星来帮助天文学家跟进这些迹象，这些超新星提供了可靠的距离测量——这是衡量这种宇宙

结合另外两台巡天望远镜（欧洲的欧几里得（Euclid）空间望远镜和智利的薇拉·鲁宾天文台（Vera C. Rubin Observatory））的数据，这些测量结果应该能为暗能量提供迄今为止最精确的约束。领导宇宙学调查的美国国家航空航天局喷气推进实验室（NASA JPL）的 Olivier Doré 表示：“这是一个相当难以测量的信号。我们在观测分析方面确实在挑战极限。”

探测暗能量需要数年的数据收集，但系外行星普查应该能产生更即时的结果。在已知的大约 6000 颗系外行星中，大多数是在它们凌日（即经过其宿主恒星前方，导致星光暂时变暗）时被探测到的。预计罗曼（Roman）将发现 100,000 颗新的凌日系外行星，但这种技术存在偏差：它对轨道紧凑的大型行星最敏感，导致系外行星群体中的大部分区域尚未被探索。

为了寻找这些未被发现的行星，罗曼将连续数月凝视银河系拥挤的中心，监测 1 亿颗恒星，寻找由一种被称为“引力微透镜”效应引起的短暂增亮。当一颗前景恒星经过一颗遥远的背景恒星前方，且较近恒星的引力起到透镜作用，短暂地放大较远恒星的光线时，就会发生这种情况。如果前景恒星拥有一颗行星，该行星也可以充当透镜，从而产生一个特征性的

南希·格雷斯·罗曼空间望远镜（Nancy Grace Roman Space Telescope）的 2.4 米镜面是由一家美国情报机构捐赠的。

增亮过程中的双重脉冲。这种很少被使用的技术可以揭示大约 2500 颗原本不可见的行星，包括比火星更小且距离其恒星更远的行星。领导微透镜调查的俄亥俄州立大学天文学家 Scott Gaudi 表示：“它能够测量那些无法通过任何其他方式测量的行星人口统计学特征。”

该天文台还将携带一台实验性日冕仪，这是一种使用特制形状掩模来遮挡星光以揭示行星光线的仪器。配备日冕仪的望远镜已经拍摄到了少数几颗年轻且炽热、能产生自身红外辉光的巨行星。但研究人员希望，罗曼更先进的日冕仪——在能够修正光束不规则性的可变形镜和能够计数单个光子的超灵敏探测器的帮助下——能够捕捉到来自更古老、更冷且大小与木星相当的系外行星的反射光。加州大学天文台（UC Observatories）主任兼日冕仪团队成员 Bruce Macintosh 表示：“罗曼是我们第一次有机会看到像木星这样成熟行星的反射光。”

这些图像甚至可能揭示云层的存在。

Roman 望远镜本身自 2010 年一项针对天体物理学界的调查建议 NASA 追求当时被称为“宽视场红外巡天望远镜”的项目以来，已经发生了显著演变。由国家侦察局（National Reconnaissance Office）捐赠的一面原计划用于间谍卫星的大镜面，将该任务转变为一个能力强得多的天文台，尽管随后的成本削减缩减了其日冕仪的规模。该任务在 2020 年以 NASA 首任首席天文学家南希·格雷斯·罗曼（Nancy Grace Roman）的名字重新命名，此后基本按计划推进。

与其他现代巡天望远镜一样，Roman 旨在捕捉意想不到的现象。每当它重新观测一片天空时，软件将自动寻找任何发生变化的目标，并迅速向全球天文学家发出警报——这一方案与 Rubin 望远镜上的方案类似。加州理工学院的警报团队负责人曼西·卡斯利瓦尔（Mansi Kasliwal）希望它能发现从合并的双星到对不稳定超新星（一种被认为仅发生在宇宙最早期的恒星中的恒星爆炸）的一切现象。她说：“Roman 将凭借其巨大的视场和深度在这一领域大获成功。”

由于该望远镜将服务于天文学的如此多领域，时间分配问题随之产生了紧张局势，但 JPL 的 Roman 副项目科学家杰森·罗兹（Jason Rhodes）表示，任务管理人员将保持灵活性。他说：“我们将根据我们认为的需求来调整（巡天计划）。”而且，由于每一次观测都将立即进入公共存档，各地的天文学家将能够挖掘 Roman 巨大的数据集，寻找尚未有人想象到的新发现。

数据概览

18,943

来自 15 家公司的抗体验证图像，一名科学侦探发现这些图像经过了篡改。这些图像本应证明这些商业研究用抗体达到了预期的工作效果。

儿童健康研究所新任负责人与 MAHA 有关联

任命约翰·盖塔尼斯引发了人们对政治驱动领导层选拔的担忧 JOCELYN KAISER

美国国立卫生研究院（NIH）上周任命了一位对自闭症持有争议观点的儿科神经学家，领导该机构的儿童健康研究所。这一选择引发了人们的担忧，认为 NIH 院长杰伊·巴塔查里亚（Jay Bhattacharya）正在选择——或者是在其上司、卫生与公众服务部（HHS）部长小罗伯特·F·肯尼迪（Robert F. Kennedy Jr.）的压力下被迫选择——那些持有边缘科学观点且没有 研究资助经验的领导者。

另一位曾在 HHS 随肯尼迪工作的儿童健康研究所新任官员，已经拦截了此前由工作人员建议资助或由该研究所前任临时负责人批准的拨款。

约翰·盖塔尼斯（John Gaitanis）直到 2025 年 7 月之前一直就职于布朗大学的孩斯博儿童医院（Hasbro Children's Hospital），他于 23 August 成为预算为 17 亿美元 billion 的尤妮斯·肯尼迪·施赖弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）的所长。盖塔尼斯在布朗大学获得医学博士学位，并在哈佛大学附属医院接受培训。他曾领导布朗大学和塔夫茨大学的儿科神经学部，并发表过关于癫痫和自闭症的研究。

但 的 Reporter 数据库没有证据表明他曾获得过 的资助，且该机构的消息人士无法在担任 拨款外部同行评审的研究人员名单中找到他。几名 工作人员告诉《科学》杂志，他们对盖塔尼斯的任命感到震惊。

盖塔尼斯的一位前同事也对被选中领导一个主要政府研究机构表示“惊讶”。“他受到那些寻求替代疗法的患者的追捧，而他在疫苗观点、信仰以及对非传统方法的投入方面具有极强的争议性，”孩斯博医院的医疗总监、布朗大学医生科学家菲利斯·丹纳里（Phyllis Dennery）说道。“他的优势在于临床而非研究，因为他没有 的资助，也没有以产生出版物的方式参与过研究项目。”

盖塔尼斯与几个持有非主流观点的自闭症组织有关联。例如，他担任儿科与特殊需求医学学院（Medical Academy of Pediatrics and Special Needs）的董事会成员，该学院推广针对自闭症的替代医学治疗，如高压氧疗法和leucovorin（一种维生素衍生物，特朗普政府官员去年基于有限的证据对其进行了推广）。今年 4 月，盖塔尼斯共同创立了一家提供 leucovorin 治疗的远程医疗公司。他还曾在联邦法院担任付费专家证人，为那些声称童年疫苗造成神经系统损害的家庭提供证词。

盖塔尼斯似乎接受了肯尼迪备受争议的“让美国再次健康”（Make America Healthy Again, MAHA）议程。2025, 9 月，他出席了由推广该运动的 MAHA 研究所举办的一场自闭症活动。

同样在去年，盖塔尼斯曾入围疾病控制与预防中心（CDC）免疫接种实践咨询委员会的候选名单，这是肯尼迪进行的一项改革的一部分，旨在引入与他一样对疫苗安全性持怀疑态度的成员。据《华盛顿邮报》（The Washington Post）报道，盖塔尼斯以“之前的专业义务”为由拒绝了该邀请。他还告诉《邮报》：“我毫无保留地支持疫苗接种。”

尽管如此，这些以及其他与肯尼迪立场相关的联系“令人担忧”，宾夕法尼亚大学的自闭症研究员大卫·曼德尔（David Mandell）表示。“现在他将监督 1100 名员工和 17 亿美元 billion 的预算，而他对于这个研究所绝对没有任何经验。”

Gaitanis 的任命是在另一位与 Kennedy 有联系的医生——内分泌学家 Dorothy Fink 成为 NICHD 副主任兼代理主任 2 周后宣布的。在 Trump 于 2025 年 1 月就职后，Fink 曾担任 HHS 代理部长，期间她主导了包括在整个部门实施通信暂停在内的举措，导致数十场 NIH 拨款评审会议被取消，并关闭了负责监督多样性、公平性和包容性工作的 HHS 办公室。

根据《科学》杂志查阅的文件，Fink 上周拒绝了数份由其工作人员建议资助的研究提案“支付清单”（paylists）。她还暂停了 11 项待处理的奖项，这些奖项此前已获得其前任代理主任的最终批准。被暂停奖项的主题涵盖了从儿童营养到暴力预防，以及政策变化对女性生殖健康的影响。正如《自然》杂志最近报道的那样，在 Bhattacharya 的领导下，与政策相关的研究正面临新的审查。

被暂停的奖项中包括几项在公立大学的项目，由于这些学校受到进行中的诉讼保护，NIH 工作人员本应不对其干预。

由于处理拨款文书需要时间，这些干扰可能会危及 NICHD 在 9 月 30 日财政年度结束前花完其全部 2026 年预算的能力。“在财政年度如此之晚的时间点停止一份已批准的支付清单，这太迟了，”曾批评 Trump 政策变化的前 项目主任 Elizabeth Ginexi 表示。

Bhattacharya 已开始填补 15 个 研究所的高层空缺，其中大多数职位在去年多位主任被解雇或被排挤后出现空缺。他重新调任了另一位主任（ 环境健康研究所负责人），并由副总统 JD Vance 的一名朋友接任。除 Gaitanis 之外，Bhattacharya 今年迄今为止选定的六个人选（部分来自 内部，部分来自外部）均属于常规选择。

Politico 最近报道称， 将很快任命生物技术高管 Steven Quay 为国家过敏和传染病研究所（NIAID）所长。据 Politico 报道，在考虑申请人的 工作人员中，Quay 未被推荐进行面试，但获得了 Kennedy 的支持。Quay 是一个争议理论的支持者，该理论在 Trump 政府内部被许多人认同，即 NIAID 的病毒学资助导致了中国的一次实验室泄漏，从而引发了 COVID-19 大流行。与 Gaitanis 一样，Quay 显然从未获得过 的资助。

Jeremy Berg（前 基础研究研究所所长，以及前《科学》杂志主编）表示，这两个人都“没有证据表明他们（至少在过去）对 的运作方式有哪怕最基本的了解，且有明确证据表明其选拔是基于政治观点”。“我一直担心这种情况会发生。” □

全球健康

全球疾病研究获得历史性资金注入

盖茨基金会向一个经常因缺乏透明度而受批评的项目承诺捐赠 5.4亿美元 GRETCHEN VOGEL

像塞内加尔达喀尔这样发生的沙尘暴会导致空气污染，这是全球疾病负担研究追踪的众多健康风险之一。

一项追踪全球健康的重点工作正获得盖茨基金会的巨额支持。本月，该慈善机构向健康指标与评估研究所（IHME）承诺捐赠超过 5 亿美元。该研究所发布全球疾病负担（GBD）研究，这是全球最广泛的疾病与健康风险数据集。但 10 August 的这一公告也让人们重新关注对 IHME 的批评，因为其结论基于外部人员无法获取的计算机模型，且这些模型往往是从非常稀疏的数据中推演而来的。

总部位于华盛顿大学（UW），长期由盖茨资助。 表示，将利用这笔为期 10 年、金额为 5.4亿美元 的赠款（该大学历史上最大的一笔赠款）来提高 GBD 研究的精准度，将其评估的地点数量从 900 多个增加到近 5000. 个。它还将扩展其全球健康预测项目（该项目有助于预测健康政策决策的影响）以及对全球健康融资的追踪。

全球健康专家、 前董事会成员林肯·陈（Lincoln Chen）表示，这笔捐赠是“盖茨资金的一次良好利用”，因为 GBD 研究“是我们定期能获得的唯一真正全面的全球健康图景”。在 2025, 年发布的最新报告中，涵盖了 204 个国家和地区的 375 种疾病和伤害的影响。由于这些数据有助于指导健康投资，康考迪亚大学的全球健康专家蒂姆·埃文斯（Tim Evans）表示：“这类投资具有不成比例的高回报。”

但全球健康社区的其他人士警告称， 的计算机模型不能取代收集人群健康信息的努力。One Health Trust 主席拉马南·拉克希米纳拉扬（Ramanan Laxminarayan）表示，对于许多估算值，“他们依赖于偏向高收入国家的数据，并对其进行了过度建模”，“而且他们的模型是不透明的，既不容易验证也无法复制”。

牛津大学的流行病学家普拉巴特·贾（Prabhat Jha）指出，这导致了一些惊人的错误。例如，2015 GBD 研究将霍乱列为加拿大腹泻死亡的主要原因，而该疾病在加拿大极其罕见，仅影响来自流行国家的旅行者。 随后修正了报告，但未解释错误原因。贾说：“我们仍然不知道这是如何发生的。导致这次误诊的底层问题是什么？”

为了撰写报告， 从全球数百万个来源收集数据，包括富裕国家的医疗系统记录、已发表的研究论文，以及在医疗系统稀疏或缺失的贫困国家中，尝试追踪疾病症状和死亡率的调查。随后，它利用这些数据构建模型，以估算伤残调整寿命年（DALY），这是一个允许研究人员比较给定区域内不同疾病影响的单位。为了避免像霍乱那样地错误， 增加了与当地专家和卫生当局的合作，由后者对其估算值进行核查。

第一份 GBD 报告是由世界卫生组织（WHO）在 19 世纪 90 年代委托编写的。2007, 年，盖茨基金会资助健康经济学家克里斯托弗·默里（Christopher Murray）成立 并扩大该研究，默里此前曾在 WHO 参与早期报告的工作。每两年一次的 GBD 报告（每份报告均作为系列论文发表在《柳叶刀》上）曾多次引发争议。2013, 年发表的第一份报告发现，疟疾死亡人数比 WHO 的估算值高出两倍多，导致 与 WHO 之间产生了严重的摩擦。在 COVID-19 疫情期间， 对感染人数和死亡人数的预测往往过高。

[⚠ 低质量翻译，建议复核] Since the source image (IMG_A2E6DCC1) was not provided in the prompt and the draft translation was a placeholder, I cannot perform the translation. Please provide the source text or image to be translated.

他们的模型是不透明的，既难以验证也无法复制。

Ramanan Laxminarayan One Health Trust

然而，该研究所依然繁荣发展，这在很大程度上归功于盖茨基金会的慷慨资助。到目前为止，该基金会在 IHME 的工作上已投入超过 3.85亿美元，且目前提供了其每年约 9000万美元 预算的 60%。默里（Murray）的年薪为 $855,000，这使他成为华盛顿大学（UW）薪酬最高的教授，他与比尔·盖茨关系密切。

默里表示，新的拨款将使 IHME 能够产生更细粒度的数据，为更小的地理区域（如州、省，甚至地方卫生当局，而非整个国家）提供疾病负担的估算。他说：“各国政府对本国的地理分布情况非常、非常感兴趣，”因为这可以揭示健康差异，并有助于将资金分配到最需要的地方。

亚伯丁大学的卫生政策系统专家露西亚·德·安布鲁奥索（Lucia D’Ambruoso）表示，这个想法本身“至关重要”，“但这并不能消除潜在的数据问题”。她指出，全球只有约 40% 的死亡病例记录了经医学认证的死因，而在低收入国家，这一比例下降到 10% 以下——这就是为什么全球卫生界如此依赖模型的原因。德·安布鲁奥索希望新资金能让 IHME 帮助低收入国家“不仅能生成这些数据，还能对其进行解读和利用”。

贾（Jha）警告称，IHME 的报告传达了一种虚假的精确感，这可能会使此类投资显得没有必要。“当他们给政策制定者一种‘我们确实拥有数据’的感觉，而实际上他们拥有的是猜测时，这很可能会分散人们的注意力，从而影响到构建那种能提供更准确信息的关键数据系统。”贾希望 IHME 能转向开源方式，更多地扮演一个数据库而非结果发布者的角色，并使原始数据和建模策略真正透明化。他说：“那将成为一个惊人的全球资源。但这可能只是痴人说梦。”

默里承认，在低收入国家建立即使是最基础的出生和死亡登记制度的努力也举步维艰。但他说，简单、低成本的信息系统正在一些最贫困的国家取得进展，而且许多中等收入国家已经建立了电子健康记录，这为人们寻求治疗的病症提供了更易获取的数据。

默里表示，IHME 还将利用新资金扩展预测卫生政策影响的模型（例如更严格的烟草控制或引入新疫苗），希望能够“在未来改变健康轨迹的 20 个主要机会方面提供更多指导”。

第三个重点将是该研究所监测全球卫生支出的努力。到目前为止，它主要追踪从高收入国家流向低收入和中等收入国家的资金，但鉴于近期全球卫生援助的大幅削减，默里说，“我们需要在追踪各国政府投入的自有资金，以及患者及其家庭贡献的金额方面做得更好。”

埃文斯（Evans）对 IHME 工作的扩展表示赞赏，“尤其是当越来越多的国家似乎认为投资战争比投资健康更重要时。……我们的健康是一项全球公共产品，我们确实需要了解如何做得更好。”

其他新闻

太空望远镜救援任务失败 一项旨在拯救尼尔·盖雷尔斯·斯威夫特天文台（Neil Gehrels Swift Observatory）的大胆任务以失败告终。这台拥有 22 年历史的太空望远镜其轨道正在衰减。美国国家航空航天局（NASA）上周宣布，一艘在创纪录时间内开发并发射的救援飞船失去了控制。斯威夫特望远镜旨在研究伽马射线暴和其他快速发展的高能宇宙事件，于 2004 年发射，原定任务周期为 2 年。但近期的太阳活动导致地球大气层膨胀，减缓了斯威夫特的轨道速度。去年，NASA 委托 Katalyst Space 公司建造一艘救援飞船，该公司在约 8 个月内完成了建造。但在 7 月 3 日发射后不久，该飞船开始剧烈旋转。在尝试使用推进器重新获得控制权数周后，NASA 和 Katalyst 公司承认失败。预计斯威夫特望远镜将在年底前重新进入大气层并被烧毁。——Daniel Clery

首批昆虫的腿数远超六条 如今，所有昆虫都有六条腿，但最早的昆虫腿数要多得多。古生物学家在重新检查了发现于德克萨斯州、伊利诺伊州和苏格兰、可追溯至 4.05 亿年前的四件类甲壳动物化石后得出了这一结论。研究人员本周在《自然》（Nature）杂志上发表报告称，这些多腿生物代表了现代有翅昆虫及其前身之间的进化环节。对代表三个新物种的标本分析显示，这些早期昆虫的中段拥有六条腿，且在后端也长有腿。这些带有桨状末端的额外腿可能使它们能够过上两栖生活。——Elizabeth Pennisi

带状疱疹疫苗与心脏健康相关 疫苗可以预防带状疱疹，这是一种由水痘病毒在晚年重新激活引起的疼痛疾病。但根据本周发表在《自然-医学》（Nature Medicine）上的一项研究，接种该疾病疫苗还可能降低心脏病的风险。研究人员发现，接种 Shingrix（一种包含水痘病毒蛋白和其他成分的重组疫苗）的人在接下来的 7 年中出现心脏问题的可能性，低于接种一种包含活病毒的较旧且效果较差疫苗的人。该团队认为，Shingrix 的成分可能会触发免疫系统的暂时性变化，从而保护心脏健康。目前丹麦正在进行一项临床试验，以更深入地研究这一联系。 ——Catherine Offord

轨道炼金术

日益成熟的空间实验室和更低廉的发射成本，正推动着在轨道上制造药物和组织的梦想

迈克尔·格雷什科（MICHAEL GRESHKO）报道。在加利福尼亚州埃尔塞贡多（El Segundo），近一个世纪以来，这个洛杉矶沿海郊区一直是美国航空航天工业的核心。第二次世界大战期间，这里的工厂大量生产用于太平洋战场的轰炸机。随后，由休斯（Hughes）和诺斯罗普（Northrop）等巨头打造的几代飞机和航天器相继问世。如今，数十家航空航天和技术初创公司与 SpaceX 共享这一街区，后者就在霍桑（Hawthorne）不远处的路端。

在一家提供披萨和啤酒的午餐店里，人们正热烈地讨论着航天器零部件的供应链。当雾气弥漫时，那些低矮的仓库似乎消融在云端——仿佛这个街区本身也在准备发射。

五月的一个周一晚上，在埃尔塞贡多东缘一座不起眼的建筑里，约 50 名来自 Varda 太空工业公司（Varda Space Industries）的工程师聚集在一起，他们见证的不是一次发射，而是一次回归。他们吃着冷披萨，玩着《卡坦岛》游戏，同时观看直播，等待航天器状态的消息。在一个较小的任务控制室里，八张办公桌面对着一面电视墙，屏幕上实时传输着来自航天器的信息，此时该航天器正处于地球另一端，在澳大利亚内陆上空向地球坠落。这个机器人胶囊大约有洗衣机大小，正准备在计划中的沙漠降落伞着陆前，在穿越大气层时经历一场炽热的俯冲。

Varda 的首席技术官尼古拉斯·恰尔德拉（Nicholas Cialdella）调整了他的 Apple Watch，他知道自己的心跳将会加快。晚上 10:59，表演开始了。胶囊以约 31,000 公里每小时的速度向地球疾驰，随后被唤醒，并与在轨道上引导它的卫星分离，它通过 GPS 和无线电信号发送了这一更新。17 分钟后，当胶囊的第一把降落伞准时打开时，现场爆发出了欢呼声。但随后，来自胶囊的遥测数据流变得断断续续。“再给我一个数据点，”一名咒骂着的工程师低声说道。

这个房间看起来非常像 NASA 或其他航空航天公司为载人任务、科学探测器和通信卫星设立的任务控制中心。但它的目标截然不同：为一个专注于生物医学的新型太空产业奠定基础。

Varda 成立于 2021 年。在短短 5 年内，它就设计、制造并向轨道发射了六个胶囊。这次为美国空军研究实验室（U.S. Air Force Research Laboratory）发射的胶囊旨在测试隔热罩材料，而其他胶囊则携带了微型实验室，能够自主地对药物化合物进行熔化、溶解、冷却和重结晶。在地球上，这些过程会受到重力的干扰，重力会驱动液体中的气泡对流，并导致晶体和颗粒沉降。但在太空中——那里没有上下之分——温暖的流体不会上升，致密的颗粒不会下沉，晶体可以在远为平静的条件下组装。

Varda 表示，因此，微重力可以使蛋白质和药物晶体更加纯净或均匀，或者培育出在地球上无法形成的一种晶体。恰尔德拉希望这些优势能转化为更易于制造、储存和给药的药物。如果成功，太空将不仅仅是一个研究场所，而将变成一个工厂车间。

Varda 仅仅是一个更大规模赌注的缩影。在学术界和工业界，研究人员正试图将国际空间站（ISS）数十年的生物医学实验转化为一种新型的制造企业。他们认为，微重力不仅能改善药物的制造，还能促进干细胞、植入物、微型器官以及其他生物材料的生长。这一愿景并不新鲜，但日益先进的轨道实验室和更低廉的火箭发射成本，正重新点燃人们的希望，即微重力最终可能成为一种工业工具，而不仅仅是一个科学奇观。

“过去几十年来最大的革命是发射成本的下降，”哈佛商学院研究太空经济的经济学家马修·温齐尔（Matthew Weinzierl）表示，“当像 Varda 这样更多的公司生产出自主制造和研究设施时，我认为我们将迎来一场类似的革命。”

在地球上方数百公里的高度，如果其应用案例显示出前景，温齐尔认为该行业具有变革性的潜力。但就目前而言，他补充道，“‘不确定’是我会用来形容它的一个词，‘处于萌芽状态’是另一个。”

然而，该领域仍然面临着一个阴影笼罩太空制造业数十年的问题：卓越的科学能否克服开展业务时那顽固的经济规律。

自从人类开始前往轨道及更远的地方以来，航天机构一直大肆宣传在地球上能收获的益处。（比如！魔术贴！）这可以被称为“黑空思维”。

5月，Varda 太空工业公司的第六个舱段从轨道返回，降落在澳大利亚内陆。

然而，几十年来，将这一承诺变为现实一直受到航天飞行严苛的物理和财务限制的阻碍。哥伦比亚大学神经内分泌学家雷·西尔弗（Rae Silver）表示，在 2000 年代国际空间站（ISS）建设期间，“如果你把稻草送入太空并将其变成黄金，它也不会具有成本效益”。西尔弗曾在 2002 年共同主持一个 NASA 工作组，该工作组协助制定了 ISS 的研究优先级。

即使实验进入轨道，研究人员也必须学习如何调整那些基于重力而开发的实验室技术。凯特·鲁宾斯（Kate Rubins）在 2009, 年加入 NASA 宇航员队伍之前，曾在怀特海德研究所（Whitehead Institute）担任首席研究员，研究病毒和免疫系统基因组学。作为一名新晋宇航员，她惊讶地发现许多熟悉的工具（如移液管）并未被太空研究人员采用——她怀疑这是不必要的。“我想，请给我解释一下其中的物理原理，”她回忆道。

当鲁宾斯在 2016, 年前往 ISS 时，她利用 5 公斤个人货运配额的大部分空间带上了移液管和其他实验室设备以进行测试。结果证明，移液管运行良好，那些被当作微型试管用于制备和存储样本的通用 96 孔板同样适用。鲁宾斯的坚持立即扩展了在 ISS 上开展生物科学研究的方式。“其中一部分，”她笑着说，“只是因为我太固执了。”

2016年，NASA 宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站检查由干细胞衍生的心脏细胞。

那些年艰苦卓绝的工作终于得到了回报。ISS 已成为一个先进的轨道实验室，配备了自动显微镜、标准化的工作流程，并且人们对细胞和分子在微重力环境下的行为有了更深入的了解。鲁宾斯现在担任匹兹堡大学 Trivedi 太空与全球生物医学研究所所长，她表示，对于某些应用而言，微重力“可能是一个有用的新变量”。

与此同时，在 SpaceX 可重复使用猎鹰 9 号火箭的推动下，发射成本的下降使得进入太空和跟进想法的成本变得更低。根据 7 月发表在《PNAS Nexus》上的一项分析，将 1 公斤材料发射到太空的经通胀调整后的成本，已从 2000 年（ISS 开始有人居住时）的 $15,000 以上下降到 2025. 年的 $4000 以下。该研究预测，如果这些趋势持续下去，从现在到 2030 年，每公斤的成本可能会再下降 50%。

“我们在理解力和知识积累方面已经达到了成熟阶段，”ISS 国家实验室首席科学官迈克尔·罗伯茨（Michael Roberts）表示，“这可以加速在地球上获得治疗方案和研究成果。”

罗伯茨指出了一家制药公司默克（Merck）的一个关键里程碑，该公司在 ISS 上进行了关于其

重磅抗癌药物 Keytruda（pembrolizumab），这是一种单克隆抗体，能够激活免疫系统以攻击肿瘤细胞。在 2019 年的一项研究中，默克（Merck）的研究人员报告称，在微重力环境下，抗体蛋白形成的晶体比传统制造方式产生的晶体更小且更均匀，这为将该药物制成注射剂而非耗时较长的静脉输液开辟了道路。尽管默克最终采用了另一种（基于地球的）方法将该注射剂商业化，但该实验凸显了微重力的优势。

默克的研究促成了 Varda 太空工业公司的成立。在 2023, 年的首次任务中，该公司将抗 HIV 病毒药物利托那韦（ritonavir）熔化，并将其重新结晶为该药物最不稳定的结构变体。此次演示表明，药物可以在轨道上进行自主处理，在太空中维持数月，并能承受大气层重新进入时的剧烈高温。

通过搭乘频繁发射的 SpaceX Falcon 9 火箭，该公司现在旨在加速曾经极其缓慢的实验过程，以便支持商业研究。“当你面对一个每年、每两年或每 3 年才能获得一个数据点的情况时，很难在商业环境下开展工作，”Varda 的首席科学官 Adrian Radocea 表示。

并非孤例。2025, 年，长期从事 ISS 载荷开发的 Redwire Space 宣布与初创公司 ExesaLibero Pharma 达成协议，在太空中生长一种实验性骨科药物的超纯晶体，以便在地球上以此为种子培育更大的晶体。今年 5 月，总部位于英国的初创公司 BioOrbit 向 ISS 发射了一项载荷，与 的胶囊类似，该载荷旨在微重力环境下自主地使药物结晶。大约在同一时间， 宣布与 United Therapeutics 建立合作伙伴关系，筛选可能从轨道处理中获益的药物制剂。

据 的首席战略官 Michael Reilly 称，在未来几年内，该公司的一个胶囊将能够处理足够用于数百名患者临床试验的药物。“我们的重点确实是将一种太空药物——在这种情况下，是我们通过微重力制造的药物——应用于人体，”他说道。

微重力的前景远不止于单个蛋白质和小分子药物。对于从康涅狄格大学分拆出来的初创公司 LambdaVision 而言，其目标是利用一种名为细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的特殊集光蛋白薄膜来制造人工视网膜。

当暴露在光线下时，细菌视紫红质会将质子泵出膜外。在天然产生该蛋白的生物体中，由此产生的离子梯度提供能量。通过堆叠多达 200 层精心排列的蛋白质，LambdaVision 希望创建能够刺激退化视网膜中残存健康细胞的植入物，从而为黄斑变性患者恢复部分视力。

现任 LambdaVision 首席执行官 Nicole Wagner 在 2009, 年协助创立该公司时，并未考虑过微重力。但在向 ISS 发送了 9 次实验后，公司发现缺乏沉淀和对流使其能够构建更均匀的蛋白质薄膜，且浪费大大减少。Wagner 表示，在地球上，大约 $60% 的薄膜最终会因为过厚或过薄而报废。

蛋白质薄膜在轨道上维持至少 6 个月后仍保持稳定，这消除了人们对太空辐射造成损害的担忧。“其他所有人发送东西是为了改变它，”Wagner 说，“而我们不希望蛋白质发生改变。”LambdaVision 计划在 2028, 年前增加 5 次 ISS 飞行，以及其首次在 ISS 之外的飞行：一项旨在测试由初创公司 Helogen 构建的设备上的轨道制造方法的联合任务。

对于加州大学圣迭戈分校桑福德干细胞研究所（Sanford Stem Cell Institute）所长卡特里奥娜·杰米森（Catriona Jamieson）而言，微重力的吸引力不在于防止生物变化，而在于加速变化。在太空中，癌细胞更容易组织成 3D 结构，并迅速激活与转移相关的通路。杰米森认为，这种加速作用可以极大地提高寻找新型癌症疗法的时间效率。2024 年，她将乳腺癌细胞送往国际空间站（ISS），以测试 rebecsinib 的有效性，这是一种由杰米森共同创立的 Aspera Biomedicines 公司开发的实验性抗癌药物。“我们在 10 天的时间里就能看到这一切，”她说，“而在地面上可能需要 10 年。”

杰米森表示，当摆脱重力的束缚时，其他类型的细胞也会表现出崭新且不寻常的行为。干细胞作为能分化为所有其他细胞类型的多能细胞，其增殖和衰老速度极快，并激活其“暗基因组”（通常处于沉默状态的 DNA 片段）中的压力反应，而这些反应在地球上出现所需的时间要长得多。“微重力释放并加速了压力生物学，”她说。

在过去的 2 decades 里，研究人员已经学会将普通的皮肤或血液细胞重新编程为诱导多能干细胞（iPSCs），这些细胞具有普通干细胞的多功能性。洛杉矶西奈山医疗中心（Cedars-Sinai Medical Center）的心脏生物学家阿伦·夏尔马（Arun Sharma）花了 10 年的时间研究 iPSCs 在微重力下的行为，以及微重力在培养这些细胞时可能带来的优势。

夏尔马从小在阿拉巴马州亨茨维尔长大，与美国国家航空航天局（NASA）马歇尔太空飞行中心的科学家和工程师的孩子们一起成长，从那时起他就一直仰望星空。在研究生期间，他与 Rubins 合作，在国际空间站上培养由 iPSCs 衍生的人类心脏细胞。现在，作为西奈山太空医学研究中心（Center for Space Medicine Research）的主任，夏尔马在地球上的一个星光熠熠的环境中关注太空：即西好莱坞的一家规模庞大的医院里。

他希望微重力能帮助诱导 iPSCs 形成类器官（organoids），即在实验室中生长、能够模拟真实器官许多特性的细胞团块，使其可用于测试药物和其他疗法，甚至用于替代活体组织。在夏尔马的实验室里，他的同事们调出了对比图，将地球上生长的类器官与在国际空间站上培养的对应物进行比较。地面的类器官看起来参差不齐：尺寸不一，相互融合，且散布着死细胞和碎片。而太空生长的版本则更丰富且纯净。“形状统一得多，且细胞死亡更少，”研究生马德琳·阿尔茨（Madelyn Arzt）一边说着，一边举起一张来自实验室群聊的截图。

这些结果可以用一个简单的物理原理解释。在地球上，类器官生长在生物反应器中，细胞被悬浮在不断循环的液体中以防止沉淀。这种流动可能会使细胞簇融合在一起，或者在脆弱的结构刚刚开始形成时将其撕裂。夏尔马说，在微重力环境下，类器官无需任何循环即可保持悬浮状态。“这很合理，对吧？”他说，“它们本来就应该是漂浮的。”

这些发现尚未发表，但其结果足够令人信服——夏尔马称之为“某种‘卧槽’时刻”——以至于 NASA 批准了 $1500万 的资金用于复制该国际空间站实验。该载荷将于今年晚些时候随 SpaceX 的补给任务发射。

如果这种效果能够维持，它可能会催生另一条太空生物制造路线——即由 iPSCs 生长的替代组织。目前，临床试验正在评估由 iPSCs 衍生的手术植入神经元是否能帮助缓解帕金森病症状，或者 iPSC 衍生的心脏细胞植入物是否能减轻心力衰竭。轨道生物反应器生产的高质量类器官（如夏尔马实验中的类器官）的产量可能会远高于地面生产的产量。

在 2023 年的首次任务中，Varda 太空工业公司证明了其能够在轨道上使艾滋病（HIV）抗病毒药物利托那韦（ritonavir）熔化并重新结晶。

此类可能性已经影响到了国际空间站（ISS）之后空间设施的规划。在轨道上运行 25 年后，这座空间站——在紧张的国际合作伙伴关系压力下，字面意义上已经开始泄漏并发出呻吟——正接近退役，而商业继任者正在成形。Sharma 和我开车穿过洛杉矶，去参观其中一个项目。在长滩的一个办公园区里，Vast Space 正在全力完成 Haven-1，这是一座商业空间站，西达赛奈医疗中心（Cedars-Sinai）计划最早于明年将其用于生物医学实验。

LambdaVision 的人工视网膜由光采集蛋白的薄膜制成。这些薄膜在太空中生长得更均匀，且浪费更少。

在公司的无尘室里放置着空间站本身：一个精细铣削的铝制圆筒，长度几乎与一辆巴士相当。身穿白色无尘服的技术人员在打开的舱口进进出出，轮流处理一些据推测非常繁琐的组装部件。

Haven-1 将仅接待少数宇航员进行为期 2 周的短期任务。其更大的目的是测试一种不同的轨道研究模式：在这种模式中，实验将日益自动化运行，而科学家仅偶尔飞上去进行维护。Vast 的首席科学家梅根·埃弗里特（Meghan Everett）表示：“我们绝对希望向自动化方向发展，”她曾任 NASA 国际空间站项目的副首席科学家。但在“我们仍在学习且仍处于起步阶段的领域，有机组人员在空间中确实能让我们获益。”

看着技术人员为 Haven-1 做最后的收尾工作，Sharma 不禁想象自己身在其中。他曾申请过几次 NASA 的宇航员团，他认为像 Rubins 这样的研究人员证明了拥有生物医学专业知识的宇航员能提供多么大的帮助。他会亲自前往太空维护他的实验吗？“自私地说，是的——我很愿意，”他说。

然而，像 Haven-1 这样的空间站能否支撑起一个繁荣的生物制造产业，取决于一个更现实的问题：经济效益。2020 年，西达赛奈医疗中心开设了一家大型生物制造设施，目前为疾病模型和细胞疗法临床试验生产 1500 种不同的细胞系。该中心主任德鲁·萨林（Dhruv Sareen）表示，目前利用 iPSCs 构建一个个性化细胞系，并培养数十亿个细胞（例如为了恢复糖尿病患者的胰岛素产生细胞），成本将超过 200万美元，且至少需要 8 个月时间。萨林曾将 3 个干细胞相关载荷送往国际空间站，他表示，在轨道上完成这一切的成本将更高。“我们可能会治愈疾病，但如果你无法负担，那又有什么意义？”他说。

不过，某些产品可能具有足够的价值来证明这次旅程的合理性。LambdaVision 与国际空间站载荷开发商 Space Tango 合作，在一个重量 10 公斤、大小如鞋盒的自动化设备中制造其蛋白薄膜。瓦格纳（Wagner）表示，目前将该载荷往返国际空间站的费用约为 $600,000。她指出，目前电子视网膜植入物的价格每只眼高达 $150,000 以上。在这种价格下，假设临床试验显示出前景且植入物最终获得监管机构批准，每次任务仅需生产 4 个人工视网膜即可覆盖发射成本。

然而，商业空间站公司将需要其他收入来源。Vast 及其竞争对手的前提是建立一个轨道经济，在这种经济中，各种付费客户——游客、研究人员、宇航员——在数百公里高空大规模地工作和娱乐。罗伯茨（Roberts）表示：“未来我们有可能在空间制造方面达成商业可行性。”但他补充道，他“并不认为在国际空间站一旦脱离轨道，立即就会有商业工厂在太空中运行并生产器官”。

目前，这种期待中的经济在很大程度上依赖于美国国家航空航天局（NASA）的慷慨资助。然而今年早些时候，该机构表示其只能负担得起支持一座商业空间站。NASA的国际空间站（ISS）项目经理达娜·魏格尔（Dana Weigel）在3月份的一次演示中表示：“尽管我们看到了投资者的兴趣，但还没有独立可验证的市场研究能够证明，一个仅由NASA提供部分资金的商业空间站具有经济可行性。”

无论NASA在国际空间站退役后采取什么行动，“我认为[低地球轨道]经济不会完全消失，”夏尔马（Sharma）随后在我们站在Vast公司停车场时说道。“现在有这么多人试图加入这场竞争。”在以一名资深人士的权威语气交谈后，这位36岁的生物学家跳进他的白色特斯拉，疾驰而去。

如果商业空间站受挫，像Varda公司那样的机器人胶囊舱可能会填补空白，甚至提供某些优势。载人空间站不仅成本更高，而且还施加了严格的安全要求，限制了宇航员可以使用的方法和试剂。

回到埃尔塞贡多（El Segundo），该公司任务控制中心的工程师们心情乐观。Varda的胶囊舱已通过降落伞安全地降落在南澳大利亚的内陆地区。Varda的载荷副总裁乔丹·克鲁姆（Jordan Croom）将这种感觉比作等待被击中腹部——结果却什么也没发生。对于恰尔德拉（Cialdella）来说，这次任务预演了未来的常规操作：运行公司内部构建的胶囊舱和卫星平台，并将胶囊舱安全带回。

该公司希望一次又一次地重复这一壮举。Varda计划在2027年进行7次飞行，2028年再进行10次。克鲁姆说：“我们不能仅仅做演示，而必须在轨道上对这些化学品进行科学级、随后是生产级的处理——而且我们还必须以一种前所未有的规模和频率来执行。”他补充道，“这令人振奋，但也有一点可怕。”

天黑很久之后，工程师们聚集在公司自制的提基酒吧（tiki bar），向半个地球之外安全降落的胶囊舱致敬。但明天，他们将回到工作中。浸渍了树脂的毡卷将被制成隔热罩。在公司停车场旁的一栋建筑中进行的推进器测试将要求员工挪车。未来的太空工厂将由零件一个个组装而成。

在另一个 era, 这一切可能是十年一度的事件。Varda团队希望它能变成日常工作的一部分：在技术上同样令人印象深刻，且像在地球上制造药物一样被视为理所当然。克鲁姆说：“我们最大的希望是，它能继续保持‘枯燥’。” □

生物物理学

RNA 结构预测的棘手问题

人工智能助力 RNA 假结设计

Anthony M. Mustoe $^{1,2}$ 和 Junzhe Guo $^{1}$

RNA 分子在生物学中扮演着极其多样化的角色，从作为编码蛋白质合成指令的信使，到充当控制基因表达的配体响应调节开关，以及催化生化反应 (1)。这些功能通常取决于每种 所采取的特定折叠方式或折叠系综，包括其二级结构和更高阶的三维 (3D) 结构 (2)。能够根据序列准确预测 结构，有望加速人们对 机制的理解，并推动合成 药物和器件的设计。然而， 结构预测已被证明是一个极其困难的问题。在本期第 931 页，Townley 等人 (3) 对旨在实现这一目标的最先进深度学习方法进行了重要评估。这项研究以及其他近期发表的 (4–6) 和尚未发表的 (7,8) 研究表明，虽然已经取得了令人兴奋的进展，但鲁棒的 结构预测仍然是一项重大挑战。

像 AlphaFold 这样预测蛋白质结构的深度学习模型彻底改变了蛋白质结构生物学 (9)，但在 领域仍然不够可靠 (10)。为什么 问题被证明更难解决？ 序列仅由四种化学性质相似的核苷酸组成，因此其提供的信息量远低于蛋白质的 20 种氨基酸构建模块。一个给定的 序列通常可以折叠成多种能量几乎相等的结构，这使得识别具有生物学相关性的构象变得十分困难。蛋白质结构预测方法还严重依赖于从跨物种的全面序列比对中学习到的进化共变信息。然而，对于大多数 而言，已识别的同源物较少，因此比对提供的信息较少。最重要的一点可能是，实验测定的 结构在数量和多样性上比蛋白质低几个数量级，这限制了用于训练模型的数据量。

在过去的 4 年里，人们开发了多种深度学习方法来应对这些挑战。Townley 等人试图测试这些模型在从头 (de novo) 设计中的实际表现——即在没有预先存在的天然序列模板的情况下，创建能够折叠成所需结构的 分子。这是一个要求极高的应用，既需要高效生成候选序列，又需要准确预测这些序列是否会采取所需的折叠方式。作者通过征集假结 (pseudoknots) 的设计使这项测试变得更加困难，假结是一类包含交错碱基配对区域的特殊 基序。由于其拓扑复杂性且折叠规则尚不明确，假结是最难预测的 基序之一，且超出了大多数传统设计算法的范围。鉴于假结是功能性 的常见特征——包括构成核酶的催化中心和配体传感器的特定结合口袋——预测和设计假结对于理解和工程化 生物学至关重要。

Townley 等人发现，最新一代的深度学习（人工智能，或 AI）系统能够为 57 种不同的测试假结架构中的 55 种设计出能够正确折叠的序列。这一表现与经验丰富的人类专家相当，后者也为同一组假结结构提交了设计方案。在成功设计的假结中，有几种的架构此前在文献中未见报道，这凸显了设计挑战的难度，并表明现有的结构数据库可能仅包含可能存在的 RNA 折叠的一小部分子集。

Townley 等人的一个关键发现是，当 AI 系统和人类都能使用一个专门用于根据序列预测 RNA 二级结构的深度学习模型时，设计成功率显著提高。该模型被称为 RNet，此前由作者利用从化学探针实验中获得的大量核苷酸分辨率 折叠模式测量数据集进行训练 (11)。RNet 使人类和 AI 系统能够区分哪些序列设计可能采用所需的假结二级结构，而哪些则可能发生错误折叠。值得注意的是，在使用 的情况下，所有设计策略的表现相当，这与 提供了决定性信息的结果一致。由于测试序列是全新的，且部分目标结构可能不存在于 的训练集中，结果表明 已经学习到了可迁移的折叠模式，可应用于所有 分子。

尽管成功设计假结是一项令人印象深刻的成就，但必须注意，如果按单条序列评估，成功率较低。经化学探针评估的设计中，仅有 $\sim 40\%$ 折叠成了所需的二级结构。当对一部分设计通过诱变实验进行更严格的评估时，仅有 \~70% 的序列令人信服地显示出目标假结结构。而当使用冷冻电子显微镜（EM）进行高分辨率分析时，七个设计中仅有 3 个显示出预期的构象。即使是经冷冻电镜确认的设计也表现出意想不到的特征，包括预期的碱基对断裂，而转而形成了未预测的三级相互作用。推而广之，这些结果表明，即使使用 ，假结二级结构的预测准确率也 <20%，而 3D 结构的准确率则大幅降低。因此，需要持续提高准确率，以实现生物 中可靠的大规模结构预测。

目前尚不清楚合成 设计的进展是否能推广到提高生物 的结构预测，因为生物 通常长得多，并且受到除优化单一、定义明确的结构之外的进化约束的影响。事实上，其他研究发现，与传统的热力学模型相比，深度学习方法在预测长生物 结构方面的表现往往较差 (4)。此外， 的功能经常依赖于结构动力学，且细胞内的 折叠通常依赖于具体语境。例如，共转录折叠、化学修饰和蛋白质结合等过程会不断改变 折叠的热力学状态 (12)。要全面理解 的生物机制并设计具有复杂功能的 ，需要超越预测单一结构，转而对完整的结构系综、其相对能量及其语境依赖性进行建模 (13)。

分子生物学中一个反复出现的教训是，RNA 遵循其自身的规则，且需要与蛋白质不同的解决方案。例如，Townley 等人以及其他近期的研究 (5, 6) 强化了经典认知 (14)，即 RNA 的二级结构在很大程度上可以独立于 3D 结构进行建模，而准确的 3D 建模则依赖于准确的二级结构。将这一规则以及其他 特有的折叠规则更全面地纳入深度学习模型，可能会提高模型的性能。 与蛋白质的另一个区别在于，通过化学探针实验，可以较为容易地在适度分辨率下测量 结构。更好地利用这一丰富的数据源（包括将探针数据作为建模过程中的约束条件，而不仅仅用于预训练），代表了提高模型性能和实用性的另一条路径。鉴于 生物学发现速度的加快以及 在生物技术中应用的扩大，解决 折叠问题从未像现在这样至关重要。

参考文献与注释

1. T. R. Cech, J. A. Steitz, Cell 157, 77 (2014).

2. X. Cao, Y. Zhang, Y. Ding, Y. Wan, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 25, 784 (2024).

3. J. Townley et al., Science 393, 931 (2026).

4. A.A. de Lajarte et al., Sci. Adv. 12, eadz4967 (2026).

5. S. Tarafder, D. Bhattacharya, Nat. Methods 23, 1349 (2026).

6. W. Wang, Z. Peng, J. Yang, Nat. Mach. Intell. 8, 722 (2026).

7. S. He, Q. Sun, bioRxiv 10.64898 / 2026.01.16.700031 (2026).

8. A. Favor et al., bioRxiv 10.1101 / 2025.10.01.679929 (2025).

9. J. Jumper et al., Nature 596, 583 (2021).

10. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 192 (2026).

11. S. He et al., bioRxiv 10.1101 / 2024.02.24.581671 (2024).

12. R. Bose, I. Saleem, A. M. Mustoe, Cell Chem. Biol. 31, 17 (2024).

13. L. R. Ganser, M. L. Kelly, D. Herschlag, H. M. Al-Hashimi, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 474 (2019).

14. P. Brion, E. Westhof, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 113 (1997).

致谢

A.M.M. 感谢美国国立卫生研究院 (R35 GM147010) 和 Arnold and Mabel Beckman 基金会的支持。A.M.M. 是 RNAConnect, Inc. 的顾问并持有其股份。

10.1126 / science.aek4499

电子设备

在弱相互作用上排列原子

范德华相互作用引导单晶金属在二维半导体上生长

June-Chul Shin $^{1}$ 和 Jeehwan Kim $^{1,2,3,4}$

下一代计算机逻辑和存储技术需要高速数据处理和低功耗，以处理海量数据负载并执行实时人工智能任务。满足这些需求需要将更多晶体管集成到有限的芯片区域内，同时保持对电流的有效控制。然而，随着传统硅晶体管的尺寸接近纳米量级，持续的微缩化变得十分困难。二维 (2D) 半导体——一种连接导体和绝缘体的原子级薄材料——是未来晶体管极具前景的材料 (1)。它们能够高效传输电荷载体（如电子和空穴，即电子的对应物），并在原子维度上调节电流流动。要实现这一潜力，需要原子级可控的金属接触，将二维半导体与外部电路连接。在本期第 938 页，Zhang 等人 (2) 报道了一种在二维半导体上生长单晶金属接触的分步工艺。这为将一系列单晶材料集成到器件中提供了一条路径。

随着器件尺寸继续缩减至单个晶粒的量级，两个具有不同原子取向的晶粒相遇而形成的晶界可能会影响器件的性能和可靠性。这些晶界会散射或俘获电子和空穴，从而降低电荷传输和电导率。没有晶界的单晶金属在空间维度上能保持均匀且优异的电学特性。形成单晶材料的一种方法是外延生长，即晶体薄膜在底层晶体衬底的引导下，以明确的原子取向生长。在传统外延中，沉积原子与衬底之间强烈的共价键或离子键有助于建立晶体学对齐。然而，二维半导体缺乏面外的悬空键，而悬空键本可作为引导进入的金属原子的锚点。此外，传统的金属沉积技术可能会通过高能原子轰击和局部热积累损坏原子级薄的二维半导体晶格。由此产生的金属与半导体之间的强相互作用还可能产生非预期的电子态，从而增加界面处的电流流动电阻并降低器件稳定性。

不同的策略解决了 n 型二维半导体 [例如二硫化钼 (MoS $_2$ )] 中的这一瓶颈，在这种半导体中，电子是主要的电荷载体。使用半金属而非金属制成的接触、替代掺杂（用杂质替换晶格中的原子）以及原子层键合（在二维半导体层与金属层之间创建强键），已大幅降低了接触电阻，其性能接近

为原子有序化采取稳健步骤

通过在原子级沉积增量之间交替设置暂停，可以稳定反应室的压力和温度，为金属生长提供稳定的环境。这抑制了在现有晶域上形成新晶核，并防止了可能产生缺陷的局部热积累。这种分步方法促进了金属原子的表面扩散以及小晶域的横向合并，从而产生长程晶体有序性。

与传统硅技术相当 (3–5)。然而，实现电荷载流子稳定地进入 p 型 2D 半导体 [例如二硒化钨 ($\text{WSe}_{2}$)]（其中空穴是主要载流子）仍然较为困难，因为空穴传输对缺陷、界面和周围环境高度敏感。这导致了先进 n 型和 p 型晶体管发展之间的不平衡。

Zhang 等人执行了一种分步工艺，其中金属原子以增量方式沉积在 2D 半导体层上，且在沉积步骤之间设有稳定间隔。该方法抑制了在现有晶域上形成新晶核，从而减少了取向错误晶域的形成。它还最大限度地减少了半导体层中的局部热积累，而这种热积累会导致金属薄膜厚度的变化和结构缺陷。在稳定间隔期间，吸附的金属原子在 2D 表面上扩散，较小的晶域横向合并成较大的晶域（见图）。这些效应促进了晶格平滑的逐层传播。

Zhang 等人的方法实现了多种金属（包括铋、银、铟、金和钯）在 n 型 ($\text{MoS}{2}$) 和 p 型 ($\text{WSe}{2}$) 2D 半导体上的外延生长，是通过界面上的弱范德华相互作用而非强共价或离子键实现的。由此产生的单晶金属接触提供了空间均匀的金属功函数（从其表面移除电子所需的最小能量），防止了电势垒的局部变化。因此，有害且非预期的电子状态（如费米能级钉扎）得到了抑制。金属-半导体界面表现接近于 Schottky–Mott 极限，这是一个理想的理论准则，其中能垒主要由金属功函数和半导体的能级决定。这使得金属接触的行为更具可预测性，允许通过选择金属来控制电荷注入。

Zhang 等人的研究可以将一个主要的工艺瓶颈——2D 半导体的无悬空键表面——重新定义为广泛单晶材料外延生长的模板。传统半导体（如硅）在表面容易形成原生氧化物，或含有面外反应性悬空键，这会使具有不同晶格结构的材料的外延集成变得复杂。相比之下，2D 半导体原子级平坦且无悬空键的表面可以引导晶体生长，而不需要沉积材料与衬底材料之间严格的晶格匹配。这些特性扩展了 2D 半导体作为外延模板的作用，用于集成不同电路组件的多种单晶材料 (6–8)。例如，单晶金属可以保持薄电极电学特性的空间连续性 (9)，而单晶绝缘体可以抑制与晶界相关的电流泄漏和器件击穿路径 (10)。

将 Zhang 等人的方法转化为实际制造仍需要进一步开发。尽管在二维半导体上逐步沉积金属原子能够实现高质量的单晶薄膜生长，但与传统的连续技术相比，重复的稳定间隔可能会增加整体处理时间，从而带来巨大的吞吐量挑战。此外，先进的 3D 器件架构（其电路组件通过垂直堆叠而非平面组装进行集成）需要能够在低温下在器件不同层上共形生长材料的沉积工艺。这是为了确保每种材料都能均匀地覆盖平面、侧壁和复杂几何结构，而不会损坏先前制造的器件层。利用气相化学反应的原子层沉积和化学气相沉积技术非常适合在具有复杂几何结构的基底上共形沉积材料。最近的研究证明，可以使用这些方法在低温下直接在二维表面生长晶体材料 (11–13)。然而，这些方法尚未能同时实现整个器件的均匀单晶生长、与工业加工的兼容性以及在复杂几何结构上的相干集成。Zhang 等人演示的范德华外延有望有助于将二维半导体表面确立为生长多种单晶材料的模板。将这一能力与低温及共形沉积技术进一步结合，可为在先进 3D 器件架构中集成单晶材料提供一条途径。□

参考文献与注释

1. K. S. Kim et al., Nat. Nanotechnol. 19, 895 (2024).

2. Y.Zhanget al., Science 393, 938 (2026).

3. W. Liet al., Nature 613, 274 (2023).

4. J. Jiang et al., Nat. Electron. 7, 545 (2024).

5. L. Gao et al., Science 390, 813 (2025).

6. Y. Cui et al., Science 383, 212 (2024).

7. Z.Zhang et al., Nat. Electron. 9, 367 (2026).

8. B.Zhao et al., Science 388, 1183 (2025).

9. S.J. Kim et al., Nature 603, 434 (2022).

10. D. Zeng et al., Nature 632, 788 (2024).

11. J. Patouillard et al., J. Tech. Sci. Technol. A 42, 050401 (2024).

12. H. Ryu et al., 论文提交至 2026 IEEE / JSAP VLSI 技术与电路研讨会，夏威夷州檀香山，2026年6月14日至18日。

13. M.Yue et al., Nat. Commun. 16, 4018 (2025).

致谢

作者感谢大韩民国贸易、工业及能源部（MOTIE）通过工业技术创新计划（P0028488）提供的支持；美国空军科学研究办公室在 FA9550-22-1-0024 奖项下的支持；以及半导体研究公司（SRC）和美国国防高级研究计划局（DARPA）的支持。

10.1126 / science.aek4631

$^{1}$ 美国马萨诸塞州剑桥市，麻省理工学院电子研究实验室。$^{2}$ 美国马萨诸塞州剑桥市，麻省理工学院机械工程系。$^{3}$ 美国马萨诸塞州剑桥市，麻省理工学院材料科学与工程系。$^{4}$ 美国马萨诸塞州剑桥市，麻省理工学院微系统技术实验室。电子邮件：jeehwan@mit.edu

RNA 疗法

重新思考载荷，重新思考载体

新型转运 RNA 药物需要重新设计的脂质纳米颗粒进行递送

Jacob W. Myerson 和 Drew Weissman

在当前的 疗法领域，转运 （tRNA）占据的份额相对较小。然而，tRNA 的医学潜力在数十年前就已得到认可 $(1)$。这些 通过将 mRNA 序列翻译成氨基酸序列来促进蛋白质合成。基于 疗法的一个目标是纠正破坏蛋白质生产的基因突变。工程化的抑制 可以将 mRNA 中的提前终止密码子翻译成所需的氨基酸，从而恢复其正常翻译为全长蛋白质。对于约 $ 10% 由此类异常终止密码子驱动的遗传疾病，抑制 是一种潜在的医疗解决方案。在本期第 881 页中，Chen 等人 $(2)$ 报道了通过重新工程化 并定制脂质纳米颗粒（LNPs）以递送 ，从而在囊性纤维化的动物和类器官模型中增强抑制 的功效。这些发现

优化 tRNA 与 mRNA 的递送

治疗用途的转运 RNA (tRNA) 与 mRNA 在制备过程中具有截然不同的修饰和序列特征。因此，将这两种类型的 RNA 递送到靶细胞需要不同的脂质纳米颗粒 (LNP) 属性。

是迈向治疗遗传病的 药物的有前景的一步。

Chen 等人基于工程化 纠正无义突变（即使 中的氨基酸代码变为停止蛋白质生产信号的遗传变化）的进展开展研究 (3, 4)。他们专注于在 中添加核苷修饰的方法，这在一定程度上受到了使 药物成为可能的修饰技术的启发 (5)。尽管工程化 疗法面临的免疫系统障碍与 药物不同，但它们可能遵循相同的化学修饰驱动路线图，从而成为成功的药物。作者筛选了核苷甲基化和假尿苷替代。 的 T-loop（一种与核糖体结合的保守序列）中的腺苷甲基化被证明是一种潜在的修饰策略。

囊性纤维化是一种以器官（包括肺部）中黏液积聚为特征的遗传病。囊性纤维化跨膜电导调节因子 (CFTR) 中的无义突变为抑制 提供了具有临床意义的应用场景。虽然 和基因编辑策略也被考虑用于囊性纤维化的治疗 (6)，但编码 CFTR 的 中的提前终止密码子是该病常见的诱因，并且在之前的抑制 原理验证工作中已被作为目标。此前关于利用 纠正 CFTR 的研究报告了在适配 的 LNP 载体或使用病毒载体递送编码 的 DNA 方面取得的成功 (3, 7)。然而，之前的工作并未系统地工程化针对肺上皮细胞（对囊性纤维化健康结果最重要的细胞类型）的靶向 递送。Chen 等人报告的数据旨在填补这一空白。

已被优化用于通过静脉注射和吸入方式将 递送到肺部 (8, 9, 10)。对于吸入递送，一种 - 制剂目前正处于囊性纤维化的 1 期临床试验中 (6)。这些具有前景的肺靶向 似乎是将 递送到肺部的理想选择。然而，将 靶向特定细胞和组织的策略面临着复杂的问题。源自化学库筛选的广泛 制剂尚未在靶向非肝细胞方面取得持久的临床成功 (11)。这引发了人们重新审视将 与靶向配体结合的旧方法的兴趣 (12)。

在筛选方法中，候选靶向 是根据其递送报告基因或示踪货物（如编码荧光酶的 或条形码 DNA $(13)$）的效果，从制剂库中选出的。当通过这种方式识别出靶向 时，结果通常无法揭示候选制剂为何能成功递送到其靶细胞。这种方法本质上无法提供关于 副作用的信息，也无法表明制剂中看似微小的变化是否会对靶向递送产生影响。沿着这一思路，在研究 向肺上皮细胞的递送时，Chen 等人探讨了该方法的一个重要问题： 所携带的 RNA 货物的类型是否是递送成功的一个因素？

Chen 等人采用了标准的基于报告基因的筛选方法，旨在寻找能将 tRNA 递送到培养的人支气管上皮细胞中的 LNP。他们使用了一个 LNP 库，这些 被设计用于携带抑制 tRNA，以恢复带有提前终止密码子的荧光素酶报告基因的活性。然而，他们通过使用报告 mRNA 代替 重复实验，在筛选中引入了一个非标准变量（见图）。其结果为 工程领域提供了一项关键发现。作者发现，封装 mRNA 或 （具有不同形态和功能的分子）在靶细胞中的报告基因活性结果截然不同。他们观察到，在相同的 配方中， 的表现并不能预测抑制 的表现。该研究主要集中在比较可电离脂质，这些 成分被认为在纳米颗粒通过内体室进入细胞后，有助于 RNA 运输到细胞质中 (14)。但研究还分析了报告基因活性与其他 配方特征（包括不同 成分的比例）之间的函数关系。同样， 递送的最佳 特征与 递送并不相关。

报告 的有效递送通常被视为可以预测治疗性 的递送。这种思维基于这样一个模型： 可以将多种不同的 RNA 递送到靶细胞的细胞质中，而 在细胞内的后续功能与递送过程无关 (14)。Chen 等人的发现对这一观点提出了质疑。事实上，在首批获得临床批准的 - 中，可电离脂质 dilinoleyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA) 被证明是将小干扰 递送到肝细胞的最佳选择 (15)，但在用于 疫苗的 中其效果较差。相比之下，Chen 等人所采用的筛选方法可能特别适用于抑制 。在筛选研究中能够克服报告基因提前终止密码子的抑制 ，正是那些能够靶向遗传病中提前终止密码子的 。Chen 等人还展示了先进的 筛选方法在确定最佳递送载体时，如何考虑包括 序列、大小、形态和功能在内的多个变量——可以称之为一种更具“货物意识”的方法。

Chen 等人的结果对数千名囊性纤维化患者具有重要意义。作者报告称，他们的 配方和 设计对培养细胞、携带 CFTR 无义突变的小鼠以及由囊性纤维化患者发育而成的类器官的 CFTR 表达和功能产生了积极影响。将这些效果转化为改善囊性纤维化患者的呼吸功能还需要进一步的工作，包括对副作用的表征，特别是考虑到 Chen 等人在小鼠中以及此前关于吸入式 递送的动物研究中 (8, 9) 都注意到了剂量依赖性炎症。此外，可能的治疗方案可能包括用于挽救异常 CFTR 表达的 和用于增强正常 CFTR 功能的药物，这种组合可能会产生额外的副作用。探索 、药物和 的治疗潜力，可能仍需要重新思考“货物”与“载体”两者。

参考文献与注释

1. T. Anastassiadis, C. Köhrer, J. Biol. Chem. 299, 105246 (2023).

2. J. Chen et al., Science 393, eaeb0054 (2026).

3. S. Albers et al., Nature 618, 842 (2023).

4. S. Albers et al., Nat. Commun. 12, 3850 (2021).

5. K. Karikó et al., Mol. Ther. 16, 1833 (2008).

6. X. Liu et al., Mol. Ther. 34, 2044 (2026).

7. J. Wang et al., Nature 604, 343 (2022).

8. S. Omo-Lamai et al., Nat. Nanotechnol. 20, 1285 (2025).

9. S. Omo-Lamai et al., Nat. Rev. Bioeng. 3, 775 (2025).

10. A. Y. Jiang et al., Nat. Nanotechnol. 19, 364 (2024).

11. T. Anchordoquy et al., ACS Nano 18, 13983 (2024).

12. H. C. Geisler et al., Nat. Protoc. 10.1038 / s41596-025-01330-w (2026).

13. S. Yoo, M. J. Yan Ang, A. M. Murray, M. J. Mitchell, Mater. Today 93, 103176 (2026).

14. S. Chatterjee, E. Kon, P. Sharma, D. Peer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 121, e2307800120 (2024).

15. A. Akinc et al., Nat. Nanotechnol. 14, 1084 (2019).

10.1126 / science.aek3835

微生物学

超越皱纹

皮肤微生物组能否塑造健康老龄化？

Sasan Jalili $^{1,2}$ 和 Julia Oh $^{3,4,5}$

皮肤老化通常被描述为结构性的变化：表皮变薄、皮脂分泌下降、弹性降低、修复速度减慢，以及对刺激、感染和慢性炎症的易感性增加。然而，皮肤不仅是一个老化的组织，也是一个老化的生态系统。皮肤承载着由细菌、真菌、病毒和螨类组成的多元群落，其组成和活动受微环境内在特征（如皮脂、水分、pH值、解剖结构和宿主遗传基因）以及外在因素（如紫外线辐射、污染和生活方式）的影响 (1)。将反映皮肤老化生境改变的微生物变化，与那些积极塑造皮肤屏障韧性、免疫力和组织修复能力的微生物变化区分开来，具有很大挑战性。然而，识别影响这些过程的微生物功能，为通过调节它们来促进健康老龄化开启了可能性。

老年人的皮肤微生物组会发生显著变化。老化的特征包括：痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）的缺失，这种微生物有助于皮肤表面的酸化、抗菌肽的产生以及脂质代谢；皮肤微生物群落的稳定性降低且异质性增加，这可能会降低其韧性；以及在某些条件下可能变得有害或为更强毒性物种铺路的微生物增加 (2)。例如，医院获得性表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）菌株可以作为更危险的金黄色葡萄球菌（S. aureus）耐药基因的储存库。值得注意的是，这些变化与个体的实际年龄相关性较低，而与“衰弱性老化”（即更能反映其生物学年龄的身体和认知缺陷的累积）的相关性更高。然而，在缺乏功能性数据的情况下，此类微生物模式最好被视为生物学年龄的生物标志物，而非驱动老化过程的因果因素。

尽管针对老年人群体的研究主要识别的是微生物特征与老化之间的关联，但在年轻或患病皮肤、动物模型以及体外系统中的实验已提供了佐证性的机制证据，证明皮肤微生物能够调节随年龄增长而恶化的过程（见图）。这些过程包括表皮分化、脂质稳态、皮肤屏障修复、训练免疫细胞以对微生物做出适当反应以及炎症的消退。因此，皮肤老化可能是由屏障衰退、免疫重塑以及皮肤微生物组组成和功能变化之间的持续交互作用所塑造的。

几种细菌和真菌在人类和小鼠中能增强皮肤屏障，要么是通过产生支持性脂质直接实现，要么是通过调节细胞信号通路间接实现。例如，表皮葡萄球菌菌株产生鞘磷脂酶，可增加小鼠体内保护性神经酰胺的含量，从而减少受损皮肤表皮的水分流失 (3)。此外，痤疮丙酸杆菌产生短链脂肪酸，通过人类中的过氧化物酶体增殖物激活受体 alpha 信号传导刺激表皮脂质的合成

皮肤衰老

随着年龄的增长，皮肤作为保护屏障的功能作用会减弱，因为其外层变得更加干燥，神经酰胺流失，且 pH 值由酸性变为中性。这种环境的变化影响了皮肤结构，并降低了有益微生物（如表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis 和痤疮丙酸杆菌 Cutibacterium acnes）的主导地位，而这些微生物参与了神经酰胺和皮脂等脂质的合成。这也增加了感染金黄色葡萄球菌 S. aureus 等病原体以及医院获得性微生物菌株的可能性。在年轻皮肤的真皮深层，调节性 T ($T_{reg}$) 细胞促进免疫耐受，而黏膜相关不变性 T (MAIT) 细胞支持组织修复。然而，在衰老皮肤中，衰老成纤维细胞会招募炎症性单核细胞，从而抑制局部抗原特异性 T 细胞的活性。这种免疫功能的重塑导致了慢性炎症，并降低了组织修复能力和抗微生物防御能力。

培养的人类皮肤（角质形成细胞）以及皮肤屏障功能的小鼠模型 (4)。值得注意的是，在小鼠和三维 (3D) 重建的人类皮肤中，某些细菌和马拉色菌 (Malassezia) 通过产生源自氨基酸色氨酸的代谢物来增强皮肤屏障，这些代谢物可与芳香烃受体结合并刺激下游信号传导 (5)。此外，在衰老皮肤中数量和质量均有所下降的皮脂，是微生物的营养底物，可被痤疮丙酸杆菌和马拉色菌代谢为氧脂素 (oxylipins) 和其他脂质衍生分子。尽管在健康的皮肤屏障环境中，它们可能支持皮肤稳态，但针对天然和重建人类皮肤的研究表明，这些脂质还会促进白细胞介素-1β (IL-1β) 和 IL-6 等炎症信号的产生 (6)。更广泛地说，皮肤中皮脂和屏障脂质的组成及丰度随年龄而产生的变化，可能不仅仅导致微生物群落的不同；它们还可能在微生物与宿主之间创建新的代谢相互作用，从而影响炎症。这种代谢重构在老年皮肤中可能尤为重要，因为老年皮肤的特点是脂质组成改变、脂质丰度降低、屏障干燥以及低度炎症。因此，与单纯的微生物组成相比，微生物活动的各种功能输出（如脂质代谢物、免疫介质或修复反应）可能是与微生物组相关的衰老更具信息量的指标。

接触共生微生物会对皮肤免疫产生长期影响，尤其是在生命早期。例如，表皮葡萄球菌可激活皮肤免疫信号通路，并塑造先天防御和适应性耐受机制 (7)。此外，共生细菌产生的核黄素驱动了新生小鼠皮肤中黏膜相关不变性 T 细胞的积累，这些细胞在成年后期的组织修复中提供支持 (8)。这些微生物还可以激活树突状细胞，促进产生 IL-17A 的 T 细胞和 CD8+ T 细胞的招募，并通过激活调节性 T 细胞来增强宿主对其存在的耐受性 (8)。真菌和细菌还可以影响皮肤对损伤或感染的免疫反应速度。

例如，马拉色菌（Malassezia）可以激活小鼠皮肤中的 IL-23 和 IL-17 通路，并刺激人类皮肤中产生马拉色菌特异性的 CCR6$^{+}$ 记忆 T 辅助 17 细胞 (9)。重要的是，皮肤免疫的微生物编程主要在生命早期或非衰老皮肤中被记录。然而，对衰老皮肤中免疫细胞亚群和炎症介质的调查显示，免疫细胞耗竭和衰老、炎症以及免疫反应受损的情况有所增加。即使是衰老人类皮肤中的轻微皮肤损伤，也可能触发强烈的免疫反应，其中衰老的成纤维细胞会招募炎症单核细胞，后者通过产生前列腺素 E2 来抑制局部的抗原特异性 T 细胞活性 (10)。与年轻皮肤相比，在衰老的小鼠和人类皮肤中还观察到真皮树突状细胞的频率和功能存在差异、T 细胞耗竭和衰老增加、调节性 T 细胞的反应性降低，以及朗格汉斯细胞的绝对数量减少 (10, 11)。这些发现支持这样一种模型：即改变的微生物暴露及其功能与年龄相关的免疫重塑相互作用，使皮肤从修复和耐受过程转向慢性炎症，尽管在人类皮肤中尚未证明其因果联系，且时间关联的证据不足以建立因果关系。

若干技术限制阻碍了衰老皮肤微生物组研究的开展。目前缺乏能够兼顾宿主衰老和年龄相关微生物变化多样性的皮肤模型。衰老动物模型提供了整体生物体的语境。然而，小鼠皮肤在架构、毛囊及皮脂腺和汗腺的结构与分布、皮脂的丰度和组成、常驻微生物，以及免疫细胞的组成和空间分布方面与人类皮肤存在差异，在衰老个体中尤为明显。此外，在小鼠模型中对多种微生物组合进行系统测试十分困难，因为每种组合都需要独立的动物队列和纵向监测。因此，具有人类相关性的体外系统至关重要。2D 模型能够同时测试许多微生物相互作用，但缺乏生物皮肤的空间组织结构。3D 皮肤模型（如重建的人类表皮、皮肤类器官和器官芯片）可能使在同一平台上研究微生物生存、皮肤屏障生理学、免疫相互作用以及衰老相关的宿主状态成为可能。然而，现有模型必须得到改进，以更好地捕捉皮肤屏障、基质和免疫生物学，并复制类似于生物皮肤的皮肤微生物群和营养微环境。此外，人类皮肤模型在替代衰老组织方面并不完美，因为供体细胞通常来源于非衰老皮肤，且许多模型是在高湿度培养条件下生成的，这可能无法还原老年皮肤干燥、脂质改变、pH 值偏移且屏障受损的栖息环境。值得注意的是，一种利用交联水凝胶和非活细胞表皮细胞来模拟角质层（皮肤最外层且营养匮乏的层）的模型，支持了人类皮肤微生物群以及痤疮丙酸杆菌（C. acnes）等难以培养的生物体的稳定定植 (12)。

采样问题也可能影响该领域研究结果的解读。虽然皮肤拭子是一种常用的技术，且适用于纵向分析，但从皮肤表面回收的细菌 DNA 可能无法代表生活在毛囊、皮肤内陷、皮脂腺、汗腺以及其他深层微生态位中的生物 $(13)$。活检可以捕捉完整的皮肤微生物组，但具有侵入性，且难以在老年人身上重复进行。为了定义微生物和免疫变化的时间序列，并识别皮肤衰退或韧性的早期变化，需要能够回收组织间液、细胞因子和免疫细胞的微创平台。由于老年皮肤的皮脂和水分含量低于年轻皮肤，对其进行采样时可能特别容易受到外部微生物物质或来自死亡或非活性原生皮肤微生物 DNA 的污染，或者受到卫生习惯、局部产品和药物使用，以及长期护理或医院环境中特定微生物菌株暴露的干扰。此外，还必须考虑皮肤衰老在种族和人群水平上的差异，以及老年人皮肤中更常见的病毒的影响。而且，由表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、痤疮丙酸杆菌（C. acnes）或马拉色菌（Malassezia）等生物诱导的许多宿主反应具有明显的菌株或物种特异性 $(7-9)$。例如，表皮葡萄球菌的共生变体与医疗保健环境相关的变体在屏障保护、促炎或抗菌耐药潜力方面可能存在显著差异。因此，医院获得性谱系可能既是生物标志物，也是衰弱性衰老的潜在风险因素。总体而言，衰老皮肤微生物组研究的进展需要：严格的阴性对照；对微生物载量和活力的评估；扩大在人类群体中的采样；功能性多组学分析（包括用于识别活性微生物程序的元转录组学、用于测量微生物和宿主来源代谢物的代谢组学，以及用于在特定皮肤生态位中定位这些活动的空间分析）；以及能够更好地模拟衰老皮肤生态系统的模型。

表观遗传调控控制着包括皮肤在内的各组织中与年龄相关的基因表达程序，它导致了细胞衰老、慢性炎症和代谢失衡。对经抗生素处理和无菌小鼠的分析显示，肠道上皮细胞的染色质景观发生了深度重塑 (14)。此外，短链脂肪酸等微生物产物被认为与组蛋白乙酰化以及调节性 T 细胞、巨噬细胞、CD8$^{+}$ 细胞毒性 T 淋巴细胞和 B 细胞的分化与功能改变有关 (15)。如果在皮肤中发现类似的微生物组依赖性过程，那么与其他器官相比，操纵皮肤微生物组和表观基因组的相对便捷性，可能会使其成为提高衰老过程中皮肤韧性的极具吸引力的治疗靶点。

皮肤衰老的特征是细胞的积累，这些细胞经历了细胞周期停滞，并转化为衰老相关分泌表型，从而促进慢性炎症和组织功能障碍。尽管细胞衰老通常被视为一种细胞内在过程，但微生物可以通过影响细胞信号传导和染色质状态的代谢产物（如丙酸和丁酸）直接调节肠上皮，并可通过炎症和代谢压力间接调节 $(14, 15)$。在衰老皮肤中，衰老角质形成细胞、成纤维细胞和免疫细胞的积累导致了 DNA 损伤反应、表观遗传重塑、慢性炎症的变化，以及表皮干细胞和祖细胞在受损后重新填充皮肤的能力下降。这些过程改变了皮肤环境，影响其微生物组成以及宿主与微生物的相互作用 $(10, 11)$。要理解这种双向相互作用，需要建立能够整合年龄相关细胞状态的模型（例如来自老年个体的细胞，或正常皮肤细胞与衰老皮肤细胞的特定混合物），同时允许接触选定的微生物或微生物产物。

皮肤衰老涉及一个动态生态系统的重组，其中宿主驱动的变化重塑了微生物群落的组成，而微生物功能则影响组织的衰退。这种理解能否指导旨在提高皮肤随年龄增长而增强韧性的干预措施？此类干预措施可能包括以微生物为中心的方法——例如应用益生菌、工程微生物，或特定的微生物菌株或多物种群落——或者以栖息地为中心的方法，旨在修复皮肤屏障脂质和炎症 (1)。最有效的策略可能会将这两种方法结合起来，因为除非有皮肤环境中适当的营养物质、pH 值、屏障状态或物理生态位支持，否则外源性微生物菌株将无法植入；而且，改善皮肤栖息地也可以促进有益微生物种群的恢复。此类策略的临床转化必须克服几个障碍：微生物组具有高度的个体化和身体部位特异性；活体生物治疗产品的生产面临复杂的监管和制造挑战；用于破坏微生物组的外用产品或递送载体可能会产生有害影响。此类干预措施的成功必须根据衰老相关特征的功能改善来评判，例如降低对感染和皮肤病的易感性、减轻瘙痒或皮肤干燥、改善皮肤修复反应、在分子水平上恢复屏障功能，以及降低炎症介质的浓度。

参考文献与注释

1. J. Oh, A. Y. Voigt, Nat. Rev. Microbiol. 23, 771 (2025).

2. P.J. Larson et al., Nat. Aging 2, 941 (2022).

3. Y. Zheng et al., Cell Host Microbe 30, 301 (2022).

4. S. Almoughrabie et al., Sci. Adv. 9, 33 (2023).

5. E. Gushiken-Ibañez et al., Nat. Microbiol. 11, 1934 (2026).

6. M. P. Pagac et al., npj Biofilms Microbiomes 11, 13 (2025).

7. S. Naik et al., Nature 520, 104 (2015).

8. M. G. Constantinides et al., Science 366, eaax6624 (2022).

9. F. Sparber et al., Cell Host Microbe 25, 389 (2019).

10. E. S. Chambers et al., Nat. Aging 1, 101 (2021).

11. S. M. Pilkington et al., Immunology 153, 60 (2018).

12. P. Wang et al., Nat. Commun. 16, 3085 (2025).

13. E. M. Acosta et al., eLife 12, e87192 (2023).

14. L.A. Gates et al., Nat. Metab. 6, 697 (2024).

15. K.A. Krautkramer et al., Mol. Cell 64, 982 (2016).

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）的支持（资助号 U01-AG084765-02, P30AG067988, R56AG060745, DP2GM12689, 7R01AR083742, 以及 1R21AR084297-01A1）。

10.1126 / science.aeh4348

医学

镰状细胞病的历史与未来

有前景的新基因疗法已经到来，但现在宣称医疗胜利还为时过早

Adrian Woolfson

Kevin Davies Belknap Press, 2026. 352 页。

《弯曲的空气》（CURVED AIR） / 1874年，西非医生詹姆斯·阿非利卡努斯·比尔·霍顿（James Africanus Beale Horton）描述了一些患者，他们患有发烧，且在雨季期间会加剧复发性疼痛危机，并伴有血液异常，这些症状在今天会被认定为与镰状细胞病（SCD）一致。他的观察开启了一段旅程，使这种疾病从临床描述转向分子解释，并最终走向基因组干预。

SCD患者体内畸形的红细胞会堵塞微小血管，减少向组织的氧气输送，并引发极其痛苦的血管闭塞危机。缺氧会产生一系列病理反应，范围涵盖肺炎、贫血、黄疸，以及无菌性坏死、失明、中风、认知障碍、终末期器官损伤和早逝。SCD在某些族群中更为常见，包括非洲裔人群。根据医疗条件的可用性，预期寿命在 5 岁到 50 岁之间。

在极具力量且令人信服的著作《弯曲的空气》中，遗传学家凯文·戴维斯（Kevin Davies）带领读者快速地——有时甚至是令人心碎地——回顾了SCD的历史和本质，美国化学家莱纳斯·鲍林（Linus Pauling）将其称为“第一种分子疾病”。戴维斯利用SCD来阐明分子遗传医学的显著成就与局限性，同时对美国医疗系统中根深蒂固的偏见、否认、冷漠、刻板印象、无知、不公正和平等缺失进行了严厉的批判。

1949年，鲍林及其同事将SCD从一种血液疾病转变为第一种在分子水平上被理解的疾病，将其起源追溯到携带氧气的血红蛋白分子中一个异常的 $\beta$-珠蛋白亚单位。英国生物化学家弗农·英格拉姆（Vernon Ingram）在1956年证明，这是由于一次突变将带负电的谷氨酸残基变成了不带电的缬氨酸。这使得镰状血红蛋白在脱氧条件下发生聚合，将红细胞扭曲成其特征形状，并诱导它们自组装成棒状纤维。

书中将患者叙事与流行病学、病理学、遗传学和生理学交织在一起。其中包括两名患有SCD的年轻非裔美国女性的记录：维多利亚·格雷（Victoria Gray），她是首位接受CRISPR-Cas9基因编辑细胞疗法Casgevy治疗的患者；以及布里塔尼·海托尔（Brittany Hightower），她死于该疾病的并发症，而这在一定程度上可能是医疗忽视导致的结果。她们的故事与美国奴隶制、优生学以及针对非裔美国人的不道德医疗实验的耻辱历史交织在一起。读者从中了解到，这些虐待行为背后的意识形态依然根深蒂固，并继续影响并延续着整个国家的制度化医疗种族主义。

戴维斯还触及了SCD的社会历史，包括黑豹党共同创始人鲍比·西尔（Bobby Seale）和美国总统理查德·尼克松（Richard Nixon）所采取的干预措施，这些行动提高了人们对该疾病的认识，帮助建立了专门的社区诊所，并促进了家庭检测。他的分析将这种复杂、顽固且具有毁灭性的疾病所伴随的心理创伤、社会病理和个人悲剧置于具体语境之中。

尽管这些疗法疗效显著，但已获批的 SCD 疗法 Casgevy（利用 CRISPR-Cas9 重新激活胎儿血红蛋白的产生）和 Lyfgenia（一种引入抗镰状 $\beta$-球蛋白变体的基因添加疗法）由于其令人咋舌的价格（分别为 220 万 和 310 万），不太可能被超过一小部分符合条件的患者接受。美国许多 SCD 患者面临着贫困、就业不稳定、医疗保险不足以及就医障碍。在非洲，即使是主干药物羟基脲，许多患者也几乎负担不起。

Curved Air 之所以成功，是因为它拒绝将分子层面的掌控等同于医学上的胜利。SCD 的故事提醒我们，如果没有可负担性和相应的社会交付系统，单靠科学突破无法改变全球医疗保健。□

10.1126 / science.aej0154

评论员是美国加利福尼亚州圣迭戈 Genyro 公司的首席执行官兼联合创始人，以及《物种的未来》（On the Future of Species，麻省理工学院出版社，2026）一书的作者。电子邮件：adrianwoolfson@yahoo.com

斯瓦米纳坦领导了变革印度农业的努力。 科学家作为 主题 M. S. 斯瓦米纳坦最著名的成就是领导了印度的绿色革命，该革命在 20 世纪大幅提升了该国的粮食生产能力。本周在《科学》播客中，《M. S. 斯瓦米纳坦：喂养印度的人》的作者 Priyambada Jayakumar 为听众提供了关于这位著名遗传学家的内部视角。10.1126 / science.ael0871

https: / scim.ag / swaminathan

多金属结核作为深海物种（如 Parapagurus 蟹）的基质。结核矿业威胁到这些尚未被充分了解的生态系统。

深海采矿速度超过科学研究与法律制定

国际海底管理局（ISA）由 36 个成员组成的理事会于 2026 年 7 月举行会议，讨论国际监管机制是否已为商业深海采矿做好准备，但会议在未通过开发条例的情况下闭幕。即便这一多边进程尚未完成，它与美国目前的行动形成了鲜明对比——美国正在推进一条单边国内路径，旨在为国家管辖范围以外区域的勘探许可证和商业回收许可提供支持。这种单边做法将削弱“共同继承财产”制度（该制度禁止主张国家主权，并要求和平利用及分享经济利益），而与此同时，新的科学证据正揭示克拉里昂-克利珀顿区（CCZ）的生态重要性，该区域位于太平洋东部和中部，是全球最大的多金属结核勘探区。

CCZ 并非如采矿爱好者所描述的那样是一个空旷或贫瘠的矿产省份。其结核为海绵、珊瑚、海葵、棘皮动物、甲壳类动物以及许多其他底栖生物提供了稀缺的硬质基质。那里已经记录了数千种后生动物，其中大多数尚未被描述 (1)，而移除多金属结核将消除或严重破坏地球上最不被了解的生态系统之一。由于这些栖息地是在地质时间尺度上发育而成的，预计其恢复速度将极其缓慢，甚至可能根本无法恢复。

近期的研究使风险计算更加精准。工业干扰和长期测试轨道表明，结核采矿的影响可能持续数十年，且生物恢复不完全 (2)。羽状流、排放物、污染物和噪音还可能影响底栖和中层水域的食物网 (3, 4)，干扰连接深海栖息地与表层物种 (5) 以及鲸鲨 (6) 和海洋哺乳动物 (7, 8) 迁徙路线的生态过程，甚至可能影响太平洋中部与东部之间的幼体连通性 (9, 10)。此外，深海采矿可能会干扰墨西哥和法国克利珀顿环礁附近相邻海洋保护区的海洋学条件，甚至可能影响附近沿海国家的保护利益。

目前对深海认知的空白意味着，如果政策制定者允许采矿开始，他们将缺乏掌握潜在损害全貌——以及政府可能需要为此负责的潜在破坏——所需的信息。ISA 理事会应将单边发证视为治理失败和生物多样性威胁 (11)。2026 年 7 月，理事会决定延长一家公司子公司的 CCZ 勘探合同，而该公司同时在寻求单边许可，且针对该承包商合规性的调查仍在进行中，这说明该管理局距离采取上述行动还有多远 (12)。在独立证据证明严重损害可以被防止、阈值和停止规则可执行且环境数据公开可用之前，不应推进任何采矿法规、开发合同或商业回收许可。

目前已有 43 个国家支持采矿暂停期 (13)，这并非政治操弄；它是唯一与科学不确定性的规模以及相关生态系统脆弱性相一致的预防性立场。

Alejandro Olivera $^{1}$ , Erick Morales-Montes de Oca $^{2}$ , Viridiana Lázaro $^{3}$ , María Fernanda Méndez-Martínez $^{2}$ , Héctor Reyes-Bonilla $^{2}$

$^{1}$ 美国亚利桑那州图森市，生物多样性中心。 $^{2}$ 墨西哥下加利福尼亚州拉巴斯，下加利福尼亚南大学海洋与海岸科学系。 $^{3}$ 墨西哥墨西哥城，绿色和平组织墨西哥分部。电子邮件：erick4220@gmail.com

参考文献与注释

1. M. Rabone 等，《当代生物学》(Curr. Biol.) 33, 2383 (2023).

2. D.O.B. Jones 等，《自然》(Nature) 642, 112 (2025).

3. M. H. Dowd 等，《自然-通讯》(Nat. Commun.) 16, 9575 (2025).

4. A. G. Glover 等，《当代生物学》(Curr. Biol.) 36, R400 (2026).

5. L. Macheriotou 等，《海洋科学前沿》(Front. Mar. Sci.) 12, 1547803 (2025).

6. H. M. Guzman 等，《海洋生物多样性记录》(Mar. Biodivers. Rec.) 11, 8 (2018).

7. H. Bailey 等，《濒危物种研究》(Endang. Spec. Res.) 10, 93 (2010).

8. J. D. Darling 等，《生物快报》(Biol. Lett.) 18, 20210547 (2022).

9. M. Romero-Torres 等，《科学报告》(Sci. Rep.) 8, 9354 (2018).

10. P.W. Glynn 等（编），《东热带太平洋珊瑚礁》，世界珊瑚礁系列 (Springer, 2017).

11. 国际海底管理局 (ISA)，《关于美国发布释放美国近海关键矿产和资源行政命令的声明》(2025年4月30日).

12. 国际海底管理局 (ISA)，《关于 Nauru Ocean Resources Inc. 申请延长多金属结核勘查合同的决定草案》(2026年7月10日).

13. 国际海底管理局大会第 31 届会议发言，牙买加金斯顿 (2026年7月27日至31日).

沙漠洪水凸显气候变化适应中的关键缺口

2026年6月，塔克拉玛干沙漠南缘经历了一次前所未有的极端降水事件，引发了突然且严重的洪水 (1)。沙漠洪水现象挑战了人们对极干旱地区水文过程的传统认知，在这些地区，洪水事件传统上被认为是罕见的。然而，这种认知正日益受到观测证据的挑战。

研究表明，自 1960 年以来，塔克拉玛干沙漠的极端洪水范围大幅扩张，这与极端降水的增强相关 (2–4)。在全球范围内，干旱和半干旱地区的洪水灾害也迅速增加 (5–7)。

在《巴黎协定》的全球适应目标 (GGA) 下，优先事项在很大程度上仍集中在已知的气候风险上，如热浪、海平面上升、长期干旱和沿海洪水，而极干旱地区山洪等新兴风险尚未得到足够关注。治理优先级与不断演变的水文现实之间的这种不匹配，进一步放大了这些地区社会生态系统的脆弱性。更重要的是，它揭示了全球气候治理中空间不公平的根本问题：干旱地区通常以水资源短缺和生态脆弱为特征，且并非温室气体的主要排放源，但却在经历由全球变暖驱动的日益剧烈的气候极端事件 (8)。这种低排放与高暴露之间的不对称，使干旱地区成为气候风险溢出最显著的区域之一 (9)。

为了填补这一适应缺口，有必要完善干旱地区气候风险的概念框架。应修正将绿洲系统视为非易涝区的传统认知，转而将其认定为具有高水文气候变率特征的生态系统，其关键特征包括干旱与洪水极值的共存，以及由冰川融水与极端降水耦合驱动的复合型灾害。应在山地冰冻圈区域、河流流域及下游绿洲系统之间建立一个综合监测和预警系统，以探测和监测复合洪水风险的完整演变过程。最后，干旱地区的洪水灾害应被明确纳入全球适应目标和气候融资机制中，包括 GGA 和损失与损害框架。

高继希 $^{1}$ , 李海东 $^{2}$ , 赵立军 $^{2,3}$ , 托力乌布别克·迪林努尔 $^{4,5}$ , 李英奎 $^{6}$ , 邵亚梅 $^{3}$

$^{1}$ 中国生态环境部生态环境卫星应用中心，北京，中国。$^{2}$ 南京林业大学林业与草业学院及土壤与水保学院，南京，中国。$^{3}$ 中国生态环境部南京环境科学研究所，南京，中国。$^{4}$ 中国气象局沙漠气象研究所，乌鲁木齐，中国。$^{5}$ 中国气象局年轮物理化学研究重点实验室，乌鲁木齐，中国。$^{6}$ 田纳西大学地理与可持续发展系，诺克斯维尔，田纳西州，美国。电子邮箱：shaoyamei@nies.org

参考文献与注释

1. “China warns of risk of ‘extreme floods’ in desert regions,” 路透社, 2026年06月11日; https: / www.reuters.com / business / environment / china-warns-risk-extreme-floods-desert-regions-2026-06-12.

2. W. Dong et al., Nat. Commun. 15, 4379 (2024).

3. Y. Suet al., J. Earth Sci. 36, 1351 (2025).

4. S. Tang, T. Zhou, L. Zhang, Weather Clim. Extrem. 46, 100739 (2024).

5. J. Yin et al., Nature 615, 212 (2023).

6. J. Feng et al., Int. J. Appl. Earth Obs. Geoinf. 139, 104511 (2025).

7. 政府间气候变化专门委员会 (IPCC), "第六次评估报告 (AR6)" (IPCC, 2021–2023)

8. S. Schöngart et al. Nat. Clim. Chang. 15, 627 (2025).

9. H. Li et al., Assessment of Climate Change and the Effectiveness of Ecological Protection and Restoration in Vulnerable Regions (中国环境出版社, 2019).

为苏丹战火蹂躏的奥贝德市寻求公共卫生支持的恳求

一场持续的公共卫生危机正在苏丹北科尔多凡州的首府奥贝德市（El Obeid）展开。在那里，苏丹武装部队（SAF）与准军事组织快速支援部队（RSF）之间旷日持久的代理人战争已导致平民伤亡、基础设施崩溃以及大规模流离失所，进而导致避难场所过度拥挤，增加了传染病爆发的风险。这场卫生危机将不会遵循传统疾病爆发的路径，因为它与同时发生的严重人道主义和人权侵害交织在一起，情况极其复杂 (1)。

与苏丹许多城市一样，奥贝德市一直承受着巨大的压力。医院和诊所的人员配备有限，药品短缺，且基础设施受损 (1, 2)。产妇护理、儿科治疗和慢性病管理等基本服务已变得难以获得。清洁饮水和卫生问题增加了霍乱、腹泻性疾病、登革热、疟疾和呼吸道感染等可预防疾病的风险 (3)。

当地的医生、护士和社区工作者继续利用现有的一切资源治疗患者，他们经常长途跋涉以接触到农村地区的家庭。苏丹红新月会、苏丹美国医师协会以及紧急响应室等社区团体也采取了行动，组织健康意识宣传活动并支持弱势家庭。

包括联合国（UN）、世界卫生组织和无国界医生组织在内的多国实体正向该市提供关键援助，但军事封锁、崩溃的基础设施和资金短缺危及了遏制这场灾难的努力。奥贝德市目前最需要的是可靠的医疗用品来源、安全饮用水以及针对当地卫生工作者的专业培训，特别是关于改善初级卫生保健方面，以防止小问题演变成紧急情况。这些资源应通过协调伙伴关系交付：苏丹卫生部和北科尔多凡州卫生当局必须主导规划与监督；联合国机构和非政府组织应致力于通过中立的协调平台协商货物和资金的人道主义准入；私营部门的物流合作伙伴和药品供应商应专注于供应链采购和仓储；社区卫生委员会和当地培训机构必须继续开展社区外展和劳动力培训工作。

奥贝德市一直具有韧性。只要获得正确的支持，其卫生系统就能恢复，并确保苏丹人民能够获得有尊严的充足护理。

Emmanuel Edwar Siddig

苏丹喀土穆，喀土穆大学。电子邮箱：emanwelleds389@gmail.com

参考文献与注释

1. 联合国，“苏丹：安全理事会警告奥贝德市存在大规模暴行风险”，联合国新闻 2026年6月20日；https: / news.un.org / en / story / 2026 / 06 / 1167773 (访问日期 2026年6月22日)。

2. 国际计划组织，“对苏丹奥贝德市面临攻击威胁发出警报”，Reliefweb 2026年6月19日；https: / reliefweb.int / report / sudan / raising-alarm-over-threat-attack-el-obeid-sudan (访问日期 2026年6月22日)。

3. 半岛电视台工作人员与路透社，“至少 29 个国家对苏丹奥贝德市的暴行发出警报”，半岛电视台 2026年6月18日；https: / www.aljazeera.com / news / 2026 / 6 / 18 / dozens-of-countries-warn-of-atrocities-amid-escalation-in-sudans-el-obeid (访问日期 2026年6月22日)。

监管影响

修正 2026 年美国车辆排放标准回撤背后的逻辑

对选择性假设和证据解释不一致的修正将推翻该政策的正当性

Antonio M. Bento $^{1,2}$ , Kenneth T. Gillingham $^{3,2}$ , Mark R. Jacobsen $^{4,2}$ , Christopher R. Knittel $^{5,2}$ , Benjamin Leard $^{6,7}$ , Joshua Linn $^{7,8}$ , David S. Rapson $^{9}$ , James M. Sallee $^{10,2}$ , Arthur A. van Benthem $^{11,2}$ , Kate S. Whitefoot $^{12}$

车辆排放和燃油经济性标准——该领域最重要的政策——自 2000. 年以来在美国经历了剧烈波动。布什政府时期标准的适度收紧在奥巴马时期得到了加速，在第一任特朗普政府时期被部分回撤，随后在拜登时期被恢复并进一步收紧。然而，现任特朗普政府采取了更激进的措施，完全取消了美国环境保护局（EPA）针对车辆的温室气体（GHG）标准。根据行政命令的要求，这些监管波动均声称得到了正式成本效益分析的支持。然而，截然相反的结论并非源于证据的演变，而是源于选择性的假设以及对关键证据的不一致解释。我们讨论了如何正确解释和应用现有证据，并证明修正这些错误将推翻取消 EPA 温室气体标准的正当性。

轻型车辆占美国交通温室气体排放量的一半以上，占总排放量的 16% (1)。我们关注的重点是 EPA 法规，它监管温室气体排放，而美国交通部（DOT）则单独监管燃油经济性。现任政府将 DOT 法规的处罚金降至零，并提出了一项不太可能对工业产生约束力的弱化版本，这在事实上使市场处于没有有效监管的状态。第二任特朗普政府近期对 EPA 标准的回撤已于 2026 年 4 月生效，且肯定会在法庭上引发争议；如果在分析中存在错误，且这些错误削弱了该机构为撤销标准所陈述的正当性，可能会产生法律漏洞。

在近期的成本效益分析中存在两项关键变化。一项是 EPA 决定忽略温室气体标准的环境效益，根据对 2024 年标准的分析，这消除了减少温室气体和协同污染物所带来的 $1.8 万亿美元的效益。这一变化是透明的，且已被广泛批评。但还存在第二项关键变化，其量级与第一项相当，但透明度较低且更难以评估。这一变化涉及消费者如何衡量燃料节省和车辆属性的价值。无论是消除环境效益还是改变估值方式，单独一项就足以反转此次回撤是否具有正向净效益。由于估值变化量级巨大且受关注相对较少，我们将其作为重点，但我们也认可两者的重要性。

估值问题的核心在于，研究一致表明，新车买家愿意支付的额外费用不足 $1，以换取 $1 的燃油节省折扣 (2–8) [见补充材料 (SM) A]。这一发现有多种解读方式，例如它可能反映了某种行为偏差，意味着低估值是一个错误；或者反映了如果以牺牲其他车辆属性为代价来提高车辆效率，则会产生隐藏成本。成本效益分析取决于这些不同机制的相对重要性。在属性恶化导致隐藏成本的情况下，我们展示了消费者的损失将如何同样体现在生产者的技术成本节省中。过去的政府在如何处理估值问题上在两个极端之间摇摆，有时并没有给出明确的解释。当一个机构在这个问题上做出战略选择时，可能会大幅改变分析结果。我们展示了最近的一次变动如何从车辆温室气体（GHG）排放监管中削减了数十亿美元的收益。

我们提供了一个框架，能够一致且透明地将关于消费者估值的实证研究映射到成本效益分析中（见 SM B）。我们将该框架应用于美国环保署（EPA）2026年的监管影响分析（RIA），该分析强调了一种采取极端立场的方案，即每 $1 的燃油节省仅计入 $0.22 的收益 (9)。我们证明，这一立场以及拜登政府时期 EPA 所采取的方法，都是基于对证据的误读。

消费者估值值得关注，原因有几点。首先，它是关键性的：正确的处理方式将推翻现任政府的分析。相比之下，它对拜登 era 2024 的分析影响较小。其次，它被错误处理了：近期多届政府在建模上出现错误，或误用了现有的实证证据，导致政策剧烈波动，从而使行业的长期投资陷入瘫痪。最后，它是不透明的：与汽油价格或每吨碳排放成本等透明参数不同，燃油节省估值的处理方式一直埋没在分析的混乱之中。我们的框架带来了必要的清晰度。该框架同样适用于美国能源部颁布的能源效率标准，因为那里也出现了相同的估值问题。

一个关于消费者如何衡量燃料节省与车辆属性价值的框架

理解价值评估的起点是这样一个问题：相对于基准车辆，消费者愿意为一台能节省 $1 燃料成本（应用折现率将未来成本转化为现值）的车辆多支付多少钱？消费者愿意支付的金额可能低于 $1，原因有两点。首先，由于注意力不足、对未来燃料使用量或价格的误解、相对于未来的当下偏好、其他认知偏差或信贷限制，消费者可能会系统性地低估燃料节省的价值。其次，可能存在属性权衡：为了降低车辆成本，制造商可能会选择那些虽然节省燃料但会损害其他属性（如重量、性能、舒适度等）的设计。我们的框架（见 SM B）展示了每一美元的燃料节省如何分解为三个必须总和为 1 的组成部分：(i) 对高燃油效率车辆的支付意愿；(ii) 导致燃料节省价值被低估的注意力不足或其他行为偏差；以及 (iii) 降低消费者效用的属性权衡（“隐藏成本”）。

在一种极端情况下，假设汽车制造商通过部署一项不改变车辆任何其他属性的节能技术来响应监管，且消费者完全关注燃料成本且没有任何偏差。在这种情况下，消费者会将 $1 的节省视为 $1. 的价值。但在现实中，许多燃油效率的提升都会影响车辆的其他属性，根据具体技术的不同，这种影响可能是负面的或正面的 (10)。经济证据还表明，许多买家对未来节省额的价值评估并不完善 (2–8)。因此，在现实中，我们预计消费者每 $1 的燃料节省所愿意支付的金额将低于 $1，且其中的差距将是注意力不足（或其他偏差）与隐藏成本的结合。但从逻辑上讲，这些组成部分之和为 1。以往的监管分析对这些组成部分的假设并不一致，且往往是隐含的。使用一种明确的分解方法——且每个组成部分都有可靠证据支持并被约束为总和为 1——将大大提高分析的透明度。

2026年EPA分析中的估值

美国环保署（EPA）2026年的监管影响分析（RIA）得出结论，取消车辆温室气体标准将使美国福利增加 $600 至 7900 亿美元 billion (9)。这一结论基于一种有问题的估值方法以及相关的技术成本。我们将早先支持更严格标准的 2024 年 EPA 分析以及 2026 年的分析，共同映射到我们的估值框架中 (10, 11)。我们揭示了这两项分析中与经验证据相悖的隐含假设。

近期这两项 EPA 分析均假设购车者需要 2.5 年的回收期，因此在效益计算中仅计入前 2.5 年的燃料节省。这意味着对于 $1 的燃料节省，其支付意愿为 $0.21 至 $0.25（见 SM A.1）。2026 年的 RIA 引入了一种不存在未来燃料节省低估的场景。因此，EPA 假设剩余的 $0.75 至 $0.79 代表了隐藏的属性权衡。如下文所述，这些假设与绝大多数现有证据相矛盾。同样，尽管行业惯例也引用类似的 2.5 年回收期，但汽车制造商通常将剩余部分归因于低估而非属性权衡——这与 2026 年 的假设相反。相比之下，2024 年的分析假设不存在隐藏的属性权衡，将全部剩余部分归因于注意力不足。

当前成本效益分析中的估值假设还造成了内部逻辑的不一致：2024 年和 2026 年的 均使用既定方法估算技术成本，这些方法假设节能技术在保持其他属性（重量、性能、舒适度等）不变的情况下实现。然而，2026 年的 同时假设存在产生隐藏成本的大规模属性权衡。如果汽车制造商是通过牺牲性能或重量而非部署新技术来实现燃油经济性，那么成本将远低于 2026 年 的估算值 (SM A.3)。

可用的经验估算

消费者仅重视 2.5 年节省额的假设缺乏经验依据（见 SM A.1）。学术文献要么估算低估程度，要么估算属性权衡，并利用这些数据来推断支付意愿。我们尚未发现有任何可靠的研究在涉及权衡的监管语境下直接估算支付意愿。尽管如此，在缺乏直接估算的情况下，我们接受 隐含的 $0.21 至 $0.25 的支付意愿作为我们的起点。

2026 年 关于未来燃料节省不存在低估的假设，与近期高质量研究的文献综述不一致，这些研究发现了显著的低估现象 (2–8)。该分析进一步。

撤销标准的货币化影响

数值以 2024 年的十亿美元计算。第 2 至 4 列反映了对第 1 列中美国环境保护局（EPA）数值的调整。在 3% 的折现率下，所有调整后的净收益综合变化为 $1.46 万亿美元。标准带来的污染治理收益未包含在内。

< / td><>2026 EPA 情景 (A3) (1)< / ><>调整：反弹 (2)< / ><>调整：燃料节省分摊 (3)< / ><>调整：技术成本 (4)< / >< / tr><>< colspan="5">3% 折现率< / >< / ><><>节省额< / ><>1290< / ><>748< / >< / ><><>成本< / ><>500< / ><>734< / ><>1418< / >< / ><><>净节省额< / ><>790< / ><>556< / ><>-128< / ><>-670< / >< / ><>< colspan="5">7% 折现率< / >< / ><><>节省额< / ><>850< / ><>493< / >< / ><><>成本< / ><>240< / ><>365< / ><>732< / >< / ><><>净节省额< / ><>600< / ><>485< / ><>118< / ><>-239< / >< / table>

此外，通过对未来收益采用高折现率并忽略某些研究中存在的近似偏差，进一步扭曲了结果。我们的文献综述（见 SM A.1 和表 S2）解决了这些问题，并指出注意力不集中（或其他行为偏差）在 $0.54 和 $0.62 之间。

关于属性权衡，监管影响分析（RIA）强调从汽油车向电动车的过渡是消费者的重要负担，但现有的实证证据表明，他们面临的成本要小得多。最近的一项研究估计，与传统的汽油车相比，纯电动汽车（EV）的属性权衡在电动车燃料成本节省额的每 1 美元中占 $0.17 至 $0.31，且随着电动车续航里程的提高而随时间下降 (12)。此外，这些是上限：消费者无需选择在没有监管的情况下原本会购买的车辆的纯电版本，并且只有在他们认为其他技术（例如混合动力）或其他车辆价值更高时才会切换。

综合来看，我们建议的三个组成部分——支付意愿、注意力不集中或其他偏差以及属性权衡——的范围分别为 21% 至 25%、54% 至 62% 以及 17% 至 31%。尽管是分别确定的，但这些范围的中点之和几乎正好等于 100%。对于今年，我们建议 EPA 在消费者估值、注意力不集中或其他偏差以及属性权衡方面分别使用 $0.22、$0.55 和 $0.23。属性权衡的数值应随时间下降。2024 年和 2026 年的估算都将 $0.22 归因于支付意愿，我们的估算也是如此。然而，2024 年的估算将 $0.78 归因于注意力不集中，$0 归因于权衡；而 2026 年的估算将 $0 归因于注意力不集中，$0.78 归因于权衡。与之前那些 EPA 分析形成鲜明对比的是，我们的估算将 $0.23 归因于权衡，$0.55 归因于注意力不集中

(图 S1) (10, 11)。

燃料价格、驾驶行为变化与电动汽车

除了估值之外，我们对监管分析还存在其他实质性的担忧。2026年规则在燃料价格方面采用了不对称的假设，它在呈现2025年《年度能源展望》中的中心燃料价格预测的同时，提供了一个低价案例，却未提供相应的高价情景——而当前的汽油价格环境已远超中心预测案例。假设低汽油价格将在机械层面且不切实际地降低燃油经济性提升所带来的收益 (SM A.2)。

2026年的监管影响分析（RIA）在处理车辆运行成本增加导致驾驶量减少（这与通常所说的“反弹效应”相反）时，还出现了一个会计错误 (13)。具体而言，该分析称，当驾驶成本增加时，消费者的处境反而更好，因为更高的成本促使消费者减少驾驶，从而在减少行程中节省了大量的燃料、维护和修理费用，美国环保署（EPA）估计这一数额约为 $250 亿。然而，根据基本的经济逻辑，消费者对这些损失行程的价值评估至少等同于他们为进行这些行程所愿意支付的费用，因此，这些行程的损失价值必须被计入撤销标准的成本中 (SM A.4)。关于驾驶行为本身变化的幅度（EPA估计在分析期间损失了约 1.4 万亿英里），学术界仍存在争议 (13)，因此我们在此不予探讨。然而，无论估计的驾驶变化如何，成本效益分析必须与消费者选择驾驶的逻辑保持一致。

我们还注意到，2024年和2026年的分析均忽略了电动汽车（EV）普及率提高可能引发的潜在电力分配成本。电动汽车的转型也可能通过平滑电网需求来带来收益。这些成本和收益具有前瞻性，因此难以估算，但我们认为它们可能是巨大的。涉及电动汽车采用标准的分析应当扩大，以涵盖与车辆电动化相关的任何显著系统成本，以及因取消标准而产生的任何与汽油相关的基础设施成本。

[...OMITTED...]

对成本效益评估的总体影响

在应用驾驶行为变化的会计修正、我们提出的低估估算以及相关的技术成本变化后，得出的结论与 2026 年的监管影响分析（RIA）截然不同。从美国环保署（EPA）的全额估值情景 A3 开始（见表格第 1 列），我们首先估计，对驾驶行为变化进行修正会导致撤销 EPA 温室气体（GHG）标准的成本增加 2340 亿美元 billion（见表格第 2 列与第 1 列的对比）。接着，我们应用所提出的燃料节省分摊方案：撤销成本进一步增加 6840 亿美元 billion（见表格第 3 列与第 2 列的对比）。因此，如果我们简单地应用 EPA 自身的模型并进行这些修正，我们会发现 2026 年 EPA 分析的结论被反转了。

最后，2026 年的 RIA 在衡量技术成本时存在逻辑矛盾：它假设制造商在采用燃料节省技术时保持其他属性不变，但与此同时，在估值中又计入了属性权衡所带来的巨大隐藏成本。这种矛盾夸大了 2026 年 RIA 中的技术成本；汽车制造商只有在能够降低合规成本的情况下，才会选择具有隐藏成本的技术。文献中的估算表明，这种矛盾可能会将撤销标准所带来的节省额夸大 42% 或 5420 亿美元 billion（见表格第 4 列与第 3 列的对比）。综合来看，我们得出结论，仅这三项修正就使撤销标准的净收益减少了 1.5万亿美元。

从经济学角度来看，消除环境效益同样存在严重问题，而在 2024 年的分析中，这部分价值被定为 1.8万亿美元。综上所述，我们认为一个更谨慎、更完整的分析几乎肯定会得出与 2026 年 RIA 不同的结论。

车辆的替代政策

对监管的分析通常仅对替代政策进行敷衍的考虑。认真考虑替代方案（这可能会确定以更低成本减少温室气体排放的政策），将成为当前辩论和政策剧烈波动的一个积极结果。

基于燃料消耗或排放因子的新车辆税是企业平均燃料经济度（CAFE）的一种替代方案。无论是以差异化税收的形式，还是以“费率返还”（feebates，将对低效车辆的征税与对高效车辆的返还相结合）的形式，这些工具都能使合规成本透明化——而 CAFE 的成本则隐藏在设计和定价选择中。不透明性在政治原因上可能具有优势，但它允许利益相关者夸大或低估成本，从而造成混乱。基于燃料消耗的税收消除了这种模糊性，解决了性能标准在市场规模方面的已知局限，并且可以在需要时增加财政收入。数十个国家已经成功实施了此类系统。

燃料税或里程税提供了另一种具有显著优势的替代方案。与 CAFE 不同，燃料定价（如碳税的情况）会同时影响车辆选择和驾驶行为，鼓励淘汰旧车，并在调整时立即影响整个车队。相比之下，CAFE 标准需要数十年才能渗透到车辆存量中。主要局限在于，如果消费者在购买车辆时忽略燃料价格，在没有标准的情况下，他们可能会对效率投资不足 $14$。正如我们的审查所示，当对未来燃料节省的低估程度较高时，将燃料税与标准相结合的混合方法可能更为理想。

2026 年的政策回撤基于几个根本性错误。仅修正未来燃料节省估值处理方式中的问题，就足以否定美国环保署（EPA）决定撤销标准的经济合理性。在对其他有问题的假设进行进一步修正时（尤其是分析中遗漏了环境损害），2026 年 EPA 分析中移除标准的理由就显得更加毫无根据。政策的波动性阻碍了汽车制造商的长期投资。尽管政治权力驱动了这些波动，但一致应用的、严谨且透明的成本效益分析可以缓解这种情况。将我们的估值框架应用于处理该问题，可以纠正多个政府任期内的错误，提供分析的一致性，从而有助于改善并稳定政策。

参考文献与注释

1. 美国环保署，交通排放源 (2022); https: / www.epa.gov / ghgemissions / transportation-sector-emissions.

2. H. Allcott, N. Wozny, Rev. Econ. Stat. 96, 779 (2014).

3. M. R. Busse, C. R. Knittel, F. Zettelmeyer, Am. Econ. Rev. 103, 220 (2013).

4. K. T. Gillingham, S. Houde, A. A. van Benthem, Am. . J. . Policy 13, 207 (2021).

5. L. Grigolon, M. Reynaert, F. Verboven, Am. . J. . Policy 10, 193 (2018).

6. B. Leard, J. Linn, Y. C. Zhou, Rev. . Stat. 105, 158 (2023).

7. B. Leard, J. Linn, K. Springel, J. Polit. . Microecon. 10.1086 / 738879 (2025).

8. J. M. Sallee, S. E. West, W. Fan, J. Public . 135, 61 (2016).

9. 美国环保署，《撤销温室气体危害认定及根据〈清洁空气法〉制定的机动车温室气体排放标准》。监管影响分析 (2026); https: / nepis.epa.gov / Exe / ZyPDF.cgi?Dockey=P101HV06.pdf.

10. K. S. Whitefoot, M. L. Fowlie, S. J. Skerlos, Environ. Sci. Technol. 51, 10307 (2017).

11. Fed. Reg. 89, 27842 (2024年4月18日)

12. C. R. Forsythe, K. T. Gillingham, J. J. Michalek, K. S. Whitefoot, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120, e2219396120 (2023).

13. K. Gillingham et al., Rev. Environ. . Policy 10, 68 (2016).

14. A. M. Bento et al., Science 362, 1119 (2018).

致谢

K.T.G. 曾担任加利福尼亚州空气资源委员会关于燃料效率监管相关问题的专家证人。K.T.G. 还曾为丰田研究院（Toyota Research Institute）以及应用环境法与政策中心（Center for Applied Environmental Law and Policy）提供咨询。D.S.R. 曾通过一家经济咨询公司在能源相关事务中担任有偿专家证人；相关实体并未资助本研究，且专家证人活动在分析或结论中未发挥任何作用。所有其他作者声明不存在竞争利益。

补充材料

10.1126 / science.aef0464

$^{1}$ 美国加利福尼亚州洛杉矶，南加州大学普莱斯公共政策学院。$^{2}$ 美国马萨诸塞州剑桥，美国国家经济研究局。$^{3}$ 美国康涅狄格州纽黑文，耶鲁大学环境学院。$^{4}$ 美国加利福尼亚州拉霍亚，加利福尼亚大学圣迭戈分校经济系。$^{5}$ 美国马萨诸塞州剑桥，麻省理工学院斯隆管理学院。$^{6}$ 美国田纳西州诺克斯维尔，田纳西大学经济系。$^{7}$ 美国华盛顿特区，未来资源组织（Resources for the Future）。$^{8}$ 美国马里兰州大学公园，马里兰大学农业与资源经济系。$^{9}$ 美国加利福尼亚州戴维斯，加利福尼亚大学戴维斯分校经济系。$^{10}$ 美国加利福尼亚州伯克利，加利福尼亚大学伯克利分校哈斯商学院。$^{11}$ 美国宾夕法尼亚州费城，宾夕法尼亚大学沃顿商学院。$^{12}$ 美国宾夕法尼亚州匹兹堡，卡内基梅隆大学工程与公共政策系。电子邮件：kenneth.gillingham@yale.edu

研究

发表于《科学》系列期刊

编辑：Michael Funk

海洋学 一角鲸作为海洋传感器

与海洋接触的冰盖边缘融化速率对海洋温度高度敏感，融化增加会导致冰缘后退和海平面上升。然而，进入这些极地地区测量海洋温度在物流上具有挑战性且成本高昂。配备海洋传感器的海豹已被用于监测南极冰盖边缘的水团特性，极大地增强了我们对当地海洋学变化的理解。针对格陵兰岛东部冰封海岸的类似需求，Heide-Jørgensen 等人为六头一角鲸安装了仪器，在 3 年期间收集了超过 2000 次温度测量数据。他们发现，较温暖的中层水现在已深入渗透到东格陵兰峡湾系统中，增强了格陵兰冰盖的潜没融化和冰山排放。—Peter U. Clark Sci. Adv. (2026) 10.1126 / sciadv.adr1424

研究人员为一角鲸配备设备，用于测量格陵兰岛周围难以进入区域的温度。

光电子学 稳定锡钙钛矿发射体

晶格稳定实现了基于 $CsSnI_{3}$ 的高效且稳定的近红外发光 LED 的制备。Bai 等人使用甲胍掺杂以抑制向 $Cs_{2}SnI_{6}$ 的相变，并添加三苯基氧化膦以平衡电子-空穴传输并改善光学性能。这些无铅器件在 963 纳米处的外部量子效率为 21.2%，在每球面度每平方米 7.1 瓦的功率下，运行半衰期为 920 小时。—Phil Szuromi Science p. 882, 10.1126 / science.aeg8955

代谢

为衰竭的心脏注入动力

恩格列净（Empagliflozin）和其他钠-葡萄糖共转运蛋白-2（SGLT2）抑制剂是旨在通过促进尿液中多余葡萄糖的排出，从而降低糖尿病患者血糖的药物。随后人们逐渐发现，无论患者是否患有糖尿病或血糖是否升高，这些药物都能改善心脏功能并保护患者免于心力衰竭。此外，SGLT2 本身在心脏中不表达，因此有益的心脏效应既不能归因于糖尿病控制，也不能归因于在心脏中的靶向作用。Forelli 等人现在证明，除了其经典活性外，SGLT2 抑制剂还能激活泛酸激酶 1（pantothenate kinase 1）——一种心脏代谢的关键酶，从而促进更高效的燃料利用并提高心脏的收缩力。——Yevgeniya Nusinovich

植物遗传学 解决古老的水稻冲突

亚洲稻和非洲稻是仅有的两种驯化水稻物种。亚非杂交稻为提高产量和韧性提供了路径，但面临着杂交不育障碍。He 等人利用全基因组连锁分析，确定了导致这种不相容性的数量性状位点为 RHS3。RHS3 由三个基因 MAO、DUN 和 JIA 组成。MAO 作为一种毒素，影响雄性和雌性配子。在花粉中，DUN 作为一种解毒剂，通过竞争性抑制 的毒性发挥作用；而在雌性配子中，JIA 和 DUN 共同通过自噬作用靶向 进行解毒。研究人员发现了具有功能性解毒剂 DUN 但毒素 功能缺失的水稻品系，这为亚非杂交稻的育种提供了潜在资源。——Unnati Sonawala 和 Madeleine Seale

Science p. 903, 10.1126 / science.aec5252

有机化学 由三个独立部分构建环丙烷

尽管将三个碳原子强行挤入三角形环中具有内在应力，但环丙烷基团足够稳定，可以出现在许多天然产物和药物中。合成它们最常用的方法是将单个活化碳片段添加到二碳烯烃中。Kong 等人现在报道了一种替代的铁催化反应，该反应将三个独立的碳片段（一个酯和两个卡宾）结合在一起，从而在构建环丙基醇时具有更大的通用性。两个偶联步骤似乎都是通过向铁配位配体进行外球加成而进行的。——Jake S. Yeston

Science p. 910, 10.1126 / science.aej0194

妊娠

了解尿路感染（UTIs）

妊娠期间的尿路感染（UTIs）与较高的早产风险相关，但将这两个过程联系起来的机制尚不清楚。Ottinger 等人开发了一种母体尿路感染小鼠模型，表明 T 细胞激活和炎症细胞因子产生与诱发早产相关，而这种表型可以通过向母鼠外源性给予白细胞介素-10 或药理学抑制 T 细胞流出而减轻。为了转化这些发现，作者研究了孕妇体内的尿液细胞因子，并将其与分娩结果和尿培养阳性率联系起来，发现与 T 细胞免疫相关的细胞因子同样与早产相关。总之，这些发现既提供了一个深入研究尿路感染与早产之间联系的模型，也为人类早产提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。 ——Courtney Malo

Sci. Transl. Med. (2026) 10.1126 / scitranslmed.aea1228

计算机工程 实时高光谱视频

与大多数提供详细光谱特征且依赖于庞大、高功耗计算系统及离线处理的高光谱系统不同，Hypervision 是一款独立的可见-近红外高光谱微系统。该系统由 Bian 等人推出，围绕 HyperN 神经处理单元构建，在闭环协同优化策略中集成了硬件加速、算法架构和拓扑感知网络剪枝。配合 Hyperspecl 传感器，Hypervision 在 512 × 512 像素的分辨率下实现了 61 个光谱通道的实时重建（每秒 32.9 帧），重量约为 950 克，功耗约为 25.3 瓦，比基于图形处理单元的同类产品低一个数量级。Hypervision 在智能驾驶、烟雾监测和无人机成像中得到了验证，在复杂、动态的场景中展现出鲁棒的性能，反映了在需要及时决策的应用中，人们对可部署、低功耗高光谱计算日益增长的期待。——Yury Suleymanov

Science p. 888, 10.1126 / science.aef8268

植物基因组学 两类蕨类植物的故事

蕨类植物的基因组长度可超过 100 gigabase pairs，并包含数百条染色体，全基因组倍增（WGDs）被认为是其原因之一。然而，水蕨目（Salviniales）的蕨类植物倾向于拥有较小的基因组，这被认为是由不同的繁殖模式导致的。为了研究多倍体和古代 WGDs 的作用，Rizzieri 等人对大水蕨（Salvinia molesta）和小水蕨（S. cucullata）的基因组进行了测序。尽管小水蕨拥有已知蕨类植物中最小的基因组，但作者发现其具有 34 对染色体；而大水蕨则是一种专性克隆二倍体，尽管此前认为它是五倍体。两者均未显示出 WGDs 的历史，这表明重复的染色体重排可能解释了水蕨目的基因组可塑性。——Corinne Simonti Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2026) 10.1073 / pnas.2602084123

染色体重排可能是大水蕨（Salvinia molesta）等蕨类植物中观察到的基因组可塑性的基础。

信号转导 溶酶体传递肾脏疾病信号

越来越多的证据表明，溶酶体是协调代谢和其他生物功能的关键信号枢纽。Nguyen 等人发现，在一种人类肾脏疾病中，溶酶体显示出非对称二甲基精氨酸（溶酶体蛋白水解的副产物）的积累增加。

这种无法释放二甲基精氨酸的情况导致了异常的脂质积累和毒性，进而可能导致细胞死亡。在细胞培养模型中，通过重新添加溶酶体代谢物可以缓解这一现象。因此，除了在细胞回收中的作用外，溶酶体被证明参与了细胞器间的信号传递，从而可能提供此前未被认识到的治疗靶点。——L. Bryan Ray

Nat. Cell Biol. (2026) 10.1038 / s41556-026-01970-4

COMPARATIVE BEHAVIOR

我们热爱动物的根源？

在人类历史上，人类在非食物语境下一直与非人类动物建立联系，据估计，如今超过一半的人类家庭养有宠物。尽管对此的解释通常诉诸于实用主义用途，但几十年来，人们在轶事中观察到了可被称为跨物种“友好”的互动。已知非人类灵长类动物也会与其他物种进行社交互动。Grueter 等人回顾了文献中记录的此类互动案例，发现多个灵长类群体之间存在积极的亲和模式，无论是指与其他灵长类动物，还是与非灵长类物种（包括其他哺乳动物、鸟类和爬行动物）之间。这些广泛分布的跨物种联系可能表明，我们渴望与自身以外的物种建立联系具有深远的根源。 —Sacha Vignieri Primates (2026) 10.1007 / s10329-026-01281-0

许多非人类灵长类动物表现出与其他物种的友好互动。

并确定了它们的尺寸分布。他们发现，陨石坑密度最高的部分位于面向火星的一侧，而理论预测其应位于面向轨道方向的一侧。这种观察到的分布可以用 （Deimos）的重新定向、尘埃对某些陨石坑的优先抹除，或这两者共同作用来解释。—Keith T. Smith

光电子学 为更快速的通信实现慢光

人工智能引擎、云端数据处理和数字通信网络的快速增长，需要能够处理海量数据的高效、快速且低功耗的互连技术。传统的马赫-曾德尔（Mach-Zender）调制器是现有技术的核心，但其体积相对较大且可扩展性有限。Jia 等人提出了一种基于结构化光子晶体慢光特性的硅光子方案。通过对光子晶体结构的精心设计，作者实现了每波长 400 gigabits per second 的调制速率，而功耗仅为每比特 15 femtojoules。这种可大规模制造的平台有望满足对节能且紧凑的高速光互连的需求。—Ian S. Osborne

Optica (2026) 10.1364 / OPTICA.603434

光谱学 电子运动的极限

过去二十年里，超快光学与原子级成像的融合，有望通过同时解析结构和动力学，直接可视化原子和电子的运动，尽管其底层的基本时空极限仍不为人所熟知。Maier 等人开发了亚飞秒扫描隧道显微镜，用以在该时空极限下直接可视化单个电子在穿过能垒时的量子运动。通过利用近红外波形的载波场调制能垒，产生了孤立的

亚 1-femtosecond 电子波包，其空间范围取决于多光子动力学与场驱动动力学之间复杂的相互作用。通过平衡量子路径干涉，作者将波函数的时空体积最小化到了阿秒-埃尺度。—Yury Suleymanov

Nat. Photon. (2026) 10.1038 / s41566-026-01932-0

火星卫星

（Deimos）面向火星的一侧陨石坑更多

火星有两颗小型卫星，火卫一（Phobos）和火卫二（Deimos），它们与行星潮汐锁定，起源尚不明确。2023 年，阿联酋火星任务探测器拍摄了此前观察不足的火卫二部分区域。Shimizu 等人在火卫二的整个表面识别出了撞击坑

Geophys. Res. Lett (2026) 10.1029 / 2025GL117346

记忆 无需海马体的巩固

人们认为，在睡眠期间，所有类型的记忆巩固都是由海马体对时空语境的重现（replay）所启动的。然而，海马体是否在所有条件下都是记忆巩固的驱动者且必不可少，仍然是一个有争议的问题。Thompson 等人表明，程序性记忆的巩固发生在纹状体中，无需海马体的参与。双侧海马体损伤并未影响记忆巩固，这表明海马体对于触发程序性记忆巩固并非必要。——Mattia Maroso

Nat. Neurosci. (2026) 10.1038 / s41593-026-02362-5

细胞生物学 IBD 中的细胞死亡变化

炎症性肠病（IBD）影响全球数百万人，导致反复的肠道炎症和使人衰弱的症状。尽管目前的疗法可以抑制炎症，但许多患者仍会经历不可预测的疾病复发，这凸显了我们在理解 IBD 驱动因素方面存在重大空白。Pang 等人发现，即使在疾病似乎得到良好控制的情况下，IBD 患者的肠道细胞比通常更容易产生细胞死亡信号。这种向夸大的细胞死亡通路活动的转变，对于处于缓解期且接受先进治疗的患者来说，是即将复发的早期预警信号，并为使用针对细胞死亡通路的治疗药物进行干预提供了可能性。 ——Stella M. Hurtley

Science p. 875, 10.1126 / science.aeh7112

神经科学 斑马鱼的感觉

丘脑皮层投射是感觉处理的主要来源，在哺乳动物中已得到广泛研究。相比之下，关于非哺乳动物脊椎动物中类丘脑皮层系统的了解则很少。Trinh 等人利用斑马鱼来确定感觉信息在外套膜（pallium，大脑皮层的同源结构）中是如何处理的。研究人员分离出一个名为前球复合体（PG）的结构，该结构主要负责将感觉（振动和视觉）信息传递至外套膜。进一步分析识别出了 PG 神经元中空间分离的亚群，它们对光刺激或振动刺激具有优先响应，并在外套膜中识别出了仅对光响应、仅对振动响应、多感觉以及综合性的神经元亚群。因此，这项研究确定了脊椎动物大脑结构和功能组织的一个保守特征。 ——Mattia Maroso

编辑：Michael Funk

Science p. 876, 10.1126 / science.aec2171

蛋白质相互作用 ASD 中的相互作用蛋白

大量的基因组和转录组数据集揭示了关于自闭症谱系障碍（ASD）生物学的宝贵见解。Wang 等人通过绘制 100 个高置信度 ASD 基因并构建一个大型蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，提供了一项互补资源，识别出 1800 多个相互作用，其中大多数（87%）此前从未被报道过。通过将亲和纯化-质谱数据与基于 AlphaFold 的结构预测相结合，并在人类诱导多能干细胞衍生的类器官和非洲爪蟾（Xenopus）胚胎中验证关键相互作用，作者表明，疾病相关变异选择性地削弱或增强了特定的 PPI，即使变异位于不同的基因中，也会产生趋同的神经发育表型。这项研究为理解 ASD 的生物学提供了宝贵的资源。——Mattia Maroso

Science p. 877, 10.1126 / science.ady4523

诱发地震：前震背后的机制

在能源开发或废物处置操作期间，注入活动经常会诱发地震。这些地震发生的频率日益增加，且有时震级足以造成破坏，这促使人们采取基于前震检测的缓解策略，尽管前震与主震行为之间的联系尚不确定。Wang 等人研究了加拿大西部沉积盆地 10 年的连续波形数据，发现当地震级在 3 级或以上的主震中，有超过 90% 在发生前出现了前震。然而，前震与主震的关系因区域和局部参数的不同而有所差异。这些结果支持一种基于地震和大地测量联合监测、且在空间上具有条件性而非固定不变的风险缓解方法。 —Angela Hessler

Science p. 878, 10.1126 / science.aed9893

基因渗入：并非完全的“沙漠”

自从尼安德特人和丹尼索瓦人的基因组被测序以来，古人类与现代人类之间广泛的基因流动变得日益明显。然而，早期的基因流动片段可能会掩盖后期的信号，且在缺乏参考基因组的情况下，基因渗入仍然难以检测。Zhang 等人开发了 TRACE，这是一种利用祖先重组图（ARG）在无需古人类参考基因组的情况下识别人类基因渗入的方法。他们发现，在所有现代人类群体中都存在来自某种“幽灵血统”古人类的渗入区域，令人惊讶的是，这些区域与此前被认定为缺乏尼安德特人和丹尼索瓦人渗入的区域（被称为“沙漠”）重叠。这项工作还支持了此前关于丹尼索瓦人渗入区域内存在超古人类血统的证据。—Corinne Simonti

Science p. 938, 10.1126 / science.aef8874

进化：XY 和 ZW 系统是否有既定路径？

尽管性染色体在生殖中至关重要，但它们经常显示出快速进化的迹象。Zhou 等人对 19 种壁虎的基因组进行了测序并检查了其性染色体，这些壁虎在不同谱系中进化出了温度依赖性以及 XY 和 ZW 遗传性别决定系统。虽然某些祖先染色体在多个物种中进化成了性染色体，但这些染色体通常并非源自同源区域。当作者检查这些区域的基因含量时，他们发现即使在具有不同性别决定系统的物种中，也存在具有性别偏向基因表达的基因簇。鉴于重组抑制将基因锁定在性染色体上的普遍性，此类特性可能会引导进化向 XY 或 ZW 系统倾斜。—Corinne Simonti

Science p. 880, 10.1126 / science.aec3449

基因治疗

不再有无义突变

无义突变通过插入提前终止密码子（PTC）阻止全长蛋白质的合成，从而导致许多遗传疾病。抑制性转移 RNA（tRNA）可以绕过这些错误的终止信号，但目前其治疗应用受到 PTC 读取效率低、免疫原性和递送挑战的限制。Chen 等人通过化学修饰改进了抑制性 tRNA，在增强治疗效果和持久性的同时，降低了先天免疫激活（参见 Myerson 和 Weissman 的观点文章）。他们还开发了专门用于肺部 tRNA 递送的非病毒脂质纳米颗粒。在从细胞、小鼠到患者来源的类器官的囊性纤维化模型中，这种非病毒方法恢复了缺失的 CFTR（囊性纤维化跨膜电导调节因子）蛋白的产生和功能。因此，非病毒递送的抑制性 tRNA 为治疗由无义突变引起的疾病提供了一个极具前景的治疗平台。—Stella M. Hurtley

Science p. 881, 10.1126 / science.aeb0054; 另见 p. 862, 10.1126 / science.aek3835

RNA

使用 AI 设计假结

RNA 分子可以折叠成复杂的三维形状，从而驱动其大部分生物学功能，但从零开始设计新的结构化 RNA 长期以来一直难以实现。Townley 等人表明，现在可以使用人工智能（AI）可靠地设计被称为假结（pseudoknots）的复杂 RNA 结构。在公民科学平台 Eterna 为期一年的竞赛中，AI 方法解决了 57 项设计挑战中的 95% 以上，其表现与人类专家玩家相当（参见 Mustoe 和 Guo 的观点文章）。冷冻电子显微镜显示，这些分子折叠成了全新的三维架构，有时还具有 AI 未被指令构建的复杂相互作用。因此，RNA 设计已进入深度学习 era.。——Di Jiang

Science p. 931, 10.1126 / science.aeg6829; 另见 p. 859, 10.1126 / .aek4499

二维半导体 二维材料的高质量接触

由于接触电阻高和热稳定性低等持续存在的问题，将可靠的金属接触与二维 (2D) 半导体集成是此类设备实际应用的一项关键挑战。Zhang 等人引入了一种原位原子层逐层蒸发工艺，将单晶金属直接沉积在二维半导体上，从而创建出费米能级钉扎极小的原子级洁净界面（参见 Shin 和 Kim 的观点文章）。由此产生的接触展现出理想的 Schottky-Mott 行为，具有极低的 n 型和 p 型接触电阻（均接近量子极限），并且在各种金属和二维材料中表现出卓越的热鲁棒性。目前的结果克服了长期存在的限制，并可能代表一次范式转移，极大地加速了二维半导体在未来电子技术中的集成。——Yury Suleymanov

p. 938, 10.1126 / .aee3132; 另见 p. 860, 10.1126 / .aek4631

器件技术 基于铋的隧穿晶体管

一种基于 p 型铋和 n 型硒化铟二维层之间隧穿的场效应晶体管 (FET) 可以降低驱动电压和功耗。Wu 等人表明，其 Bi / InSe 隧穿 FET 中的有利能带效应使得器件运行不再受玻尔兹曼热离子发射的限制，而是基于冷载流子注入。这些在硅平台上生长的器件在仅 160 毫伏的栅极电压下，保持了超过 7 个数量级的有效电流开关比，而最先进的 FET 则约为 800 毫伏。——Phil Szuromi

p. 917, 10.1126 / .adx6059

铁电体 通过氮化提高能量存储

铁电钛酸盐薄膜的合成后处理引入了钛-氮键，导致介电能量存储密度提升高达 50%。Yi 等人表明，将薄膜交替浸入液氮和热浴中可使薄膜掺氮，并避免引入会加速降解的氢。通过最大化极化并最小化剩余极化，研究人员在弛豫铁电薄膜中实现了高达每立方厘米 286 焦耳的存储密度。——Phil Szuromi

p. 923, 10.1126 / .aeb5274

PAIN

BRAF 增强脊髓疼痛

感觉神经元中名为 NMDARs 的谷氨酸受体活性增加会引发慢性神经病理性疼痛。Jin 等人发现，神经损伤后的这种现象可以通过 BRAF 抑制剂来阻断。在啮齿动物中，脊髓神经损伤后神经病理性疼痛的强度和持续时间是由激酶 从感觉神经细胞体转移到脊髓神经元的中央末梢所驱动的，在那里， 激活的信号增加了突触前和突触后 NMDARs 的激活度及其丰度。经批准用于治疗癌症的 抑制剂降低了动物对各种刺激的超敏反应，这表明 抑制剂可能会被重新开发用于治疗疼痛。——Leslie Ferrarelli

Sci. Signal. (2026) 10.1126 / scisignal.aeh6852 发育期间的雄激素保护动物免受过敏原诱导的肺部炎症。他们发现，雄激素促进了雄性小鼠肺部交感神经的支配，进而通过去甲肾上腺素抑制 2 型炎症。因此，除了对免疫细胞的直接作用外，雄激素还可能通过内分泌-神经免疫信号轴来减轻肺部的过敏反应。——Seth Thomas Scanlon

Sci. Immunol. (2026) 10.1126 / sciimmunol.aed0186

哮喘 预防哮喘需要极强的神经作用

在青春期，哮喘和其他过敏性疾病的患病率从男性转向女性。越来越多的证据表明，性激素有助于驱动这一现象。通过对小鼠的研究，Tu 等人报告称

一个坏死性凋亡到凋亡的信号轴是炎症性肠病的底层机制

Jiyi Pang†, Aysha H. Al-Ani†, 等

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aeh7112

引言：每天，数以十亿计的人类细胞通过受到严格调控的死亡程序被清除，这些程序在不引发炎症的情况下维持组织完整性。在肠道中，这些通路的紊乱可能会产生深远的影响。例如，细胞死亡调控中罕见的遗传缺陷会导致儿童出现严重的早发性炎症性肠病（IBD）。这些单基因疾病引发了一个更广泛的假设，即肠道细胞死亡是更普遍的多因素 IBD 形式背后的因果驱动力。这一观点推动了治疗试验，但目前仍缺乏直接证据证明异常的细胞死亡驱动了普遍的人类疾病。

基本原理：我们进行了一项前瞻性临床队列研究，以确定肠道细胞死亡仅仅是炎症的结果，还是人类 IBD 中一个在机制上定义明确的特征。我们对肠道活检样本进行了细胞死亡信号的转录和翻译后特征分析，在患者来源的肠道类器官中对这些机制进行了功能性剖析，并将这些特征与患者的炎症状态及纵向临床结果相关联。这种综合方法使我们能够确定细胞死亡程序在病变发展过程中何时出现，它们在人类肠上皮中如何受到调控，以及它们是否具有预后价值。

结果：来自 IBD 成年患者的肠道活检显示，两条细胞死亡通路——坏死性凋亡（necroptosis）和凋亡（apoptosis）的信号传导增加。然而，这些通路并不符合细胞死亡激活的经典模型。相反，坏死性凋亡和凋亡

人类肠道中的细胞死亡受到严格控制，而在 IBD 中则出现失调。 Xenium 空间转录组数据的渲染图像显示，不同的肠道细胞类型差异性地表达细胞死亡相关基因。这些细胞死亡通路表达的空间模式在 IBD 患者中发生了改变，且这种改变早于并能预测即将发生的肠道损伤。

信号是通过与离散上皮亚群中炎症诱导的转录重塑相关的非经典机制产生的。这些上皮状态在健康的肠道组织中基本不存在，表明炎症创造了对异常死亡信号具有新易感性的细胞群体。在患者来源的肠道类器官中进行的功能研究支持了这一模型，并有助于定义炎症信号促进细胞死亡通路激活的上皮机制。出乎意料的是，在黏膜病变形成的最早阶段即可检测到异常的细胞死亡信号。即使在临床症状轻微的患者以及接受先进治疗的患者中，这些信号也出现在新生病变中，这表明目前的治疗可能在抑制炎症的同时，未能完全消除上皮死亡程序。纵向随访进一步显示，肠道细胞死亡信号增加的患者在 2 到 3 年内的疾病复发率更高。因此，上皮死亡信号不仅是活动期疾病的一个分子特征，也是未来临床发作的标志。

结论：上皮细胞死亡信号在 IBD 病变早期出现，且在接受先进治疗后依然存在，并能预测疾病复发。 □

通讯作者：Edwin Hawkins (hawkins.e@wehi.edu.au), Britt Christensen (britt.christensen@mh.org.au), Andre Samson (samson.a@wehi.edu.au), James Vince (vince@wehi.edu.au), James Murphy (jamesm@wehi.edu.au) †这些作者对本工作贡献相同。引用本文请标注为 J. Pang et al., Science 393, eaeh7112 (2026). DOI: 10.1126 / science.aeh7112

一个坏死性凋亡至凋亡的信号轴是炎症性肠病的潜在机制

Jiyi Pang $^{1,2,\dagger}$ , Aysha H. Al-Ani $^{1,2,3,4,\ddagger}$ , Komal M. Patel $^{1}$ , Yunzhuo Zhou $^{1}$ , Samuel N. Young $^{1}$ , Jinjin Chen $^{1,2}$ , Isabella Kong $^{5}$ , Marilou Barrios $^{1,2}$ , James A. Rickard $^{1,3}$ , Siqi Chen $^{1,2,6}$ , Xiuquan Ma $^{1,2}$ , Farzaneh Shojaee $^{1,2}$ , Seong-Beom Kim $^{7}$ , Siavash Foroughi $^{1,2}$ , Wayne Cawthorne $^{1,2}$ , Annette V. Jacobsen $^{1,2}$ , Asha Jois $^{1,2,8}$ , Ashley L. Weir $^{1,2}$ , Lachlan W. Whitehead $^{1,2}$ , Pradeep Rajasekhar $^{1,2}$ , Christopher R. Horne $^{1,2,9}$ , Ruqian Lyu $^{1,2}$ , Lucy J. Mather $^{1}$ , Raymond K. H. Yip $^{1}$ , Ellen Tsui $^{1}$ , Imadh Azeez $^{1,2}$ , Tao Tan $^{1,2}$ , Weiwei Liang $^{10,11}$ , Suresh Sivanesan $^{3,4}$ , Andrew Metz $^{3,4}$ , Ash Patwardhan $^{3,4}$ , Natalie Shea $^{3,4}$ , Guru Iyngkaran $^{3,4}$ , Daniel Schneider $^{3,4}$ , Alexander T. Elford $^{3,4}$ , William Beattie $^{3,4}$ , Finlay Macrae $^{3,4}$ , Gianmaria Liccardi $^{12,13,14}$ , Henning Walczak $^{12,15}$ , Yuxia Zhang $^{10,11}$ , Oliver M. Sieber $^{1,2}$ , Tim Spelman $^{1}$ , Lisa Giulino-Roth $^{5}$ , Michael Christie $^{1,3}$ , Yunshun Chen $^{1}$ , Kelly L. Rogers $^{1,2}$ , Rory Bowden $^{1,2}$ , Sandra E. Nicholson $^{1,2}$ , Kate E. Lawlor $^{1,16,17}$ , Edwin D. Hawkins $^{1,2,\ddagger}$ , Britt Christensen $^{1,2,3,4,\ddagger}$ , Andre L. Samson $^{1,2,\ddagger}$ , James E. Vince $^{1,2,\ddagger}$ , James M. Murphy $^{1,2,9,*\ddagger}$

炎症性肠病（IBD）是由细胞因子信号改变、适应不良的免疫反应、菌群失调以及肠道屏障功能障碍引起的一种慢性疾病。尽管目前的治疗旨在通过纠正这些失衡来诱导缓解，但大多数患者最终会复发，这表明关键的致病机制依然存在。在本文中，我们将异常的上皮细胞死亡信号鉴定为 IBD 的一个潜在特征，该特征在处于缓解期以及接受先进治疗的患者中均会出现。从机制上讲，初期的炎症使上皮细胞转向一种类似于 M1 巨噬细胞的转录状态，从而促进了不依赖于 RIPK1 的坏死性凋亡信号。随后，该信号触发了由诱导型一氧化氮合酶辅助的吸收性上皮细胞线粒体凋亡，以及由 PUMA 介导的肠道干细胞死亡。因此，异常的上皮细胞死亡信号代表了 IBD 的一个标志，它在黏膜病变发展的早期出现，在目前的治疗策略下依然存在，并能预测临床复发。

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），是一种以黏膜炎症复发性为特征的胃肠道慢性疾病。到 2030 年，西方国家将有高达 1% 的人口受到 IBD 的影响，且在其他工业化国家的发病率也在上升 (1)。由于 IBD 的病因是多方面的 (2)，目前的治疗方法并非根治，而是通过长期免疫抑制来减轻炎症 (3–5)。即使在接受肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂等先进治疗的情况下，大多数患者仍会经历病情波动，从而需要升级治疗方案；仅有 13 到 34% 的患者能够实现深度缓解（以组织学炎症的消失为证据）(6, 7)。这种临床模式表明，即使在炎症看似消退后，IBD 的病理驱动因素依然存在。

细胞凋亡介导了组织物质的有序清除或回收，对于包括感染控制和癌症预防在内的许多生理过程至关重要 (8)。内源性凋亡需要依赖 BAX- / BAK 的线粒体通透化，而外源性凋亡则依赖于启动半胱天冬酶 caspase-8 (8)。两种类型的凋亡最终都会导致效应半胱天冬酶 caspase-3、-6 和 -7 的激活，这些酶通过切割底物来拆解细胞 (8)。坏死性凋亡是另一种形式的细胞死亡，通常在凋亡受损时被激活 (9–14)。坏死性凋亡信号导致受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸激酶 (RIPK)-1、RIPK3、Z-核酸结合蛋白 1 (ZBP1) 和 / 或 Toll / 白细胞介素-1 受体结构域包含接头分子 1 (TRIF) 形成一种被称为坏死小体 (necrosome) 的细胞内支架。坏死小体激活 RIPK3 和混合谱系激酶域样蛋白 (MLKL) 以触发坏死性凋亡 (15–20)。与凋亡（其中细胞内成分被降解以限制免疫反应）不同，坏死性凋亡涉及明显的质膜裂解，从而促进细胞内容的促炎性释放 (21)。

在 IBD 发病机制中起核心作用的细胞因子，包括 TNF 和干扰素 (IFNs)，也是强效的细胞死亡触发因子 (22–27)。因此，细胞死亡增加长期以来一直与 IBD 相关，且细胞死亡抑制剂正被探索作为 UC 的治疗方法 (24, 25, 28–37)。尽管如此，很少有研究使用确定性标志物来检测 IBD 组织中的细胞凋亡 (38–41) 或坏死性凋亡 (30–32, 42–44)，且尚无研究考察接受先进治疗的患者或对多种细胞死亡模式进行分析。为了填补这些空白，我们在先进治疗的背景下，定义了成年 IBD 患者中细胞凋亡和坏死性凋亡的流行率及其机制。

结果

为了阐明 IBD 中细胞死亡与黏膜病变之间的关系，我们从 CD 或 UC 患者中采集了非炎症、边缘炎症和炎症肠组织的活检样本（图 1A 和表 S1）。对于没有内镜炎症的患者，活检样本采集自此前检查中被归类为非炎症、边缘炎症或炎症的部位。作为非 IBD 对照组，我们采集了因非炎症性疾病或为了排除恶性肿瘤而进行结肠镜检查的成年人的肠道活检样本。我们从 80 名患者中采集了 900 份以上的活检样本，采样部位均匀分布在回肠至直肠（图 1B）。根据临床、内镜和组织学标准，大多数患者的疾病处于静息期或轻度活动期（图 1℃ 和图 S1, A 至 C）。该队列具有澳大利亚 (45) 及其他西方国家 人群的代表性，但其中很大比例 (62%) 正在接受生物制剂或小分子药物治疗（图 1D），以下统称为“先进疗法”。因此，本文研究的分子事件代表了在 静息期以及在接受先进疗法的情况下所发生的改变。

我们将组织学、免疫印迹、大体和空间转录组学以及上皮类器官测定与人口统计学和临床元数据相结合（图 1A 和表 S1）。我们验证了 的黏膜标志物 (46)（包括 S100A8 和 S100A9）在我们的样本中以炎症依赖的方式表达（图 1E），且组织病理学评分与内镜炎症相关（图 S1℃）。接下来，我们进行了基因集富集分析，以识别在 中可能受到干扰的生物学通路。尽管许多患者正在接受先进疗法，但在我们的 样本队列中，TNF 和 IFN 相关基因仍出现失调（图 1F 和图 S1D）。凋亡相关基因在 样本中也出现了失调，而坏死性凋亡和铁死亡的特征则没有（图 1F 和图 S1D）。凋亡通路的失调与一个事实不符，即经典凋亡基因的多态性与成年发作的 无关 (47)。事实上，尽管在移植物抗宿主病中经常观察到凋亡 (48)，但组织病理学评估未能检测到 组织中有显著水平的凋亡细胞（图 S1E）。因此我们推论，如果 中存在细胞死亡失调，那么它涉及的是被忽视的机制。

细胞死亡信号增强是 IBD 的一个特征

为了确定 IBD 中细胞死亡信号是否失调，我们利用免疫印迹法分析了凋亡途径的表达和激活情况。组织信号相对于定义明确的人类 HT29 细胞培养信号进行了定量分析（图 2, A 至 C）。由于抗坏死凋亡药物是潜在的 疗法 (35–37)，我们还对坏死凋亡途径进行了分析。总共测量了 41 个细胞死亡信号标志物（每个标志物的平均样本量 n = 23 名患者；图 2B 和图 S2）。坏死凋亡信号增强 [由磷酸化 RIPK3 (pRIPK3) 定义] 和凋亡信号增强（由剪切型 caspase-3 定义）是 的普遍特征（图 2, A 至 C）。无论治疗类别如何，这两种途径的激活均与 UC 和 CD 患者的肠道炎症相关（图 2, A 至 C，以及图 S2）。

在远离黏膜炎症区域采集的非炎症 活检样本中，坏死凋亡信号也有所升高（31 份非炎症 样本中的 16 份，以及 89 份 样本中的 54 份，其 pRIPK3 水平高于非 平均值；例如 NM058；图 2A）。这表明坏死凋亡激活是病变发展的早期事件。尽管 RIPK3 激活的传统模型 (49) 涉及 RIPK1 的共同激活以及负调节因子的抑制（例如 caspase-8, cFLIP $_{L}$ , HOIP, FADD, OTULIN 和 IAPs），但 中的 RIPK3 激活并未遵循这一模式（图 2, B 和 C，以及图 S2, A 和 B）。相反，RIPK3 的激活与 ZBP1 表达的增加更为密切（图 2℃）。此外，在部分患者中，RIPK3 激活的增强最终导致了 MLKL 的激活（89 份 样本中的 21 份，其 pRIPK3 和 pMLKL 水平均高于非 平均值；例如 NM058；图 2A）。另一部分患者表现出 RIPK3 和 RIPK1 的共同激活（79 份 样本中的 20 份，其 pRIPK1 和 pRIPK3 水平高于非 平均值；例如 NM058；图 2A），这表明患者分层对于 RIPK1 抑制剂的临床试验可能至关重要 (35–37)。RIPK1、RIPK3 和 MLKL 激活之间的脱节可能反映了免疫印迹法的局限性、RIPK 信号传导的随机性或非经典 RIPK3 信号传导。

肠道炎症与凋亡之间的关系则有所不同。在组织学上处于炎症状态的 组织中观察到了凋亡信号的增强（30 份炎症 样本中的 16 份，以及 93 份 样本中的 38 份，其剪切型 -3 水平高于非 平均值；例如 NM028 和 NM036；图 2A），这表明凋亡在病变发展中起到了更下游的作用。从机制上看，启动子 ，-10，的剪切以及细胞死亡抑制因子（HOIP, cFLIP $_{L}$ 和 XIAP）水平的降低与 -3 的激活同步发生（图 S2, A 至 C）。在没有明显剪切型 -3 的 组织中，经常检测到活性全长 RIPK3 水平升高（93 份样本中的 30 份），而许多炎症 样本中同时检测到了 pRIPK3 和 -3 的剪切形式（30 份样本中的 20 份；图 S2D）。这些发现表明，炎症相关的坏死凋亡向凋亡的信号转换发生在相同的细胞中，尽管需要通过原位检测凋亡和坏死凋亡标志物来正式验证这一可能性。总体而言，93 份 样本中有 74 份的 pRIPK3 和 / 或剪切型 -3 水平高于非 平均值，这表明即使患者接受先进治疗，肠道细胞死亡信号的增强在 中依然显著。

炎症诱导的转录重构了上皮细胞死亡信号

研究人员对活检样本进行了大体 RNA 测序，以探讨炎症如何改变细胞死亡信号。在涵盖坏死性凋亡和凋亡通路的 164 个预定义基因列表中（表 S1），仅有 6 个基因以炎症依赖方式显著上调：NOS2、MLKL、PDK1、ZBP1、BCL2A1 和 NFKB2（图 3A 以及图 S3, A 和 B）。BCL2L10 是唯一显著下调的基因（图 3A 以及图 S3, A 和 B），而 caspase-6 在炎症性 IBD 组织中有所减少（图 S2A 和 S3A）。对先前研究的元分析证实，NOS2、MLKL、PDK1、ZBP1、BCL2A1 和 NFKB2 在 IBD 中的肠道表达水平升高 (50)。这些数据表明，少数基因表达的改变即可深刻影响细胞死亡信号，且 / 或细胞死亡是由翻译后机制驱动的。

随后，我们进行了无监督分层聚类，以识别共调控的基因模块。在识别出的模块中，“聚类 B”较为显著，因为它包含几个感兴趣的基因，包括 NOS2、MLKL 和 ZBP1（图 3B）。为了深入了解其上游调控，我们对聚类 A 至 E 进行了转录因子富集分析和数字细胞术分析。这些分析表明，聚类 B 受与 M1 型巨噬细胞相关的转录因子和基因控制（图 S3, C 和 D），从而产生了一种理论，即聚类 B 表达的增加是由于 M1 型巨噬细胞浸润到 组织中所致。与该假设相反，数字细胞术显示，在我们的 样本中 M1 型巨噬细胞并未富集（图 S3, E 和 F，以及表 S1），这可能是因为大多数患者的病情控制良好。因此，我们查询了 组织中聚类 B 表达的增加是否是由非免疫驻留细胞类型引起的。

与此逻辑一致，公开的单细胞 RNA 测序数据表明，在 UC 患者中，聚类 B 基因主要在吸收性肠上皮细胞中上调（图 S3G）(51)。免疫组化进一步表明，上皮内坏死性凋亡信号 [由 caspase-8 簇定义 (44)] 存在于非炎症性 组织中，而上皮内凋亡信号（由剪切后的 caspase-3 定义）则与组织学上的炎症性 组织相关（图 S3H）。聚类 B 基因的表达与上皮炎症标志物 [由 LCN2 和 DUOX2 的增加定义 (52)] 相镜像，并且在接受不同类别治疗的患者中均明显（图 S3I）。综合这些观察结果，我们假设未知的炎症信号增加了肠上皮细胞中聚类 B 基因的表达，从而在初发 病灶中驱动坏死性凋亡信号，并在更晚期的病灶中促进凋亡信号。我们进一步假设， 中的炎症上皮模拟了 M1 型巨噬细胞对炎症的转录响应 (53–55)。

具有邻近炎症上皮扩张的免疫生态位使细胞死亡发生偏移

我们利用空间转录组学来从机制上定义 IBD 中上皮细胞死亡是如何改变的。我们选择了 51 份具有高 RNA 完整性的肠道活检样本，以涵盖不同程度的炎症、肠道部位、IBD 亚型和治疗类别（图 S4A 和表 S1）。我们对 160 个细胞死亡相关基因、90 个来自 易感位点的基因以及 230 个细胞类型标志物的表达进行了制图（表 S1）。在所有活检样本中，共检测到约 170 万 个细胞，包括人类肠道的主要上皮和免疫细胞类型（图 3℃）。正如预期，非炎症 和非 活检样本的细胞组成相似（图 S4, C 和 D）。即使在炎症 样本中，浆细胞也是唯一显著扩张的群体（图 S4, C 和 D）。非 样本与 样本之间的这些相似性证实，我们队列中的大多数患者疾病控制良好。尽管如此，一种分级的且依赖于炎症的增加在

图 1. 定义细胞死亡在 中作用的前瞻性研究。(A) 研究设计。(B) 本研究中所用活检样本的解剖来源。(C) 招募时队列的疾病活动度。每个点代表一名 患者。临床活动度通过 Harvey-Bradshaw 指数（针对 CD）或简单临床结肠炎活动指数（针对 UC）衡量。

内镜活动度通过简单内镜评分（针对 CD）或 Mayo 子评分（针对 UC）衡量。组织病理学活动度通过 Robarts 组织病理学指数（RHI；针对所有病例）衡量。(D) 招募时队列的人口统计学或临床特征：原发性硬化性胆管炎 (PSC)、硫嘌呤或甲氨蝶呤 (IMM)、美沙拉嗪 (5-ASA)、独家肠内营养 (EEN)、无治疗 (None)、英夫利昔单抗或阿达木单抗 (anti-TNF; $\alpha$-TNF)、乌司亭奴单抗 (anti-IL12 / 23)、维多珠单抗 (anti-$\alpha_{4}\beta_{7}$)、托法替尼 (JAKi) 以及皮质类固醇 (Steroids)（表 S1）。(E) 热图显示 患者肠道活检样本（n = 26 非炎症，n = 24 边缘，n = 25 炎症活检）相对于非 患者（n = 23）中选定基因的平均表达量。选定的基因为 S100A8 和 S100A9（编码钙卫蛋白）以及 患者中前 50 个和后 50 个炎症相关黏膜标志物 (46)。(F) 对与 (E) 中相同活检样本的批量 RNA 测序数据进行的基因集富集分析。显示了归一化富集分数 (NES) 和名义 P 值。

观察到了 cluster B 的表达（图 3D 和图 S5A）。cluster B 的转录上调主要局限于分化后的吸收性上皮的一个亚群，在此被称为结肠细胞 #2（colonocyte #2 cells）（图 3D 和图 S5A）。与此前呈现的结果一致（图 2 和图 3A），在非炎症性 IBD 组织中检测到了结肠细胞 #2 中 B 的上调，因此这代表了病变发展的早期步骤（图 3D 和图 S5A）。轨迹推断分析确认，在 IBD 患者中， B 的表达在结肠细胞分化的末期增加（图 S5, B 和 C）。在 和非 样本之间，XIAP、FADD 或 RIPK1 的表达没有显著变化（图 S5A）。结肠细胞 #2 中 B 基因的上调伴随着 $\mathrm{B^{+}}$ 结肠细胞 #2 亚群的扩张（图 3, E 至 G）。在非 肠道中， $\mathrm{B^{+}}$ 结肠细胞 #2 非常罕见，而在高度炎症的 组织中，该亚群上升至上皮细胞的 $\sim 30\%$（图 3, F 和 G）。相比之下， $\mathrm{B^{+}}$ 干细胞在 组织中依然罕见，且以 NOS2 表达为主，对炎症的转录反应较低（图 S5, D 至 F）。因此，结肠细胞 #2 对炎症产生了一种在性质和数量上截然不同的反应。

为了研究新生炎症对隐窝顶端的影响，我们在非炎症 样本中对 B $^{+}$ 结肠细胞 #2 及其对应的 B $^{-}$ 细胞进行了差异表达分析（图 3, H 至 K）。许多 易感基因，包括 ICAM1、SOCS1、TNFAIP3、ESRRA 和 ITPKA，在 B $^{+}$ 结肠细胞中呈差异表达。此外，许多炎症和免疫的正调节因子，包括 TNF、NFKB2、RELB、CXCL1 和 CCL23，在 B $^{+}$ 结肠细胞 #2 中有所增加。 B $^{+}$ 和 B $^{-}$ 结肠细胞 #2 之间的这种分歧在亚群层面（图 3H）以及相邻上皮区域的空间分布上（见图 3I 中的地标 1 至 4）均十分明显。这些观察结果表明，炎症性结肠细胞 #2 调节着 风险和黏膜免疫。为了推进这一假设，我们比较了 B $^{+}$ 或 B $^{-}$ 结肠细胞 #2 下方的固有层（lamina propria）的基因表达和细胞组成（图 3, J 和 K，以及图 S5, H 至 J）。黏膜免疫的正调节因子，包括 TNF、IFNG、OSM、CCL3、S1PR5、ITGAX 和 CD137，在 B $^{+}$ 结肠细胞 #2 下方的固有层中上调（图 3J）。这些促炎变化与 B $^{+}$ 结肠细胞 #2 附近固有层中表达 IFNG 的 CD4 $^{+}$ T 细胞的富集相一致（图 3K 和图 S5, A 以及 G 至 J）。浆细胞（plasmablasts）在 B $^{+}$ 结肠细胞 #2 下方生态位的缺失（图 S5J）可能与 中浆细胞反应的偏移有关 (56)。总而言之， 中出现了一个炎症生态位，其特征为：(i) 隐窝顶端附近固有层中 CD4 $^{+}$ T 细胞的聚集，(ii) IFNG 和 TNF 等炎症触发因子的表达增加，(iii) 隐窝顶端结肠细胞中 B 基因表达增加，以及 (iv) 这些炎症性 B $^{+}$ 结肠细胞的扩张。我们认为，该生态位是一个早期的、能够改变疾病进程的事件，它促进了 中的肠道细胞死亡信号传导。

IFN $\gamma$ 与 TNF 协同诱导肠上皮类器官死亡

细胞死亡、TNF 以及 IFN $\gamma$ 相关通路在 IBD 中出现失调（图 1 至 3）。因此，我们研究了炎症细胞因子是否会触发上皮细胞死亡。将源自 IBD 和非 IBD 组织的肠道干细胞类器官维持在 IntestiCult 类器官生长培养基 (OGM) 中，并使用添加了 Wnt 抑制剂 IWP2 的 IntestiCult 类器官分化培养基将其分化为结肠细胞类器官（图 4A）。通过形态学、定量聚合酶链反应 (PCR)、免疫组化和批量 RNA 测序确认了类器官的身份（图 4, A 和 B，以及 . S6, A 至 C）。随后，我们量化了在接受 IBD 相关细胞因子或微生物 Toll 样受体 (TLR) 配体处理后的类器官死亡情况 (. S6D)。TNF 未引起显著的结肠细胞死亡，IFN$\gamma$ 诱导了约 40% 的结肠细胞死亡，而 TNF 和 IFN$\gamma$ 联合处理则杀死了高达 80% 的结肠细胞 (. 4, C 和 D，以及 . S6, E 和 F)。干细胞类器官对这些刺激表现出类似但较不明显的死亡反应 (. 4, C 和 D，以及 . S6E)。在源自 IBD 和非 IBD 组织的类器官中观察到了相当的反应 (. 4℃ 和 . S6E)。尽管 I 型或 III 型干扰素（单独使用或与 TNF 联合使用）均触发了经典的转录反应，但未能诱导上皮细胞在 24 小时内死亡 (. S6, G 和 H)。将 IFN$\gamma$ 与 TRAIL、FasL 或 TLR 配体结合同样未能增强细胞毒性 (. S6, I 和 J)。值得注意的是，在测试的刺激物中，只有 IFN$\gamma$ 诱导了强烈的 NOS2 表达，这表明它是结肠细胞中 cluster B 的关键诱导因子 (. S6H)。这些数据表明，IFN$\gamma$ 和 TNF 的组合是肠上皮死亡的强驱动因素（视频 S1）。

IFNγ 通过转录改变肠上皮细胞以促进细胞死亡信号传导

大体 RNA 测序显示，经 IFNγ 和 TNF 处理的类器官的转录组与 IBD（炎症性肠病）肠道相似（图 S7, A 和 B）。与 IBD 生检样本（图 S3D）类似，数字细胞术显示，经 IFNγ 和 TNF 处理的上皮类器官在转录上模拟了 M1 型巨噬细胞的特征 [图 S6K；使用了专为免疫细胞设计的 LM22 矩阵 (57)]。经 IFNγ 和 处理的类器官还上调了 B 簇基因（CASP8, CASP10, ZBP1, MLKL 和 NOS2；图 4E），这与我们的 IBD 队列（图 3A）以及一个更大的 IBD 队列（图 4E）中的转录变化相似。在经 IFNγ 和 处理的类器官中，凋亡和坏死性凋亡的其他关键调节因子也发生了上调（图 4F 和图 S7℃）。肠类器官的免疫印迹证实，IFNγ 增加了 caspase-8, caspase-10, ZBP1 和 MLKL 的水平，且 IFNγ 和 的联合处理导致了外源性 (-8 / -10)、内源性 (-9) 和效应器 (-3) 的加工，以及 RIPK3 和 MLKL 的激活与剪切（图 4G）。与干细胞相比，这些炎症诱导的凋亡和坏死性凋亡信号在结肠细胞中更为普遍（图 4G），这与其对细胞因子诱导死亡的高度敏感性一致（图 4℃）。由于 gasdermins 控制黏膜修复 (24, 58)，且许多焦亡基因在 IBD 组织中上调（图 S7D），我们还测量了炎症类器官中的焦亡信号。尽管未观察到 GSDMC 的蛋白水解激活，但对结肠细胞进行 IFNγ 和 处理导致了由凋亡 -3 驱动的 GSDMD 失活和 GSDME 激活（由 GSDMD p43 和 GSDME p30 定义；图 S7E）。因此，用 IFNγ 和 处理肠类器官重现了 IBD 患者生检样本和结肠细胞 #2 细胞中炎症状态下的转录和翻译后细胞死亡信号特征。

图 2. IBD 中的坏死性凋亡和凋亡信号增加。(A) HT29 细胞（灰色文字；左）和患者肠道生检样本（黑色文字；右）裂解液的免疫印迹。由 和 Smac 模拟物 (TS) 诱导的凋亡信号。由 TS 和 IDN-6556 (TSI) 诱导的坏死性凋亡信号。每块凝胶的第五道包含经 TSI 处理的 $RIPK3^{- / -}$ 或经 TSI 处理的 $MLKL^{- / -}$ 细胞的裂解液（详见源数据）。注明了每位患者的研究编号 (NM)、IBD 亚型 (UC / CD) 和治疗方案。显示了每个生检部位的组织病理学评分 (RHI)：硫嘌呤或甲氨蝶呤 (IMM)、美沙拉嗪 (5-ASA)、无治疗 (Tx free)，或英夫利昔单抗或阿达木单抗 (anti-; $\alpha$-)。(B) 热图显示 IBD 患者生检样本相对于非 IBD 患者中指定蛋白质或翻译后修饰的表达水平。数据以中位数表示（来自 n = 23 份生检 / 靶点 / 内镜分级的平均值）。*P < 0.05，采用经 Geisser-Greenhouse 校正的一元方差分析 (one-way ANOVA)。(C) 图表显示 HT29 细胞和生检样本中指定蛋白质或翻译后修饰的相对表达水平。每个点代表一次生检。柱状图表示平均值。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001，采用经 Geisser-Greenhouse 校正的一元方差分析。

IFN $\gamma$ 和 TNF 导致肠道类器官线粒体凋亡

为了定义炎症诱导的上皮细胞死亡机制，我们使用了坏死性凋亡抑制剂（Nec1s、GSK872 和 TC13172）、焦亡抑制剂（MCC950 和 VX765）、铁死亡抑制剂（liproxstatin-1 和 ferrostatin-1）、死亡配体中和抗体（FASL 和 TRAIL 中和抗体）以及凋亡半胱天冬酶抑制剂（Q-VD-OPh 和 IDN-6556）(图 4, H 和 I，以及图 S7, F 至 N)。尽管这些抑制剂在对照实验中能够限制细胞死亡（图 S7, F, G 和 J 至 N），但没有一种抑制剂能防止 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的类器官杀伤（图 4, H 和 I，以及图 S7, H 和 I）。即使使用 Q-VD-OPh 进行泛半胱天冬酶抑制，也仅能延迟 IFN$\gamma$ 和 TNF 处理类器官的死亡，而共同抑制坏死性凋亡或焦亡并未提供额外的保护（图 4I 和图 S7I）。然而，正如预期的那样，使用 IDN-6556 (59) 对 caspase-8 / cFLIP 异二聚体进行更强效的抑制，诱发了 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的坏死性凋亡类器官死亡（图 S7I）。由于没有任何单一抑制剂能显著保护肠道类器官免受 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的死亡，我们考虑类器官是否通过线粒体凋亡死亡，在这种凋亡中，BAX / BAK 介导的线粒体膜通透化足以导致细胞死亡 (60–62)。这一假设源于相关实验，在这些实验中，促进 BAX / BAK 激活的 BH3 模拟物 (63, 64) 在 QVD-OPh 存在的情况下触发了类器官死亡（对照实验确认 QVD-OPh 阻断了半胱天冬酶活性；图 S7, J 和 M）。因此，我们构建了过表达 BCL-2 的类器官（图 5, A 至 C，以及图 S8, A 和 B），BCL-2 是 BAX / BAK 驱动的线粒体凋亡的抑制剂 (65)，并确认这防止了 BH3 模拟物诱导的类器官死亡（图 5, A 至 C）。BCL-2 过表达还防止了 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的死亡及半胱天冬酶加工，且正如预期，这一效果被 BCL-2 拮抗剂 ABT199 (66) 逆转（图 5, A 至 C，以及图 S8B）。此外，IFN$\gamma$ 和 TNF 处理诱导了 BAX / BAK 寡聚化（图 5D），而 BAX 缺失则减轻了 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的类器官死亡（图 S8, C 和 D，以及图 5E）。因此，线粒体凋亡是 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的肠道干细胞和结肠细胞死亡的主要机制。

坏死性凋亡信号并非导致 IFNγ 和 TNF 诱导类器官死亡的原因

我们接下来研究了凋亡、坏死性凋亡（necroptosis）和焦亡（pyroptosis）之间的相互作用。在经 IFN $\gamma$ 和 TNF 处理的结肠细胞中，阻断坏死性凋亡既没有减少 caspase-3 的激活，也没有改变 caspase 介导的 RIPK3 切割（图 S9A）。阻断线粒体凋亡未能阻止 RIPK3 和 MLKL 的磷酸化，但确实减少了 RIPK3 的切割，并消除了炎症类器官中 gasdermin E 的切割（图 5F 和图 S9B）。因此，尽管坏死性凋亡和凋亡信号对炎症具有共同的转录响应，但两者可以独立运行，而 gasdermin E 介导的信号是在炎症结肠细胞中由凋亡下游诱发的。

RIPK1 抑制或 ZBP1 缺失均未能阻止炎症结肠细胞中 RIPK3 的激活（图 S9, A 至 D）。类器官中 ZBP1 的缺失同样没有改变 IFNγ 和 TNF 触发的死亡或 caspase-3 切割（图 S9, C 和 D），而 RIPK1 非依赖性的 RIPK3 激活在炎症的 BCL-2 过表达结肠细胞中仍然发生（图 S10, A 和 B）。为了研究炎症结肠细胞中非致死性的坏死性凋亡信号，我们在存在或不存在 RIPK3 或 MLKL 抑制的情况下，对 IFNγ 和 TNF 处理的 BCL2 过表达类器官进行了大宗 RNA 测序（Fig. 5G 和图 S10A）。这种方法表明，在 IFNγ 和 TNF 处理的结肠细胞中，RIPK3 和 MLKL 信号上调了少量基因，包括 NUPR1（图 5H）。NUPR1 是一种应激诱导的转录调节因子，在炎症结肠细胞（图 S10℃）以及 IBD 组织（图 S10D）中均有所增加。RIPK3 和 MLKL 信号诱导 NUPR1 的重要性尚不清楚。因此，IFNγ 和 TNF 处理在结肠细胞中同时促进了非致死性的坏死性凋亡信号和致死性的凋亡信号。

PUMA 驱动肠道干细胞凋亡

为了研究类器官中线粒体凋亡的机制，我们分析了 BCL-2 家族的转录水平，该家族是线粒体凋亡的主调节因子（图 6, A 和 B，以及图 S11A）。相对于干细胞，结肠细胞在基础状态下表达更高水平的促凋亡 -2 家族成员，而 IFNγ 和 TNF 处理进一步加剧了这种促死亡状态（图 6B 和图 S11A）。对公开的单细胞 RNA 测序数据的分析证实，在 IBD 患者中，结肠细胞比未分化的上皮细胞更容易处于促凋亡状态（图 S11B）(51)。-2 家族中这些表达变化与 IFNγ 和 TNF 杀死类器官的能力，以及结肠细胞对此类损伤的高度敏感性是一致的（图 4℃）。

为了鉴定限制上皮凋亡的关键蛋白，我们使用 -2, -XL 和 MCL-1 的抑制剂处理类器官，这些因子能够抵消 BAX 和 BAK 的激活。分析显示，-XL, 但非 -2, 对于防止干细胞和结肠细胞死亡至关重要，且结肠细胞的生存还依赖于 MCL-1（图 6℃）。值得注意的是，拮抗 -XL 和 MCL-1 的促凋亡蛋白 PUMA 在炎症类器官中上调，尤其是在干细胞中（图 6, B 和 D）。因此，我们推测 对 IFNγ 和 TNF 诱导的肠道细胞死亡具有重要作用。为了验证这一假设，我们删除了类器官中编码 的基因 BBC3。BBC3 的缺失保护了干细胞, 但未保护结肠细胞, 免受 IFNγ 和 TNF 诱导的 caspase-3 加工和死亡（图 6, E 至 J）。这表明炎症通过增加 的表达来损害肠道干细胞。支持这一观点且与先前研究 (67) 一致的是，一部分 IBD 患者（在 11 名受试患者中的 4 名）在 caspase-3 切割的上游显示出 水平升高（图 6K 和图 S11℃），这与 本身是 caspase 底物 (68) 的事实一致，并表明 在这些病例中是凋亡的启动因子。

诱导型一氧化氮合酶在 IBD 中上调且高水平表达促进结肠细胞死亡

炎症诱导的结肠细胞凋亡机制尚不明确。我们假设诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 是导致该现象的原因，因为它可以许可巨噬细胞中的线粒体凋亡 $(53)$，且编码 iNOS 的基因 $NOS2$ 在 IBD 组织、炎症结肠细胞 #2 细胞以及炎症结肠细胞类器官中均上调（图 3, A 和 H 至 I，以及图 7, A 和 B）。免疫组化证实，iNOS 水平在 组织中增加，尤其是在炎症上皮内（图 7, C 至 F，以及图 S12, A 至 C）。同样，IFN$\gamma$ 和 TNF 处理在结肠细胞中诱导了 iNOS 和亚硝酸盐（一氧化氮产生的标志物）的产生，在干细胞中的诱导程度较低（图 7, G 和 H）。为了正式验证我们的假设，我们删除了类器官中的 $NOS2$。在结肠细胞类器官中删除 $NOS2$ 减少了 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的亚硝酸盐产生、凋亡 caspase 激活以及细胞死亡（图 7, I 至 L,

A B

C

D

F

G

H

J

图 3. 中的细胞死亡信号与免疫生态位旁炎症结肠细胞的扩张同步发生。(A) 批量 RNA 测序数据。图表显示 生检样本（$n = 26$ 非炎症，$n = 24$ 边缘，以及 $n = 25$ 炎症）相对于非 组织（$n = 23$）中坏死性凋亡和凋亡基因的平均表达量。$\log_{2}$ 倍数变化 $>1$ 或 $<-1$ 且经 Benjamini–Hochberg 多重检验 $P < 0.05$ 的项标有星号。根据表达相似性排序的无监督层次聚类树状图。(B) 预测调节聚类 A-E 的主要转录因子家族（图 S3℃）。(C) 空间转录组 (ST) 数据中所有细胞的均匀流形近似与投影 (UMAP)（图 S4A）。$N = 1,732,121$ 个细胞（下采样至 $1.5 \times 10^{5}$ 个细胞；每个点代表一个细胞）。 生检样本根据炎症的缺失（ 非炎症； RHI 0）或存在（ 炎症； RHI 1+）进行分组（图 S4B）。(D) 伪批量细胞类型的 ST 表达值（计数）。UMAP 显示生检组之间聚类 B 基因集的差异表达。显示 $\log_{2}$ 倍数变化 $>0.5$ 且经 edgeR 准似然 F 检验 $\text{}P < 0.01$ 或 $\text{}P < 0.0001$ 的结果。(E) 上皮细胞的 UMAP。$N = 675,867$ 个细胞（下采样至 $1.5 \times 10^{5}$ 个细胞；每个点代表一个细胞）。(F) 聚类 B $^{+ / -}$ 上皮亚型的比例。经双因素方差分析 (2-way ANOVA) $\text{**}P < 0.001$。

Benjamini-Krieger-Yekutieli。(G) 每份活检中 cluster B $^{+}$ 结肠细胞 #2 的数量。每个点代表一次活检。柱状图为组平均值。根据 1-way ANOVA Kruskal-Wallis 检验，**P < 0.01 且 ****P < 0.0001。(H) IBD 非炎症组中 cluster B $^{+}$（N = 6126 个细胞）与 B $^{-}$ 结肠细胞 #2（N = 101,823 个细胞）之间的差异基因表达。每个点代表一个基因。错误发现率 (FDR) 由 edgeR 的 Benjamini–Hochberg 方法计算。(I) 来自 IBD 非炎症样本的 ST 数据密度图。前三行显示选定基因的相对表达量。左下角显微照片显示 4',6-二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色的细胞核，以及感兴趣线 (LOI) 和地标 (1, 2, 3, 和 4)。右下角图表显示选定基因沿 LOI 的相对表达量。比例尺，1 mm。(J) 距离 B $^{+ / -}$ 结肠细胞 #2 亚群 35 $\mu$ m 范围内的细胞被

进行了伪批量处理（图 S4H）。图表显示 B $^{+}$ 与 B $^{-}$ 邻域之间的差异表达。每个点代表一个基因。(K) FICTURE (130) 描绘。

以及图 S12D）。靶向 NOS2 同样限制了干细胞类器官中的 iNOS 和亚硝酸盐水平，但并未改变 IFN$\gamma$ 和 TNF 诱导的杀伤作用（图 7, M 至 P），这可能是因为炎症状态下的干细胞产生较少的 iNOS 和一氧化氮（图 7, G 和 H）。这些数据表明，IFN$\gamma$ 和 TNF 将 iNOS 增加到足以促进结肠细胞线粒体凋亡的水平。

上皮细胞死亡信号可预测复发

炎症会重构肠上皮，以促进坏死性凋亡（necroptotic）和凋亡（apoptotic）信号（图 8A）。由于这是黏膜病变中一个早期且分级的事件，我们推论，肠道细胞死亡信号的增加可能预示着疾病的进展。为了验证这一假设，我们在招募后对一组 IBD 患者进行了 24 到 36 个月的随访。在入组的 52 名患者中，22 名失访，14 名患者病情稳定且治疗方案未改变（非复发），16 名患者经历了至少一次炎症发作，需要使用皮质类固醇、升级治疗或更换治疗方案（复发；图 8B）。与该队列中疾病活动度得到良好控制的情况一致，大多数患者在招募时具有正常的血清白蛋白和 C 反应蛋白（CRP）水平（图 8, C 和 D）。在基线时，非复发组和复发组之间的 CRP 水平没有检测到差异（图 8D），而随后复发的患者血清白蛋白水平略低，但具有显著性差异（图 8℃）。在随后复发患者的活检样本中检测到了组织炎症迹象的增加（图 8E），这表明存在常规临床生物标志物无法捕捉到的低级别黏膜炎症。与这一观点一致，随后复发的患者体内坏死性凋亡标志物 pRIPK3 的水平高于非 IBD 对照组（图 8F）。在随后复发的 IBD 患者中，还观察到凋亡标志物 cleaved caspase-3 的非显著性增加（图 8G）。因此，炎症的细微增加（通常处于临床检测限或低于检测限）与结肠细胞死亡的非常规机制密不可分，并具有预后价值。

讨论

细胞死亡失调长期以来被认为与炎症性肠病（IBD）有关，最明确的证据来自由细胞死亡调节因子 XIAP、RIPK1 和 CASP8 的先天性缺陷引起的罕见早发性病例 (69-72)。这些单基因机制是否延伸至成人发病的 IBD 尚不清楚。在本研究中，我们发现成人 IBD 患者中的坏死性凋亡（necroptotic）和凋亡（apoptotic）信号并不依赖于 XIAP、RIPK1、CASP8 的缺失或其他形式的细胞死亡去抑制。相反，初期的炎症诱导了特定基因（包括 ZBP1 和 MLKL）的表达，并促进了 RIPK3 的激活。值得注意的是，由于在黏膜病变发展过程中 RIPK3 的激活早于 caspase 的激活，坏死性凋亡信号可能代表了对肠道炎症的前线反应，而非对凋亡受损的次级反应。作为体外先例，已知仅通过改变少数通路组件的表达，即可将凋亡引导至坏死性凋亡的结果 (73, 74)。我们还发现，炎症诱导 PUMA 和 iNOS 的表达，以促进干细胞和结肠细胞的线粒体凋亡。尽管凋亡通常被认为是一个免疫静默过程，但我们的数据表明，它具有引起焦亡蛋白 gasdermin E 激活的潜力。gasdermin E 的激活是否会放大 IBD 中的炎症仍未知。我们的发现可能解释了为什么 IFNγ 和 TNF 的共同给药会导致小鼠肠隐窝死亡 (54)，并赋予了 IBD 患者中 $NOS2^{+}$ 肠上皮细胞扩增的功能意义 (52)。总之，这些结果强调了炎症是 IBD 中上皮可塑性和细胞死亡信号的强效诱导因子。

慢性肠道炎症会增加结直肠癌的风险 (75, 76)。在 IBD 组织中观察到的细胞死亡信号是否会影响炎症相关结直肠癌的风险尚不清楚。细胞死亡相关基因 BBC3、RIPK3、ZBP1 和 MLKL 的多态性在结肠炎相关肿瘤样本中并未富集 (75, 76)。此外，缺失 Ripk3 或 Mlkl 并不会改变小鼠炎症相关结直肠癌的进展 (77)，这表明这些效应因子并不调节炎症驱动的恶性肿瘤。相比之下，NOS2 的突变在结肠炎相关肿瘤患者中有所富集，这表明 iNOS 可能会使发炎的上皮对凋亡更加敏感，从而防御恶性肿瘤的产生 (75, 76)。鉴于其抗肿瘤潜力，iNOS 促进结肠细胞凋亡的精确机制及其在其他上皮模型（如气液界面肠道类器官）中的作用值得进一步研究。

只有在纠正潜在疾病驱动因素的情况下 (78)，IBD 患者才可能实现持久缓解。非经典上皮细胞死亡信号是黏膜病变的一种早期、分级特征，它出现在组织学正常的 IBD 组织中，并可预测复发。在固有层中发现一个使上皮功能发生偏移且在组织学上不明显的生态位，可能也具有预后价值。由于失调的细胞死亡信号在各种治疗方案及缓解期中依然存在，我们认为目前的疗法对其具有耐药性或靶向效率低下。最终，失衡的上皮细胞死亡信号是 IBD 的一个早期预警信号。纠正这一“坏死性凋亡-凋亡”信号轴可能有助于实现 IBD 的“分子愈合”。

材料与方法 抗体

本研究中使用的所有一抗均列于表 S1 中。对于图 2 和图 S2，用于免疫印迹的一抗为：pMLKL (Ab187091, Abcam), MLKL (3H1, 自制 $(18)$；可通过 Sigma-Aldrich 购买，货号 MABC604), RIPK1 (BD 38 / RIP, BD Biosciences), ZBP1 (5H15L56, Invitrogen), CYLD (D6O5O, Cell Signaling Technology), cFLIP (D5J1E, Cell Signaling Technology), TRADD (7G8, ), caspase-8 (D35G2, ), pRIPK3 (D6W2T, ), RIPK3 (1H2, 自制 $(79)$；可通过 Merck 购买，货号 MABC1640), GAPDH (MAB374, Millipore), pRIPK1 (D813A, ), HOIP (E6M5B, ), Sharpin (D4P5B, ), RIPK3 (E1Z1D,

1 A

B

C

D

E 相对于非 IBD 的 $\log_{2}$ 倍数变化 F G

H

图 4. IFN $\gamma$ 与 TNF 协同作用触发肠道类器官死亡。(A) 肠道类器官分化流程及代表性显微照片。比例尺，100 $\mu$ m。(B) 通过定量 PCR (qPCR) 检测干细胞 (LGR5)、杯状细胞 (MUC2) 和结肠细胞 (ALPI, FABP1) 细胞标志物的表达 (n = 4 名捐赠者)。采用双因素方差分析 (Two-way ANOVA) 及 Sidak 多重比较检验。(C 和 D) 使用来自非 IBD 组织的类器官进行 IFN$\gamma$ 和 / 或 TNF 处理。(C) 使用 IncuCyte 成像 (图 S4D) 测量死亡百分比，样本来自 n = 5 名捐赠者。数据为五次实验的平均值 $\pm$ 标准误 (SEM)。采用双因素方差分析及 Sidak 多重比较检验（与未处理组相比；最后三个时间点）。(D) (C) 中处理 21 小时后的代表性显微照片。比例尺，550 $\mu$ m。(E) 选定基因的热图，对比来自 UC 或 CD 患者的肠道活检样本与 (50) 中的非 IBD 患者（上方），或经 IFN$\gamma$ / TNF 处理 3.5 小时的类器官（下方）。(F) (E) 中类器官单个重复样本的差异基因表达分析。所有条目均满足调整后 $P < 0.05$；采用经验贝叶斯调节 t 统计量和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正。(G) 经 IFN$\gamma$ 和 / 或 TNF 处理的类器官的免疫印迹（三次实验中的一次）。

(H) 肠道类器官预处理 (0.5 小时) 使用溶剂 [二甲基亚砜 (DMSO), −]、RIPK3 抑制剂 (GSK872, 简写为 G872)、RIPK1 抑制剂 (Nec1s)、MLKL 抑制剂 (TC13172, 简写为 TC172)、Caspase-1 抑制剂 (VX-765)、NLRP3 抑制剂 (MCC950, 简写为 MCC)、ferrostatin-1 (Fer-1)、liproxstatin-1 (Lipr-1) 或泛 caspase 抑制剂 Q-VD-OPh (QVD)，随后进行 IFN$\gamma$ / TNF 处理 (n = 7 次实验，使用五名捐赠者的类器官，平均值 $\pm$ SEM)。采用双因素方差分析及 Sidak 多重比较检验（与 IFN$\gamma$ / TNF / DMSO 组相比）。(I) 肠道类器官预处理 0.5 小时使用所示的细胞死亡抑制剂，随后进行 IFN$\gamma$ / TNF 处理 (n = 3 次实验，使用五名捐赠者的类器官，平均值 $\pm$ SEM)。采用双因素方差分析及 Sidak 多重比较检验（与 IFN$\gamma$ / TNF / Q-VD-OPh 组相比）。对于所有分析，$P > 0.05$ (ns), *$P \le 0.05$, **$P \le 0.01$, ***$P \le 0.001$, ****$P \le 0.0001$。

Technology), ABIN-1 (4664S, Cell Signaling Technology), cIAP1 (D5G9, Cell Signaling ), cIAP2 (15℃8, 内部制备), caspase-8 (B.925.8, Invitrogen), RIPK1 (D94℃12, ), caspase-3 (9662S, ), -10 (M059-3, MBL), FADD (2782S, ), ADAR1 (E6X9R, ), TAK1 (D94D7, ), OTULIN (EPR1984I, Abcam), MLKL (大鼠, 7G2, 内部制备 (19); 可从 Merck 购买，货号 MABC1636), A20 (D13H3, ), -10 (EPR10890, Abcam), XIAP (EPR22189, Abcam), iNOS (MAB950, R&D Systems), PUMA (98672, ), -6 (9762, )。对于图 4 至 7 以及图 S6 至 S12，免疫印迹使用的一抗为：-3 (9662, ), -8 (9746, ), -9 (9508, ), -10 (M059-3, MBL), pMLKL (Ab187091, Abcam), MLKL (3H1, 内部制备 (18); 可从 Sigma-Aldrich 购买，货号 MABC604), ZBP1 (5H15L56, Invitrogen), pRIPK3 (D6W2T, ), RIPK3 (1H2, 内部制备 (79); 可从 Merck 购买，货号 MABC1640), BCL-XL (2764, ), MCL-1 (5453, ), PUMA (98672, ), β-actin (A-1798, Sigma), GAPDH (MAB374, Millipore), iNOS (MAB9502, R&D), BCL2 (克隆 Bcl-2-100, WEHI), BAK (4B5, WEHI (80)), GSDME (84005S, ), GSDMD (69469, ), GSDMC (HPA026317, Sigma), BAX (49F9, 由 WEHI David Huang 教授内部提供)。

免疫印迹使用的二抗（工作浓度 1:10,000）为：辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的山羊抗大鼠免疫球蛋白 (Ig) (3010-05, Southern BioTech)、HRP 偶联的山羊抗兔 Ig (4010-05, Southern BioTech) 以及 HRP 偶联的山羊抗小鼠 Ig (1010-05, Southern BioTech Cat)。

免疫组化使用的一抗为：-8 (MA5-15226, 克隆 B.925.8; RRID:AB_10978471; 0.619 g / L Thermo Fisher Scientific)、cleaved--3 (9661, ) 和 iNOS (MAB9502, R&D, 1:200)、LGR5 (TA503316, OTI2A2, Thermo Fisher Scientific, 1:300) 以及肠碱性磷酸酶多克隆抗体 (PA5-22210, Thermo Fisher Scientific, 1:200)。

研究伦理

通过皇家墨尔本医院（RMH）胃肠病科对接受内窥镜检查的参与者进行肠道组织采集的伦理批准已获得人类研究伦理委员会（HREC）的认可：HREC 2021.074。此项研究符合国家健康与医学研究委员会（NHMRC）的《人类研究伦理行为国家声明》（2007）以及《药物临床试验质量管理规范指导原则》（CPMP / ICH-135 / 95）。参与单位 WEHI 已获得特定场地的治理许可。涉及机构（RMH、WEHI 和墨尔本大学）之间的协作通过《墨尔本学术健康研究协作协议（非商业性）》正式确立。本研究中的人类研究是根据世界医学协会《赫尔辛基宣言》中表达的原则进行的，并符合美国卫生与公众服务部《贝尔蒙特报告》中阐明的原则。本研究中使用的人类材料均在获得所有受试者签署的知情同意书后获取。

肠道活检样本采集

对由 RMH 胃肠病科计划进行下消化道内镜评估（灵活乙状结肠镜或结肠镜检查）的成年人（无论是否患有 IBD）进行了资格筛选。若患者具有以下情况，则不符合招募条件：活动性感染、活动性恶性肿瘤、同时或目前接受抗肿瘤治疗、过去一个月内使用过非甾体抗炎药、遗传性或家族性息肉病综合征、非 IBD 形式的结肠炎（例如显微镜下结肠炎、缺血性结肠炎、分流结肠炎或憩室炎）。符合条件的患者被招募并签署了知情同意书。从 2021 年 8 月 30 日到 2023 年 4 月 21 日，共招募了 80 名患者（表 S1）。1 名招募的患者因在内镜检查中发现疑似结直肠癌而被排除在本研究之外。对于 IBD 患者，肠道活检样本通过内镜从肠道的相对非炎症区域、边缘炎症区域和炎症区域获取。在 6 次情况下，还从肠道的狭窄区域采集了活检样本（表 S1）。在没有内镜炎症迹象的情况下，活检采集则根据个人之前的疾病活动部位而定（例如，如果一名回肠 CD 患者的 SES-CD 为 0, 则回肠被视为历史上的“炎症”区域，而肠道远端部分被视为“边缘”和“非炎症”部位）。不患有 IBD 的患者（非 IBD 对照组）仅从肠道的非炎症段通过内镜获取活检样本，且每位患者采集的片段具有可比性。活检采集使用了 Boston Scientific Radial Jaw 活检钳和 Olympus EVIS EXERA III 内镜。获取后，匹配的活检样本立即被放入以下冰冷介质中：1. $10\%$ v / v 中性缓冲福尔马林，2) 添加了蛋白酶抑制剂（ThermoFisher Scientific 目录号 A32955）和磷酸酶抑制剂（ThermoFisher 目录号 A32957）的 dPBS（Thermo Fisher 目录号 14190144），3) RNAlater（ThermoFisher 目录号 AM7021），以及 4) 含 $15~\mathrm{mM}$ HEPES（DMEM / F-12, STEMCELL Technologies, 36254）和 $1\%$ w / v 牛血清白蛋白（BSA, Sigma-Aldrich, A4612）的 DMEM / F-12。每个部位 / 每位患者 / 每种介质采集 2 份活检样本。

本研究使用了 16 个独立的肠道类器官系。5 个类器官系由 n = 5 名结直肠癌患者切除肠道组织的健康边缘制备而成。7 个类器官系由图 1 中 n = 7 名非 IBD 患者的肠道活检样本制备而成。4 个类器官系由图 1 中 n = 4 名 IBD 患者的肠道活检样本制备而成。所有患者均提供了书面知情同意书，且该研究获得了所有相关机构人类研究伦理委员会的批准（HREC 2016.249, HREC 2021.074）。

疾病活动的临床评分

在内镜检查当天，对患者进行了访谈以获取同步的临床症状学资料。克罗恩病（CD）患者采用 Harvey-Bradshaw 指数（HBI）进行评分：缓解 0-5；轻度 5-7；中度 8-16；重度 >16 (81)。溃疡性结肠炎（UC）患者采用简易临床结肠炎活动指数（SCCAI）进行评分：缓解 $\le 2$；轻度 3-5；中度 6-11；重度 >12 (82)。

图 5. IFN $\gamma$ / TNF 诱导的肠道类器官死亡通过线粒体凋亡进行。(A 和 B) 野生型对照和 BCL2 过表达类器官经 IFN $\gamma$ / TNF 处理后评估细胞死亡情况（n = 3 名捐赠者，三次实验的平均值 ± SEM）。BCL-XL 抑制剂 A-1331852 (BCL-XLi) 用作线粒体凋亡对照。(B) 在 IFN $\gamma$ / TNF 处理前 0.5 小时，向 BCL2 过表达类器官中加入 BCL-2 抑制剂 ABT199 (BCLi) 并评估细胞死亡情况（n = 3 名捐赠者，三次实验的平均值 ± SEM）。两组之间采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）及 Sidak 多次比较检验。(C) 经强力霉素（+DOX）或强力霉素联合 ABT199 (+DOX+BCL2i) 过夜预处理的强力霉素诱导 BCL2 表达的结肠细胞类器官的免疫印迹，随后按所示加入 IFN $\gamma$ / TNF 或 A-1331852 (BCLXLi) 和 S63845 (MCL1i)（三次实验中的一次）。(D) 对经 IFN $\gamma$ / TNF 刺激的类器官提取的膜组分进行蓝色天然 PAGE 分析（三次实验中的一次）。加入 A-1331852 (BCL-XLi) 和 S63845 (MCL1i) 处理 4 小时作为线粒体凋亡对照。(E) CRISPR / Cas9 靶向 BAX (BAX $^{sgRNA}$) 和对照 (Scramble $^{sgRNA}$) 类器官经 IFN $\gamma$ / TNF 处理后评估细胞死亡情况（n = 3 名不同捐赠者，三次实验的平均值 ± SEM）。BAX $^{sgRNA}$ 组与 Scramble $^{sgRNA}$ 组之间采用双因素方差分析及 Sidak 多次比较检验（最后三个时间点）。(F) 经 IFN $\gamma$ / TNF 处理的强力霉素诱导 BCL2 表达的结肠细胞类器官的免疫印迹分析（三次实验中的一次）。在 IFN $\gamma$ / TNF 处理前 0.5 小时加入 GSK'872 作为坏死性凋亡抑制剂对照。(G 和 H) 强力霉素诱导 BCL2 表达的结肠细胞类器官（n = 3 名捐赠者）经强力霉素过夜预处理，随后加入 GSK'872、TC13172 或 DMSO 处理 0.5 小时。随后类器官经 IFN $\gamma$ / TNF 处理 8 小时并收获用于大体 RNA 测序。(G) 实验示意图。(H) 火山图显示，与 DMSO 对照组相比，所有坏死性凋亡抑制剂组中的 NUPR1 均下调。所有统计分析中，P > 0.05 (ns)，*P $\le$ 0.05，**P $\le$ 0.01，***P $\le$ 0.001，****P $\le$ 0.0001。

肠道炎症的内镜评分

克罗恩病（CD）患者采用简易内镜评分（SES-CD）：0-2（缓解），2-6（轻度）；6-15（中度），>15（重度）(83)。溃疡性结肠炎（UC）患者采用 Mayo 内镜评分：0（正常 / 无活动），1（轻度），2（中度），3（重度）(84)。

IBD 临床生物标志物评估

根据 IBD 标准指南监测方案 (85)，患者接受了静脉采血以测量关键血液生物标志物，包括 C 反应蛋白 (CRP) 和白蛋白：CRP < 5 mg / L 为正常；白蛋白 < 35 g / L 为降低。患者还需提供粪便样本以测量粪钙卫蛋白，水平 >50 $\mu$ g / g 被认为因肠道炎症而升高。若这些检测是在内镜活检采集和临床评估前六周内进行的，则将其结果纳入分析。

临床结果随访

在最后一名患者入组后，对电子医疗记录进行了长达 24-36 个月的审查。疾病复发的定义基于以下记录证据：临床症状复发、生化复发（CRP 或钙卫蛋白升高）、内镜或组织学疾病活动度、或因 IBD 相关住院而需要使用皮质类固醇；治疗升级或医疗方案变更；以及 IBD 相关手术。若患者搬迁且医疗护理转移至外部机构，或未能参加后续预约，则被视为失访。

类器官的生成与分化

新鲜的人类肠道样本被采集并保存在含有 15 mM HEPES 的 DMEM / F-12（DMEM / F-12, STEMCELL Technologies, 36254）中，其中包含 100 $\mu$ g / ml Primocin（Invivogen, ant-pm-05）和 1% w / v 牛血清白蛋白（BSA, Sigma-Aldrich, A4612），直至进一步处理。样本用含有 100 $\mu$ g / ml Primocin 和 20 $\mu$ g / 庆大霉素（Gentamicin, Thermo Fisher Scientific, 15710064）的 5 磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤 3 次，然后在含有 100 $\mu$ M 二硫苏糖醇（dithiothreitol, Merck, 10197777001）的 3 mM EDTA 螯合缓冲液（Sigma-Aldrich, E5134）中，在室温下消化 $\sim$ 30 分钟，期间定期摇晃以促进隐窝（crypt）释放。通过简短的离心收集隐窝，并将其重新悬浮在含有 1% w / v BSA 的 DMEM / F-12 中。

随后，采用 $(86)$ 中描述的低粘度基质悬浮培养法生成并培养类器官。简而言之，使用 1 含有 5% Matrigel 基质（Bio-strategy, BDAA354234）、100 U / 青霉素-链霉素（penicillin-streptomycin, Life Technologies, 15140122）、10 $\mu$ M Rho 激酶抑制剂 Y27632（Stemcell Technologies, 72308）和 20 $\mu$ g / 庆大霉素的 IntestiCult $^{™}$ 类器官生长培养基（人类）（OGM, STEMCELL Technologies, 06010），将隐窝重新悬浮并接种于无菌的 24 孔未处理组织培养板（Falcon, 351147）中。培养板在 37℃、5% CO $_{2}$ 条件下孵育。每两天通过向每孔添加 200 $\mu$ L 新鲜 OGM 来更换一次培养基。在 7 到 14 天内获得成熟的类器官。

对于传代，类器官通过在 4℃ 下以 300 xg 离心 3 分钟来收集。沉淀用冰冷的 PBS 洗涤一次，然后在 37℃ 下与 TrypLE Express 酶（Thermo Fisher Scientific, 12604021）孵育 10 分钟以进行细胞解离。细胞在 10,000 xg 下离心 30 秒，通过加入 1 含有 1% BSA 的 DMEM / F-12 来终止消化。然后使用 26 G 针头将细胞沉淀机械解离成单细胞，并重新接种到无菌、未处理的 24 孔板中，接种密度为每孔 $1 \times 10^{5}$ 个细胞，最终体积为 1 补充了 5% Matrigel 基质和 10 $\mu$ M Rho 激酶抑制剂 Y27632 的 OGM。培养板在 37℃、5% CO $_{2}$ 条件下孵育，每两天通过向每孔添加 200 $\mu$ L 新鲜 OGM 来更换一次培养基。在 7 天内获得成熟的类器官。

为了获得结肠细胞类器官，收集第 4-6 天的未分化类器官，用冰冷的 PBS 洗涤两次，并重新悬浮在补充或不补充 $10~\mu \mathrm{M}$ IWP-2（STEMCELL Technologies, #72122）和 $5\%$ Matrigel 基质的 IntestiCult™ 类器官分化培养基（人类）（ODM, STEMCELL Technologies, 100-0214）中。随后将重新悬浮的类器官重新接种并在 $37^{\circ}\mathrm{C}$、 $5\%$ $\mathrm{CO}_{2}$ 条件下孵育。分化 4 天后，将类器官用于实验。

细胞系与培养

HT29 (ATCC, HTB-38)、HEK293T (ATCC, CRL-3216)、MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26) 和 HepG2 (ATCC, HB-8065) 细胞最初来源于美国标准细胞库（American Type Culture Collection）。$RIPK1^{- / -}$、$RIPK3^{- / -}$、$MLKL^{- / -}$ HT29 细胞此前已有报道 (87–89)。对于多西环素 (dox) 诱导的 NOS2 HEK293T 细胞，将 pLIX403-hNOS2 (90)（由 Edward Morgan 提供，Addgene 质粒 #110800）与 pMDL（包装）、RSV-REV（包装）和 VSVg（包膜）共同转染至 HEK293T 细胞中，使用稀释在 OptiMEM (Thermo Fisher Scientific) 中的 Lipofectamine 2000 在 DMEM 中产生慢病毒颗粒。48 小时后收集细胞培养上清液，并在细胞转导前通过 0.45 $\mu$ m 过滤器过滤。慢病毒转导通过将正常的细胞培养基更换为含有慢病毒颗粒的 DMEM 并维持 24 小时来完成。转导阳性细胞通过 puromycin (2 $\mu$ g / ml) 筛选 3 天。

虽然细胞系的形态及其对细胞死亡刺激的反应与其所述来源一致，但未对其来源进行进一步验证。每 $\sim$ $ 6 个月通过聚合酶链式反应对细胞系进行监测，以确认其无支原体污染。人类细胞系维持在含有 8-10% v / v 胎牛血清 (FBS, Sigma-Aldrich)、L-谷氨酸和 50 U / ml 青霉素、50 $\mu$ g / ml 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM, Gibco, Life Technologies) 中，置于 37℃ 和 10% $\mathrm{CO}_{2}$ 的加湿培养箱中。

小鼠巨噬细胞的制备

骨髓源性巨噬细胞的制备方法如所述 $(53)$。从股骨和胫骨中采集骨髓细胞，并在含有 10% FBS、50 U / ml 青霉素、50 $\mu$ g / ml 链霉素和 15-20% L929 细胞条件培养基的 DMEM 中培养 6 天，并在第 3. 天额外添加 10 ml 20% (v / v) 的 L929 细胞条件培养基。采集后第 6. 天，将分化的 BMDM 以每孔 $5 \times 10^{5}$ 个细胞的密度重新接种于 24 孔板中，培养基为 500 $\mu$ L DMEM / FCS 和 20% L929 条件培养基，并在第 7 天用于实验。

A

图 6. IFN $\gamma$ / TNF 诱导的干细胞类器官高效死亡需要 PUMA。 (A) 显示 BCL-2 促生存家族成员与促死亡成员之间相互作用的示意图。(B) 3' mRNA 测序（n = 3 名供体）中，未经处理和经 IFN $\gamma$ / TNF 处理的类器官中促凋亡基因（左）或促生存基因（右）的归一化转录本计数总和。(C) 干细胞类器官（n = 4 名供体，符号）或结肠细胞类器官（n = 3 名供体，符号）使用 BH3 模拟物处理 24 小时：

ABT-199 (BCL2i), A-1331852 (BCL-XLi), 或 S63845 (MCL1i)，并评估细胞死亡情况（四次实验的平均值 ± SEM）。采用 Tukey 多重比较检验的一元方差分析（与未处理组相比）。(D) 经 IFN$\gamma$ / TNF 处理的类器官的免疫印迹分析（三次实验中的一次）。(E 和 F) CRISPR / Cas9 靶向 BBC3 (BBC3 $^{sgRNA}$ ) 和对照 (Scramble $^{sgRNA}$ ) 的干细胞类器官经 IFN$\gamma$ / TNF 处理并评估细胞死亡情况（n = 3 名供体，三次实验的平均值 ± SEM）。采用 Sidak 多重比较检验的双因素方差分析。针对每种处理（最后三个时间点），在 Scramble $^{}$ 和 BBC3 $^{}$ 类器官之间进行比较。(F) 干细胞类器官经 IFN$\gamma$ / TNF 处理 21 小时后的代表性 IncuCyte 图像。比例尺，400 $\mu$m（左）；200 $\mu$m（右）。(G) 经 IFN$\gamma$ / TNF 处理 24 小时的 BBC3 $^{}$ 和 Scramble $^{}$ 干细胞类器官的免疫印迹（三次实验中的一次）。(H 至 J) 结肠细胞类器官按照 (E)、(F) 和 (G) 中所示进行处理和分析。(K) 显示患者肠道活检样本中 PUMA 和剪切型 caspase-3 水平的代表性免疫印迹。图中显示了每位患者的编号 (NM)、IBD 亚型 (UC / CD)、治疗方案以及每个活检部位的组织病理学评分 (RHI)。蓝色箭头表示 caspase-3 的激活形式。灰色箭头表示每种蛋白质的全长形式。对于所有统计分析，P > 0.05 (ns), *P $\le$ 0.05, **P $\le$ 0.01, ***P $\le$ 0.001, ****P $\le$ 0.0001。

类器官刺激

类器官在未涂层的 24 孔组织培养板中用 OGM 维持至第 7, 天，然后通过 300g 离心 3 分钟进行收集。沉淀物用冰冷的 PBS 洗涤一次，随后分别重新悬浮于含有 5% Matrigel 基质的 OGM（用于干细胞类器官）或补充了 10 $\mu$ M IWP-2 和 5% Matrigel 基质的 ODM（用于结肠细胞类器官）中。随后将 300-500 个类器官以三复孔形式接种于未处理的 96 孔组织培养板（Falcon, 351172）中，每孔加入 50 $\mu$ L 培养基。周围的孔用 PBS 填充，并将培养板置于 37℃、5% CO $_{2}$ 的培养箱中孵育直至处理。

除非图注中另有说明，类器官分别使用以下试剂处理：IFN$\gamma$ (50 ng / ml, R&D, 285-IF-100)、IFN$\alpha$ (100 U / ml, PBL assay science, 11101-2)、$\beta$ (100 U / , Rebif 44, Merck Serono)、$\lambda$1 (100 ng / , R&D, 1598-IL-025)、$\lambda$3 (100 / , R&D, 5259-IL-025)、人 Fc-TNF (50 / , 自制 (91))、LPS (50 / , InvivoGen; tlrl-3pelps)、Pam-3-CSK4 (500 / , InvivoGen; tlrl-pms)、PolyI:C (10 $\$g / , InvivoGen; tlrl-picw)、FAS 配体 (10 / , Peprotech, 310-03H)、TRAIL (5 / , 自制)。在涉及多个时间点的情况下，刺激按反向时间顺序进行，以便所有类器官在同一时间被收获。其他处理试剂包括：Necrostatin-1s (10 $\$M, nec1s, Merck, 504297)、GSK'872 (10 $\$M, SynKinase, SYN-5481)、TC13172 (5 $\$M, MedChemExpress #HY-101524)、GSK'481 (1 $\$M, Sapphire Bioscience, #13-20309)、VX-765 (40 $\$M, Selleck, S2228)、MCC950 (10 $\$M, 由澳大利亚昆士兰大学 A. Roberson 和 M. Cooper 慷慨提供)、Ferrostatin-1 (20 $\$M, Fer-1)、liproxstatin-1 (40 $\$M, Lipr-1)、Q-VD-OPh (40 $\$M, QVD, MedChemExpress, HY-12305)、IDN-6556 (20 $\$M, 由 Idun Pharmaceuticals 提供)、人 Fas 配体 / TNFSF6 抗体 (10 $\$g / , R&D, MAB126)、人 TRAIL / TNFSF10 抗体 (10 $\$g / , R&D, MAB375)、RAS-选择性致死 3 (RSL3, 20 $\$M)、ABT-737 (1 $\$M, Active Biochem; A-6044)、环己酰亚胺 (10 $\$g / , Sigma; C7698)、TNF (50 / )、Smac 模拟物 (1 $\$M, Compound A, TetraLogic Pharmaceuticals)、Q-VD-OPh (20 $\$M)、ABT-199 (1 $\$M, BCL2 抑制剂, Active Biochem; A-1231)、S63845 (10 $\$M, MCL1 抑制剂, Active Biochem; A-6044) 以及 A-1331852 (2 $\$M BCL-XL 抑制剂; AbbVie, 由 WEHI 的 Guillaume Lessene 提供)。

细胞系处理

MDA-MB-231 和 HepG2 细胞以每孔 $2 \times 10^{4}$ 个细胞的密度接种于 96 孔板中，加入 100 $\$ L 含有 10% FCS 的 DMEM。细胞贴壁后，MDA-MB-231 细胞用重组人 $\gamma$ (50 / ) 预处理过夜，随后用 TRAIL (50 / ) 处理 48 小时。在 TRAIL 处理前 30 分钟加入 TRAIL 中和抗体 (10 $\$g / )。HepG2 细胞用 Actinomycin D, Streptomyces sp (0.5 $\$g / , Sigma-Aldrich, 114666) 和 FAS 配体 (100 / ) 处理 48 小时，在 FAS 配体处理前 30 分钟加入人 Fas 配体 / TNFSF6 抗体 (10 $\$g / )。BMDMs 用 LPS (100 / ) 预处理 3 小时，随后用 Nigericin (10 $\$M, Sigma; N7143) 处理。Dox-诱导-NOS2 HEK293T 细胞以每毫升 $1 \times 10^{6}$ 个细胞的密度接种于 10 厘米培养皿中，然后用多西环素 (1 $\$g / , Sigma-Aldrich) 处理过夜。

为了制作用于免疫印迹的细胞培养标准品，HT29 细胞在含有 8% v / v FCS 的 DMEM 中进行处理。处理培养基中补充了：100 / 重组人 TNF-$\alpha$-Fc（如 (91) 中所述自制）、500 nM Smac 模拟物（由 Tetralogic Pharmaceuticals 提供）和 5 $\$M IDN-6556（由 Idun Pharmaceuticals 提供）。HT29 细胞处理时间为 7.5 小时。

通过核糖核蛋白和电穿孔对类器官进行 CRISPR 基因编辑

使用 Integrated DNA Technologies (IDT) 的 Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统和已发表的方案 (92) 生成了人类 NOS2 和 BAX 敲除的肠道类器官。Alt-R™ -Cas9 crRNA (2 nM) 使用 IDT 的在线软件 (https: / www.idtdna.com / site / order / designtool / index / _PREDESIGN) 设计。crRNA 序列列于表 S1 中。为了形成 gRNA，将 crRNA 和 Alt-R -Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550 (5 nM, IDT, 1075927) 重新悬浮至 100 μM 并混合至最终浓度 50 μM，加热至 95℃ 保持 5 分钟，然后冷却至室温。为了形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物，将 Alt-R™ S.p. Cas9-GFP V3 (100 μg, IDT, 10008100) 稀释至 5 μg / μL，并与 gRNA (50 μM) 按 1:2.5 的摩尔比混合 (3 μl sgRNA + 2.3 μl Cas9)。混合物在室温下孵育 20 分钟。

收获成熟的类器官（第 7 天）并将其消化成单细胞悬液，每次电穿孔反应使用 $1 \times 10^{6}$ 个细胞。细胞在 4℃ 下以 300 g 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤两次，并重新悬浮在 20 $\mu$ L 的 P3 初级核转染溶液 (Lonza, V4XP-3032) 中。核转染混合物由 5.3 $\mu$ L RNP 复合物、1.2 $\$ L IDT 电穿孔增强剂 (1075915) 和 20 $\$ L 细胞 / P3 核转染溶液组成，总体积为 30 $\$ L。将混合物加入提供的 Nucleocuvette Strip 中，使用 4D-Nucleofector Core Unit (Lonza, AAF-1003B) 和 4D-NucleofectorTM X Unit (20 $\$ L 规格) (Lonza, AAF-1003X) 在程序代码 DS-138 下进行转染。

电穿孔后立即将细胞转移至 Eppendorf 管中，用冰冷 PBS 洗涤，并重新悬浮在含有 DAPI (Thermo Fisher Scientific, 00-4959-52) 用于活力染色的 500 $\$ L 荧光激活细胞分选 (FACS) 缓冲液中。细胞悬液通过 40 $\$ m 过滤器，并通过 FACS 分选以分离 DAPI 阴性且 ATTO 550 和 GFP 均为阳性的单个活细胞。分选后的细胞收集在含有 1% BSA 和 10 $\$ M Y27632 的 DMEM / F-12 的 Eppendorf 管中。收集的细胞在返回至未处理的 24 孔板进行扩增前，用新鲜的含有 5% 基质胶 (matrix gel) 和 10 $\$ M Y27632 的 OGM 洗涤并重新悬浮。类器官培养 7-10 天后收获，通过免疫印迹法评估基因组编辑效率，详见相关图表及图注。

利用病毒转导对类器官进行基因改造

设计了 BBC3 sgRNA 或随机序列（scramble）sgRNA，并将其克隆到 lentiCRISPR v2 Cas9 骨架中（由 F. Zhang 慷慨赠送，http: / n2t.net / addgene:52961；RRID:Addgene_52961）(93)。使用慢病毒转导将 sgRNA（列于表 S1）引入肠道类器官中。慢病毒颗粒的产生基于此前描述的 CRISPR / Cas9 方案 (94)。简而言之，将 HEK293T 细胞以每孔 $1 \times 10^{6}$ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。将 $1.48\mu \mathrm{g}$ 质粒 DNA 和慢病毒包装载体（$0.74\mu \mathrm{g}$ pMDL、$0.37\mu \mathrm{g}$ RSV-REV、$0.44\mu \mathrm{g}$ VSVg）与 Lipofectamine 2000（Thermo Fisher, 11668027）及 OptiMEM 混合，并根据制造商的方案添加到细胞中。混合物孵育过夜，然后

B

C

E

F

G

1

J

K

M

N

0

P

图 7. 在 IBD 组织中检测到 iNOS 增加，且其可促进 IFN $\gamma$ / TNF 诱导的结肠细胞类器官杀伤。(A) IBD 患者相对于对照组患者的 NOS2 增加。数据综合自 26 项研究 (50)。(B) 火山图显示 IFN $\gamma$ / TNF 处理的结肠细胞类器官与未处理类器官相比的差异表达基因（DEGs）和 NOS2 水平。(C 和 D) 患者与非 对照组肠道活检样本中 iNOS 水平的代表性免疫印迹及其相应的定量分析 (D)（平均值 ± 标准误，每组 n=7）。更多免疫印迹请参见图 S12。图中显示了每个活检部位的患者研究编号 (NM)、 亚型 (UC / CD)、治疗情况和组织病理学评分 (RHI)。(E 和 F) 肠道活检样本中 iNOS 免疫组化代表图 (E) 及其定量分析 (F)（平均值 ± 标准误，n=5 名 患者和

$n = 4$ 名非 IBD 对照患者）。iNOS 染色的其他示例请参见图 S12。比例尺：$200\mu \mathrm{m}$（上）；$20\mu \mathrm{m}$（下）。(G 和 H) 干细胞和结肠细胞类器官经 IFN $\gamma$ 和 / 或 TNF 处理，随后 (G) 通过免疫印迹测量 iNOS 表达（三次独立实验中的一次），或 (H) 定量 24 小时后的亚硝酸盐 (${NO}_2^-$) 产量（$n = 4$ 名捐赠者 [符号]，四次独立实验的平均值 $\pm$ SEM）。(I 至 K) 指定的结肠细胞类器官经 IFN $\gamma$ 和 TNF 处理，并评估细胞死亡情况 (I)（$n = 3$ 名捐赠者，三次独立实验的平均值 $\pm$ SEM）。统计分析采用双因素方差分析 (two-way ANOVA) 及 Sidak 多重比较检验。对比组为 Control $^{{sgRNA}}$ 组与相应的 NOS2 $^{{sgRNA}}$ 组。为了清晰起见，仅展示最后三个时间点的统计分析结果。(J) 中显示了 IFN $\gamma$ / TNF 处理的肠道类器官代表性图像。比例尺：$400\mu {m}$（左）；$200\mu {m}$（右）。亚硝酸盐 (${NO}_2^-$) 产量在 24 小时后进行测量 (K)（$n = 3$ 名捐赠者，三次独立实验的平均值 $\pm$ SEM）。(L) 经 IFN $\gamma$ 和 TNF 处理 24 小时的结肠细胞类器官的免疫印迹分析。显示的是三次独立实验中的一次。更多重复实验请参见图 S12D。(M 至 P) 干细胞类器官的处理和分析方法与 (I)、(J)、(K) 和 (L) 相同。

A

B

C

D

E

F

G

图 8. 上皮细胞死亡信号增加预示疾病复发。(A) 提出的非经典坏死性凋亡向凋亡转换的上皮信号机制，该机制出现在 IBD 患者中，且与疾病亚型或治疗选择无关。(B) 对 IBD 患者从招募（基线）起进行监测，患者在随后的 3 年内分为失访 (LTFU)、维持相同治疗方案（未复发）或需要升级 / 更改治疗方案（复发）（表 S1）。(C 和 D) IBD 患者基线时的血清白蛋白水平和血清 CRP。(P < 0.01，采用非配对 t 检验)。每个点代表一名患者。标出了血清白蛋白 (34 至 50 g / 升) 和 CRP (0 至 5 mg / 升) 的正常范围。(E 至 G) 每位患者采集的最严重炎症活检样本的组织病理学评分 (E)，以及基线时的 pRIPK3 水平 (F) 或剪切 caspase-3 水平 (G)。每个点代表一次活检。(P < 0.01，(E) 采用单因素方差分析 [1-way ANOVA] 及 Dunnett 校正，(F) 和 (G) 采用单因素方差分析及 Tukey 校正)。

次日更换为含有 10% FCS 的 DMEM。48 小时后收集病毒上清液，通过 0.45 $\mu$ m 过滤器过滤，并根据制造商说明使用 Lenti-X 浓缩仪 (Takara Bio, 631232) 浓缩 20 倍。慢病毒颗粒重新悬浮于 OGM 中，分装并储存于 -80℃。转染的 HEK293T 细胞用含有 10% FCS 的 DMEM 培养基更新，并在转染 72 小时后重复上述步骤。

培养七天的类器官被消化成单细胞，用于慢病毒转导。细胞被重新悬浮在 250 $\mu$ L OGM 中，并接种到未经处理的 24 孔板中，每孔 $2 \times 10^{5}$ 个细胞，然后与 250 $\mu$ L 浓缩慢病毒颗粒混合，其中添加了 8 $\$ g / ml Polybrene (Sigma-Aldrich, TR-1003) 和 10 $\$ M Y27632。每个基因靶向实验使用四个孔。将培养板在 32℃ 下以 600 g 离心一小时，随后在 37℃、5% CO $_{2}$ 条件下孵育 6 小时。孵育后，收集细胞，洗涤，并重新悬浮在含有 5% 基质凝胶和 10 $\$ M Y27632 的新鲜 OGM 中，然后将其放回未经处理的 24 孔板中以允许类器官生长。对于嘌呤霉素筛选，基因修饰的类器官被消化成单细胞，并在含有 5% 基质凝胶和 10 $\$ M Y27632 的 OGM 中与嘌呤霉素 (2 $\$ g / ml) 共培养 3 天。收集存活的类器官，洗涤，并重新悬浮在含有 5% 基质凝胶和 10 $\$ M Y27632 的新鲜 OGM 中，然后将其放回未经处理的 24 孔板中继续生长。含有多西环素诱导的人 BCL2（克隆至 pFTRE3G PGK puro (18)）的慢病毒颗粒以同样的方式产生。

人类 ZBP1 敲除肠道类器官是通过两步 CRISPR 策略产生的。首先，通过慢病毒转导建立稳定表达 Cas9 的类器官。Cas9-mCherry 构建体（由 Marco Herold 实验室慷慨赠送）按照上述方法包装成慢病毒颗粒。转导后，类器官扩增 7 天，并通过 FACS 分离 mCherry 阳性细胞，以产生表达 Cas9 的类器官系。经过 1-2 代传代以允许恢复和扩增后，将表达 Cas9 的类器官解离成单细胞，并用靶向 ZBP1 的合成 gRNA 或非靶向随机对照 gRNA（序列列于表 S1）进行电穿孔。对于每次电穿孔反应，将 $1 \times 10^{6}$ 个细胞重新悬浮在 P3 初级核转染溶液中，并使用 4D-Nucleofector 系统 (Lonza) 的 DS-138 程序进行电穿孔。电穿孔后立即洗涤细胞，并重新悬浮在添加了 $5\%$ 基质凝胶和 $10~\ \mathrm{M}$ Y27632 的 OGM 中，然后接种在未经处理的 24 孔板中进行恢复和扩增。

为了组成性过表达人类 BCL2，使用逆转录病毒 pMIG BCL2 FLAG IRES GFP 质粒（由 John Silke 实验室赠送），通过 Lipofectamine 2000 将 HEK293T 细胞与逆转录病毒包装载体 (VSVg 和 gagpol) 共转染来产生逆转录病毒颗粒，在 10 厘米培养板中每孔使用 4 $\$ g 和 6 $\$ g。收集病毒上清液，过滤，并根据制造商的说明使用 Retro-X $^{™}$ Concentrator (Takara Bio, 631455) 浓缩 20 倍，然后按照与慢病毒转导相同的步骤（见上文）用病毒颗粒感染类器官。使用 GFP $^{+}$ 细胞的细胞分选来富集过表达 BCL2 的类器官。简而言之，将感染的类器官消化成单细胞，并重新悬浮在添加了碘化丙啶 (PI, 10 $\$ g / ml) 和 10 $\$ M Y27632 的 FACS 缓冲液 (PBS 中含 1% FCS) 中。利用荧光激活细胞分选，将 GFP 阳性的单个活细胞 (PI 阴性) 分选到含有 1% BSA 和 10 $\$ M Y27632 的 DMEM / F-12 Eppendorf 管中。收集的细胞经洗涤并重新悬浮在含有 5% 基质凝胶和 10 $\$ M Y27632 的新鲜 OGM 中，然后将其放回未经处理的 24 孔板中进行扩增。

组织学与免疫组化

对于细胞沉淀：将经过胰蛋白酶处理的细胞在室温下以 $670 \times g$ 离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于 10% (v / v) 中性缓冲福尔马林中，在室温下孵育 15 分钟，然后再次在室温下以 $670 \times g$ 离心 3 分钟。将细胞沉淀重新悬浮于 50 -70 $\mu$ L 预热至 56℃ 的 HistoGel（Epredia 目录号 HG-4000-012）中，然后用移液枪滴加到冰冷的玻璃盖玻片上使其凝固。凝固后的沉淀储存于 70% (v / v) 乙醇中，直至进行样本处理和石蜡包埋（Tissue-Tek VIP 6 AI）。

对于类器官：从 96 孔板的 2-3 个孔中收集类器官并转移至 Eppendorf 管中。在 10,000 rpm 下离心 1 分钟后，将类器官沉淀轻轻重新悬浮于 1 ml PBS 中。为确保去除残留的 Matrigel，将类器官样本置于冰上 1 小时，随后在 10,000 rpm 下离心 1 分钟。将沉淀重新悬浮于 55-60℃ 预热的 HistoGel 中，轻轻移液，并放置在预冷的盖玻片上。在 4℃ 下凝固 15 分钟后，将凝胶圆顶在 4℃ 的 10% 福尔马林中固定过夜。随后将固定后的圆顶转移至冷冻模具中，准备进行石蜡包埋。随后的组织学或免疫组化分析在切片的石蜡包埋类器官上进行，使用针对 LGR5 的抗体（克隆 OTI2A2, Thermo Fisher Scientific, TA503316, 1:300, 见 (86) 描述）。对于肠碱性磷酸酶多克隆抗体 (ALPI) 染色，切片在 97℃ 下用低 pH 修复缓冲液（-2）处理 30 分钟，然后在 Dako Omnis 平台上用 ALPI（目录号 PA5-22210, 1:200）染色 1 小时，随后用二抗染色 30 分钟，接着用底物显色剂 (DAB)（DAKO, GV82511-2）处理 10 分钟，并用苏木精进行复染。使用 Olympus VS200 扫描仪在 60x 物镜（数值孔径 1.42，浸油）下对载玻片进行扫描。显示的肠道组织和类器官免疫组化图像使用 ImageJ (96) 进行处理，亮度与对比度调整至 0-235 范围，伽马值设置为 1.5。

肠道炎症的组织病理学评分

使用 Robarts 组织病理学指数 (RHI) 来衡量活检样本中的 IBD 活动度 $(97)$。评分由一名具有胃肠道专业知识的解剖病理学家根据福尔马林固定石蜡包埋活检切片的苏木精-伊红染色载玻片进行。载玻片在疾病状态（对照组或 IBD）和炎症状态（非炎症、边缘或炎症）方面进行了去标识化处理，但活检的解剖位置是已知的。当样本因高水平炎症和组织异常（例如，组织主要由炎症性中性粒细胞渗出物组成）而无法评分时，将被赋予一个 15 的伪评分，这可能低估了疾病活动程度。

iNOS 表达的免疫组化定量

使用 QuPath (v0.4.3) (95) 对图像进行分析。手动定义一个感兴趣区域以覆盖整个切片。随后对棕色 DAB 信号进行阈值处理，以分离 iNOS 阳性区域。然后测量 iNOS 阳性区域占整个切片的百分比。

细胞和组织蛋白裂解物

对于人类组织裂解物：将活检样本从冰冷的 dPBS 转移至 0.4 ml 冰冷的 RIPA 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 0.5% v / v Triton X-100, 0.1% w / v 脱氧胆酸钠, 0.5% w / v SDS, 以及 90 mM NaCl）中，其中添加了 1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Cell Signaling Technology 目录号 5872）和 100 U / ml Benzonase（Sigma-Aldrich 目录号 E1014），随后使用 Qiagen TissueLyzer II（30 Hz, 1 分钟）通过不锈钢球轴承进行匀质化。对于类器官裂解物：收集约 1000-2000 个类器官，用冰冷的 PBS 洗涤两次，并在 60-120 μL 冰冷的 RIPA 缓冲液中进行裂解，其中添加了 cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物（Roche Biochemicals, 11697498001）、磷酸酶抑制剂（Merck, 4906837001）和 100 U / ml Benzonase（Sigma-Aldrich 目录号 E1014）。HT29 或 HEK293T 细胞在添加了 cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂和 100 U / ml Benzonase 的 RIPA 缓冲液中进行裂解。

免疫印迹

裂解液的蛋白质浓度是根据制造商的说明，使用 Pierce™ BCA 蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific, 23225）测定的。对于图 2 和图 S2，$20\mu \mathrm{g}$ 的 HT29 细胞裂解液和 $40 - 50~\mu \mathrm{g}$ 的组织裂解液在 Laemmli 样品缓冲液（126 mM Tris-HCl, pH 8, $20\%$ v / v 甘油, $4\%$ w / v SDS, $0.02\%$ w / v 溴酚蓝, $5\%$ v / v 2-巯基乙醇）中煮沸 10 分钟，并使用 MES 运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific 目录号 NP000202）通过 $4 - 12\%$ Bis-Tris 凝胶（Thermo Fisher Scientific 目录号 NP0335BOX）进行分级。注：患者裂解液始终与 HT29 细胞标准品同时运行，以便在本研究中对免疫印迹数据进行定量比较。在转移至聚偏二氟乙烯（Merck 目录号 IPVH00010）后，凝胶按照制造商的说明（Thermo Fisher Scientific 目录号 LC6060）进行考马斯亮蓝染色，且膜在含有 $0.1\%$ Tween 20 的 TBS（TBS+T）中用 $5\%$ w / v 牛脱脂奶粉进行封闭，然后使用一抗（大鼠一抗稀释比例为 1:2000，其他一抗在添加了 $0.01\%$ w / v 叠氮化钠的封闭缓冲液中稀释比例为 1:1000；详见“抗体”部分）在 $4^{\circ}\mathrm{C}$ 下孵育过夜，用 TBS + T 洗涤两次，用适当的 HRP 偶联二抗（详见“抗体”部分）进行检测，用 TBS + T 洗涤四次，最后在 ChemiDoc Touch 成像系统（Bio-Rad）上通过增强化学发光（Merck 目录号 WBLUF0100）显现信号。在检测来自同一物种的一抗之间，膜在室温下用洗脱缓冲液（200 mM 甘氨酸 pH 2.9, $1\%$ w / v SDS, $0.5\mathrm{mM}$ TCEP）孵育 30 分钟，然后重新封闭。

对于所有其他免疫印迹图，蛋白质浓度被调整为 1 mg / ml。随后将裂解液与 SDS-PAGE 样品缓冲液混合。裂解液中的蛋白质使用 4%-12% 梯度凝胶（Invitrogen）进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜（Amersham）或 Immobilon-P 聚偏二氟乙烯膜（Merck Millipore; IEVH85R）上。为了确保类器官裂解液的蛋白质上样准确，常规进行 Ponceau 染色。膜在室温下用 (TBS+T) 中的 5% 脱脂奶（Devondale）封闭 30 分钟。封闭后，膜与一抗在 4℃ 下孵育过夜。一抗稀释在含有 0.04% 叠氮化钠的 5% BSA TBS+T 中，除非另有说明，稀释比例通常为 1:1000。在检测来自同一物种的一抗之间，膜在室温下用洗脱缓冲液（200 mM 甘氨酸 pH 2.9, 1% w / v SDS, 0.5 mM TCEP）孵育 30 分钟，然后重新封闭。详见“抗体”部分。适当的 HRP 偶联二抗（详见“抗体”部分）在 TBS+T 中的 5% 脱脂奶中按 1:5000-10,000 稀释，并在室温下作用于膜 1 小时。在抗体孵育之间，膜用 TBS+T 洗涤三次，每次 5 分钟；在二抗孵育后，洗涤四次，每次 5 分钟。膜使用 ECL（Millipore, Bio-Rad）显影，并使用 Image Lab v6.1（Bio-Rad）在 ChemiDoc Touch 成像系统（Bio-Rad）上进行可视化。

对于 BN-PAGE 免疫印迹，类器官使用 0.025% (w / v) 的 digitonin 在冰上进行 10 min 的通透化处理，随后在 4℃ 下以 13,000 g 离心 5 min，将细胞质和重膜组分分离。接着，将膜组分重新悬浮于裂解缓冲液 [20 mM tris (pH 7.4), 135 mM NaCl, 1.5 MgCl₂, 1 EGTA, 和 10% (v / v) 甘油，并添加 1% (v / v) digitonin 和完全蛋白酶抑制剂 (0.5 μg / ml; Sigma-Aldrich)] 中，在冰上处理 30 min。裂解后，样本在 4℃ 下以 13,000 g 离心 10 min 并收集上清液。样本在 NativePAGE™ Bis-Tris Mini 蛋白凝胶（3 至 12%, 1.0 , Invitrogen）中运行。凝胶被转移至聚乙烯idene 二氟化物（PVDF）膜上，并使用 TBS+T 中 5% (w / v) 的脱脂奶粉在室温下封闭 1 hour 以防止非特异性结合。膜在 4℃ 下与一抗孵育过夜。

在两次抗体孵育之间，膜用 TBS+T 洗涤三次，每次 5 min；在二抗孵育后，洗涤四次，每次 5 min。使用 ECL (Millipore, Bio-Rad) 对膜进行显影，并利用 ChemiDoc Touch 成像系统 (Bio-Rad) 和 Image Lab v6.1 (Bio-Rad) 软件进行可视化。

免疫印迹定量

对于图 2、图 8 和图 S2，使用 Image Lab v6.1 (Bio-Rad) 对原始全分辨率 .scn Chemidoc 文件进行密度分析。对于磷酸化或剪切事件，其密度信号相对于其母蛋白进行表达（例如，磷酸化 RIPK3 的值相对于非磷酸化 RIPK3 表达，剪切的 caspase-3 值相对于总 caspase-3 信号表达）。对于未修饰的目标，其密度信号首先相对于 HT29 细胞标准品中的相同未修饰蛋白进行表达，然后根据 GAPDH 的差异进行调整（例如，一份活检裂解液中的 cIAP2 水平相对于 $20\mu \mathrm{g}$ 未处理 HT29 细胞裂解液中的 cIAP2 水平表达，然后进一步根据这些裂解液之间 GAPDH 的差异进行调整）。

对于图 6、图 7 以及图 S8 和 S11，使用 ImageJ v1.54h (96) 进行密度分析。免疫印迹图像首先转换为灰度图（8 位），并通过应用滚动球半径为 50 像素的背景减除来降低背景噪声。随后将图像反色以准备条带选择。对每个感兴趣的条带，定量其积分密度 (IntDen)。对于 PUMA 分析，每个条带的积分密度值相对于同一膜上经 TNF 和 Smac 模拟物 (TS) 处理的 HT29 细胞样本进行归一化，然后根据 GAPDH 的差异进行调整。对于 iNOS 分析，每个条带的积分密度值相对于每张膜上的非 IBD 对照进行归一化，然后根据 GAPDH 的差异进行调整。

IncuCyte 细胞死亡测量

类器官活力使用 IncuCyte S3 (Sartorius) 系统进行评估，具体如所述 $(98)$。简而言之，类器官按照上述步骤接种到未处理的 96 孔板中。在成像前一小时，加入 IncuCyte Cytotox Red Dye (Sartorius, 4632)，稀释比例为 1: 20000，用于染色死细胞。在整个测定过程中，使用 4$\times$ 物镜和 Spheroid 扫描类型，通过相衬 / 明场通道和红色荧光通道（曝光时间 250 ms）采集明场和荧光图像。两个通道的图像被导出并通过自定义半自动宏使用 ImageJ 1.53t 进行分析。简而言之，明场和红色荧光图像对被裁剪，如图 S4D 所示。使用 “MorphoLibJ” 插件 $(99)$ 对明场图像进行预处理，然后根据 0 到 132 像素值的阈值范围将图像转换为二值掩模。裁剪后的

“感兴趣区域 (ROI)” 被测量并定义为类器官总面积。对于红色荧光图像，在明场 ROI 内并基于手动阈值掩模测量阳性区域。细胞死亡通过红色荧光阳性类器官面积相对于类器官总面积的百分比来评估。MDA-MB-231, HepG2 和 BMDM 的活力也通过 IncuCyte S3 (Sartorius) 成像进行测量。细胞以三复孔形式接种在 96 孔板中，并在成像前用 SPY505-DNA (1:1000, Spirochrome, SC101) 和碘化丙啶 (PI, $0.3\mu \mathrm{g / ml}$ , Sigma-Aldrich, P4170) 孵育 3 小时。在整个测定过程中，使用 $10\times$ 物镜和 Standard 扫描类型，通过相衬通道、绿色荧光通道（曝光时间 300 ms）和红色荧光通道（曝光时间 400 ms）采集相衬和荧光图像。

算法设置经过调整，以准确检测绿色和红色斑点。为了计算 $\%$ PI 阳性细胞（即细胞死亡），将红色通道的斑点计数除以绿色通道的计数，结果乘以 100。

一氧化氮产生量的 Griess 检测

Griess 检测按照此前所述的方法进行 $(53)$。细胞上清液与在 OGM 或 ODM 中浓度范围为 100 $\mu$ M 至 1.56 $\mu$ M 的亚硝酸钠标准曲线一起进行双重复检测，标准曲线则进行三重复检测。在每 25 $\$ L 细胞上清液中，加入 25 $\$ L 溶于磷酸（5% v / v, Sigma）的磺胺酸（1% w / v, Sigma），并孵育 5 分钟。随后加入 25 $\$ L 溶于水的 N-1-萘乙二胺二盐酸盐（0.1% w / v, Sigma）。使用 CLARIOstar Plus 微孔板阅读器（BMG LABTECH）测量吸光度，然后根据经背景校正的亚硝酸钠标准曲线进行内插计算。

Caspase DEVDase 活性检测

DEVDase 检测通过使用含有 DEVD 序列的合成肽底物来测量执行 caspase（主要是 caspase-3 / 7）的活性，该序列在细胞凋亡过程中被特异性切割。切割会释放荧光或显色报告基团，从而提供凋亡 caspase 活性的定量读数。收集类器官并使用 DISC 缓冲液（20 mM Tris-HCL pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 EDTA 和 10% 甘油）以及补充的 cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂进行裂解。Ac-DEVD-AMC 底物（20 $\$ M, BD Pharmingen, 556449）、二硫苏糖醇（2 ）和蛋白酶检测缓冲液（20 HEPES pH 7.5, 10% 甘油）的底物混合物在临用前新鲜配制。将 20 $\$ L 细胞裂解液与 200 $\$ L 底物混合物在 37℃ 下孵育 1 小时。使用 CLARIOstar Plus 微孔板阅读器（BMG LABTECH）测量荧光，激发波长为 380 nm，发射波长范围为 430-460 nm。

类器官的 RNA 分离与定量聚合酶链反应 (qPCR)

按照制造商指南，使用 ISOLATE II RNA Mini Kit (Bioline, 52073) 从类器官中分离总 RNA。使用 SuperScript III 逆转录酶 (Invitrogen, 18080-085) 和 oligo (dT) 核苷酸 (Promega, C110B-C) 将 $1 \ \mathrm{g}$ RNA 逆转录为 cDNA。使用 Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0223) 和 ViiA 7 实时 PCR 系统 (Applied Biosystems) 对 cDNA 样本或无核酸酶水（对照）进行定量实时 PCR (qRT-PCR)。样本进行双重复运行。相对基因表达量以管家参考基因 HPRT 为基准进行归一化，并以相对于未刺激对照样本或 OGM 样本的倍数变化表示，使用 $\Delta \Delta \mathrm{Ct}$ 法 (100) 进行分析。本研究中使用的 qRT-PCR 引物序列列于表 S1 中。

肠道活检样本的大量 RNA 测序与分析

样本经解冻并去除 RNAlater 后，将组织转移至预填充有 350 $\mu$ l NucleoSP RNAXS 试剂盒（Macherey-Nagel 目录号 SKU: 740902.250）RA1 缓冲液的螺旋盖管中。使用 10 颗 3 mm 酸洗锆珠（OPS diagnostics 目录号 BAWZ 3000-300-23），在 Qiagen TissueLyzer II（30 Hz，5min）中对组织进行匀质化处理。匀质化后的样本在 11,000 $xg$ 下离心 1 分钟以去除组织碎片，随后按照制造商说明书使用 Nucleospin RNAXS 柱试剂盒纯化 RNA，且不添加载体。纯化产物使用 Qubit™ HS Assay 试剂盒（Thermo Fisher Scientific 目录号 Q32852）进行定量，并使用 TapeStation 4200（Agilent 目录号 G2991BA）的高灵敏度 ScreenTape（Agilent 目录号 5067- 5579）进行完整性可视化。使用 10 纳克产物，按照 SMARTer Stranded Total-Seq Pico-Input Mammalian kit v.3（Takara Bio. 目录号 SKU: 634487）的制造商说明书并进行少量修改（具体为在 94℃ 下碎片化 3 min 以及进行 13 个 PCR2 循环）来制备索引文库。文库浓度通过 Qubit™ dsDNA Assay 试剂盒（Thermo Fisher 目录号 Q32851）进行定量，文库大小使用 D1000 ScreenTape（Agilent 目录号 5067-5582）测定，并在 TapeStation 4200（Agilent 目录号 G2991BA）中进行可视化。将等摩尔量的文库进行混合，并按照制造商说明书在 NovaSeq 6000（Illumina, San Diego, USA）的一个 S4 通道上进行 150-bp 双端测序。

双端 150-bp 序列使用 CASAVA v1.8.2 进行拆分，并使用 Cutadapt (v1.9) 进行 read 修剪 $(101)$。修剪后的 reads 随后使用 HISAT2 $(102)$ 比对到人类基因组 (GRCh38)。使用 Subread 软件包（版本 1.34.7）中的 FeatureCounts 进行 read 计数，随后将至少在三个样本中每百万 reads 计数（CPM）<2 的基因从下游分析中剔除 $(103, 104)$。计数数据使用 M 值修剪平均值法（trimmed mean of M-values method）进行归一化，并使用 limma-voom 流程进行两两比较的差异基因表达分析（limma 版本 3.40.6）$(103, 105, 106)$，或使用 GraphPad Prism v10 进行多组比较。每次比较均使用错误发现率（false discovery rate）方法进行多重检验校正 $(107)$。CPM $\log_{2}$ 倍数变化的热图使用 GraphPad Prism v10 生成。对于通路扰动分析，使用 Gene Set Enrichment Analysis 软件 v2.2.2 $(108)$ 以及人类 MSigDB 标志性 (H) 基因集 $(109)$。对于表达模式分析，使用 cluster R 软件包通过无监督层次聚类来识别高度相关基因的子集。在层次聚类下，表达数据首先经过归一化，然后推导不同基因和基因集之间的差异或距离，使用欧几里得距离法创建距离矩阵。最佳聚类通过肘法（Elbow method）、平均轮廓法（average Silhouette method）和 / 或 Gap 统计量法（Gap statistic method）确定。随后使用 hclust 函数生成树状图以直观表示聚类结果 $(110)$。对于转录因子富集分析，将聚类 A-E 的基因提交至 ChIP-X Enrichment Analysis 3

(ChEA3) 工具 $(111)$，并根据 ChEA3 的默认设置选取了富集程度最高的 10 个转录因子。转录因子被手动分配到相应的家族中，并通过使用 DeepVenn 工具 $(112)$ 生成的韦恩图进行展示。在数字细胞术方面，全转录组 RNA 测序分析中的细胞类型丰度估计及相关性分析是使用 CIBERSORTx $(113)$ 完成的。CIBERSORTx 分析所使用的特征矩阵文件为来自 $(57)$ 的 LM22 文件。对于 GSEA，使用了 GSEA 软件 v4.3.3 $(108)$，并采用了来自 MSigDB $(109)$ 中 GO:BP（基因本体生物过程）的所有基因集。

类器官的大量 RNA 测序与分析

对于图 4 至 6 以及图 S5 和 S6 中的大量 RNA 测序，按照制造商指南，使用 ISOLATE II Mini Kit (Bioline, 52073) 从类器官中分离总 RNA。使用 Agilent 4200 TapeStation 评估提取物的质量，且完整性数值 (RIN) 大于 9 的样本用于进一步应用。对于 mRNA 测序，使用 $100\mathrm{ng}$ 总 RNA，按照 QuantSeq $3^{\prime}$ mRNA-Seq Library Prep kit (Lexogen) 方案制备 $3^{\prime}$ mRNA 测序文库。随后在 NextSeq 500 (Illumina) 上对文库进行测序。使用 Casavav1.8.2 和 Cutadapt (v1.9) (114) 对单端 75 bp reads 进行解复用，以去除 poly A 尾及接头，并去除质量分数低于 20. 的低质量 reads。丢弃长度短于 50 个碱基的 reads，以确保下游分析的高质量，并使用 fastQC (115) 进行评估和验证。随后使用 STAR (116) 将 reads 比对到参考基因组 GRCh38，并使用 featureCounts (103) 在外显子水平上量化基因表达，以获取原始计数数据。移除了没有当前符号名称的基因。

对于图 5, 中的大量测序，使用 NucleoSpin XS Kit (Takara, 740902.250) 从类器官中分离总 RNA。使用 Agilent 4200 TapeStation 评估提取物的质量，且 RIN 值大于 9 的样本用于进一步应用。文库制备按照制造商说明，使用 TruSeq Library Prep Kit (Illumina, CA, USA)，每样本输入 $100\mathrm{ng}$。使用 Agilent Tapestation 和 QubitTM 分析试剂盒用于 Qubit 2.0 荧光计 (Life technologies) 对文库进行定量。使用单索引对单个文库进行条形码标记。随后制备索引文库并稀释至 $750\mathrm{pM}$，使用 P4 100 循环试剂盒及 v3 化学试剂 (Illumina, CA, USA) 在 NextSeq2000 仪器上进行单端 (1x 132 碱基) 测序，具体操作遵循制造商说明。

碱基调用 (base calling) 和质量评分由车载软件 v2.4.6, 且 FASTQ 文件的生成和解复用使用 bcl2fastq 转换软件 v2.15.0.4。

数据过滤、标准化和差异表达分析使用 mastR (117) 进行。在分析之前，使用 edgeR::filterByExpr (118) 过滤掉低计数基因，并使用 TMM (106) 对原始计数数据进行标准化。差异表达分析由 mastR 使用具有默认设置的 limma-voom-treat (119) 流水线执行。对于图 4 至 6 以及图 S5 和 S6，差异表达分析采用双因子设计，以“状态”（细胞分化状态）和“处理”（样本处理）作为协变量来拟合线性模型。生成经验贝叶斯调节 t 统计量，并进行 Benjamini–Hochberg 多重检验校正，以识别每次比较中具有统计学意义的基因（校正后 p 值 <0.05）。对于通路扰动分析，使用 GSEA 软件 v2.2.2 (108) 以及人类 MSigDB 标志性 (H) 基因集 (109)。使用 singscore (120) 对样本进行评分，其标志基因源自 LM22 特征矩阵 (113)。每种免疫细胞类型的标志基因是基于 LM22 中的表达谱，使用 HDBSCAN 聚类方法 (121) 确定的。

单细胞 RNA 测序数据再分析

来自 $(51)$ 的“非 IBD”、“IBD 非炎症”和“IBD 炎症”样本的原始计数使用 R 语言包 scater $(122)$ 进行了质量控制。为了分析和可视化高维 scRNA-seq 数据，我们使用了主成分分析 (PCA) 和统一流形逼近与投影 (UMAP)。IBD 炎症数据使用相同的流程进行了子集提取和重新标准化。子数据集中每个单个细胞的基因集评分分别使用 AUCell $(123)$ 根据 cluster B 标记列表（表 S1）计算得出。差异基因表达分析使用 mastR $(117)$ 的伪体 (pseudo-bulked) 方法进行，该方法根据“状态 (state)”、“样本 (sample)”和“标识 (ident)”将原始计数汇总到每个伪体样本中。细胞数少于 20 个的伪样本被排除，最终保留 62 个样本用于分析。

空间转录组学的 RNA 质量评估

从每个福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 的活检样本中采集 5 $\mu$ m 的切片放入微量离心管中，并根据制造商的方案使用 RNeasy FFPE Kit (Qiagen, 目录号 73504) 提取 RNA。使用 TapeStation RNA High Sensitivity Screentape Kit (Agilent, 目录号 5067-5579) 测量 RNA 浓度和片段化概况，并使用 DV200 指标进行计算。

Xenium 基因面板

我们为 Xenium 平台设计了一个包含 480 个基因的面板，用于空间检测：手动选择的凋亡、坏死性凋亡 (49) 和焦亡细胞死亡通路中的基因，已知 IBD 风险位点 (46, 47, 124) 内的基因，以及来自人类肠道图谱 (125) 的各种上皮和非上皮细胞类型的标记物。Xenium 面板中的完整基因列表见表 S1。

Xenium 空间转录组学的组织切片

福尔马林固定石蜡包埋的组织块在校准的旋转微切片机 (Leica Histocore BIOCUT) 上进行修整和平整，并使用新鲜的低剖面刀片切割 5 $\mu$ m 的切片。在切片前，使用 RNaseZAP (Sigma-Aldrich #R2020-250ML) 对微切片机、镊子和周围表面进行去污处理，并在样本之间更换手套以尽量减少交叉污染。切片漂浮在 45℃ 的 Milli-Q 水中以使其轻轻铺平，然后直接贴在 Xenium 载玻片 (10x Genomics, 目录号 PN-1000460) 上。随后，Xenium 载玻片在工作台上风干至少 1 小时，并在 42℃ 下孵育 3 小时，之后存储在室温密封干燥器中 $\leq$ 7 天，然后进行成像。

Xenium 空间转录组成像

安装在 Xenium 载玻片上的切片根据 10x Genomics 的演示方案（CG000578, Rev F）进行了脱蜡和脱交联处理。载玻片的制备遵循制造商的 原位基因表达及细胞分割染色方案（CG000749, Rev B），其中定制探针在 50℃ 下杂交过夜，随后进行洗涤、连接和扩增。为了提高细胞分割的准确性，切片使用 细胞分割附加试剂盒（10x Genomics, 1000662）在 4℃ 下染色过夜。随后，按照 分析仪用户指南（G000584, Rev K）将载玻片（及所需试剂）加载到 分析仪仪器中。选择与基因面板相匹配的相应代码本。随后生成一张低分辨率的全片图像，以标记空间分析的感兴趣区域。数据通过自动化样本和液体处理设备，在探针杂交（带有荧光标记）、图像采集和探针剥离的迭代循环中获取。 机载分析流水线 3.3.0.1 版本直接在仪器上运行，用于图像处理、细胞分割、图像配准、解码、去重和二次分析。运行结束后，将载玻片从 分析仪仪器中取出，并根据 10x Genomics 的演示方案（CG000613, Rev B）使用 10 mM 连亚硫酸钠溶液处理以去除淬灭化学物质。随后进行 Mayer the Hematoxylin 和 Eosin Y 染色、脱水，使用 Micromount (Leica) 封片，并在 SLIDEVIEW VS200 载玻片扫描仪 (Olympus) 上重新成像。注：所有试剂（包括水）均为分子级无核酸酶试剂，载玻片孵育是通过将 热循环适配器（10x Genomics, 目录号 PN-3000954）放置在热循环仪（Bio-Rad 目录号 C1000 Touch）上完成的，以确保高效且均匀的热传递。

空间转录组数据预处理与下游分析

细胞分割采用 ProSeg (v3.0.10; (126))。保留总转录本计数 $\geq$ 20 且总计数在第 98 百分位数或以下（$\leq$ 98$^{th}$ percentile）的细胞用于分析。下游分析在 Scanpy (v1.11.2; (127)) 和 edgeR (v4.6.3; (128)) 中进行。批次效应使用 Scanpy 中的 Harmony 算法进行校正。无监督聚类在 Scanpy 中使用 Leiden 算法对所有细胞以及上皮细胞子集分别进行，并根据标志基因表达对聚类进行注释。结肠细胞 #2 (Colonocyte #2) 被分层为 cluster B$^{+}$ ($\log_{2}$ CPM $\geq$ 15) 和 cluster B$^{-}$ ($\log_{2}$ CPM < 15) 子集。

相邻细胞定义为在结肠细胞 #2 细胞 35 $\mu$m 半径范围内的细胞，并被分类为 B$^{+}$ 结肠细胞 #2 邻居、B$^{-}$ 结肠细胞 #2 邻居或共享邻居（即同时在 B$^{+}$ 和 B$^{-}$ 结肠细胞 #2 的 35 $\mu$m 范围内）。

edgeR 中的伪体 (Pseudobulk) 差异表达分析包括：(i) 在各活检组（non-IBD, RHI 0 和 RHI 1$^{+}$）中，每种细胞类型内 B 基因集与其他 IBD 相关细胞死亡基因的比较；(ii) RHI 0 组内 B$^{+}$ 与 B$^{-}$ 结肠细胞 #2 的比较；(iii) RHI 0 组内 B$^{+}$ 与 B$^{-}$ 干细胞的比较；以及 (iv) B$^{+}$ 与 B$^{-}$ 结肠细胞 #2 邻域的比较（仅限于所有上皮细胞中 B$^{+}$ 结肠细胞 #2 >1% 的活检样本）。文库大小使用 M 值修剪平均值法 (trimmed mean of M-values method) 进行标准化。使用准似然方法 (glmQLFit) 拟合基因级负二项广义线性模型，并使用准似然 F 检验评估差异表达。错误发现率 (FDR) <0.05 的基因被认为具有差异表达。

上皮细胞的伪时间轨迹 (Pseudotime trajectories) 使用 Slingshot 的 Python 实现版本 (129) 进行推断。像素级细胞类型模式使用 FICTURE (130) 结合已注释细胞类型的参考标志基因权重进行可视化；每个渲染像素对应 $0.5\mu m^{2}$。

数据库设计

来自研究 5 个分支（患者病史、临床病史、临床数据、组织病理学评分、免疫印迹定量）的定量和定性数据使用 REDCap (131, 132) 和 Microsoft Excel 进行管理。由于 RNA 测序数据的复杂性，这些数据改为使用 RStudio v2024.4.2.764 分别管理。所有数据均与患者的研究编号（父项）和每次活检的内镜分类（子父项）相关联，以便在研究的不同分支之间进行多参数分析。

数据可视化与统计分析

对于所有以图表显示的数据，中心测量值、方差和独立重复次数在相应的图注中规定。所有热图中表示的数字均在表 S1 中提供。统计检验仅应用于独立执行至少三次的数据。统计检验方法和 P 值截断值在相应的图注中规定。统计检验使用 GraphPad Prism v10 执行，但差异基因表达分析除外（详见上文）。对于图 4 至图 7 中的数据，类器官图表中描绘的每个数据点（符号）代表一个独立的生物学重复（即不同的捐赠者），每次实验重复的次数在图注中详细说明。所有 HepG2 和 MDA-MB-231 实验的图表均显示来自同一细胞系实验的数据点。体外实验的重复样本是在不同日期或由不同研究人员使用独立试剂获取的，并以平均值 $\pm$ 标准误差 (SEM) 表示。

参考文献与注释

1. G. G. Kaplan, J. W. Windsor, The four epidemiological stages in the global evolution of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 18, 56–66 (2021). doi: 10.1038 / s41575-020-00360-x; pmid: 33033392

2. A. N. Ananthakrishnan, Epidemiology and risk factors for IBD. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 12, 205–217 (2015). doi: 10.1038 / nrgastro.2015.34; pmid: 25732745

3. C. A. Lamb et al., British Society of Gastroenterology consensus guidelines on the management of inflammatory bowel disease in adults. Gut 68, S1–S106 (2019). doi: 10.1136 / gutjnl-2019-318484; pmid: 31562236

4. T. Raine et al., ECCO Guidelines on therapeutics in ulcerative colitis: Medical treatment. J. Crohns Colitis 16, 2–17 (2022). doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjab178; pmid: 34635919

5. H. Gordon et al., ECCO guidelines on therapeutics in Crohn's disease: Medical treatment. J. Crohns Colitis 18, 1531–1555 (2024). doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjae091; pmid: 38877997

6. A. Tursi et al., Effectiveness and safety of infliximab and adalimumab for ambulatory Crohn's disease patients in primary gastroenterology centres. Eur. J. Intern. Med. 25, 485–490 (2014). doi: 10.1016 / j.ejim.2014.02.010; pmid: 24631020

7. A. Wilson et al., High infliximab trough concentrations are associated with sustained histologic remission in inflammatory bowel disease: A prospective cohort study. BMC Gastroenterol. 21, 77 (2021). doi: 10.1186 / s12876-021-01650-7; pmid: 33602145

8. L. Galluzzi et al., Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 25, 486–541 (2018). doi: 10.1038 / s41418-017-0012-4; pmid: 29362479

9. F. K. Chan et al., A role for tumor necrosis factor receptor-2 and receptor-interacting protein in programmed necrosis and antiviral responses. J. Biol. Chem. 278, 51613–51621 (2003). doi: 10.1074 / jbc.M305633200; pmid: 14532286

10. W. J. Kaiser et al., RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature 471, 368–372 (2011). doi: 10.1038 / nature09857; pmid: 21368762

11. A. Oberst et al., Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature 471, 363–367 (2011). doi: 10.1038 / nature09852; pmid: 21368763

12. A. Kawahara, Y. Ohsawa, H. Matsumura, Y. Uchiyama, S. Nagata, Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with death domain. J. Cell Biol. 143, 1353–1360 (1998). doi: 10.1083 / jcb.143.5.1353; pmid: 9832562

13. D. Vercammen et al., Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 187, 1477–1485 (1998). doi: 10.1084 / jem.187.9.1477; pmid: 9565639

14. N. Holler et al., Fas triggers an alternative, caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule. Nat. Immunol. 1, 489–495 (2000). doi: 10.1038 / 82732; pmid: 11101870

15. S. He et al., Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell 137, 1100–1111 (2009). doi: 10.1016 / j.cell.2009.05.021; pmid: 19524512

16. Y. S. Cho et al., Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell 137, 1112–1123 (2009). doi: 10.1016 / j.cell.2009.05.037; pmid: 19524513

17. L. Sun et al., Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell 148, 213–227 (2012). doi: 10.1016 / j.cell.2011.11.031; pmid: 22265413

18. J. M. Murphy et al., The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity 39, 443–453 (2013). doi: 10.1016 / j.immuni.2013.06.018; pmid: 24012422

19. A. L. Samson et al., MLKL trafficking and accumulation at the plasma membrane control the kinetics and threshold for necroptosis. Nat. Commun. 11, 3151 (2020). doi: 10.1038 / s41467-020-16887-1; pmid: 32561730

20. S. E. Garnish 等，MLKL 的构象互变及其与 RIPK3 的脱离先于坏死性凋亡引起的细胞死亡。Nat. Commun. 12, 2211 (2021). doi: 10.1038 / s41467-021-22400-z; pmid: 33850121

21. H. Nakano, S. Murai, K. Moriwaki，坏死性凋亡细胞释放损伤相关分子模式的调节。Biochem. J. 479, 677–685 (2022). doi: 10.1042 / BCJ20210604; pmid: 35293986

22. G. R. D'Haens, S. van Deventer，抗 TNF 治疗炎症性肠病 25 年：过去的教训与未来展望。Gut 70, 1396–1405 (2021). doi: 10.1136 / gutjnl-2019-320022; pmid: 33431575

23. S. C. Davies 等，口服 Janus 激酶抑制剂用于维持溃疡性结肠炎的缓解。Cochrane Database Syst. Rev. 1, CD012381 (2020). pmid: 31984480

24. K. K. Jena 等，III 型干扰素诱导肠上皮细胞焦亡并损害黏膜修复。Cell 187, 7533–7550.e23 (2024). doi: 10.1016 / j.cell.2024.10.010; pmid: 39500322

25. C. Günther 等，Caspase-8 调节 TNF-$\alpha$ 诱导的上皮坏死性凋亡和末端回肠炎。Nature 477, 335–339 (2011). doi: 10.1038 / nature10400; pmid: 21921917

26. G. van Loo, M. J. M. Bertrand，TNF 导致的死亡：炎症之路。Nat. Rev. Immunol. 23, 289–303 (2023). doi: 10.1038 / s41577-022-00792-3; pmid: 36380021

27. D. Boehmer, I. Zanoni，健康与疾病中的干扰素。Cell 188, 4480–4504 (2025). doi: 10.1016 / j.cell.2025.06.044; pmid: 40845809

28. J. V. Patankar, C. Becker，肠上皮细胞死亡及其对慢性炎症的影响。Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 17, 543–556 (2020). doi: 10.1038 / s41575-020-0326-4; pmid: 32651553

29. J. V. Patankar 等，E 型前列腺素受体 4 通过阻断上皮坏死性凋亡驱动肠道炎症的消退。Nat. Cell Biol. 23, 796–807 (2021). doi: 10.1038 / s41556-021-00708-8; pmid: 34239062

30. M. Pierdomenico 等，坏死性凋亡在炎症性肠病儿童中处于活跃状态，并导致肠道炎症加剧。Am. J. Gastroenterol. 109, 279–287 (2014). doi: 10.1038 / ajg.2013.403; pmid: 24322838

31. A. Negroni 等，RIP3 和 pMLKL 促进坏死性凋亡诱导的炎症并改变肠上皮细胞的膜通透性。Dig. Liver Dis. 49, 1201–1210 (2017). doi: 10.1016 / j.dld.2017.08.017; pmid: 28844856

32. R. Wang 等，基因组不稳定导致的肠干细胞坏死性凋亡触发肠道炎症。Nature 580, 386–390 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2127-x; pmid: 32296174

33. A. Nenci 等，上皮 NEMO 将先天免疫与慢性肠道炎症联系起来。Nature 446, 557–561 (2007). doi: 10.1038 / nature05698; pmid: 17361131

34. R. Schwarzer, H. Jiao, L. Wachsmuth, A. Tresch, M. Pasparakis，FADD 和 caspase-8 通过控制 MLKL 和 GSDMD 介导的肠上皮细胞死亡来调节肠道稳态和炎症。Immunity 52, 978–993.e6 (2020). doi: 10.1016 / j.immuni.2020.04.002; pmid: 32362323

35. K. Weisel 等，RIPK1 抑制剂 GSK2982772 在活动性溃疡性结肠炎患者中的随机、安慰剂对照研究。BMJ Open Gastroenterol. 8, e000680 (2021). doi: 10.1136 / bmjgast-2021-000680; pmid: 34389633

36. Sanofi，“SAR443122 在成年溃疡性结肠炎参与者中的剂量探索研究 (RESOLUTE)” (2022); https: / clinicaltrials.gov / study / NCT05588843.

37. AbbVie，“ABBV-668 口服胶囊研究，旨在评估中至重度溃疡性结肠炎成年参与者的不良事件和疾病活动度变化” (2023); https: / clinicaltrials.gov / study / NCT05570006.

38. G. Talmon, T. Manasek, R. Miller, D. Muirhead, A. Lazenby，凋亡性隐窝脓肿：胃肠道病理学中一个被低估的组织学发现。Am. J. Clin. Pathol. 148, 538–544 (2017). doi: 10.1093 / ajcp / aqx100; pmid: 29140405

39. T. F. Bullen et al., Characterization of epithelial cell shedding from human small intestine. Lab. Invest. 86, 1052–1063 (2006). doi: 10.1038 / labinvest.3700464; pmid: 16909128

40. M. J. D. Baars et al., Multiplex spatial omics reveals changes in immune-epithelial crosstalk during inflammation and dysplasia development in chronic IBD patients. iScience 27, 110550 (2024). doi: 10.1016 / j.isci.2024.110550; pmid: 39165839

41. S. A. Hughes et al., Caspase-8-driven apoptotic and pyroptotic crosstalk causes cell death and IL-1β release in X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency. EMBO J. 42, e110468 (2023). doi: 10.15252 / embj.2021110468; pmid: 36647737

42. Y. Shi, X. Cui, Y. Sun, Q. Zhao, T. Liu, Intestinal vitamin D receptor signaling ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis by suppressing necroptosis of intestinal epithelial cells. FASEB J. 34, 13494–13506 (2020). doi: 10.1096 / fj.202000143RRR; pmid: 32779265

43. M. Zhou et al., ABIN3 negatively regulates necroptosis-induced intestinal inflammation through recruiting A20 and restricting the ubiquitination of RIPK3 in inflammatory bowel disease. J. Crohns Colitis 15, 99–114 (2021). doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjaa131; pmid: 32599618

44. S. Chiou et al., An immunohistochemical atlas of necroptotic pathway expression. EMBO Mol. Med. 16, 1717–1749 (2024). doi: 10.1038 / s44321-024-00074-6; pmid: 38750308

45. D. Busingye, A. Pollack, K. Chidwick, Prevalence of inflammatory bowel disease in the Australian general practice population: A cross-sectional study. PLOS ONE 16, e0252458 (2021). doi: 10.1371 / journal.pone.0252458; pmid: 34043730

46. J. M. Peloquin et al., Characterization of candidate genes in inflammatory bowel disease-associated risk loci. JCI Insight 1, e87899 (2016). doi: 10.1172 / jci.insight.87899; pmid: 27668286

47. K. M. de Lange et al., Genome-wide association study implicates immune activation of multiple integrin genes in inflammatory bowel disease. Nat. Genet. 49, 256–261 (2017). doi: 10.1038 / ng.3760; pmid: 28067908

48. H. M. Shulman et al., Histopathologic diagnosis of chronic graft-versus-host disease: National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: II. Pathology Working Group Report. Biol. Blood Marrow Transplant. 12, 31–47 (2006). doi: 10.1016 / j.bbmt.2005.10.023; pmid: 16399567

49. C. R. Horne, A. L. Samson, J. M. Murphy, The web of death: The expanding complexity of necroptotic signaling. Trends Cell Biol. 33, 162–174 (2023). doi: 10.1016 / j.tcb.2022.05.008; pmid: 35750616

50. L. Massimino et al., The Inflammatory Bowel Disease Transcriptome and Metatranscriptome Meta-Analysis (IBD TaMMA) framework. Nat. Comput. Sci. 1, 511–515 (2021). doi: 10.1038 / s43588-021-00114-y; pmid: 38217242

51. K. Parikh et al., Colonic epithelial cell diversity in health and inflammatory bowel disease. Nature 567, 49–55 (2019). doi: 10.1038 / s41586-019-0992-y; pmid: 30814735

52. J. Li et al., Identification and multimodal characterization of a specialized epithelial cell type associated with Crohn's disease. Nat. Commun. 15, 7204 (2024). doi: 10.1038 / s41467-024-51580-7; pmid: 39169060

53. D. S. Simpson et al., Interferon- $\gamma$ primes macrophages for pathogen ligand-induced killing via a caspase-8 and mitochondrial cell death pathway. Immunity 55, 423–441.e9 (2022). doi: 10.1016 / j.immuni.2022.01.003; pmid: 35139355

54. R. Karki et al., Synergism of TNF- $\alpha$ and IFN- $\gamma$ Triggers Inflammatory Cell Death, Tissue Damage, and Mortality in SARS-CoV-2 Infection and Cytokine Shock Syndromes. Cell 184, 149–168.e17 (2021). doi: 10.1016 / j.cell.2020.11.025; pmid: 33278357

55. T. Krausgruber et al., Structural cells are key regulators of organ-specific immune responses. Nature 583, 296–302 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2424-4; pmid: 32612232

56. M. Uzzan et al., Ulcerative colitis is characterized by a plasmablast-skewed humoral response associated with disease activity. Nat. Med. 28, 766–779 (2022). doi: 10.1038 / s41591-022-01680-y; pmid: 35190725

57. A. M. Newman et al., Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat. Methods 12, 453–457 (2015). doi: 10.1038 / nmeth.3337; pmid: 25822800

58. J. Zhang et al., Epithelial Gasdermin D shapes the host-microbial interface by driving mucus layer formation. Sci. Immunol. 7, eabk2092 (2022). doi: 10.1126 / sciimmunol.abk2092; pmid: 35119941

59. G. Brumatti et al., The caspase-8 inhibitor emricasan combines with the SMAC mimetic birinapant to induce necroptosis and treat acute myeloid leukemia. Sci. Transl. Med. 8, 339ra69 (2016). doi: 10.1126 / scitranslmed.aad3099; pmid: 27194727

60. V. S. Marsden et al., Bcl-2-regulated apoptosis and cytochrome c release can occur independently of both caspase-2 and caspase-9. J. Cell Biol. 165, 775–780 (2004). doi: 10.1083 / jcb.200312030; pmid: 15210727

61. P. G. Ekert et al., Apaf-1 and caspase-9 accelerate apoptosis, but do not determine whether factor-deprived or drug-treated cells die. J. Cell Biol. 165, 835–842 (2004). doi: 10.1083 / jcb.200312031; pmid: 15210730

62. V. S. Marsden et al., Apoptosis initiated by Bcl-2-regulated caspase activation independently of the cytochrome c / Apaf-1 / caspase-9 apoptosome. Nature 419, 634–637 (2002). doi: 10.1038 / nature01101; pmid: 12374983

63. A. Kotschy et al., The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models. Nature 538, 477–482 (2016). doi: 10.1038 / nature19830; pmid: 27760111

64. J. E. Vince et al., The mitochondrial apoptotic effectors BAX / BAK activate Caspase-3 and -7 to trigger NLRP3 inflammasome and Caspase-8 driven IL-1β activation. Cell Rep. 25, 2339–2353.e4 (2018). doi: 10.1016 / j.celrep.2018.10.103; pmid: 30485804

65. A. Strasser, D. L. Vaux, Viewing BCL2 and cell death control from an evolutionary perspective. Cell Death Differ. 25, 13–20 (2017). doi: 10.1038 / cdd.2017.145; pmid: 29099481

66. A. W. Roberts et al., Targeting BCL2 with venetoclax in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 374, 311–322 (2016). doi: 10.1056 / NEJMoa1513257; pmid: 26639348

67. W. Qiu et al., PUMA-mediated intestinal epithelial apoptosis contributes to ulcerative colitis in humans and mice. J. Clin. Invest. 121, 1722–1732 (2011). doi: 10.1172 / JCI42917; pmid: 21490394

68. B. A. Callus et al., Triggering of apoptosis by Puma is determined by the threshold set by prosurvival Bcl-2 family proteins. J. Mol. Biol. 384, 313–323 (2008). doi: 10.1016 / j.jmb.2008.09.041; pmid: 18835564

69. E. A. Worthey et al., Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease. Genet. Med. 13, 255–262 (2011). doi: 10.1097 / GIM.0b013e3182088158; pmid: 21173700

70. A. S. Lehle et al., Intestinal inflammation and dysregulated immunity in patients with inherited Caspase-8 deficiency. Gastroenterology 156, 275–278 (2019). doi: 10.1053 / j.gastro.2018.09.041; pmid: 30267714

71. D. Cuchet-Lourenço et al., Biallelic RIPK1 mutations in humans cause severe immunodeficiency, arthritis, and intestinal inflammation. Science 361, 810–813 (2018). doi: 10.1126 / science.aar2641; pmid: 30026316

72. Y. Li et al., Human RIPK1 deficiency causes combined immunodeficiency and inflammatory bowel diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 116, 970–975 (2019). doi: 10.1073 / pnas.1813582116; pmid: 30591564

73. W. D. Cook et al., RIPK1- and RIPK3-induced cell death mode is determined by target availability. Cell Death Differ. 21, 1600–1612 (2014). doi: 10.1038 / cdd.2014.70; pmid: 24902899

74. X. Li et al., RIP1-dependent linear and nonlinear recruitments of caspase-8 and RIP3 respectively to necrosome specify distinct cell death outcomes. Protein Cell 12, 858–876 (2021). doi: 10.1007 / s13238-020-00810-x; pmid: 33389663

75. S. Olafsson et al., Somatic Evolution in Non-neoplastic IBD-Affected Colon. Cell 182, 672–684.e11 (2020). doi: 10.1016 / j.cell.2020.06.036; pmid: 32697969

76. K. Nanki et al., Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature 577, 254–259 (2020). doi: 10.1038 / s41586-019-1844-5; pmid: 31853059

77. S. Alvarez-Diaz et al., Necroptosis is dispensable for the development of inflammation-associated or sporadic colon cancer in mice. Cell Death Differ. 28, 1466–1476 (2021). doi: 10.1038 / s41418-020-00673-z; pmid: 33230260

78. D. Turner et al., STRIDE-II: An update on the Selecting Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease (STRIDE) initiative of the International Organization for the Study of IBD (IOIBD): Determining therapeutic goals for treat-to-target strategies in IBD. Gastroenterology 160, 1570–1583 (2021). doi: 10.1053 / j.gastro.2020.12.031; pmid: 33359090

79. E. J. Petrie et al., Viral MLKL homologs subvert necroptotic cell death by sequestering cellular RIPK3. Cell Rep. 28, 3309–3319.e5 (2019). doi: 10.1016 / j.celrep.2019.08.055; pmid: 31553902

80. G. Dewson et al., Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell 36, 696–703 (2009). doi: 10.1016 / j.molcel.2009.11.008; pmid: 19941828

81. R. F. Harvey, J. M. Bradshaw, A simple index of Crohn's-disease activity. Lancet 1, 514 (1980). doi: 10.1016 / S0140-6736(80)92767-1; pmid: 6102236

82. R. S. Walmsley, R. C. Ayres, R. E. Pounder, R. N. Allan, A simple clinical colitis activity index. Gut 43, 29–32 (1998). doi: 10.1136 / gut.43.1.29; pmid: 9771402

83. M. Daperno et al., Development and validation of a new, simplified endoscopic activity score for Crohn's disease: The SES-CD. Gastrointest. Endosc. 60, 505–512 (2004). doi: 10.1016 / S0016-5107(04)01878-4; pmid: 15472670

84. K. W. Schroeder, W. J. Tremaine, D. M. Ilstrup, Coated oral 5-aminosalicylic acid therapy for mildly to moderately active ulcerative colitis. A randomized study. N. Engl. J. Med. 317, 1625–1629 (1987). doi: 10.1056 / NEJM198712243172603; pmid: 3317057

85. T. Kucharzik et al., ECCO-ESGAR-ESP-IBUS Guideline on Diagnostics and Monitoring of Patients with Inflammatory Bowel Disease: Part 1: Initial diagnosis, monitoring of known inflammatory bowel disease, detection of complications. J. Crohns Colitis 19, jjaf106 (2025). doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjaf106; pmid: 40741688

86. Y. Hirokawa et al., Low-viscosity matrix suspension culture enables scalable analysis of patient-derived organoids and tumoroids from the large intestine. Commun. Biol. 4, 1067 (2021). doi: 10.1038 / s42003-021-02607-y; pmid: 34518628

87. A. V. Jacobsen et al., The Lck inhibitor, AMG-47a, blocks necroptosis and implicates RIPK1 in signalling downstream of MLKL. Cell Death Dis. 13, 291 (2022). doi: 10.1038 / s41419-022-04740-w; pmid: 35365636

88. E. J. Petrie et al., Conformational switching of the pseudokinase domain promotes human MLKL tetramerization and cell death by necroptosis. Nat. Commun. 9, 2422 (2018). doi: 10.1038 / s41467-018-04714-7; pmid: 29930286

89. M. C. Tanzer et al., Combination of IAP antagonist and IFN $\gamma$ activates novel caspase-10- and RIPK1-dependent cell death pathways. Cell Death Differ. 24, 481–491 (2017). doi: 10.1038 / cdd.2016.147; pmid: 28106882

90. C. M. Lee, S. Tripathi, E. T. Morgan, Nitric oxide-regulated proteolysis of human CYP2B6 via the ubiquitin-proteasome system. Free Radic. Biol. Med. 108, 478–486 (2017). doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2017.04.015; pmid: 28427998

91. C. Bossen et al., Interactions of tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor family members in the mouse and human. J. Biol. Chem. 281, 13964–13971 (2006). doi: 10.1074 / jbc.M601553200; pmid: 16547002

92. A. Huber, C. Dijkstra, M. Ernst, M. F. Eissmann, Generation of gene-of-interest knockouts in murine organoids using CRISPR-Cas9. STAR Protoc. 4, 102076 (2023). doi: 10.1016 / j.xpro.2023.102076; pmid: 36853714

93. N. E. Sanjana, O. Shalem, F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods 11, 783–784 (2014). doi: 10.1038 / nmeth.3047; pmid: 25075903

94. P. J. Baker, S. L. Masters, "Generation of genetic knockouts in myeloid cell lines using a lentiviral CRISPR / Cas9 system" in Innate Immune Activation: Methods and Protocols, D. De Nardo, C. M. De Nardo, Eds. (Springer, 2018), pp. 41–55.

95. P. Bankhead et al., QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci. Rep. 7, 16878 (2017). doi: 10.1038 / s41598-017-17204-5; pmid: 29203879

96. C. A. Schneider, W. S. Rasband, K. W. Eliceiri, NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods 9, 671–675 (2012). doi: 10.1038 / nmeth.2089; pmid: 22930834

97. M. H. Mosli et al., Development and validation of a histological index for UC. Gut 66, 50–58 (2017). doi: 10.1136 / gutjnl-2015-310393; pmid: 26475633

98. J. Pang, H. Chang, L. Whitehead, J. E. Vince, "Real-time tracking of cell death in human intestinal organoids: A quantitative imaging approach" in Methods in Cell Biology (Academic, 2026); https: / doi.org / 10.1016 / bs.mcb.2026.05.004.

99. D. Legland, I. Arganda-Carreras, P. Andrey, MorphoLibJ: Integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics 32, 3532–3534 (2016). doi: 10.1093 / bioinformatics / btw413; pmid: 27412086

100. K. J. Livak, T. D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the $2(-\Delta \Delta C(T))$ method. Methods 25, 402–408 (2001). doi: 10.1006 / meth.2001.1262; pmid: 11846609

101. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10 (2011). doi: 10.14806 / ej.17.1.200

102. D. Kim, J. M. Paggi, C. Park, C. Bennett, S. L. Salzberg, Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat. Biotechnol. 37, 907–915 (2019). doi: 10.1038 / s41587-019-0201-4; pmid: 31375807

103. Y. Liao, G. K. Smyth, W. Shi, featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923–930 (2014). doi: 10.1093 / bioinformatics / btt656; pmid: 24227677

104. Y. Liao, G. K. Smyth, W. Shi, The R package Rsubread is easier, faster, cheaper and better for alignment and quantification of RNA sequencing reads. Nucleic Acids Res. 47, e47 (2019). doi: 10.1093 / nar / gkz114; pmid: 30783653

105. C. W. Law, Y. Chen, W. Shi, G. K. Smyth, voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biol. 15, R29 (2014). doi: 10.1186 / gb-2014-15-2-r29; pmid: 24485249

106. M. D. Robinson, A. Oshlack, A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biol. 11, R25 (2010). doi: 10.1186 / gb-2010-11-3-r25; pmid: 20196867

107. Y. Benjamini, Y. Hochberg, Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. J. R. Stat. Soc. Series B Stat. Methodol. 57, 289–300 (1995). doi: 10.1111 / j.2517-6161.1995.tb02031.x

108. A. Subramanian et al., Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15545–15550 (2005). doi: 10.1073 / pnas.0506580102; pmid: 16199517

109. A. Liberzon et al., The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 1, 417–425 (2015). doi: 10.1016 / j.cels.2015.12.004; pmid: 26771021

110. M. Maechler, P. Rousseeuw, A. Struyf, M. Hubert, H. Hornik, "Title" (R package version 2.1.6, 2023); https: / cran.r-project.org / web / packages / cluster / index.html.

111. A. B. Keenan et al., ChEA3: Transcription factor enrichment analysis by orthogonal omics integration. Nucleic Acids Res. 47, W212–W224 (2019). doi: 10.1093 / nar / gkz446; pmid: 31114921

112. T. Hulsen, DeepVenn -- a web application for the creation of area-proportional Venn diagrams using the deep learning framework Tensorflow.js. arXiv:2210.04597 [cs.HC] (2022).

113. A. M. Newman et al., Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat. Biotechnol. 37, 773–782 (2019). doi: 10.1038 / s41587-019-0114-2; pmid: 31061481

114. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10–12 (2011). doi: 10.14806 / ej.17.1.200

115. S. Andrews, "FastQC" (2010); https: / github.com / s-andrews / FastQC.

116. A. Dobin et al., STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15–21 (2013). doi: 10.1093 / bioinformatics / bts635; pmid: 23104886

117. J. Chen, A. Mohamed, D. D. Bhuva, M. J. Davis, C. W. Tan, mastR: Marker Automated Screening Tool for multi-omics data. bioRxiv 590691 [Preprint] (2024); https: / doi.org / 10.1101 / 2024.04.24.590691.

118. M. D. Robinson, D. J. McCarthy, G. K. Smyth, edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139–140 (2010). doi: 10.1093 / bioinformatics / btp616; pmid: 19910308

119. M. E. Ritchie et al., limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, e47 (2015). doi: 10.1093 / nar / gkv007; pmid: 25605792

120. M. Foroutan et al., Single sample scoring of molecular phenotypes. BMC Bioinformatics 19, 404 (2018). doi: 10.1186 / s12859-018-2435-4; pmid: 30400809

121. L. H. McInnes, J. Healy, "Accelerated hierarchical density based clustering" in IEEE International Conference on Data Mining Workshops (ICDMW), New Orleans, LA, USA, (IEEE, 2017); pp. 33–42; https: / doi.org / 10.1109 / ICDMW.2017.12.

122. D. J. McCarthy, K. R. Campbell, A. T. L. Lun, Q. F. Wills, Scater: Pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics 33, 1179–1186 (2017). doi: 10.1093 / bioinformatics / btw777; pmid: 28088763

123. S. Aibar et al., SCENIC: Single-cell regulatory network inference and clustering. Nat. Methods 14, 1083–1086 (2017). doi: 10.1038 / nmeth.4463; pmid: 28991892

124. L. Jostins et al., Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature 491, 119–124 (2012). doi: 10.1038 / nature11582; pmid: 23128233

125. R. Elmentaite et al., Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature 597, 250–255 (2021). doi: 10.1038 / s41586-021-03852-1; pmid: 34497389

126. D. C. Jones et al., Cell simulation as cell segmentation. Nat. Methods 22, 1331–1342 (2025). doi: 10.1038 / s41592-025-02697-0; pmid: 40404994

127. F. A. Wolf, P. Angerer, F. J. Theis, SCANPY: Large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15 (2018). doi: 10.1186 / s13059-017-1382-0; pmid: 29409532

128. Y. Chen, L. Chen, A. T. L. Lun, P. L. Baldoni, G. K. Smyth, edgeR v4: Powerful differential analysis of sequencing data with expanded functionality and improved support for small counts and larger datasets. Nucleic Acids Res. 53, gkaf018 (2025). doi: 10.1093 / nar / gkaf018; pmid: 39844453

129. K. Street et al., Slingshot: Cell lineage and pseudotime inference for single-cell transcriptomics. BMC Genomics 19, 477 (2018). doi: 10.1186 / s12864-018-4772-0; pmid: 29914354

130. Y. Si et al., FICTURE: Scalable segmentation-free analysis of submicron-resolution spatial transcriptomics. Nat. Methods 21, 1843–1854 (2024). doi: 10.1038 / s41592-024-02415-2; pmid: 39266749

131. P. A. Harris et al., Research electronic data capture (REDCap)—A metadata-driven methodology and workflow process for providing translational research informatics support. J. Biomed. Inform. 42, 377–381 (2009). doi: 10.1016 / j.jbi.2008.08.010; pmid: 18929686

132. P. A. Harris et al., The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. J. Biomed. Inform. 95, 103208 (2019). doi: 10.1016 / j.jbi.2019.103208; pmid: 31078660

133. 数据来源：J. Pang 等，《坏死性凋亡向凋亡信号轴是炎症性肠病的底层机制》，Dryad (2026)；https: / doi.org / 10.5061 / dryad.wm37pvn39。

致谢

我们感谢皇家墨尔本医院内镜中心 (3W) 和麻醉人员 A. Trinh, E. Zhang, J. Winston, S. Sood, A. Mack, P. Tagkalidis 以及 P. Prichard 在内镜活检样本采集方面提供的帮助；感谢为本研究捐献组织的患者；感谢 S. Hughes 在患者样本免疫印迹分析方面提供的帮助；感谢 A. Hempel (WEHI), B. Rosengarten (澳大利亚克罗恩病与结肠炎协会) 和 I. Wicks (WEHI) 对本工作提供的建设性反馈；感谢 WEHI 单克隆抗体设施工作人员为本研究生产的多种抗体；以及 WEHI 组织学团队在免疫组化方面提供的高水平支持。我们承认在准备部分图表时使用了 BioRender.com。资金支持：本工作得到了 Kenneth Rainin 基金会（向 J.M.M.、A.L.S.、B.C. 和 A.H.A. 提供创新者资助）、澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC 资助 1172929 和 2034104 提供给 J.M.M.，资助 2008692 提供给 J.E.V.，资助 2002965 和 2048925 提供给 A.L.S.，以及资助 2008652 提供给 E.D.H.）、澳大利亚研究理事会（ARC 未来研究员资助 FT190100266 提供给 K.E.L.）、Stafford Fox 医学研究基金会 (OMS)、通过 NHMRC 独立研究机构基础设施支持计划获得的运行基础设施资助，以及维多利亚州政府运行基础设施支持的资助。我们衷心感谢 Colonial 基金会的支持。J.M.M. 获得了 Anaxis Pharma Pty. Ltd. 的研究资助。奖学金支持提供给 A.H.A.（澳大利亚联邦政府研究培训计划墨尔本大学奖学金、澳大利亚克罗恩病与结肠炎协会 IBD 博士奖学金、Avant 培训医生奖学金、澳大利亚胃肠病学会 Celltrion IBD Fellowship）；J.P.（墨尔本大学博士奖学金）；W.C.（澳大利亚政府研究培训计划津贴奖学金、Chism 原住民博士顶额奖学金、Ormond 学院原住民奖学金、Ormond 学院 Peter Callow 纪念奖学金、墨尔本大学 MDHS 原住民研究培训支持计划、墨尔本大学原住民住宿资助、WEHI 博士顶额奖学金）；A.J.（NHMRC Dora Lush 博士奖学金；WEHI ARCS 奖学金）；以及 S.C.（WEHI InSPIRE 实习计划）。Y.C. 得到了已故 Judith C. Philpots 遗产的捐赠支持。H.W. 的资金由亚历山大·冯·洪堡基金会、Wellcome Trust 研究员奖 (214342 / Z / 18 / Z)、医学研究委员会资助 (MR / S00811X / 1)、英国癌症研究计划资助 (A27323) 以及由德国研究基金会 (DFG) 资助的三项协作研究中心资助 (SFB1399, Project C06, SFB1530-455784452, Project A03 和 SFB1403-414786233) 和由 Netzwerke 2021. 资助的 CANcer TARgetting (CANTAR) 提供。G.L. 的资金由科隆生物化学中心 (Center for Biochemistry, Köln Fortune)、由 Netzwerke 2021, 资助的 CANcer TARgetting (CANTAR) 以及由德国研究基金会 (DFG) 资助的两项协作研究中心资助 (SFB1399, Project C06, SFB1530-455784452, Project A03) 提供，并与同样由 DFG 资助的协作项目 SFB1403 相关联。作者贡献：概念化：J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P., E.D.H.；方法论：J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P., Y.C., E.D.H.；调查：A.H.A., J.P., K.M.P., Y.Zho., S.N.Y., I.K., M.B., J.A.R., W.C., A.V.J., A.J., C.R.H., S.C., X.M., F.S., S.B.K., W.L., S.S., A.L.S., Y.Z., Y.C., R.Y., E.T., L.M.；分析：A.H.A., J.P., I.K., S.F., J.C., A.W., L.W.W.。

P.R., I.A., T.S., A.L.S., R.L., Y.Zho., Y.C.；资源：A.H.A., S.S., A.M., A.P., N.S., G.I., T.T., D.S., A.E., W.B., F.Mc., B.C., G.L., H.W., O.M.S., M.C., A.L.S.；监督：Y.C., Y.Zha., O.S., L.G.R., E.D.H., K.L.R., R.B., S.E.N., K.E.L., B.C., A.L.S., J.E.V., J.M.M.；论文撰写——初稿：J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P.；论文撰写——审阅与编辑：所有作者。利益冲突：K.M.P., S.N.Y., A.V.J., C.R.H., K.E.L., A.L.S. 和 J.M.M. 参与或曾参与一项与 Anaxis Pharma Pty. Ltd. 合作开发程序性细胞死亡（necroptosis）通路抑制剂的项目。A.T.E.

同时也隶属于澳大利亚霍巴特皇家霍巴特医院（Royal Hobart Hospital）胃肠病科。其余作者声明无利益冲突。数据、代码和材料可用性：支持本研究结果的所有数据均包含在正文或补充材料中。所有原始免疫印迹数据均可在网上获取 (133)。转录组数据可从基因表达本体（Gene Expression Ontology）存储库获取，登录号为：GSE330696（经 IFNγ 和 / 或 TNF 处理的类器官的大量 RNA 测序）；GSE331309（经 IFNγ 和 TNF 以及 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 抑制剂处理的 BCL2 过表达类器官的大量 RNA 测序）；GSE282165（患有或未患有 IBD 患者肠道活检的大量 RNA 测序）；以及 GSE330953（患有或未患有 IBD 患者肠道活检的 Xenium 空间转录组学）。本研究中产生的试剂可根据要求向通讯作者索取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会（American Association for the Advancement of Science）。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse。本研究全部或部分由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（资助号 1172929, 2034101, 2008692, 2002965, 2048925, 和 2008652）资助，该委员会是一个 cOAlition S 组织。作者将根据 CC BY 公共版权许可协议提供作者接受稿（AAM）版本。

补充材料

图 S1 至 S12；表 S1；视频 S1；MDAR 可重复性检查清单

2024年11月13日提交；2026年4月1日重新提交；2026年6月23日接收 10.1126 / science.aeh7112

斑马鱼类丘脑皮层电路中的分级感觉处理

Anh-Tuan Trinh*, Anna Maria Ostenrath, Ignacio del Castillo-Berges, Fanchon Cachin, Mina Koç, Susanne Kraus, Bram Serneels, Koichi Kawakami, Emre Yaksi*

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aec2171

引言：哺乳动物皮层依赖于信息的分布式处理，支持从感觉表征到多模态整合以及多样化认知操作的并行且专业化的计算。丘脑皮层投射对于塑造整个皮层的计算专业化至关重要。来自鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类的比较证据表明，脊椎动物的外套膜（mammalian cortex 的进化祖先）在拓扑结构上被组织成分子截然不同的核团。然而，非哺乳动物脊椎动物丘脑皮层电路中感觉计算的并行化和专业化程度仍不为人所知。

基本原理：非哺乳动物脊椎动物的外套膜如何处理感觉信息，以及在脊椎动物中是否适用趋同或趋异的组织原则，仍是待解决的问题。这在硬骨鱼中尤为有趣，因为其外套膜几乎不接收或不接收来自一级丘脑逃逸通路（mammalian cortex 的主要感觉输入）的输入。相反，一条通过前球状复合体（PG）的并行顶盖逃逸通路充当主要感觉输入。这提出了两个基本问题：硬骨鱼外套膜在没有丘脑逃逸通路的情况下如何进行感觉计算？以及这些感觉电路在硬骨鱼中是如何组织的？在这项工作中，我们研究了斑马鱼中类丘脑皮层电路如何编码和整合感觉信息。

结果：我们发现 PG 是将来自中脑和间脑的感觉选择性输入中继到斑马鱼外套膜的主要枢纽。 神经元具有异质性，并被组织成部分重叠但空间分离的功能集群，专门响应视觉和振动刺激。这些感觉特异性信号在投射到外套膜的拓扑组织 轴突中得以保留。 刺激会差异性地招募空间上不同的外套膜区域。相比之下，外套膜表现出较低的感觉选择性和较高的多模态整合能力。尽管外套膜外侧或内侧的一些神经元仅对光或振动产生响应，但很大一部分神经元对两者均有响应。我们还在前中央外套膜中鉴定出一类“整合神经元”，它们仅在视觉和振动刺激同时出现时才产生响应。这些神经元表现出非线性（超加性）响应，表明其进行的是高阶计算而非简单的求和。总体而言，感觉计算沿着外套膜从后到前的轴线逐渐变得更加复杂。

结论：我们提供了关于硬骨鱼前脑中类丘脑皮层电路结构和功能的关键见解，为理解非哺乳动物脊椎动物外套膜如何接收和处理感觉信息奠定了基础。与哺乳动物初级感觉皮层不同，

感觉处理在斑马鱼大脑类丘脑皮层电路中的分布。解剖追踪和体内钙成像显示，斑马鱼 神经元在部分重叠但空间分离的集群中编码视觉和振动刺激，并投射到拓扑截然不同的外套膜区域。外套膜的响应沿后-前轴线表现出感觉选择性降低，以及多模态和非线性整合能力增强。

在丘脑逃逸（thalamofugal）输入的主导下，斑马鱼的端脑（pallium）主要通过视顶盖逃逸（tectofugal）的PG通路接收感觉信息。在解剖结构上，斑马鱼的PG类似于鸟类和爬行动物的圆核（nucleus rotundus）以及哺乳动物的高级丘脑的输入-输出组织形式。因此，硬骨鱼类的端脑接收感觉信息的方式与哺乳动物的一次感觉皮层不同。尽管如此，斑马鱼端脑中的区域特化和分级感觉计算与鸟类端脑相似，后者被组织成专门的核团。尽管与哺乳动物的丘脑-皮层系统存在差异，但斑马鱼类丘脑-皮层样电路在日益复杂的感觉处理这一广泛原则上趋于一致，包括分布在专门端脑核团中的多感官整合和非线性巧合检测。这些结果表明，尽管在进化过程中输入架构有所分歧，但分级且区域特化的并行处理是脊椎动物端脑的一个趋同特征。

神经科学

斑马鱼类丘脑皮层电路中的分级感觉处理

Anh-Tuan Trinh $^{1}$ , Anna Maria Ostenrath $^{1}$ , Ignacio del Castillo-Berges $^{1}$ , Fanchon Cachin $^{1}$ , Mina Koç $^{2}$ , Susanne Kraus $^{1}$ , Bram Serneels $^{1}$ , Koichi Kawakami $^{3,4}$ , Emre Yaksi $^{1,5}$

丘脑皮层投射塑造了哺乳动物皮层的功能区域化和并行感觉计算。然而，非哺乳动物脊椎动物中丘脑皮层计算的原理仍缺乏足够研究。在这项工作中，我们研究了斑马鱼的外套膜（pallium，脊椎动物皮层的同源器官）如何接收和处理感觉信息，以及其架构与其他脊椎动物的丘脑皮层电路如何对比。我们揭示了前球状复合体（preglomerular complex, PG）这一类丘脑皮层通路，是斑马鱼外套膜视觉和振动信息的主要来源。PG及其外套膜投射表现出感觉特异性和拓扑组织化的响应。相比之下，外套膜神经元则显示出拓扑组织化的分级结构，范围涵盖从感觉特异性到多模态以及巧合检测的非线性响应。我们的结果表明，在拓扑组织化的类丘脑皮层电路中，感觉转换的分级结构反映了脊椎动物之间的一种趋同原理。

哺乳动物皮层表现出空间分布的计算专业化和分级结构 (1-4)。这些皮层分级实现了从感觉编码 (5, 6) 到多重信息流整合 (1, 4, 7) 的并行神经计算。它们通常利用多样化的编码策略 (8, 9)，从而产生认知功能 (8, 10)。来自鸟类 (11-14)、爬行动物 (15-17)、两栖动物 (18) 和鱼类 (19-23) (24) 的分子、解剖和生理学证据表明，脊椎动物外套膜（哺乳动物皮层的同源器官）表现出多种拓扑组织化的专业化和分级结构。揭示脊椎动物外套膜接收和转换信息的趋同或趋异原理，仍然是一个主要的实验挑战。

丘脑皮层投射对于塑造皮层组织和专业化至关重要 (3, 4, 25)。初级感觉皮层接收来自致力于特定模态的一级丘脑核团的空间组织化输入 (5, 6)。例如，一级视觉丘脑——外侧膝状体 (LGN) 接收直接的视网膜输入并将其转发至初级视觉皮层 (V1)，对方向、方位和空间位置进行编码 (6, 26)；而高阶和关联皮层则通过由高阶丘脑介导的皮层-丘脑环路整合多种模态 (2, 3, 25)。例如，枕核（pulvinar）作为一个高阶丘脑核团，主要接收来自上丘 (SC)、视觉和高阶皮层的信息 (6, 27)，并将信息转发至涉及物体识别、空间注意力和引导运动的高级视觉、运动和额叶皮层 (27, 28)。因此，向哺乳动物皮层投射的一级和高阶丘脑投射代表了具有互补功能的并行通路。这些并行通路也存在于爬行动物 (29, 30) 和鸟类 (26, 30–33) 中，并参与视觉运动、感知和空间处理 (15, 32, 34)。

位于背侧端脑的硬骨鱼类外套膜（pallium）由空间组织明确、分子特性 $(19, 35, 36)$ 及功能 $(37–42)$ 截然不同的区域组成。消融硬骨鱼类外套膜的不同区域会导致适应性行为和学习能力受损 $(37, 40)$。硬骨鱼类的真正丘脑（Th；在发育上可与第一级丘脑相类比）向外套膜发送较弱的投射 $(43, 44)$。然而，一个平行的硬骨鱼类感觉中继枢纽——前球状复合体（PG）接收来自中脑顶盖的支配并投射至外套膜 $(21, 44–48)$。尽管 PG 作为将感觉信息传递至硬骨鱼类外套膜的重要中继站发挥着核心作用，但感觉信息如何在 PG 中编码，以及随后如何在外套膜中被转换和整合，目前仍不清楚。

在这项工作中，我们研究了斑马鱼外套膜如何接收和处理感觉信息，以及其架构与其他脊椎动物的丘脑-皮层回路相比如何。

结果

PG 是斑马鱼端脑皮层间脑输入的初级来源

我们探讨了斑马鱼端脑皮层（pallium）如何接收感觉信息。我们使用了 21 至 28 天大的光学可访问幼年斑马鱼。幼年斑马鱼能够执行认知要求较高的行为，例如学习 (49)、社交互动 (50) 和适应性行为 (41, 51)。为了可视化 PG 的输入和输出，我们在全脑离体标本的幼年斑马鱼 中通过离子电泳注入了 TMR-dextran，一种红色荧光示踪剂 (52, 53)（图 1, A 和 B）。在 10 天和 21 天大的动物端脑皮层中（图 1B 和图 S1, A 至 C）以及 7 天大斑马鱼的电子显微镜 (EM) (54) 重建图中（图 S1, F 至 H，以及视频 S1）可以看到顺行标记的 轴突。 轴突仅存在于同侧半球，主要支配背内侧 (Dm)、背中央 (Dc) 和背外侧 (Dl) 端脑（图 1, B 和 C）。同样的

注射还揭示了同侧间脑（Hyp, Th, PO, TLa）和中脑（OT, SGN, TS）核团中逆行标记的 支配神经元（图 1, B 和 D，以及图 S2, A 至 E），以及投射回 的端脑 Dm 神经元（图 1℃ 和图 S2F）。在 7 天大斑马鱼的 EM 重建图中也能看到 Dm 到 的投射（图 S1I）。

哺乳动物丘脑的皮层投射神经元被标记为谷氨酸能 (6, 55)。然而，释放 $\gamma$-氨基丁酸的（GABA 能）丘脑中间神经元和网状神经元并不投射到皮层。斑马鱼 由谷氨酸能标记 $[N = 6$ : $80.34 \pm 1.37\%$ Tg(vglut2a:DsRed) (56)] 和 GABA 能标记 $[19.66 \pm 1.37\%$ , Tg(gad1b:GFP) (57)] 的神经元共同组成（图 1E 和图 S2, G 和 H）。端脑皮层的 dextran 偶联荧光染料注射显示，没有任何逆行标记的皮层投射 神经元与 gad1b 共标（绿色；图 1, F 至 H），而其中约 $90\%$ 与 vglut2a 共标（图 S3）。这些实验还揭示了 是斑马鱼端脑皮层的主要输入区域，仅有极小部分（$\sim 13\%$）的逆行标记皮层投射神经元位于

斑马鱼 Th 中（图 1, I 和 J，以及图 S4A）。空间受限的 TMR-dextran 皮层注射显示，在 Dl 注射后，外侧 神经元被逆行标记（图 S4, B 和 D），而在 Dm 注射后，内侧 神经元被标记（图 S4, C 和 E）。最后，即使在 5 天大的斑马鱼幼鱼中，皮层注射后 神经元的逆行标记也是可见的（图 S1, D 和 E）。总之，我们的结果表明， 是主要的谷氨酸能枢纽，通过在解剖上分离的 子区域，将间脑和中脑信息传递至不同的斑马鱼端脑皮层区域。

图 1. 是斑马鱼端脑皮层间脑输入的主要来源。(A) 从腹侧拍摄的解剖幼鱼脑离体标本的明场图像示例。红星标记了 在解剖上不同的叶。(B) 幼鱼脑离体标本 中神经示踪剂 (TMR-Dextran) 注射的示例。红星标记注射部位。白色虚线标记大脑轮廓。(C) 观察到的 与斑马鱼背端脑或端脑皮层之间外在连接的汇总示意图 (N = 14 条鱼)。(D) 观察到的 与间脑及中脑结构之间连接的汇总示意图 (N = 14 条鱼)。(E) Tg(vglut2a:DsRed;gad1b:GFP) 鱼系解剖幼年斑马鱼脑离体标本的荧光图像；vglut2a

[版面噪声，已略]

PG 对不同感觉模态表现出选择性和拓扑组织化的响应

在羊膜动物中，丘脑被分为不同的初级亚核，用于编码来自不同感觉模态的信息 (1, 5, 6, 55)。

为了研究 PG 的感觉计算，我们测量了其对红光闪烁和机械振动的响应。10 天大的 $Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)$ (60) 斑马鱼通过在全神经元中表达荧光钙指示剂，实现了对深层 的体内成像。我们观察到，一部分 神经元被光或振动激活（图 2G，左侧和右侧，分别为光和振动），而另一部分则被抑制（图 2, H 和 I，蓝色）。接下来，我们探讨了 神经元是对单一感觉模态具有选择性，还是具有多感觉特性（即同时对光和振动产生响应）。我们观察到，与多感觉神经元相比，绝大多数 神经元仅对一种感觉模态产生响应（仅对光响应者，$11.6 \pm 1.4\%$；仅对振动响应者，$10.5 \pm 2.0\%$；多感觉响应者，$3.3 \pm 0.6\%$）（图 2, J 和 K；仅对光响应对比多感觉响应，$P = 1.82 \times 10^{-4}$；仅对振动响应对比多感觉响应，$P = 1.0 \times 10^{-3}$；Wilcoxon 秩和检验；图 S5E），这突显了大多数 神经元的感觉选择性特质。

此外，我们探讨了 的亚区域是否表现出拓扑组织化的感觉响应。我们观察到，相邻 神经元之间的响应相关性（图 2, L 和 M）高于随机水平。感觉响应 神经元的空间分布也比随机分布更集中（图 S5F）。随后，我们对比了所有空间对齐动物中 感觉响应的空间分布。 响应的二维 (2D) 空间直方图显示，光响应和振动响应在空间上部分重叠（图 2N，顶部）。然而，对比这些直方图发现， 的后外侧神经元对光（橙色）有更高的偏好，而 的前内侧神经元则偏好

图 2. PG 神经元形成拓扑组织的功能集群，并表现出感觉选择性响应。(A) Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 斑马鱼体内成像的两光子显微镜图像示例。白色虚线标出 PG。(B) 使用 k-means 聚类的 体内自发持续活动的示例。暖色代表神经活动增加。(C) 同一示例鱼中 神经元的 3D 重建。神经元根据 (B) 中标记的集群身份进行颜色编码。A，前；M，内侧；L，外侧；P，后；D，背侧。(D) 神经元自发持续活动的成对相关性随神经元对之间距离的变化而变化。灰色虚线代表距离随机打乱时的成对相关性。阴影区域表示 SEM ( $N = 11$ 条鱼)。(E)

神经元在两个连续自发活动期间的集群保真度，与集群身份的随机分布进行了比较。(F) 神经元对在两个连续自发活动期间的成对 Pearson 相关系数 ( $r^2$ )。仅绘制了显著相关 ( $P < 0.05$ ) 的部分。散点图中成对相关性的概率密度用颜色梯度表示。灰色点代表从随机分布中获得的成对相关性。随机数据（灰色，$r^2 = 0.0003$）和观测数据（黑色，$r^2 = 0.543$）的相关系数是通过黑色虚线表示的线性拟合获得的。误差棒表示 SEM ( $N = 11$ 条鱼，*** $P < 0.001$ ，配对 Wilcoxon 符号秩检验)。(G 和 H) 所有鱼在体内对光（左）和振动（右）刺激响应时，被激活 [钙信号增加的神经元，红色，(G)] 和被抑制 [钙信号降低的神经元，蓝色，(H)] 的 神经元的叠加 2D 重建。颜色梯度代表响应 神经元的空间概率密度。无响应的 神经元为深灰色，而 之外的神经元为浅灰色。(I) 神经元对光（左）和振动（右）刺激响应的钙信号时间进程。暖色表示神经活动增加；冷色表示活动降低。平均钙信号显示在每个热图的底部，阴影表示 SEM ( $N = 11$ 条鱼)。(J) 所有单个 神经元在光和振动刺激下的平均响应。光或振动刺激下被激活的 神经元的概率密度用颜色编码。未被激活的神经元显示为灰色点。(K) 在单个鱼中，被光或振动（排他性）或两种刺激（多感官）激活（红色）和抑制（蓝色）的响应 神经元的比例（黑色空心圆）。(L 和 M) 神经元对光 (L) 和振动 (M) 刺激响应的成对相关性随神经元对之间距离的变化而变化。灰色虚线代表距离随机打乱时的成对相关性。阴影区域表示 SEM ( $N = 11$ 条鱼)。(N) （上）所有鱼中所有光激活（左）和振动激活（右）的 神经元的位置在空间上对齐并叠加在 2D 直方图中。颜色越暖表示每个分箱（bin）中的神经元数量越高。（下）两个 2D 直方图之间的差异显示在左下角，而每个空间分箱的 $P$ 值显示在右下角。不显著的分箱用灰度表示，而显著的空间分箱用颜色表示。暖色表示对光刺激的空间偏好，而冷色表示对振动刺激的偏好 ( $N = 11$ 条鱼)。虚线标出 的解剖边界。误差棒代表 SEM ( $N = 11$ 条鱼，*** $P < 0.001$ ，Wilcoxon 秩和检验)。

对振动刺激（青色，图 2N，底部）产生反应，尽管个体之间存在差异（图 S5G）。一致地，基于单个 PG 神经元对光线和振动反应的 k-means 聚类分析显示，具有不同感觉偏好的 PG 簇在空间上部分分离（图 S5, H 至 K，以及视频 S3）。在单个动物中，这些由感觉诱发的 簇与自发活动簇部分重叠（图 S6）。总之，这些结果表明 神经元表现出选择性的感觉反应，且部分重叠但相互分离的 子区域偏好不同的感觉刺激。

支配斑马鱼端脑 pallium 的 PG 轴突被组织成对不同感觉模态具有选择性的拓扑区域

来自不同丘脑核团的轴突投射在羊膜动物皮层的功能和拓扑组织中发挥着重要作用 (2, 6)。我们探讨了类似的原理是否也存在于硬骨鱼类中。为了验证这一点，我们使用了一株 $Tg(gSAIzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s)$ 转基因鱼系，该鱼系在投射至 pallium 的 PG 轴突中表达转基因钙指示剂 GCaMP6s。我们通过向 注射 TMR-dextran，确认了幼年斑马鱼 pallium 中表达 GCaMP6s 的轴突起源于 ，并发现 GCaMP6s 与 TMR-dextran 信号之间存在强烈的重叠（图 3A）。体内双光子 $Ca^{2+}$ 成像显示， 轴突表现出自发的持续活动（图 3, B 和 C）。对持续 轴突活动的 K-means 聚类分析 (38, 39, 41, 51, 61)（图 3℃）揭示了在拓扑上分离的轴突簇（图 3, C 和 D；图 S7, A 和 B；以及视频 S4）。相邻 轴突像素的钙信号表现出高于随机水平的相关性（图 3E 和图 S7℃）。 轴突集群（图 3F）以及 轴突钙动力学之间的相关性（图 3G）在连续的时间段内保持稳定。这些结果表明，pallium 中 轴突末梢的自发活动在拓扑上是有组织的。

接下来，我们研究了 轴突向 pallium 传递什么样的感觉信息。为此，我们测量了 pallium 轴突对光刺激和振动刺激的钙信号响应，并观察到了兴奋和抑制现象（图 3, H 至 J）。随后我们探讨这些 轴突是否与 神经元一样，对单一感觉模态具有选择性。 轴突响应幅度的分布揭示了其对光刺激或振动刺激具有强烈的偏好（图 3K 和图 S7D）。因此，我们观察到，与少部分多感觉轴突相比，仅对光或仅对振动产生响应的 轴突比例显著更高（图 3L；仅对光响应对比多感觉响应，$P = 1.96 \times 10^{-4}$；仅对振动响应对比多感觉响应，$P = 5.92 \times 10^{-4}$；Wilcoxon 秩和检验）。

随后，我们研究了 轴突中感觉响应的拓扑组织，并观察到相邻轴突表现出更高相关性的感觉响应（图 3, M 和 N），且其聚焦度高于随机水平（图 S7E）。我们还观察到，在所有鱼类中空间位置一致的 轴突表现出拓扑上不同的感觉响应。具体而言，前外侧轴突表现出光偏好，而内侧和后侧区域表现出振动偏好（图 3O 和图 S7F）。一致地，利用视觉和振动联合响应对 pallium 轴突进行 k-means 聚类分析，揭示了不同鱼类之间 轴突簇的空间分离（图 S7, G 至 J）。在个体动物中，感觉诱发的 轴突簇与自发活动簇部分重叠（图 S7, K 至 M）。总之， 轴突表现出选择性的感觉响应，且这些响应部分地分离在拓扑上不同的 pallium 区域，这与哺乳动物皮层初级感觉区域的一级丘脑投射相似 (3, 5, 6)。

自发性和诱发性 PG 活动招募拓扑结构截然不同的外套层区域

我们的结果表明，PG 神经元是斑马鱼外套层（pallium）的主要间脑输入，并且它们选择性地编码不同的感觉模态。但是，斑马鱼外套层在何处以及如何接收来自 的信息？为了研究这一点，我们采用了基于自发性和诱发性 活动的两种互补方法。首先，我们询问哪些外套层区域与单个 簇的自发活动显示出强相关性。由于缺乏标准的幼年斑马鱼脑图谱，我们利用解剖标志（21, 35, 38, 41, 51）来标注单个外套层区域（图 S8, A 至 C），并确认这些区域在体内表现出截然不同的自发活动模式（图 S8D）。我们观察到，与单个 簇相关性最高的外套层神经元位于 Dm 和 Dl，这与接收 轴突的外套层区域在很大程度上重叠（图 S9, A 至 E），这一模式与 到外套层连接的格兰杰因果分析结果相似（图 S9, F 至 H）。

接下来，我们使用一种因果方法研究 到外套层的连接，通过双极玻璃微电极（38, 52）刺激 ，同时对 $Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)$ (60) 幼年斑马鱼脑离体样本中的神经活动进行体积成像（图 4A）。短暂的 微刺激（2 ms）在同侧和对侧外套层均诱发了兴奋和抑制（图 4B）。同侧外套层表现出的兴奋显著多于对侧外套层，而抑制则均匀分布在两个半球（图 4℃；兴奋，$P = 0.0024$；Wilcoxon 符号秩检验）。钙信号增加的兴奋性神经元在 Dm、Dc、Dl 以及外套层前部区域 (Da) 中更为普遍（图 4B 和图 S10A）。在 $Tg(elavl3:GCaMP6s)$ 动物中进行的更快速（22 Hz）的单平面记录显示，不同的外套层区域以不同的起始时间做出响应，这表明在 激活时它们的招募存在时间层级（图 S11, A 至 D）。我们观察到，受抑制的神经元主要位于 Da（图 4B 和图 S10B）。我们还观察到，同侧外套层的响应具有更高的试次间皮尔逊相关性，因此对 刺激表现出更可靠的响应（图 4, D 和 E，以及图 S10℃）。 诱发的外套层激活在这些区域中更为可靠（图 S10, C 和 D），且响应显著（图 S10, A 和 B）。在 紧邻区域外进行微刺激未引起外套层响应（图 S10, E 至 J）。突触阻断剂 NBQX 和 APV（浓度分别为 10 和 50 μM）消除了 诱发的外套层激活（图 S10, K

M

J

0

图 3. 斑马鱼端脑（pallium）中的 PG 轴突形成了拓扑组织化的集群，并表现出感觉选择性响应。(A) 在 Tg(gSAlzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s) 幼鱼中，表达转基因钙指示剂 GCaMP6s（绿色）的斑马鱼端脑 PG 轴突的双光子显微镜图像。通过在 中注射 TMR-葡聚糖进行共标记（如图 1B 所示），确认这些 GCaMP6s 标记的轴突起源于 （N = 3 条鱼）。(B) 示意图展示了斑马鱼端脑中 轴突投射的成像区域和位置，由虚线标出。(C) 单条鱼在自发持续活动期间，端脑 轴突的钙信号示例（以像素单位检测）。轴突活动使用 k-means 聚类被分为六个不同的集群。(D)

（上）与 (C) 中同一条鱼的 轴突双光子显微镜图像。（下）根据 (C) 中的 k-means 集群身份进行颜色编码的检测到的 轴突 2D 重建图。(E) 轴突自发活动的成对相关性随像素对之间距离的变化而变化。灰色虚线代表距离随机打乱时的成对相关性。阴影区域表示标准误差 SEM（N = 12 条鱼）。(F) 轴突在两个连续自发活动期间的集群保真度，与集群的随机分布进行了比较。(G) 两个连续自发活动期间 轴突像素的成对 Pearson 相关性。仅绘制了显著相关（P < 0.05）的部分。散点图中成对相关性的概率密度用颜色梯度表示。灰色点代表从随机分布中获得的成对相关性。随机数据（灰色，$r^{2} = 0.0008$）和观测数据（黑色，$r^{2} = 0.477$）的相关系数是通过线性拟合（由虚线指示）获得的。误差棒代表标准误差 SEM（$N = 12$ 条鱼，$*** P < 0.001$，配对 Wilcoxon 符号秩检验）。(H 和 I) 所有鱼在体内对光（左）和振动（右）刺激做出响应时，被激活 [红色，(H)] 和被抑制 [蓝色，(I)] 的 轴突像素的叠加 2D 重建图。颜色梯度代表响应 轴突的空间概率密度。未响应的 轴突显示为灰色（$N = 12$ 条鱼）。(J) 轴突钙信号对光（左）和振动（右）响应的时间进程。暖色表示神经活动增加；冷色表示神经活动减少。平均钙信号显示在每个热图的底部，阴影表示标准误差 SEM（$N = 8$ 条鱼）。(K) 所有单个 轴突像素在光和振动刺激下的平均响应。概率

在光或振动刺激下，被激活的 PG 轴突像素的密度以颜色编码显示。未被激活的轴突显示为灰色点。(L) 在单条鱼中，由光或振动（排他性）或由两种刺激（多感官）共同激活（红色）和抑制（蓝色）的响应 PG 轴突像素的比例。(M 和 N) PG 轴突对光 (M) 和振动 (N) 刺激响应的成对相关性随轴突像素对之间距离的变化而变化。灰色虚线代表距离随机打乱时的成对相关性。阴影区域表示 SEM ($N = 12$ 条鱼)。(O)（顶部）来自所有鱼的所有光激活（左）和振动激活（右）PG 轴突的位置在空间上对齐，并叠加在二维直方图中。较暖的颜色表示每个分箱（bin）中的神经元数量较高。（底部）两个二维直方图之间的差异显示在左下角，

而每个空间分箱的 $P$ 值显示在右下角。不显著的分箱以灰度表示，而显著的空间分箱以颜色显示。暖色表示对光刺激的空间偏好，而冷色表示对振动刺激的偏好 ($N = 12$ 条鱼)。误差线代表 SEM ($N = 12$ 条鱼, $* * * P < 0.001$，Wilcoxon 秩和检验)。

至 N)。总而言之，这些结果表明，PG 微刺激在不同的外套膜区域（除背侧后外套膜 (Dp) 外）诱发了显著且具有拓扑组织结构的响应。

斑马鱼外套膜中的感觉响应选择性较低且具有拓扑组织特性

接下来，我们探讨了感觉信息在斑马鱼外套膜（pallium）中是如何进一步处理的。为了在体内测量感觉响应，我们使用了头部固定的 $(38, 39, 41, 51, 61)$ 幼年斑马鱼 $Tg(eval3:GCaMP6s)$ $(60)$，其所有神经元均表达 GCaMP6s。在光刺激和振动刺激下，我们观察到外套膜中同时存在兴奋和抑制反应（图 4, F 至 H）。与 PG 神经元和轴突不同，除了仅对光或振动刺激产生响应的外套膜神经元外，很大一部分外套膜神经元对光和振动刺激均表现出多感觉响应（图 4, I 和 J，以及图 S12A）。在光和振动刺激下，相邻的外套膜神经元表现出相关活动（图 4, K 和 L）以及高于随机概率的局灶性（fig. S12B）。尽管存在大量多感觉外套膜神经元，但我们观察到 Dl 和 Dm 分别对光和振动刺激表现出偏好性（图 4M）。

斑马鱼外套膜中的多感觉表征比 PG 中更显著

我们的结果显示，与 不同，大多数外套膜神经元是多感觉的，能对光和振动均产生响应（图 4, I 和 J）。这提出了这样一种可能性：某些外套膜神经元整合了来自并行感觉信息流的信息。为了研究这一点，我们将来自 神经元（图 5, A 和 D）的感觉整合与来自外套膜中 轴突（图 5B）以及外套膜神经元（图 5, C 和 E）的感觉整合进行了比较。我们观察到，外套膜神经元中的多感觉响应显著多于外套膜 轴突（图 5, F 至 I； 轴突对比外套膜神经元，$P = 0.02$；Dunn 检验），尤其是在外套膜区域 Dc 和 Dm 中（图 S12, C 至 F）。此外，与 神经元和轴突相比，外套膜中的光响应和振动响应表现出显著更高的皮尔逊相关系数（ 神经元对比外套膜神经元，$P = 0.0027$； 轴突对比外套膜神经元，$P = 0.0051$；Dunn 检验）和余弦相似度（ 轴突对比外套膜神经元，$P = 0.039$；Dunn 检验）（图 5, J 至 L）。这些发现表明，感觉选择性从类丘脑的 到类皮层的外套膜逐渐降低。

斑马鱼端脑皮层中感觉计算的层级结构具有拓扑组织特性

我们证明了感觉表征从 PG 到端脑皮层（pallium）变得更加复杂，且端脑皮层中同时包含模态特异性神经元和多感觉神经元。接下来，我们探讨了这些不同类别的神经元在空间上是如何组织的。我们发现，仅对光或振动产生反应的神经元主要分别位于不同的端脑皮层区域，即 Dl 和 Dm（图 6, A 和 B），这类似于哺乳动物感觉皮层的模态特异性分区 (2, 6)。相比之下，多感觉神经元位于端脑皮层的中内侧区域，主要分布在 Dc 和 Dm（图 6℃）。

随后，我们通过跨模态刺激 (63) 检查了端脑皮层的感觉整合，在该实验中，光刺激和振动刺激被同时传递（. S13, A 到 D）。接着，我们识别出了那些不对单独的光或振动产生反应，但仅对两者同时出现产生反应的端脑皮层神经元。我们将这些神经元称为“整合型”神经元。整合型神经元在端脑皮层神经元中所占比例最大（. S13E）。此外，它们定位于端脑皮层一个独特的前中央区域，即前 Dc（. 6D）。这些发现凸显了斑马鱼端脑皮层中感觉计算的层级结构和专业化，反映了信息处理复杂性的增加。

有人可能会认为，端脑皮层中的整合型神经元可能是由于阈值效应而产生的。例如，光和振动刺激的线性组合可能会驱动弱端脑皮层神经元超过检测阈值，从而错误地显示出非线性。为了探讨这种可能性，我们采用了一个量化多感觉非线性的指数 (51, 64)。根据该指数，如果一个神经元对同步刺激的反应超过了其对每种单独刺激反应的线性之和，则将其分类为“超加性”（superadditive）（. 6, E 到 G, 右）。如果同步反应弱于最强的单一反应，则将其分类为“抑制性”（depressed）（. 6, E 到 G, 左）。所有其他神经元被分类为“亚加性”（subadditive）（. 6, E 到 G, 中）。当我们绘制这些不同类别的端脑皮层神经元的空间分布图时（. 6H），我们发现抑制性神经元（端脑皮层神经元中占比最大的一类，. 6F）位于端脑皮层最前缘、后缘和侧缘（. 6H, 左，以及 . S13F）。超加性神经元位于端脑皮层的前中央区域（. 6H, 右，以及 . S13H），与整合型神经元的空间分布高度重叠（. 6D）。大多数整合型神经元被分类为超加性（. 6, I 和 J），凸显了这两个群体之间的重叠。亚加性神经元则分布在后部区域（. 6H, 中，以及 . S13G）。总而言之，我们的结果揭示了斑马鱼端脑皮层中感觉计算的功能层级和专业化，且具有强烈的拓扑区域化特征（. S14）。

讨论

一级丘脑是哺乳动物皮层感觉信息的主要来源 $(1, 6, 25)$。斑马鱼的“真丘脑”（thalamus proper）介导各种感觉计算 $(65–67)$。然而，我们发现前丘脑（PG）而非真丘脑，是斑马鱼端脑皮层（pallium）端脑外输入的主要来源，这与其他硬骨鱼类一致 $(20, 21, 45, 47, 48)$。硬骨鱼的 PG 与其他脊椎动物的丘脑结构相比如何？ 到端脑皮层的神经支配在 5 天大的斑马鱼中就已经存在，这与哺乳动物丘脑皮层投射的早期发育一致 $(68)$。与哺乳动物丘脑相似 $(6, 55)$，斑马鱼的 主要由谷氨酸能神经元组成，包含较少数量的 GABA 能神经元。只有谷氨酸能 神经元投射到端脑皮层，这镜像了哺乳动物的丘脑接力神经元 $(6, 55)$。因此，GABA 能 神经元可能充当局部中间神经元。

图 4. 由 激活和感觉刺激诱发的端脑皮层反应具有异质性且呈拓扑组织分布。(A) (顶部) 方案图，表示在对端脑皮层神经元进行双光子钙成像期间，对幼年斑马鱼脑离体样本中的 进行微电极刺激 (N = 12 条鱼)。(中间) 幼年斑马鱼端脑皮层的方案图，叠加了 轴突的终止区 (左) 以及由虚线划定的解剖学识别的端脑皮层区域位置 (右)。(底部) 明场图像，指示脑离体样本中微刺激电极的位置 (由红星表示)。 边界由白色虚线圆圈突出显示。(B) 刺激后所有被激活 (红色)、被抑制 (蓝色) 的端脑皮层神经元以及无反应神经元 (灰色) 的 2D 重建图。所有鱼的数据在空间上对齐并叠加。颜色梯度代表反应端脑皮层神经元的空间概率密度。每个重建图下方是沿外侧-内侧轴的激活 (红色) 和抑制 (蓝色) 神经元的计数 (N = 12 条鱼)。(C) 相对于受刺激 ，同侧和对侧半球中被激活 (顶部) 和被抑制 (底部) 的端脑皮层神经元的比例 (N = 12 条鱼, **P < 0.01, 配对 Wilcoxon 符号秩检验)。(D) (顶部) 在重复微刺激试验中可靠反应的端脑皮层神经元的 2D 重建图。仅当相关性 P < 0.1 时，端脑皮层神经元试验间反应的 Pearson 相关系数才用颜色编码。(底部) 沿外侧-内侧轴可靠反应的端脑皮层神经元的计数 (N = 12 条鱼)。(E) 按半球绘制的跨试验可靠激活神经元的比例 (N = 12 条鱼, *P < 0.05, 配对 Wilcoxon 符号秩检验)。(F 和 G) 在体内对光 (左) 和振动 (右) 刺激做出反应的所有空间对齐鱼类中，被激活 [红色, (F)] 和被抑制 [蓝色, (G)] 的端脑皮层神经元的叠加 2D 重建图。颜色梯度代表反应端脑皮层神经元的空间概率密度。无反应的端脑皮层神经元显示为灰色。(H) 端脑皮层神经元对光 (左) 和振动 (右) 刺激反应的钙信号时间进程。暖色表示神经活动增加；冷色表示活动减少。平均钙信号显示在每个热图的底部；阴影表示 SEM (N = 10 条鱼)。(I) 所有单个端脑皮层神经元在光和振动刺激下的平均反应。光或振动刺激下被激活的端脑皮层神经元的概率密度用颜色编码。未被激活的神经元显示为灰色点。(J) 被光或振动激活 (红色) 和抑制 (蓝色) 的反应端脑皮层神经元的比例

[版面噪声，已略]

[版面噪声，已略]

在哺乳动物中，非线性源于不同的电路基元 $(1, 2, 4, 8, 9)$。在硬骨鱼类中，外套膜（pallium）的非线性在何处以及如何产生？解剖学研究表明，硬骨鱼类的外套膜包含循环 $(53, 78)$、前馈与反馈 $(21, 22, 48, 70, 93)$ 以及半球间 $(21, 52)$ 连接。此类架构基元在鸟类 $(11, 12, 13)$ 和爬行动物的外套膜 $(15)$ 中也有记载。PG 刺激产生了一波扩散的外套膜活动，触及了没有 PG 支配的区域以及对侧外套膜，这表明存在多突触传播。此外，约 $40\%$ 的外套膜神经元在光刺激和振动刺激同时进行时表现出竞争性抑制。鉴于斑马鱼外套膜主要由谷氨酸能神经元组成 $(19, 40)$，这种刺激竞争可能是由谷氨酸能外套膜神经元与 GABA 能亚外套膜（subpallial）神经元之间的反馈连接介导的 $(36, 93)$。一致的是，刺激谷氨酸能 PG 也会诱发前外套膜的抑制，这可能是通过亚外套膜 GABA 能电路实现的。尽管我们关注的是 PG 到外套膜连接的宏观功能解剖结构，但我们的发现强调了建立斑马鱼外套膜详细的解剖、突触和功能连接图谱的必要性。凭借其体积小、光学可及的脑部以及强大的遗传工具箱，斑马鱼在结合电子显微镜（EM, 54）和光遗传学（94）之后，有望成为首批实现完整外套膜连接组的脊椎动物之一，从而紧随果蝇连接组 $(95)$ 的进展。

A

C

D

E

F

G

H

I

J

K L

图 5. 感官表征在从 PG（后脑感觉核）传递到外套膜（pallium）的过程中选择性降低。(A 至 C) 受激发的 PG 神经元 [(A) N = 11 条鱼]、 轴突 [(B) N = 12 条鱼] 以及外套膜神经元 [(C) N = 10 条鱼] 的 2D 重建图，根据其感官选择性进行颜色编码（橙色代表仅对光响应，青色代表仅对振动响应，紫色代表多感官响应，灰色代表所有其他神经元）。(D) 被分类为仅对光响应（左）、仅对振动响应（中）和多感官响应（右）的不同 神经元的示例轨迹。单次试验响应显示为细线，粗线代表多次试验的平均响应。试验响应根据感官刺激进行颜色编码（橙色：光；青色：振动）。(E) 与 (D) 相同，但针对的是外套膜神经元。(F 至 H) 神经元 (F)、 轴突 (G) 和外套膜神经元 (H) 的平均感官响应散点图，采用与 (A) 至 (C) 相同的颜色编码。(I) 从 到外套膜的所有数据集中，多感官响应神经元或单元的比例。(J) 所有数据集（深紫色：外套膜神经元；紫色： 轴突；浅紫色： 神经元）中神经元或单元感官响应相关性的累积分布。(K) 不同数据集之间多神经元感官表征的平均相关性。(L) 不同数据集之间多神经元感官表征的平均余弦相似度。误差线代表 SEM（标准误差）。(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Kruskal-Wallis 检验后接 Dunn's 检验)。

B

D

F H

G

I

J 图 6. 斑马鱼外套膜中的感官表征层级在拓扑结构上是有组织的。(A 至 D) 所有空间对齐的鱼中，仅对光 (A) 或振动 (B) 刺激有响应的受激发外套膜神经元、对光和振动均有响应的多感官外套膜神经元 (C)，以及在单独呈现刺激时不响应，但仅在光和振动同时传递时才响应的整合性外套膜神经元的叠加 2D 重建图。颜色梯度代表受激发外套膜神经元的空间概率密度。所有其他外套膜神经元显示为灰色 ($N = 10$ 条鱼)。(E) 所有外套膜神经元交互指数的累积分布。(F) 表现出

每条鱼中表现出加成性或抑制性的个体比例（$N = 10$ 条鱼；$P < 0.01$；$P < 0.001$；Wilcoxon 秩和检验）。(G) 与单独给予光刺激（橙色）和振动刺激（青色）相比，在同时给予光和振动刺激（金色）后，表现出抑制性（左）、亚加成性（中）和超加成性（右）的pallium神经元的平均响应。(H) 表现出抑制性（左）、亚加成性（中）和超加成性（右）的pallium神经元的2D重建图。颜色梯度代表分类后的pallium神经元的空间概率密度。所有其他pallium神经元以灰色显示（$N = 10$ 条鱼）。(I) 根据交互指数分类的先前识别的整合性pallium神经元的2D重建图：黄色代表超加成性，蓝色代表抑制性，红色代表亚加成性，灰色代表所有其他神经元。(J) 每条鱼中表现出加成性或抑制性的整合性pallium神经元的比例（$**P < 0.001$；Wilcoxon 秩和秩和检验）。误差棒代表 SEM。

斑马鱼中脑和后脑中的感觉-运动计算已被广泛研究 (94, 96–98)。然而，（非嗅觉）感觉信息如何在斑马鱼的pallium（哺乳动物皮层的同源结构）中接收和处理，目前仍不十分清楚。我们证明，尽管丘脑传出输入极少，但斑马鱼的pallium通过PG中继的视顶盖传出输入，演化出了趋同的架构和计算。这些日益复杂的pallium响应模式与PG激活时pallium神经元的渐进式招募相一致。这种pallium功能的隔离组织表明感觉计算存在区域特异性，并且在一定程度上存在分级电路排列。未来的电子显微镜（EM）重建 (54) 对于揭示斑马鱼pallium的连接基元、架构层级和区域化至关重要。一方面，斑杂鱼pallium的区域化类似于鸟类pallium的核团式、非层级架构 (12, 13, 32)。另一方面，从pallium后部到前部非线性程度的逐渐增加，类似于哺乳动物皮层中并存的功能特异性和层级结构，其中后部区域执行较简单的感觉计算，而前部的高级皮层处理更复杂、整合性的过程 (1, 7, 90)。我们的结果强调，区域化是脊椎动物pallium的一个基本特征。这种区域化可能支持pallium作为能够同时执行多种操作的并行处理器的作用，这应通过使用扩展的刺激空间进一步测试。斑马鱼pallium的这种功能区域化是否反映了不同的分子特征尚不清楚。

最近的转录组研究以前所未有的分辨率绘制了包括哺乳动物 (87) 在内的多种脊椎动物 pallium 的分子拓扑图 (14, 16–18, 88)。我们预计，斑马鱼pallium的分子图谱将有助于将区域特异性的功能和分子特征相对齐，并实现pallium神经元多样性的跨物种比较。

材料与方法

斑马鱼养殖与品系

除另有说明外，大多数实验使用了幼鱼（受精后 21 至 28 天，dpf）。所有斑马鱼均饲养在 3.5 L 的水槽中，维持在 $28^{\circ}$ C 的温度、pH 7.2、电导率 $\sim700 \mu$ 西门子。鱼类处于 14:10 的昼 / 夜循环中，所有鱼类维护程序均已获得挪威食品安全局（NFSA）的批准。此年龄段的斑马鱼尚未发育成熟，因此还没有性别。实验使用了以下转基因品系的鱼：通过将 Tg(vglut2a:DSred) (56) 与 Tg(gad1b:GFP) (57) 杂交产生的 (vglut2a:DsRed;gad1b:GFP)；(elavl3:GCaMP6s) (60)；(elavl3:H2B-GCaMP6s) (60)；以及通过将 (gSAIzGFFD707A:Gal4) 和 (USA:GCaMP6s) (62) 品系杂交创建的 (gSAIzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s) 品系。(gSAIzGFFD707A:Gal4) 是在国立遗传学研究所（日本三岛）使用基于 Tol2 转座子的基因陷阱和增强子陷阱构建体 (37, 99) 产生的。

样本量根据实验室之前的实验确定，且仅使用健康的鱼进行实验。对于成像实验，仅使用在经荧光显微镜筛选后显示出明亮荧光的动物进行实验。健康状况受损且必须被安乐死地动物也被排除在我们的分析之外。

由于 PG 是一个腹侧结构，我们使用 (elavl3:H2B-GCaMP6s) 品系来可靠地对单个 PG 神经元进行成像和分割（图 2 以及图 S5, S6 和 S9）。核定位的 H2B-GCaMP6s 提供了更高的亮度和更清晰的细胞边界，从而能够在该深度自信地识别 PG 神经元。同样的核标记还帮助我们对位于全脑离体样本最腹侧部分的披层神经元进行成像，该样本以腹侧向上放置，以便精确放置微刺激电极（图 4, A 至 E，以及图 S10）。对于快速离体披层成像（图 S11）、体内 PG 轴突成像（图 3 和图 S7）以及披层钙成像（图 4, F 至 M, 6 以及图 S8, S12 和 S13），由于细胞质 GCaMP6s 具有更高的灵敏度和动态范围，我们采用了该指标。

伦理指南声明

所有在斑马鱼幼鱼上进行的实验程序均符合欧洲议会和欧盟理事会的 Directive 2010 / 63 / EU 指令。相关程序已获得挪威食品安全局的批准，FOTS-ID:#30433, FOTS-ID:#24125, FOTS-ID:#25648。

离体样本制备

离体样本的制备如之前所述 $(38)$。简而言之，鱼首先在冰冷的人造鱼水（AFW，20L 蒸馏水中加入 1.2 g 海盐）中麻醉，然后在充氧（Carbogen, 95% O₂ / 5% CO₂, 林德公司）的人造脑脊液（ACSF）中通过斩首安乐死。ACSF 是通过将以下盐类溶解在蒸馏（反渗透，RO）水中制备的：131 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.23 KH2PO₄, 2 MgSO₄7H₂O, 10 葡萄糖, 2.5 CaCl₂, 和 20 NaHCO₃ $(52)$。安乐死后，首先去除底层的肌肉组织、颌骨和眼睛。随后，小心地去除皮肤、硬脑膜和骨骼，使完整解剖的脑部能够自由接触充氧的 ACSF。提取的脑部随后使用钨针固定在涂有 Sylgard（World Precision Instruments）的小培养皿中，然后转移到成像装置（荧光或双光子装置，见下文）中，脑部在其中不断用充氧 ACSF 灌注。随后，它们被用于神经追踪或钙成像实验（见下文离体 $Ca^{2+}$ 实验部分）。

神经示踪剂注射

解剖示踪实验在 $Tg(elavl3:GCaMP6s)$、$Tg(gad1b:GFP)$ 和 $Tg(vglut2a:DSred)$ 鱼系幼鱼的离体脑组织中进行。在这些实验中，使用由手动载物台控制的明场 / 荧光显微镜（Olympus BX51WL）对大脑进行可视化。染料的荧光使用绿色 LED（530 nm）（M530L3, ThorLabs）进行可视化。使用 5x 空气物镜（Olympus, MPlanFLN NA 0.15）和 10x 水浸物镜（Olympus, MPlanFLN NA 0.3）来观察离体脑组织。

使用四甲基罗丹明右旋糖酐染料（3000 MW, Thermofischer）来标记感兴趣的细胞体和投射。对于使用 $Tg(vglut2a:DSred)$ 鱼类的实验，我们改用 Alexa647-右旋糖酐染料（10,000 MW, Thermofischer）。鉴于染料带电，我们采用离子电泳法在感兴趣的结构中进行局部注射。神经示踪染料被装入硼硅酸盐玻璃移液管（1.00 mm；World Precision Instruments）中，该移液管使用水平拉管机（P-2000, Shutter Instruments）拉制。我们使用银丝电极，通过刺激单元（ISO-Flex, A.M.P.I.）以不同的间隔（Master8, A.M.P.I.）和幅度施加微小的电脉冲，以便在荧光显微镜下控制注射量。小剂量注射使用 0.2 mA 的电流，以 1Hz 的间隔进行 200-400 次 25 ms 的脉冲。

相比之下，大剂量注射在相同频率和幅度下使用 600-800 次脉冲完成。神经示踪剂注射后，离体组织在 4℃ 的相同 ACSF 中孵育过夜前，保持用含氧 ACSF 灌流 3-4 小时。随后，样本在 4% 多聚甲醛中固定 4-6 小时。组织固定后，幼鱼离体脑组织按照 Binaree 组织透明化试剂盒（#HRTC-012, Binaree）的推荐方案进行组织透明化处理。简而言之，组织在 4℃ 的 Binaree 起始溶液中孵育过夜。次日，将样本转移至含有 500 μL 组织透明化溶液 A 的孔板中，并在 37℃ 下孵育 24 小时。然后，样本用 RO 水洗涤四次，每次在 4℃ 下以 30 rpm 震荡 20 分钟。随后，将样本转移至

另一个含有 500 μL 组织透明化溶液 B 的孔板中，并在 37℃ 下再次孵育 24 小时。最后，组织再次用蒸馏（RO）水洗涤四次（同前所述），然后使用 Binaree 提供的封片剂将其封片在显微镜载玻片上。

EM 数据分析

EM 数据获取自 $(54)$。利用 Neuroglancer（一个连接到 CAVE [Connectome Annotation Versioning Engine] 后端的基于 Web 的可视化工具 $(100)$）在 Fish1 EM 体积数据中识别并校对前球状复合体（preglomerular complex）和外套膜（pallium）中的感兴趣神经元。校对过程包括检查正交截面（xy、xz 和 yz 平面）中的原始电子显微照片，并结合 3D 神经突触轨迹追踪，手动修正自动分割中的形态学错误，包括合并错误（distinct neuronal processes were incorrectly fused，即不同的神经元突触被错误地融合）和分割错误（continuous processes were fragmented across multiple segments，即连续的突触被碎片化为多个片段）。从校对后的候选样本中，选择了一组高质量的“外套膜投射 PG 神经元”和“PG 投射外套膜神经元”的完整重建结果，用于生成相关图表。

共聚焦成像与解剖分析

组织块在透明化处理后，使用共聚焦显微镜（Zeiss Examiner Z1 LSM 880 共聚焦显微镜）进行成像，所用物镜为 10x（Zeiss, Plan-Apochromat NA 0.45）或 20x 物镜（, Plan-Apochromat, NA 0.8）。Z-stack 图像通过 Zen 3.9 () 获取，随后使用 ImageJ / Fiji 或 Imaris 4.0 (Oxford Instruments) 进行进一步分析。细胞计数在 Imaris 4.0. 中手动完成。我们的解剖分析基于 (21, 38) 中确定的解剖标志以及成年斑马鱼脑图谱 (AZBA) (35)。

体内双光子 $Ca^{2+}$ 成像

对于体内实验，使用了配备 20x 水浸物镜（ 7 MP, W Plan-Apochromat NA 1.0）的双光子显微镜系统 (Scientifica)。激发光源采用调谐至 920 nm 的锁模钛宝石激光器（Spectra Physics, MaiTai）。利用压电陶瓷（Physik Instrumente）在 8 个平面上进行体积体内记录，每个体积的采集速率为 2.2 – 3.4Hz。PG 记录采用 $1536 \times 850$ 像素的图像尺寸，而端脑记录采用 $1536 \times 600$ 像素的图像尺寸。所有记录均使用 SciScan 软件套装 (LabView) 完成。

对于体内双光子钙成像实验，首先按照 (38, 39, 41, 51) 的方法将幼年斑马鱼嵌入琼脂糖中。简而言之，将鱼嵌入记录皿（World Precision Instruments, Fluorodish）中的低熔点（LMP, Fisher Scientific）琼脂糖（AFW 中浓度为 2.5%）中，等待 20 min 使琼脂糖凝固。随后，用手术刀去除鼻子、嘴巴周围的三角形琼脂糖区域以及包含尾部的另一个三角形区域。然后将嵌入的鱼转移到记录装置中，在记录前 30 min，记录皿中持续灌流加热至 28℃（Warner Instrument Corporation）且充氧（Carbogen）的 AFW。

在进行感觉刺激之前，记录 10 min 的持续自发活动。随后，每隔 1 min 向鱼提供一次感觉刺激（红光闪烁或机械振动），参数参考之前的研究 $(39, 41, 51)$。红光由放置在鱼前方的红色 LED（LedEngin, LZ1-00R105；波长 630-nm）产生。在这些实验中，光闪烁持续时间为 200 ms，在鱼所在位置的 635nm 强度为 0.318 mW。此外，机械振动是通过向电磁敲击器（SparkFunElectronics, ROB-10391）施加 50 ms 长的 6 V 电流产生的，产生 300-10000Hz 之间的振动频率 $(51)$。这两者均由连接到计算机的 Arduino 控制，并使用 Matlab (Mathworks) 启动。这些感觉刺激要么单独交付（图 2, 3, 和 4 以及图 S5, S6, S7, 和 S12），要么同时交付（起始时间同步；图 6 和图 S13），且均在之前的研究 $(39, 41, 51)$ 中被使用。光刺激、振动刺激或光与振动的共同刺激重复八次，刺激间隔为 60 s。最后，不同刺激条件之间的时间间隔为 4 min。

体外 $\text{Ca}^{2+}$ 成像

对于离体组织钙成像实验，使用了类似的双光子显微镜装置（Scientifica），连接至调谐至 920 nm 的 Ti:Saphire 激光器（MaiTai, Spectra Physics）。同样使用了相同的采集软件（SciScan, LabView），但改为使用 16 倍水浸物镜（Nikon, NA 0.8, LWD 3.0）。通过以 2.2-2.5Hz 的速率对 8 个平面进行成像，图像尺寸为 $1536 \times 750$ 像素，实现了整个端脑的体积成像。对于快速记录实验（图 S11），我们以 22 Hz 的速率对三个独立的单平面进行成像。

此外，利用与神经追踪实验类似的荧光显微镜装置进行了对照微刺激实验。在这种情况下，使用蓝色 (470 nm) LED (M470L3, ThorLabs) 来激发并可视化 GCaMP 荧光。荧光图像使用 QImaging 相机（Teledyne Photometrics）和 Occular 图像采集软件（Teledyne Photometrics）进行采集。离体组织的单平面图像以 40 Hz 的频率采集，相机曝光时间设置为 4 ms。

微电极刺激

玻璃移液管微电极的制备方法如 $(38)$ 所示，首先使用水平拉管机（Model P-2000, Sutter Instruments）拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（1.00 mm; World Precision Instruments）。玻璃电极的电阻约为 $ 10-12 MOhm。通过使用双组分环氧树脂胶（Locite）将两个玻璃电极粘合，使玻璃移液管尖端彼此距离在 1-2 mm 以内，从而创建自定义的双极电极。随后，用 ACSF 填充玻璃移液管，并使用微操纵器（Scientifica）将其定位在脑内。使用电流隔离单元（Digitimer DS3 型），通过一组 10 个短促 (2 ms) 的电流脉冲 (30-50 $\mu$ A) 刺激 PG 神经元，刺激间隔为 60 s。对于对照实验（图 S10），使用 40-50 $\mu$ A 的电流脉冲组来刺激 PG 及其相邻脑区（距离 PG 约 $ 20 $\mu$ m 之外）的神经元。

数据分析与量化

双光子显微成像图像使用 Suite2p (101) 进行对齐，随后通过视觉检查以确认是否存在任何异常的运动伪影（例如 z 轴方向的漂移）。仅使用经过运动和漂移校正的实验数据进行进一步分析。对应于神经元的感兴趣区域 (ROI) 是使用一种自定义的半自动模板匹配算法 (38, 39, 51, 61, 62) 检测的。随后使用自定义 Matlab 脚本提取 ROI 的空间位置，并计算每个神经元的荧光相对变化 ($\Delta F / F$)。对于感觉和电刺激实验，$\Delta F / F$ 是基于每次刺激试验前 5 s 的基线计算的。相比之下，在持续的自发活动期间，$\Delta F / F$ 是使用 6 min 的滑动基线窗口计算的。随后，$\Delta F / F$ 信号使用 Yaksi 和 Friedrich (102) 中描述的低通滤波器进行滤波。上述 $Ca^{2+}$ 信号处理均在 Matlab (Mathworks) 中使用自定义脚本完成。脑区的界定是根据 (21, 38) 和 AZBA (35) 中确定的解剖标志手动完成的。对于端脑记录，仅分析背端脑并将其视为斑马鱼的外套层 (pallium)。端脑 PG 轴突的检测采用了 (41) 中描述的方法。原始荧光图像首先进行分箱 (binned)，然后使用基于阈值的算法在手动绘制的分箱荧光图像区域内检测轴突像素。相对荧光强度值大于最大像素值 25% 的分箱像素被视为轴突像素。随后，对荧光图像进行独立成分分析以识别轴突 ROI (41)，在进一步分析前对其进行手动检查。

单个神经元的自发持续神经活动使用 Matlab 中的 k-means 聚类函数 $(38, 51, 61)$ 被聚类为功能集群。我们使用神经活动的相关性作为神经元之间的距离度量。聚类所采用的最佳集群数量是通过肘法 (elbow method) $(38, 41, 61)$ 确定的。简而言之，肘法计算每个集群元素的簇内距离之和，并由实际数据（黑色）以及具有与实际数据相同方差但无集群结构的模拟数据（灰色，100 次迭代）的平均簇间距离之和进行归一化。该计算针对多达 30 个 k-means 集群进行迭代。相关的 k-means 集群数量对应于肘点，即黑色曲线出现明显弯曲的地方。集群质心随机初始化并迭代 100 次，直到获得稳定的集群身份。该分析分别针对 PG 神经元数据（图 S5, N = 11 条鱼）、外套层 轴突数据（图 S7, N = 12 条鱼）以及外套层自发活动的体内记录（图 S8, N = 10 条鱼）进行。

为了进一步量化功能性 集群的拓扑结构，我们将来自不同个体的 神经元在不同轴（前后轴、内外侧轴、背腹轴以及所有 3D 坐标）上的位置拟合到 MATLAB (Matworks) 中的线性支持向量机 (SVM) 模型 (103) 中，并测试其是否能准确预测通过 k-means 聚类获得的 神经元集群身份。随后使用 10 折交叉验证确定模型的准确率。接着将该模型与随机打乱模型进行比较，在随机打乱模型中，沿测试空间轴的集群标签被随机打乱。共生成 500 个此类模型，以计算随机打乱模型的平均分类准确率。

为了评估这些神经元的集群身份（cluster identity）是否随时间保持稳定，我们使用了集群忠实度指数 $(38, 61)$。简而言之，该指数衡量了每个神经元在间隔 30 s 的连续 4 min 时间段内保持在同一个 k-means 集群中的概率。随后，将这些集群忠实度值与一个随机分布进行比较，在该分布中，每个神经元的集群身份被随机打乱。

为了评估在体内（in vivo）感觉刺激和体外（ex vivo）电微刺激后，前室球（PG）和外套膜（pallial）记录单元（神经元和轴突）的功能拓扑结构，后续分析仅考虑有响应的单元。这些响应单元的量化方法如之前的研究 $(38, 51)$ 中所述。简而言之，当神经元 / 轴突在刺激开始后 5 s 时间窗（响应期）内的跨试次平均响应大于基线活动（刺激开始前 5 s）的平均值加上 2.5 倍标准差时，被分类为正响应（“兴奋”）。相反，当响应期内的平均活动小于基线活动的平均值加上 1.5 倍标准差时，则被识别为负响应（“抑制”）神经元或轴突。

为了可视化不同鱼类之间响应单元的空间分布，我们将每条鱼所有识别出的感兴趣区域（ROI，神经元或轴突像素）沿 X 和 Y 维度的空间位置归一化为 0 到 1 之间的值，这对应于对齐后大脑的 X 和 Y 边界。空间对齐后，所有记录鱼类的神经元被相互叠加，然后使用基于核平滑函数的密度图或 2D 直方图进行可视化。这种响应神经元空间位置的 2D 重建是对大脑每个半球分别进行的，但图 4B 除外，在该图中我们检查了外套膜中的同侧与对侧响应。为了量化数据集的拓扑选择性，我们将振动 2D 直方图的计数从光照 2D 直方图的计数中减去，然后使用高斯滤波器进行平滑，以创建“差异” 2D 直方图。为了计算 PG 神经元、外套膜中 PG 轴突以及外套膜神经元在这些 2D 直方图中空间隔离的统计相关性，我们计算了每个分箱像素中视觉响应与振动响应之间的统计显著性，并且仅在显示出显著差异的像素中展示视觉与振动响应之间的差异。

为了量化兴奋的神经元或轴突是否显示出显著的空间定位，我们使用了聚焦指数 $(39)$。简而言之，聚焦指数的范围从 0 到 1（0 表示分布高度随机，1 表示神经元分布高度聚焦）。其计算方法为：1 减去所有兴奋神经元对的平均欧几里得距离，再除以单个半球内所有神经元的平均欧几里得距离。随后，使用每个半球的平均聚焦指数来计算每条鱼的平均聚焦指数。

所有响应单元或轴突像素的时间进程轨迹使用 Rastermap (104) 进行排序，然后使用 Matlab (Mathworks) 将其可视化为热图。

为了量化响应单元的感觉选择性，我们比较了平均响应向量，即兴奋单元在响应期间的平均响应 $(\Delta F / F)$ 幅度。为了研究感觉选择性在感觉处理层级中是如何呈现的，我们对所有记录单元在光照和振动刺激后的平均感觉响应向量进行了相关性分析（图 5）。仅对光照或振动其中之一产生响应的单元被分类为专属神经元或轴突。对两种感觉刺激均产生响应的单元被分类为多感觉神经元或轴突。

仅在两种刺激同时呈现时产生响应，而在单独呈现时无响应的神经元被分类为整合神经元。

由于缺乏幼年斑马鱼端脑皮层（pallium）的解剖图谱，我们利用先前建立的解剖标志物（21, 35, 38, 41, 51）（图 S8℃），在每条鱼中分别标注了端脑皮层区域。这些标志物为端脑皮层区域和神经元提供了可靠的功能边界。为了确保标注的准确性，我们确认每个划定的区域在体内记录期间表现出截然不同的自发活动模式，并且对不同的 k-means 聚类表现出选择性偏好（图 S8D）。随后，使用聚类选择性指数来量化划定区域与通过 k-means 聚类识别的功能聚类之间的重叠程度（38）。为了计算聚类选择性，我们通过将聚类端脑皮层神经元的稀疏度与端脑皮层神经元的随机采样进行比较来衡量（39, 61）。聚类选择性为 1 表示给定端脑皮层区域内的所有神经元都属于同一个功能聚类，而值为 0 则表示该区域内的神经元均匀分布在所有聚类中，因此在功能上没有区别。

为了研究端脑皮层中 PG 持续活动与感觉诱发活动之间的关系，我们首先使用 k-means 聚类对 PG 神经元的自发持续活动进行聚类，并将每个聚类的平均活动作为群体向量。然后，我们将该平均群体向量与每个单独的端脑皮层神经元进行相关性分析。相关值 >0.4 的端脑皮层神经元被认为具有强相关性（图 S9, C 至 E）。

对单个端脑皮层神经元到单个 神经元的格兰杰因果分析（Granger causality analysis）是在 Matlab (Mathworks) 中使用经济建模工具箱中的 “gctest” 函数完成的。随后，选取与单个 神经元具有最显著 $P < 0.05$ 因果关系的排名前 10% 的端脑皮层神经元，以检查它们在端脑皮层中的空间分布。使用对应于 $\sim1$、$\sim2$ 和 $\sim3$ 秒时间延迟的不同滞后阶数，来测试从 到端脑皮层是否存在任何显著的因果关系（图 S9, F 至 H）。

为了进一步量化端脑皮层神经元的响应特性（图 6），我们计算了一个交互指数（51, 64）。我们在响应期间（刺激开始后的 5 秒内）测量了神经元对光、振动或共同刺激（光和振动）的平均响应 (R)。接着，使用以下改编的公式计算交互指数：

$$ \mathrm{Interactiveindex} = \frac {R _ {\mathrm{Light} \& {Vib}} - \max \left(R _ {{Light}} , R _ {{Vib}}\right)}{\max \left(R _ {{Light}} , R _ {{Vib}}\right)} \times 1 0 0 $$

如果交互指数 >100，则该神经元被分类为“超加性”（superadditive），即其对共同刺激的响应是其在单独刺激期间最大响应的两倍。相反，如果交互指数 <0，则该神经元被分类为“抑制性”（depressed），因为其共同刺激响应小于单独刺激期间的最大响应。交互指数在 0 和 100 之间的值被分类为“亚加性”（subadditive）。

所有分析图表均在 Matlab (Mathworks) 中生成，随后在 Illustrator (Adobe) 中组装。 神经元的 EM 重建视频在 Blender 中生成，所有其他视频均在 Matlab (Mathworks) 中生成。

统计学分析

所有统计分析均在 Matlab 中完成。配对检验采用 Wilcoxon 符号秩检验，而非配对检验则采用 Wilcoxon 秩和检验。对于不同划定脑区之间的比较，首先进行 Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 事后检验。除非另有说明，所有误差棒均代表平均值的标准误差 (SEM)。用于统计比较的随机化是通过对数据集中的相关变量（例如集群身份）进行随机打乱来实现的。

参考文献与注释

1. K. D. Harris, G. M. Shepherd, The neocortical circuit: Themes and variations. Nat. Neurosci. 18, 170–181 (2015). doi: 10.1038 / nn.3917; pmid: 25622573

2. S. M. Sherman, Thalamus plays a central role in ongoing cortical functioning. Nat. Neurosci. 19, 533–541 (2016). doi: 10.1038 / nn.4269; pmid: 27021938

3. M. M. Halassa, S. M. Sherman, Thalamocortical Circuit Motifs: A General Framework. Neuron 103, 762–770 (2019). doi: 10.1016 / j.neuron.2019.06.005; pmid: 31487527

4. J. A. Harris et al., Hierarchical organization of cortical and thalamic connectivity. Nature 575, 195–202 (2019). doi: 10.1038 / s41586-019-1716-z; pmid: 31666704

5. T. Guillamón-Vivancos, M. Aníbal-Martínez, L. Puche-Aroca, F. J. Martini, G. López-Bendito, Sensory modality-specific wiring of thalamocortical circuits. Nat. Rev. Neurosci. 26, 623–641 (2025). doi: 10.1038 / s41583-025-00945-y; pmid: 40745219

6. S. M. Sherman, R. W. Guillery, Exploring the thalamus and its role in cortical function (MIT press, 2006).

7. M. Rigotti et al., The importance of mixed selectivity in complex cognitive tasks. Nature 497, 585–590 (2013). doi: 10.1038 / nature12160; pmid: 23685452

8. K. M. Tye et al., Mixed selectivity: Cellular computations for complexity. Neuron 112, 2289–2303 (2024). doi: 10.1016 / j.neuron.2024.04.017; pmid: 38729151

9. K. D. Miller, Canonical computations of cerebral cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 37, 75–84 (2016). doi: 10.1016 / j.conb.2016.01.008; pmid: 26868041

10. R. V. Rikhye, R. D. Wimmer, M. M. Halassa, Toward an Integrative Theory of Thalamic Function. Annu. Rev. Neurosci. 41, 163–183 (2018). doi: 10.1146 / annurev-neuro-080317-062144; pmid: 29618284

11. M. Stacho et al., A cortex-like canonical circuit in the avian forebrain. Science 369, eabc5534 (2020). doi: 10.1126 / science.abc5534; pmid: 32973004

12. A. Calabrese, S. M. Woolley, Coding principles of the canonical cortical microcircuit in the avian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 3517–3522 (2015). doi: 10.1073 / pnas.1408545112; pmid: 25691736

13. J. Dugas-Ford, C. W. Ragsdale, Levels of homology and the problem of neocortex. Annu. Rev. Neurosci. 38, 351–368 (2015). doi: 10.1146 / annurev-neuro-071714-033911; pmid: 26154980

14. E. Rueda-Alaña et al., Evolutionary convergence of sensory circuits in the pallium of amniotes. 387, eadp3411 (2025). doi: 10.1126 / .adp3411; pmid: 39946453

15. J. Fournier, C. M. Müller, I. Schneider, G. Laurent, Spatial Information in a Non-retinotopic Visual Cortex. Neuron 97, 164–180.e7 (2018). doi: 10.1016 / j.neuron.2017.11.017; pmid: 29249282

16. M. A. Tosches et al., Evolution of pallium, hippocampus, and cortical cell types revealed by single-cell transcriptomics in reptiles. 360, 881–888 (2018). doi: 10.1126 / .aar4237; pmid: 29724907

17. D. Hain et al., Molecular diversity and evolution of neuron types in the amniote brain. 377, eabp8202 (2022). doi: 10.1126 / .abp8202; pmid: 36048944

18. J. Woych et al., Cell-type profiling in salamanders identifies innovations in vertebrate forebrain evolution. 377, eabp9186 (2022). doi: 10.1126 / .abp9186; pmid: 36048957

19. L. Anneser, C. Satou, H. R. Hotz, R. W. Friedrich, Molecular organization of neuronal cell types and neuromodulatory systems in the zebrafish telencephalon. Curr. Biol. 34, 298–312.e4 (2024). doi: 10.1016 / j.cub.2023.12.003; pmid: 38157860

20. H. Ito, N. Yamamoto, Non-laminar cerebral cortex in teleost fishes? Biol. Lett. 5, 117–121 (2009). doi: 10.1098 / rsbl.2008.0397; pmid: 18832057

21. J. Yáñez, M. Folgueira, I. Lamas, R. Anadón, The organization of the zebrafish pallium from a hodological perspective. J. Comp. Neurol. 530, 1164–1194 (2022). doi: 10.1002 / cne.25268; pmid: 34697803

22. N. Yamamoto, H. Ito, Visual, lateral line, and auditory ascending pathways to the dorsal telencephalic area through the rostrolateral region of the lateral preglomerular nucleus in cyprinids. J. Comp. Neurol. 508, 615–647 (2008). doi: 10.1002 / cne.21717; pmid: 18381599

23. M. Tibi et al., A telencephalon cell type atlas for goldfish reveals diversity in the evolution of spatial structure and cell types. Sci. Adv. 9, eadh7693 (2023). doi: 10.1126 / sciadv.adh7693; pmid: 37910612

24. S. M. Suryanarayana, J. Pérez-Fernández, B. Robertson, S. Grillner, The evolutionary origin of visual and somatosensory representation in the vertebrate pallium. Nat. Ecol. Evol. 4, 639–651 (2020). doi: 10.1038 / s41559-020-1137-2; pmid: 32203472

25. D. S. Roy, Y. Zhang, M. M. Halassa, G. Feng, Thalamic subnetworks as units of function. Nat. Neurosci. 25, 140–153 (2022). doi: 10.1038 / s41593-021-00996-1; pmid: 35102334

26. E. I. Knudsen, Evolution of neural processing for visual perception in vertebrates. J. Comp. Neurol. 528, 2888–2901 (2020). doi: 10.1002 / cne.24871; pmid: 32003466

27. N. Cortes, H. J. Ladret, R. Abbas-Farishta, C. Casanova, The pulvinar as a hub of visual processing and cortical integration. Trends Neurosci. 47, 120–134 (2024). doi: 10.1016 / j.tins.2023.11.008; pmid: 38143202

28. R. Beltramo, M. Scanziani, A collicular visual cortex: Neocortical space for an ancient midbrain visual structure. Science 363, 64–69 (2019). doi: 10.1126 / science.aau7052; pmid: 30606842

29. A. B. Butler, A. Reiner, H. J. Karten, Evolution of the amniote pallium and the origins of mammalian neocortex. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1225, 14–27 (2011). doi: 10.1111 / j.1749-6632.2011.06006.x; pmid: 21534989

30. A. B. Butler, Evolution of the thalamus: A morphological and functional review. Thalamus Relat. Syst. 4, 35–58 (2008). doi: 10.1017 / S1472928808000356

31. W. J. Clark, M. Colombo, The functional architecture, receptive field characteristics, and representation of objects in the visual network of the pigeon brain. Prog. Neurobiol. 195, 101781 (2020). doi: 10.1016 / j.pneurobio.2020.101781; pmid: 32097689

32. O. Güntürkün, K. von Eugen, J. Packheiser, R. Pusch, Avian pallial circuits and cognition: A comparison to mammals. Curr. Opin. Neurobiol. 71, 29–36 (2021). doi: 10.1016 / j.conb.2021.08.007; pmid: 34562800

33. J. Rose, The avian brain. Curr. Biol. 32, R1076–R1079 (2022). doi: 10.1016 / j.cub.2022.07.072; pmid: 36283368

34. S. Watanabe, Effects of ectostriatal lesions on discriminations of conspecific, species and familiar objects in pigeons. Behav. Brain Res. 81, 183–188 (1996). doi: 10.1016 / S0166-4328(96)89079-6; pmid: 8950015

35. J. W. Kenney et al., A 3D adult zebrafish brain atlas (AZBA) for the digital age. eLife 10, e69988 (2021). doi: 10.7554 / eLife.69988; pmid: 34806976

36. T. Mueller, M. F. Wullimann, An evolutionary interpretation of teleostean forebrain anatomy. Brain Behav. Evol. 74, 30–42 (2009). doi: 10.1159 / 000229011; pmid: 19729894

37. P. Lal et al., Identification of a neuronal population in the telencephalon essential for fear conditioning in zebrafish. BMC Biol. 16, 45 (2018). doi: 10.1186 / s12915-018-0502-y; pmid: 29690872

38. E. M. Bartoszek et al., Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Curr. Biol. 31, 3861–3874.e3 (2021). doi: 10.1016 / j.cub.2021.08.021; pmid: 34416179

39. S. Fore et al., Functional properties of habenular neurons are determined by developmental stage and sequential neurogenesis. Sci. Adv. 6, eaaz3173 (2020). doi: 10.1126 / sciadv.aaz3173; pmid: 32917624

40. T. Aoki et al., Imaging of neural ensemble for the retrieval of a learned behavioral program. Neuron 78, 881–894 (2013). doi: 10.1016 / j.neuron.2013.04.009; pmid: 23684786

41. A. K. Mutlu et al., Topographically organized dorsal raphe activity modulates forebrain sensory-motor representations and contributes to defensive behaviors. Nat. Commun. 17, 6243 (2026). doi: 10.1038 / s41467-026-75490-y

42. C. Yang et al., A population code for spatial representation in the zebrafish telencephalon. Nature 634, 397–406 (2024). doi: 10.1038 / s41586-024-07867-2; pmid: 39198641

43. E. Rink, M. F. Wullimann, Connections of the ventral telencephalon (subpallium) in the zebrafish (Danio rerio). Brain Res. 1011, 206–220 (2004). doi: 10.1016 / j.brainres.2004.03.027; pmid: 15157807

44. T. Mueller, What is the Thalamus in Zebrafish? Front. Neurosci. 6, 64 (2012). doi: 10.3389 / fnins.2012.00064; pmid: 22586363

45. A. C. Giassi, T. T. Duarte, W. Ellis, L. Maler, Organization of the gymnotiform fish pallium in relation to learning and memory: II. Extrinsic connections. J. Comp. Neurol. 520, 3338–3368 (2012). doi: 10.1002 / cne.23109; pmid: 22430442

46. N. Yamamoto, H. Ito, Fiber connections of the anterior preglomerular nucleus in cyprinids with notes on telencephalic connections of the preglomerular complex. J. Comp. Neurol. 491, 212–233 (2005). doi: 10.1002 / cne.20681; pmid: 16134137

47. S. Bloch et al., Non-thalamic origin of zebrafish sensory nuclei implies convergent evolution of visual pathways in amniotes and teleosts. eLife 9, e54945 (2020). doi: 10.7554 / eLife.54945; pmid: 32896272

48. M. F. Wullimann, T. Mueller, Teleostean and mammalian forebrains contrasted: Evidence from genes to behavior. J. Comp. Neurol. 475, 143–162 (2004). doi: 10.1002 / cne.20183; pmid: 15211457

49. F. Palumbo, B. Serneels, R. Pelgrims, E. Yaksi, The Zebrafish Dorsolateral Habenula Is Required for Updating Learned Behaviors. Cell Rep. 32, 108054 (2020). doi: 10.1016 / j.celrep.2020.108054; pmid: 32846116

50. E. Dreosti, G. Lopes, A. R. Kampff, S. W. Wilson, Development of social behavior in young zebrafish. Front. Neural Circuits 9, 39 (2015). doi: 10.3389 / fncir.2015.00039; pmid: 26347614

51. A. M. Ostenrath et al., Inhibition mediated by group III metabotropic glutamate receptors regulates habenula activity and defensive behaviors. Nat. Commun. 16, 7187 (2025). doi: 10.1038 / s41467-025-62115-z; pmid: 40764295

52. F. Kermen, P. Lal, N. G. Faturos, E. Yaksi, Interhemispheric connections between olfactory bulbs improve odor detection. PLOS Biol. 18, e3000701 (2020). doi: 10.1371 / journal.pbio.3000701; pmid: 32310946

53. A. T. Trinh, E. Harvey-Girard, F. Teixeira, L. Maler, Cryptic laminar and columnar organization in the dorsolateral pallium of a weakly electric fish. J. Comp. Neurol. 524, 408–428 (2016). doi: 10.1002 / cne.23874; pmid: 26234725

54. M. D. Petkova et al., A connectomic resource for neural cataloguing and circuit dissection of the larval zebrafish brain. bioRxiv, 2025.2006.2010.658982 (2025).

55. E. G. Jones, The thalamus (Springer Science & Business Media, 2012).

56. N. Miyasaka et al., From the olfactory bulb to higher brain centers: Genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish. J. Neurosci. 29, 4756–4767 (2009). doi: 10.1523 / JNEUROSCI.0118-09.2009; pmid: 19369545

57. C. Satou et al., Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development 140, 3927–3931 (2013). doi: 10.1242 / dev.099531; pmid: 23946442

58. W. Guido, S. M. Lu, S. M. Sherman, Relative contributions of burst and tonic responses to the receptive field properties of lateral geniculate neurons in the cat. J. Neurophysiol. 68, 2199–2211 (1992). doi: 10.1152 / jn.1992.68.6.2199; pmid: 1491266

59. E. J. Ramcharan, J. W. Gnadt, S. M. Sherman, Higher-order thalamic relays burst more than first-order relays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 12236–12241 (2005). doi: 10.1073 / pnas.0502843102; pmid: 16099832

60. N. Vladimirov et al., Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nat. Methods 11, 883–884 (2014). doi: 10.1038 / nmeth.3040; pmid: 25068735

61. S. K. Jetti, N. Vendrell-Llopis, E. Yaksi, Spontaneous activity governs olfactory representations in spatially organized habenular microcircuits. Curr. Biol. 24, 434–439 (2014). doi: 10.1016 / j.cub.2014.01.015; pmid: 24508164

62. C. Diaz Verdugo 等，Glia-neuron interactions underlie state transitions to generalized seizures. Nat. Commun. 10, 3830 (2019). doi: 10.1038 / s41467-019-11739-z; pmid: 31444362

63. B. E. Stein, T. R. Stanford, Multisensory integration: Current issues from the perspective of the single neuron. Nat. Rev. Neurosci. 9, 255–266 (2008). doi: 10.1038 / nrn2331; pmid: 18354398

64. R. A. Stevenson 等，Identifying and quantifying multisensory integration: A tutorial review. Brain Topogr. 27, 707–730 (2014). doi: 10.1007 / s10548-014-0365-7; pmid: 24722880

65. L. A. L. Heap, G. Vanwalleghem, A. W. Thompson, I. A. Favre-Bulle, E. K. Scott, Luminance Changes Drive Directional Startle through a Thalamic Pathway. Neuron 99, 293–301.e4 (2018). doi: 10.1016 / j.neuron.2018.06.013; pmid: 29983325

66. H. Baier, M. F. Wullimann, Anatomy and function of retinorecipient arborization fields in zebrafish. J. Comp. Neurol. 529, 3454–3476 (2021). doi: 10.1002 / cne.25204; pmid: 34180059

67. A. Kramer, Y. Wu, H. Baier, F. Kubo, Neuronal Architecture of a Visual Center that Processes Optic Flow. Neuron 103, 118–132.e7 (2019). doi: 10.1016 / j.neuron.2019.04.018; pmid: 31147153

68. G. López-Bendito, Z. Molnár, Thalamocortical development: How are we going to get there? Nat. Rev. Neurosci. 4, 276–289 (2003). doi: 10.1038 / nrn1075; pmid: 12671644

69. J. W. Phillips 等，A repeated molecular architecture across thalamic pathways. Nat. Neurosci. 22, 1925–1935 (2019). doi: 10.1038 / s41593-019-0483-3; pmid: 31527803

70. R. G. Northcutt, Forebrain evolution in bony fishes. Brain Res. Bull. 75, 191–205 (2008). doi: 10.1016 / j.brainresbull.2007.10.058; pmid: 18331871

71. A. Wallach, A. Melanson, A. Longtin, L. Maler, Mixed selectivity coding of sensory and motor social signals in the thalamus of a weakly electric fish. Curr. Biol. 32, 51–63.e3 (2022). doi: 10.1016 / j.cub.2021.10.034; pmid: 34741807

72. M. F. Wullimann, R. G. Northcutt, Visual and electrosensory circuits of the diencephalon in mormyrids: An evolutionary perspective. J. Comp. Neurol. 297, 537–552 (1990). doi: 10.1002 / cne.902970407; pmid: 2384612

73. T. Isa, E. Marquez-Legorreta, S. Grillner, E. K. Scott, The tectum / superior colliculus as the vertebrate solution for spatial sensory integration and action. Curr. Biol. 31, R741–R762 (2021). doi: 10.1016 / j.cub.2021.04.001; pmid: 34102128

74. J. Yáñez, M. H. Eguiguren, R. Anadón, Neural connections of the torus semicircularis in the adult Zebrafish. J. Comp. Neurol. 532, e25586 (2024). doi: 10.1002 / cne.25586; pmid: 38289191

75. Z. Lu, R. R. Fay, Acoustic response properties of single units in the torus semicircularis of the goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 173, 33–48 (1993). doi: 10.1007 / BF00209616; pmid: 8366473

76. B. A. Porter, T. Mueller, The Zebrafish Amygdaloid Complex - Functional Ground Plan, Molecular Delineation, and Everted Topology. Front. Neurosci. 14, 608 (2020). doi: 10.3389 / fnins.2020.00608; pmid: 32765204

77. S. B. Elliott, E. Harvey-Girard, A. C. Giassi, L. Maler, Hippocampal-like circuitry in the pallium of an electric fish: Possible substrates for recursive pattern separation and completion. J. Comp. Neurol. 525, 8–46 (2017). doi: 10.1002 / cne.24060; pmid: 27292574

78. A.-T. Trinh, S. E. Clarke, E. Harvey-Girard, L. Maler, Cellular and Network Mechanisms May Generate Sparse Coding of Sequential Object Encounters in Hippocampal-Like Circuits. eneuro 6, ENEURO.0108–0119.2019 (2019).

79. H. Fotowat, C. Lee, J. J. Jun, L. Maler, Neural activity in a hippocampus-like region of the teleost pallium is associated with active sensing and navigation. eLife 8, e44119 (2019). doi: 10.7554 / eLife.44119; pmid: 30942169

80. T. Mueller, Z. Dong, M. A. Berberoglu, S. Guo, The dorsal pallium in zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae, Teleostei). Brain Res. 1381, 95–105 (2011). doi: 10.1016 / j.brainres.2010.12.089; pmid: 21219890

81. R. G. Cook, T. B. Patton, T. Shimizu, Functional Segregation of the Entopallium in Pigeons. Philosophy 130, 59–86 (2013). pmid: 25018563

82. A. Hoerder-Suabedissen, Z. Molnár, Development, evolution and pathology of neocortical subplate neurons. Nat. Rev. Neurosci. 16, 133–146 (2015). doi: 10.1038 / nrn3915; pmid: 25697157

83. Y. C. Wang, S. Jiang, B. J. Frost, Visual processing in pigeon nucleus rotundus: Luminance, color, motion, and looming subdivisions. Vis. Neurosci. 10, 21–30 (1993). doi: 10.1017 / S0952523800003199; pmid: 8424926

84. M. F. Wullimann, Neural origins of basal diencephalon in teleost fishes: Radial versus tangential migration. J. Morphol. 281, 1133–1141 (2020). doi: 10.1002 / jmor.21237; pmid: 32710814

85. M. F. Wullimann, N. Mokayes, I. Shainer, E. Kuehn, H. Baier, Genoarchitectonics of the larval zebrafish diencephalon. J. Comp. Neurol. 532, e25549 (2024). doi: 10.1002 / cne.25549; pmid: 37983970

86. Y. Ishikawa et al., Developmental origin of diencephalic sensory relay nuclei in teleosts. Brain Behav. Evol. 69, 87–95 (2007). doi: 10.1159 / 000095197; pmid: 17230016

87. Z. Yao et al., A high-resolution transcriptomic and spatial atlas of cell types in the whole mouse brain. Nature 624, 317–332 (2023). doi: 10.1038 / s41586-023-06812-z; pmid: 38092916

88. N. Hecker et al., Enhancer-driven cell type comparison reveals similarities between the mammalian and bird pallium. Science 387, eadp3957 (2025). doi: 10.1126 / science.adp3957; pmid: 39946451

89. T. Kato, Y. Yamada, N. Yamamoto, Ascending gustatory pathways to the telencephalon in goldfish. J. Comp. Neurol. 520, 2475–2499 (2012). doi: 10.1002 / cne.23049; pmid: 22247053

90. D. Badre, M. D'Esposito, Is the rostro-caudal axis of the frontal lobe hierarchical? Nat. Rev. Neurosci. 10, 659–669 (2009). doi: 10.1038 / nrn2667; pmid: 19672274

91. M. Torigoe et al., Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nat. Commun. 12, 5712 (2021). doi: 10.1038 / s41467-021-26010-7; pmid: 34588436

92. M. T. Kaufman et al., The implications of categorical and category-free mixed selectivity on representational geometries. Curr. Opin. Neurobiol. 77, 102644 (2022). doi: 10.1016 / j.conb.2022.102644; pmid: 36332415

93. Y. Tanimoto et al., Transgenic tools targeting the basal ganglia reveal both evolutionary conservation and specialization of neural circuits in zebrafish. Cell Rep. 43, 113916 (2024). doi: 10.1016 / j.celrep.2024.113916; pmid: 38484735

94. A. B. Arrenberg, F. Del Bene, H. Baier, Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17968–17973 (2009). doi: 10.1073 / pnas.0906252106; pmid: 19805086

95. M. Winding et al., The connectome of an insect brain. Science 379, eadd9330 (2023). doi: 10.1126 / science.add9330; pmid: 36893230

96. A. M. Fernandes et al., Neural circuitry for stimulus selection in the zebrafish visual system. Neuron 109, 805–822.e6 (2021). doi: 10.1016 / j.neuron.2020.12.002; pmid: 33357384

97. F. Del Bene et al., Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science 330, 669–673 (2010). doi: 10.1126 / science.1192949; pmid: 21030657

98. M. Privat et al., Sensorimotor Transformations in the Zebrafish Auditory System. Curr. Biol. 29, 4010–4023.e4 (2019). doi: 10.1016 / j.cub.2019.10.020; pmid: 31708392

99. K. Asakawa, K. Kawakami, The Tol2-mediated Gal4-UAS method for gene and enhancer trapping in zebrafish. Methods 49, 275–281 (2009). doi: 10.1016 / j.ymeth.2009.01.004; pmid: 19835787

100. S. Dorkenwald et al., CAVE: Connectome Annotation Versioning Engine. Nat. Methods 22, 1112–1120 (2025). doi: 10.1038 / s41592-024-02426-z; pmid: 40205066

101. M. Pachitariu et al., Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv 061507 [Preprint] (2017); https: / doi.org / 10.1101 / 061507.

102. E. Yaksi, R. W. Friedrich, Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods 3, 377–383 (2006). doi: 10.1038 / nmeth874; pmid: 16628208

103. C. Cortes, V. Vapnik, Support-Vector Networks. Mach. Learn. 20, 273–297 (1995). doi: 10.1023 / A:1022627411411

104. C. Stringer et al., Rastermap: A discovery method for neural population recordings. Nat. Neurosci. 28, 201–212 (2025). doi: 10.1038 / s41593-024-01783-4; pmid: 39414974

105. A.-T. Trinh, E. Yaksi, Dataset for Trinh et al., 2026, Sigma2 (2026); https: / doi.org / 10.11582 / 2026.gvso70gj.

致谢

我们感谢 M. Ahrens（美国 HHMI, Janelia Farm）和 S. Higashijima（日本冈崎综合生物学研究所）提供的转基因鱼系。感谢 J. Lichtman 和 F. Engert 实验室开放访问斑马鱼幼鱼全脑电子显微镜（EM）数据，以及 F. Collman 实验室提供的自动化重建工具。我们还感谢 S. Eggen、F. Acuña-Hinrichsen、V. Nguyen 以及我们的鱼类设施支持团队提供的技术协助。感谢 M. Witter（挪威 NTNU）、L. Maler（加拿大渥太华大学）以及 Yaksi 实验室带来的启发性讨论。资金支持：K.K. 获得 JSPS KAKENHI 资助（JP24K02008）。A.-T.T. 获得欧洲 Horizon Marie-Curie 个人博士后奖学金（grant 101066743）。E.Y. 获得 NFR FRIPRO 研究资助 239973 和 314212，以及 RCN 卓越中心计划（项目编号 332640）。Yaksi 实验室的工作由挪威科技大学 Kavli 系统神经科学研究所资助。作者贡献：概念化：A.-T.T., E.Y.；方法论：A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., M.K., S.K., B.S., K.K., E.Y.；调查：A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., M.K., S.K., B.S., E.Y.；可视化：A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., E.Y.；资金获取：A.-T.T., K.K., E.Y.；项目管理：E.Y.；监督：A.-T.T., E.Y.；初稿撰写：A.-T.T., E.Y.；审阅与编辑：A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., S.K., B.S., K.K., E.Y.。竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：钙成像数据可在 NIRD 存储库（105）获取。分析代码和绘图相关代码可在 GitHub 在线获取（https: / github.com / yaksilab / PG-Pallium_

paper）。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会（American Association for the Advancement of Science）。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse。本研究全部或部分由欧洲 Horizon Marie-Curie 个人博士后奖学金（grant 101066743）资助；根据要求，作者将根据 CC BY 公共版权许可提供作者接受稿（AAM）版本。

补充材料

图 S1 至 S14；MDAR 可重复性检查清单；视频 S1 至 S4 提交日期：2025年9月11日；接收日期：2026年6月22日；在线发表日期：2026年7月2日 10.1126 / science.aec2171

自闭症突变重塑蛋白质相互作用网络以驱动神经发育病理

Belinda Wang†, Rasika Vartak†, Kelsey M. Hennick†, Yefim Zaltsman†, Zun Zar Chi Naing† 等

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.ady4523

引言：自闭症谱系障碍（ASD）的特点是极高的遗传异质性，迄今为止已鉴定出 250 个以上的高置信度风险（hcASD）基因。这些基因由罕见的、具有显著效应的编码变异定义，在转录组分析中显示出功能和发育上的趋同性。然而，这些方法提供的机制见解有限，且除了遗传变异本身之外，尚未确定具体的治疗靶点。由于蛋白质是细胞的主要功能单位，绘制 ASD 的物理相互作用组——并确定 变异如何重塑该组——对于超越基因列表和广泛的病理生理主题，进而深入理解神经发育病理的因果关系至关重要。

基本原理：为了增强我们对 的分子理解，我们使用亲和纯化-质谱法（AP-MS）绘制了 100 个 hcASD 蛋白质和 54 个患者来源的错义变异图谱，大幅扩展了已知的 蛋白质相互作用景观。通过将这些数据集与 AlphaFold 结构建模以及在非洲爪蟾（Xenopus）和人类前脑类器官中的功能研究相结合，我们研究了遗传上不同的风险因素是否趋同于共同的生物学机制，以及趋同的神经发育表型是否是通过疾病相关变异对蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的选择性重塑而产生的。

结果：由此产生的 -PPI 网络包含 1800 个以上的相互作用，其中 87% 此前未见报道。该网络在兴奋性谱系的神经前体细胞（NPCs）中富集，呈现出高度互连的架构，风险蛋白质趋同于共同的复合物，包括

DCAF7。对选定相互作用的功能审讯表明，此前未被表征的 DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 复合物的破坏会损害前体细胞增殖并降低体内前脑的大小。此外，患者来源的错义突变经常诱导趋同的 PPI 重塑。例如，不同的 FOXP1 突变削弱了其与 FOXP4 的物理相互作用，导致 FOXP4 功能获得性地重新分布到异位基因组靶点。在人类前脑类器官中，这种生化重塑驱动了皮层神经元的过早分化并改变了神经活动。在 FOXP1 突变背景下遗传缺失 FOXP4 可挽救这些神经发育缺陷；尽管具体机制仍需进一步确定，但这表明重塑的相互作用是突变表型的基础。

结论：综上所述，这些发现定义了 分子趋同的双层模型：在野生型状态下通过共享的相互作用网络趋同，以及在突变状态下通过相互作用重塑的重复功能后果趋同。更广泛地说，这项工作建立了一个可扩展的框架，用于系统性审讯自闭症蛋白质组，实现了可药用蛋白质界面的优先级排序，并为旨在恢复神经发育轨迹的精准治疗策略提供了理性基础。 □

ASD 相互作用组图谱揭示了分子层面的趋同性。(A) 100 个 hcASD 蛋白和 54 个患者突变的蛋白相互作用组揭示了一个高度趋同的蛋白复合物网络。(B) 趋同的蛋白复合物被优先用于在人类神经前体细胞和非洲爪蟾（Xenopus）中进行功能验证。(C) 突变驱动的重连（例如 FOXP1-FOXP4 相互作用的中断）会改变大脑发育，例如 FOXP1 突变类器官中皮层类器官的深层神经发生。R513℃，精氨酸 $^{513}$ → 半胱氨酸；R513H，精氨酸 $^{513}$ → 组氨酸；L327P，亮氨酸 $^{327}$ → 脯氨酸；CRISPRi，CRISPR 干扰；WT，野生型。

蛋白相互作用

自闭症突变重塑蛋白质相互作用网络以驱动神经发育病理

Belinda Wang $^{1}$ , Rasika Vartak $^{2,3}$ , Kelsey M. Hennick $^{1,4,5}$ , Yefim Zaltsman $^{1}$ †, Zun Zar Chi Naing $^{2,3,6}$ †§, Benjamin J. Polacco $^{2,3}$ , Ali Bashir $^{7}$ , Manon Eckhardt $^{2,3}$ , Mehdi Bouhaddou $^{2,3,6}$ ¶, Jiewei Xu $^{2,3,6}$ , Nawei Sun $^{1}$ , Micaela C. Lasser $^{1}$ , Yuan Zhou $^{2,3}$ , Justin McKeitney $^{2,3}$ , Keelan Z. Guiley $^{7}$ , Pawel Gniewek $^{7}$ , Una Chan $^{8}$ , Naufa Amirani $^{8}$ , Owen Griffiths $^{1,4,5}$ , Nishant Chadha $^{1,4,5}$ , Reshmi Tognatta $^{2,3}$ , Merve Cakir $^{2,3}$ , Martin Gordon $^{2,3}$ , Prachi Khare $^{2,3}$ , Sam Drake $^{1}$ #, Vanessa Drury $^{1}$ , David F. Burke $^{9}$ , Silvano Gonzalez $^{1}$ , Sahar Alkhairy $^{10}$ , Reuben Thomas $^{3}$ , Stephanie Lam $^{8}$ , Montana Morris $^{1}$ ††, Ethel Bader $^{1}$ , Mélanie Dos Santos $^{11}$ , Anastassia V. Komarova $^{11}$ , Maxwell Bennett $^{2,3}$ , Craig Ennis $^{2}$ , Octavio Castillo $^{1,2}$ , Yvonne Lim $^{2}$ , Robert Martin $^{2}$ , Meghan Seyler $^{1}$ ‡‡, Tierney Baum $^{1}$ §§, Rebecca Krasnoff $^{1}$ ¶¶, George Wang $^{1}$ , Sagnik Middya $^{1,4,5}$ , Sheng Wang $^{1}$ , Presley Pham $^{1}$ , Juan Arbelaez $^{1}$ , Dexter Pratt $^{12,13}$ , Sofia Bali $^{14}$ , Shivali Chag $^{2}$ , Julia A. Kaye $^{8,15}$ , Nadir Mahmood $^{7}$ ##, Lee Spraggon $^{2}$ , Thomas Rolland $^{16}$ , Shawn Hervey-Jumper $^{17}$ , James S. Fraser $^{2,14}$ , Thomas Bourgeron $^{16}$ , Steven Finkbeiner $^{8,15,18,19,20}$ , Caroline Demeret $^{11}$ , Danielle L. Swaney $^{2,3,6,19}$ , Sourav Bandyopadhyay $^{7}$ , Trey Ideker $^{12,13}$ , Pedro Beltrao $^{9,21}$ , Helen Rankin Willsey $^{1,22}$ , Ruth Hüttenhain $^{2,3,6}$ †††, Kirsten Obernier $^{2,3,}$ , Tomasz J. Nowakowski $^{1,2,4,5,17,23,}$ , Matthew W. State $^{1,2,24,}$ , A. Jeremy Willsey $^{1}$ ‡‡‡, Nevan J. Krogan $^{2,3,6,14*}$

对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络进行系统映射，并确定自闭症谱系障碍（ASD）中的致病突变如何重塑这些网络，为揭示疾病机制和寻找治疗机会提供了一个强大的框架。利用亲和纯化-质谱技术，我们系统地映射了 100 个高置信度 ASD 基因的 PPI，发现了 1800 多个相互作用。通过评估致病性错义突变的影响，利用 AlphaFold，并在人类来源的模型系统中验证关键发现，我们发现野生型状态下蛋白质复合物具有显著的趋同性，且独立突变驱动了趋同的 PPI 重塑。例如，来自不同患者的 FOXP1 变体破坏了其与 FOXP4 的相互作用，导致脑类器官中的皮层神经发生和神经活动发生改变。总体而言，这些发现将遗传变异与蛋白质网络以及 ASD 中趋同的神经发育功能障碍联系了起来。

自闭症谱系障碍（ASD）是一种具有高度遗传性的神经发育综合征，其特点是显著的遗传异质性和个体间的临床变异 $(1-3)$。在过去的 15 年中，全外显子组测序研究基于罕见的（通常是新发的）蛋白质损伤变异，识别出了 250 多个具有大效应的风险基因 $(4-7)$。这些大效应的编码突变在受损最严重的 ASD 患者以及共患神经发育障碍（包括智力障碍、癫痫、语言极少或缺失以及严重运动发育迟缓）的个体中高度富集。

尽管取得了这些进展，但将高置信度自闭症谱系障碍（hcASD）风险基因转化为对病理生理学的深入理解——并最终为该疾病最严重的类型开发有效的靶向疗法——仍然是一个重大挑战 (8)。这种困难源于广泛的多效性、人类大脑发育的动态性，以及对 ASD 风险蛋白物理相互作用的认知有限，且尚不清楚突变如何改变这些蛋白复合物的结构和功能 (9, 10)。两个核心未解决的问题是：多样化的 ASD 蛋白在多大程度上汇聚于共同的分子复合物，以及特定的致病突变如何改变蛋白结构、相互作用、功能，并最终影响神经发育。

一种有前景的策略是在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）水平上检查真实的 风险基因，以及与疾病相关的编码突变是否选择性地破坏或重构了这些相互作用，而非简单地消除基因功能 (11)。如果 hcASD 相关突变通过重构共同的蛋白复合物而汇聚，那么 PPI 网络应当能指向将遗传变异与神经发育功能障碍联系起来的可靶向因果机制。验证这一假设需要系统、大规模且与疾病相关的相互作用图谱，这些图谱需能解析 蛋白质组中相当一部分的野生型（WT）相互作用以及特定突变引起的扰动。然而，此类图谱在很大程度上一直处于缺失状态。

在此，我们利用亲和纯化-质谱法（AP-MS），绘制了 100 个 hcASD 基因和 54 个患者来源的致病变异体的 PPI 图谱 (4)。我们在人类胚胎肾（HEK）293 T 细胞中生成了这些相互作用图谱，以实现可扩展性和跨疾病的可比性，随后在多个实验系统中验证了关键发现，包括爪蟾（Xenopus tropicalis）、人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经前体细胞以及前脑类器官。该方法揭示了 分子汇聚的双层架构：在 WT 状态下，风险蛋白稳定地汇聚于共同的复合物，且存在突变诱导的 PPI 重构的汇聚模式。

我们证明，与这 100 个 风险基因相互作用的蛋白形成了一个高度互连的网络，该网络重现了发育中人类大脑中与 相关的风险基因表达模式，并且富集了额外的 风险基因，但并未富集精神分裂症风险基因。对关键相互作用的功能验证确认，这些突变扰乱了早期神经发生并改变了电生理特性。综上所述，这些结果表明，遗传异质性的 风险基因和不同的突变汇聚于复合物并重构 PPI，提供了一个将遗传变异与蛋白结构和功能，并最终与汇聚性神经发育病理学联系起来的机制框架。

PPI 映射揭示 ASD 网络

我们通过在 HEK293T 细胞中利用 AP-MS 个别表达 100 种带有 Streptag 标记的 hcASD 蛋白，对已识别的 hcASD 基因 (4) 之间的结构和功能关系进行了评估（图 1A），从而构建了一个 ASD PPI 网络 (ASD-)（图 1B；图 S1, A 至 C；以及表 S1）。HEK293T 细胞提供了高通量 映射所需的易操作性、蛋白质组深度以及既定的基准。该方法此前已实现大规模识别在癌症、心脏病、神经退行性疾病和传染病等多种细胞类型中存在的真实、稳定且通常具有化学计量关系的物理相互作用 [例如，参见 (12–19)]。由此产生的网络通过总计 1881 次相互作用，将 100 种 蛋白与 1074 个独特的高置信度相互作用因子连接起来。其中 87% 为此前未识别的相互作用，每个 蛋白的中位相互作用因子数为 11 个（图 1, C 和 D）。这些相互作用揭示了 蛋白之间强大的互连性，以及向共享相互作用因子和复合物的收敛（见后续章节）。ASD- 捕捉到了比现有 数据库更广泛的相互作用图谱（图 1E），并且与此前发表的、在神经元培养物或脑组织中生成的较小规模 ASD- 网络有显著重叠（图 S1D 和表 S1），从而证明了其生物学相关性。

A

B

C

D

E

图 1. 蛋白相互作用映射揭示相互作用因子。(A) 研究概览，显示 100 个 基因此前的功能注释，突出显示每类中最显著的两个基因 [FDR < 0.05; (4)]，野生型 (WT, ASD-) 和患者来源突变型 ($ASD_{mut}$-) 相互作用网络的生成，以及下游研究。(B) 在 HEK293T 细胞中生成 100 个 基因 数据的工作流程。(C) 显示 ASD- 内部相互作用分布的柱状图。(D) 每个 蛋白的相互作用因子数量分布（中位数 = 11）。红线表示分布的 LOESS 平滑曲线。(E) ASD- 与现有大规模 数据集 (54,67,68,89,90) 中分析的 蛋白数量及 相关相互作用数量的比较。点的大小反映了每个数据集的独特相互作用因子数量。

$^{1}$ 加利福尼亚大学旧金山分校 (UCSF) Weill 神经科学研究所精神病学与行为科学系，美国加利福尼亚州旧金山。$^{2}$ 加利福尼亚大学定量生物科学研究所，美国加利福尼亚州。$^{3}$ J. David Gladstone 研究所数据科学与生物技术 Gladstone 研究所，美国加利福尼亚州。$^{4}$ 加利福尼亚大学解剖学系，美国加利福尼亚州。$^{5}$ 加利福尼亚大学 Eli and Edythe Broad 再生医学与干细胞研究中心，美国加利福尼亚州。$^{6}$ 加利福尼亚大学细胞与分子药理学系，美国加利福尼亚州。$^{7}$ Rezo Therapeutics，美国加利福尼亚州。$^{8}$ 加利福尼亚大学 Gladstone 研究所系统与治疗中心。

旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{9}$ 欧洲分子生物学实验室，欧洲生物信息学研究所 (EMBL-EBI)，Wellcome 基因组园区，剑桥，英国。$^{10}$ 计算机科学与工程系，加州大学圣迭戈分校，拉霍亚，加利福尼亚州，美国。$^{11}$ 相互作用组学、RNA 与免疫部门，巴斯德研究所，巴黎，法国。$^{12}$ 医学系，加州大学圣迭戈分校，拉霍亚，加利福尼亚州，美国。$^{13}$ 基因组医学研究所，加州大学圣迭戈分校，拉霍亚，加利福尼亚州，美国。$^{14}$ 生物工程与治疗科学系，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{15}$ Taube / Koret 神经退行性疾病中心，格莱斯顿研究所，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{16}$ 人类遗传学与认知功能部门，巴斯德研究所，UMR3571 CNRS, IUF，巴黎市立大学，巴黎，法国。$^{17}$ 神经外科系，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{18}$ 神经内科，加州大学旧金山分校，加利福尼亚州，美国。$^{19}$ 生理学系，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{20}$ 神经科学研究生项目与生物医学科学项目，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{21}$ 分子系统生物学研究所，生物学系，苏黎世联邦理工学院，苏黎世，瑞士。$^{22}$ Biohub，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{23}$ 卡夫利基础神经科学研究所，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。$^{24}$ 兰利·波特精神病研究所，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。*通讯作者。电子邮件：nevan.krogan@ucsf.edu

(N.J.K.); jeremy@willseylab.com (A.J.W.); matthew.state@ucsf.edu (M.W.S.); tomasz.nowakowski@ucsf.edu (T.J.N.); kirsten. obernier@ucsf.edu (K.O.) †这些作者对这项工作贡献均等。‡现地址：Maze Therapeutics，南旧金山，加利福尼亚州，美国。§现地址：阿斯特捷利康 (AstraZeneca)，波士顿，马萨诸塞州，美国。¶现地址：微生物学、免疫学与分子遗传学系，加州大学洛杉矶分校，洛杉矶，加利福尼亚州，美国。#现地址：Altos Labs，南旧金山，加利福尼亚州，美国。**现地址：哥伦比亚大学 Mailman 公共卫生学院，纽约，纽约州，美国。††现地址：纽约大学 Langone 医学中心，纽约，纽约州，美国。‡‡现地址：WAP Sustainability Consulting，查塔努加，田纳西州，美国。§§现地址：细胞与发育生物学系，范德比尔特大学，纳什维尔，田纳西州，美国。¶¶现地址：纽约大学医学院，纽约，纽约州，美国。##现地址：Nkarta, Inc.，南旧金山，加利福尼亚州，美国。†††现地址：分子与细胞生理学系，斯坦福大学，斯坦福，加利福尼亚州，美国。‡‡‡现地址：Calico Life Sciences LLC，南旧金山，加利福尼亚州，美国。

ASD-PPI 相互作用蛋白在人类大脑中表达且富集 ASD 遗传风险

-PPI 相互作用蛋白重现了 风险基因的核心转录和遗传特征。在发育期 $(20)$ 和成年人类大脑 $(21)$ 的 RNA 测序 (RNA-seq) 数据中，不包括 hcASD 基因的相互作用蛋白子集（interactors $^{no\ hcASD}$，n = 1043）在大脑组织中高度表达，并且在产前和产后发育过程中紧密追踪 基因的表达模式（图 2, A 至 C；图 S2A；以及表 S2）。该子集重现了 相关基因的核心表达特征，包括在产前皮层 $(22)$ 以及成年皮层和小脑中的高表达（图 S2, B 和 C；以及表 S2），并显示出中等的进化约束，该约束高于 HEK293T 蛋白质组但低于 基因（图 S2D 和表 S2），这表明它们可能通过多基因机制促成 。 相关的从头突变致病变异在

完整的相互作用蛋白集（interactors, n = 1074）和 interactors $^{no\ }$ 中均有所富集，但在 HEK293T 蛋白质组的其余部分中未见富集（图 2D 和表 S2），这表明相互作用蛋白本身在遗传上与 相关。这种富集程度与在神经元培养物 $(23)$ 和大脑组织 $(24, 25)$ 中生成的 网络相互作用蛋白相当（图 S2, E 至 G）。- 相互作用蛋白还与近期大规模测序研究 $(5-7)$ 确定的 风险基因高度重叠，但与精神分裂症相关基因 $(26)$ 不重叠，支持了其具有一定程度的特异性（图 2E，图 S2H，以及表 S2）。为了探索 - 在 基因发现方面的潜力，我们模拟了规模不断扩大的网络。随着更多 基因的加入， 相关遗传变异的富集逐渐集中在 interactors $^{no\ }$ 中

（图 2F），并捕捉到越来越多已知和新确定的风险基因 (+) $(6)$，且在 100 个 基因时没有出现饱和迹象（图 2G），这表明扩大网络可能会揭示额外的风险基因。总之，这些正交分析证明了 - 捕捉到了与 相关的相互作用。

为了精准定位与 相关的细胞类型，我们检查了 - 网络在涵盖皮层和皮层下细胞类型的产前人类大脑单细胞 RNA-seq (scRNA-seq) 图谱中的表达情况 $(27)$（图 2H）。之前的研究涉及到了有丝分裂后的兴奋性和抑制性神经元 (ENs 和 INs) $(4, 6)$。- 在有丝分裂后的 ENs 中显示出最强的网络表达，在 INs 中有一定富集（图 2I）。然而，通过纳入来自 元数据库 STRING $(28)$ 的相互作用蛋白之间的连接来扩展 -，增加了网络中高度连接的相互作用蛋白的统计权重。这种从以风险基因为中心转向以相互作用组为中心的视角转变，使富集方向从成熟神经元转移到了兴奋性神经元的神经前体细胞 (NPC-ENs)，以及在较小程度上转移到了抑制性神经元的神经前体细胞 (NPC-INs)（图 2I）。这一模式在三个独立的产前大脑图谱中是一致的（图 S2I 和表 S2），并且在神经元中生成的较小网络中得到了重现 [iPSC 衍生的 EN 网络 (iEN-) $(23)$；图 2I]。这些结果表明，与 相关的蛋白质相互作用组主要集中在 EN 的生成和早期分化，这与之前仅基于 基因富集而广泛涉及有丝分裂后神经元的报告 $(4, 6)$ 发生了偏移。

ASD-PPI 揭示分子收敛性

通过基因本体（Gene Ontology）注释中的连接性和相似性对 hcASD 蛋白及其相互作用因子进行组织 $(29)$（图 3A 和表 S3），结果显示出与此前结果 $(10, 22, 30, 31)$ 一致的功能收敛性。ASD-PPI 网络显示出高度的连接性：31% 的 hcASD 蛋白彼此之间存在相互作用，而 35% 的相互作用因子与多个 蛋白结合（图 S3A 和表 S3），这表明存在功能重叠。与此一致，该网络表现出边密度和平均节点度数的增加（这些指标与分子收敛性相关），同时表现出较低的模块化程度（图 3B 和图 S3B）。这反映了 蛋白之间存在一个密集且互连的景观，而非被分割成孤立的模块。这些数值比之前发表的围绕统一生物学主题（如酪氨酸激酶 $[n = 90 (32)]$ 或乳腺癌基因 $[n = 39 (12)]$）而组织的 AP-MS 网络所观察到的数值更为极端，表明 ASD-PPI 中具有更强的分子收敛性（图 3B 和图 S3B）。按临床表型对 蛋白进行分层 $[ASD\text{-}主导 (ASD_{p})$ 与广泛神经发育 (ASD_{NDD}) (4)]$，结果显示相互作用因子的重叠并未增加，这表明这些 子组之间没有功能上的区别（图 S3, B 和 C；以及表 S3）。

若干 蛋白通过已知和此前未知的相互作用，与此前被认为与 ASD 相关的蛋白复合物发生相互作用。这些复合物包括 Sin3 复合物 [祖细胞增殖与分化 (33, 34)]、Mediator 复合物 [转录与神经干细胞身份 (35, 36)] 以及 PAF1 复合物 [祖细胞增殖与神经元迁移 (37–39)]，其中亚基 CTR9 和 LEO1 接近或略低于高置信度 ASD 关联的阈值（图 3, C 至 E；以及图 S3, D 和 E）。尽管 PAF1 复合物的单个组件未达到 基因的统计阈值 (4, 6)，但它们与多个 蛋白的高度连接性表明其在 ASD 病理生物学中发挥集体作用，这与近期支持 PAF1 复合物成员 LEO1 为 ASD 风险基因的临床遗传学证据一致 (40)。此外，17 个 基因与 AP2 相关网格蛋白介导的内吞复合物相互作用（图 3F），表明这些基因在基因调节之外还具有多样化的作用。

ASD-PPI 富集了由 AlphaFold 预测的疾病相关直接 PPI

ASD- 包含直接和间接的 。为了识别直接结合伴侣及其三维（3D）相互作用界面，我们重新利用 AlphaFold-Multimer (AF) $(41, 42)$ 来筛选我们的 ASD-，这将人类蛋白质组中 hcASD 蛋白质相互作用的预测限制在 1881 个经实验支持的相互作用中（图 4A 和表 S4）。这包括 hcASD-蛋白质-相互作用者（-int; ASD-）和相互作用者-相互作用者（int-）对，后者并未通过我们的 AP-MS 直接测定。为了寻找一个鲁棒的直接相互作用预测指标，我们评估了几个源自 AF 的指标。平均界面预测模板建模得分（mean ipTM）$(41)$ 反映了预测相互作用界面的一致性和准确性，它能最好地将 - 对与阴性对照（-random）区分开来，得分在 0.5 以上的样本显示出 5 到 10 倍的

可能直接接触的富集（图 4B 和图 S4, A 和 B）。这识别出 113 个高置信度的直接 蛋白质相互作用 [错误发现率 (FDR) 为 10 到 20%，113 个中的 49 个此前未被识别]（图 S4℃ 和表 S4），以及 466 个通过中间结合伴侣与 蛋白质相连的间接相互作用者（- 链接；图 4℃ 和表 S4）。与 iEN- $(23)$ 相比，ASD- 的预测直接相互作用率几乎高出两倍，这表明 ASD- 富集了直接 。

我们使用 NanoLuc (N2H) 分裂荧光酶二元相互作用分析 $(43, 44)$ 验证了预测相互作用的一个子集，确认 37 对测试样本中的 12 对（$\sim32\%$）为直接结合者（图 S4D），这与 N2H 在已知直接相互作用者上的表现一致，且高于 AP-MS 数据通常观察到的 10 到 15% $(45-47)$。几对在 N2H 中呈阴性的样本（例如 NUP155-SMPD4, SETD5-TBL1X, GNAI1-TNFAIP8, DYRK1A-KIAA0232, 以及 DYRK1A-DCAF7）通过 NPC 中的免疫组化共定位得到了确认，为其物理接近性提供了正交支持（图 S4E 以及参见图 S5E）。此前未知的 以及 AF 预测的 NUP155 与 SMPD4 之间的相互作用（图 4G），后者是一种与小头畸形相关的蛋白质 $(48)$，凸显了该方法在揭示神经发育疾病关键相互作用方面的价值。

蛋白质 DYRK1A 与 DCAF7 之间的相互作用是一个高置信度 AF 界面预测的典范（图 4, B 和 D 至 F）。尽管该相互作用已被证实 $(49)$，但其 3D 结构仍未被解析。

A

C

G

图 2. ASD-PPI 相互作用因子在脑中表达且富集 ASD 遗传风险。(A) hcASD 基因、非 hcASD 相互作用因子 ($^{no\ }$) 以及其他 HEK293T 蛋白在产前脑中的表达 (20)。(B 和 C) 基因与非 相互作用因子在 524 个脑样本中的表达相关性 [皮尔逊决定系数 ($R^{2}$) = 0.81, $P < 1 \times 10^{-15}$] (B) 以及在发育阶段的相关性 [(C) 斯皮尔曼相关系数 ($\rho$) = 0.946]。(D 和 E) 相互作用因子在 从头损伤突变 (D) 以及 或精神分裂症风险基因 (5–7,26) 中的富集情况 (E)。(F 和 G) 诱饵数量对相互作用因子 风险富集 (F) 和 + 恢复 (G) 的影响。(G) 中的阴影表示 1000 次排列中中位数的 ±1 标准差 (SD)。OR，比值比。(H) 产前脑单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) t-分布随机邻域嵌入 (t-SNE) (27)。Endoth.，内皮细胞；Div.，分裂细胞；Prog.，祖细胞；OPC，少突胶质细胞前体细胞。(I) -PPI 和 iEN- 网络在不同细胞类型中（包含和不包含 STRING）的相对共表达。颜色表示名义显著细胞类型 (P < 0.05) 相对于其他细胞类型的边缘共表达；灰色表示其他细胞类型。数据通过 Student's t 检验 (A)、单侧 Fisher 精确检验 [(D), (F), 和 (G)] 或 Wilcoxon 秩和检验 (I) 进行分析。名义显著为 P < 0.05，显著为经 Bonferroni 校正后的 P < 0.05。对于箱线图，中心线代表中位数，箱体边界为四分位距 (IQR)，须线为 ±1.5 × IQR。对于点须图，OR 为 ±95% 置信区间 (CI)。n.s. 表示不显著，*0.01 < P < 0.05, **0.001 < P < 0.01, 以及 ***P < 0.001。

B

A

C

E

图 3. - 展示了 蛋白之间的分子收敛。(A) - 网络图， 蛋白和相互作用因子的位置基于连接性 (AP-MS) 和共享的基因本体 (GO) 术语。相互作用因子的颜色反映了代表性的富集 GO 类别，这些类别在最大化覆盖范围的同时尽量减少了冗余。(B) -、乳腺癌 (12) 和激酶组 (32) 中诱饵对之间的相互作用因子重叠情况，显示为显著成对重叠的比例 (超几何分布 $P < 0.05$)。通过与 1000 个随机度匹配的 BioPlex 网络（小提琴图）进行比较，每个网络的比例被分别转换为 Z 分数。(C 至 F) 显示 蛋白与 Sin3 (C)、Mediator (D)、PAF1 (E) 和 AP2 介导的网格蛋白包被凹陷 (F) 复合物相互作用的 网络。深色线表示 AP-MS 边缘，细灰色线表示 CORUM 或 STRING 边缘，灰色阴影表示 CORUM 复合物。

预测的界面与 DYRK1A 已知的 DCAF7 结合区域（残基 80 至 100）(50) 相匹配，并显示出高度的进化保守性，这与保留功能性重要结合的选择压力一致（图 4, E 和 F）。删除该区域 (DYRK1A $^{\Delta80-100}$ ) 会破坏其与 DCAF7 的结合，但不会影响其与 FAM54℃ 的结合，后者结合在 DYRK1A 的催化结构域（残基 156 至 479）(51)（图 S4F 和表 S4）。这些发现证明了 AF 预测直接 PPI 以及介导这些相互作用的特定界面的能力。我们进一步确认 AF 预测的界面可以模拟患者突变的影响：GNAI1-RIC8A 界面的定向诱变显示，结合亲和力与预测的致病性相关（见后续章节和 . S8E）。

A

B

C

D

G

E

F

H

. 4. 预测直接 PPI 相互作用界面。(A) 对 hcASD-int (n = 1763) 和 int- (n = 29,850) 对进行界面预测的工作流程。示例子网络显示 预测的边通过 - 相互作用（紫色）将两种 hcASD 蛋白连接起来。(B) ipTM 分数在 PPI 集合中的分布。虚线表示 ipTM = 0.5 阈值，在此阈值下， 蛋白- 对相对于随机对照组有约 5 倍的富集。对比包括 iEN-PPI (23) 和 -random（阴性对照）。(C) 每个 蛋白的相互作用因子数量（灰色），重点标注了被 预测为直接相互作用的因子（蓝色）。紫色线表示通过 验证的直接或介导的 (-) 路径与 蛋白连接的相互作用因子。对于缺乏 直接边的 蛋白，红线表示最大的 验证相互作用因子复合物。(D 至 F) 预测的 DYRK1A-DCAF7 结构 (D)，根据模型置信度 [预测局部距离差异测试 (pLDDT); (E)] 或序列保守性 [ConSurf; (F)] 着色。(G) 预测的 NUP155-SMPD4 结构。(H) 在不同脑细胞类型中，带有或不带有 - 边的 ASD-PPI 的相对共表达 [(27); 见 . 2H]。颜色反映了每种细胞类型相对于所有其他细胞类型的相对网络边共表达（Wilcoxon 秩和检验，估计中位数差异）。名义上显著的细胞类型 (P < 0.05) 带有颜色，其他则为灰色。

为了确定 支持的直接相互作用组是否在特定细胞类型中富集，我们按照上述方法评估了其在三个产前大脑 scRNA-seq 细胞图谱 (27, 52, 53) 中的表达（见 . 2I 和 . S2I）。113 个 预测的直接 - 对未显示出细胞类型富集；然而，加入 预测的 - 连接后，在 NPC 中出现了富集，特别是 NPC-EN (. 4H, . S4G 和表 S4)，这与我们基于 STRING 的发现一致（见前述章节；. 2I 和 . S2I）。这一模式在 iEN-PPI 中得到了重复 (. 2I 和 . S2I)。因此，ASD 相互作用组主要汇聚在兴奋性谱系的生成和早期分化上。

DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 复合物调节神经发生与分化

为了进一步探索分子层面的趋同性，我们重点研究了与 8 个或更多 hcASD 蛋白结合的 7 个“枢纽相互作用因子”（图 5A 和图 S3A）。在现有的相互作用组中 (54)，仅 DCAF7 相互作用组显示出对其他 ASD 风险基因 [hcASD+; (6)] 的强富集，这表明 蛋白趋同于 DCAF7（图 5B 和表 S5）。

DCAF7 是一种接头蛋白，可与 DYRK1A 等 蛋白相互作用，调节其核转位及蛋白相互作用（例如与 HAP1）$(55)$，并与 AUTS2 和 SKI 相互作用以调节神经元谱系特化，凸显了其在神经发育中的作用 $(56)$。通过比较 DCAF7 及其结合的 伙伴的相互作用因子重叠情况发现， 蛋白 DYRK1A 和此前未被表征的 KIAA0232 与 DCAF7 具有显著的相互作用因子重叠（图 5D 和表 S5），且 AF 预测两者均为 DCAF7 的直接相互作用因子（表 S4）。在 iPSC 衍生的 iENs 中进行的内源性 DYRK1A AP-MS 实验回收了 DCAF7 和 KIAA0232，并显示与 HEK293T 细胞衍生的相互作用因子有相当大的重叠（图 S5, A 和 B）。在 HEK293T 细胞中进行的连续 AP-MS 进一步证实，这三种蛋白以复合物的形式发生物理相互作用，其 126 个共有相互作用因子在 + 中富集（图 5E 和图 S5, C 和 D）。所有三种蛋白在 HEK 细胞和 NPC 中均定位于有丝分裂纺锤体（图 S5E），这与此前在非洲爪蟾（Xenopus）和人类 NPC 中关于 DYRK1A 的发现一致 $(57, 58)$。此外，ASD-PPI 相互作用因子在与有丝分裂纺锤体组织相关的蛋白（如中心粒卫星体和中心体）中富集（图 S5F 和表 S5）。

我们评估了 DCAF7、DYRK1A 和 KIAA0232 在体内是否具有共同的神经发育功能。此前的工作表明，非洲爪蟾中 DYRK1A 的缺失会破坏细胞周期，增加细胞凋亡并减小端脑尺寸 (58)。利用 CRISPR-Cas9 诱变技术在非洲爪蟾中研究发现，敲除（缺失；KO）dcaf7 或 kiaa0232 产生的表型与 dyrk1a 缺失相似，均导致端脑尺寸减小，从而将该复合物与 ASD 相关表型联系起来（图 5F 和表 S5）。为了将此结果与人类临床表现联系起来，我们分析了特发性 ASD 患者的皮层类器官 scRNA-seq 数据 (59)：DCAF7- 蛋白子网络在头围正常（而非大头畸形）的 ASD 患者差异表达基因 (DEGs) 中富集（图 S5G）。这表明 DCAF7 的相互作用有助于导致不伴有大头畸形的 ASD 表现，这与在非洲爪蟾中观察到的前脑生长减少一致。

为了研究细胞机制，我们使用 CRISPR 介导的敲低 (KD) 在人类 iPSC 衍生的 NPC 中降低 DCAF7、DYRK1A 或 KIAA0232 的表达。DCAF7 敲低增加了神经分化过程中的细胞死亡（图 S5, H 和 I；以及表 S5），这与 DCAF7 在促进细胞生存中的作用一致 (60)。敲低 DCAF7 或 KIAA0232 均降低了 Ki67 阳性 NPC 的比例，表明祖细胞增殖受损（图 S5, J 和 K；以及表 S5）。全局蛋白质组学揭示了 NPC 在 DCAF7 或 KIAA0232 敲低后的协调变化（图 S6A），在 + 以及细胞周期、染色质和转录调节因子中富集（图 S6, B 和 C；以及表 S5）。相比之下，DYRK1A 敲低轻微增加了 Ki67 阳性 NPC 的比例（图 S5, J 和 K），这与 DYRK1A 的剂量依赖性效应一致 (61, 62)。事实上，尽管 DYRK1A mRNA 显著减少，但全局蛋白质组学检测到 DYRK1A 蛋白量的下降幅度极小（图 S6D），表明 NPC 中存在强大的转录后缓冲机制。尽管有这种缓冲作用，但在敲低该复合物的所有三个成员后，部分受 DYRK1A 调节 (63–65) 的关键神经发生转录因子——PAX6、FOXG1 和 SOX2——的表达均下调（图 5, G 和 H；以及表 S5）。综合而言，这些数据表明 DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 复合物的破坏会损害跨物种的神经发生。

hcASD 基因错义突变改变 PPI 并导致趋同的相互作用变化

我们接下来评估了 30 个 hcASD 蛋白中，预测为具有高度有害性的 54 个患者来源的致病性新发错义突变 (4) 如何重新配置 PPI（图 6A 和表 S6）。该突变网络 $(\mathrm{ASD}_{\mathrm{mut}}\text{-PPI})$ 识别出 253 个显著改变的相互作用 $(P < 0.05)$，包括增加或增强以及丢失或减弱的相互作用（图 6, B 至 D；表 S6；以及材料与方法）。丢失的相互作用（136 个；95 个唯一相互作用因子）在 hcASD 蛋白中富集（图 S7A 和表 S6），支持了主要的功能缺失机制 (66)。在人类 NPC 中对这些相互作用进行映射，确认了其与我们的 HEK293T 数据具有强重叠，且共享的相互作用因子在突变敏感链接和 AF 预测的直接链接中均显著富集（图 6D, 图 S7B, 和表 S6），支持了该网络在不同细胞环境中的鲁棒性。

鉴于 ASD-PPI 的趋同性，我们研究了相同或不同 hcASD 基因中的错义突变是否会导致共同的蛋白质相互作用变化。在具有多个变异的 13 个 hcASD 蛋白中，45% 的改变的相互作用在两个或更多突变体中重复出现（例如，SLC6A1 和 FOXP1 突变体；图 6D 和表 S6）。我们还额外识别出 15 个在两种不同 hcASD 突变体中显示出一致变化的相互作用因子；例如，三个 FOXP1 突变体和一个 FOXP2 突变体均丢失了与 FOXP4 的相互作用（图 6D；图 S7, C 和 D；以及表 S6）。

将 $\mathrm{ASD}_{\mathrm{mut}}\text{-PPI}$ 与其他 PPI 网络 (23, 54, 67–70)（见材料与方法, 图 S7E, 和表 S6）相结合，结果显示差异相互作用一致地趋向于 WT 网络中识别的功能模块（图 3, C 至 F）。例如，两种 MKX 突变体 $[Arg^{93}\rightarrow Gly(R93G), L89F]$ 均增强了与 Sin3 转录抑制复合物的相互作用，而两种 MYT1L 突变体 (H522Q, C504R) 均减少了与 Mediator 复合物的相互作用，这表明基因表达调节出现了失调。同样，两种 STXBP1 突变体 (R551℃, A251T) 和两种 AP2S1 突变体 (R10W, G64D) 分别显示出与囊泡运输复合物和网格蛋白复合物更强的相互作用。总的来说，这些发现表明，患者来源的突变驱动的相互作用变化趋向于支配神经发育的关键生物过程。[氨基酸残基的单字母缩写如下：A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; 以及 Y, Tyr。]

接下来，我们利用 AF 来优先筛选那些 hcASD 基因突变位于预测相互作用界面（<10 Å；见材料与方法）的直接相互作用（图 7A）。这在 216 个相互作用的界面上识别出涉及 22 个 hcASD 基因的 34 个突变（表 S7）。在突变状态下减弱的相互作用中，有 46% 与界面突变相关，而增强的相互作用中仅有 18%，这表明界面突变主要起破坏作用（图 S8A 和表 S7）。例如，PPP2R5D E198K 突变直接接触相互作用界面（1.6 Å），导致与 PPP4℃ 的相互作用丧失（图 7, B 和 C；以及图 S8B）。相比之下，GNAI1 I319T 突变距离其与 RIC8A (71) 的界面较远（6.1 Å），却增强了 PPI（图 7, D 和 E；以及图 S8℃）。对该残基的定向诱变显示，相互作用亲和力与预测的致病性相关：良性变体 I319V 未显示出变化，而三种致病变体则改变了 RIC8A 的结合（图 S8E）。最后，在 ASD$_{mut}$-PPI 中评估的三种 FOXP1 错义变体破坏了其与 FOXP4 的相互作用（图 7F），且被预测为具有高度致病性（图 S8F 和表 S7）。尽管位于不同的结构位置——FOXP1 R513H 位于 DNA 界面，而 FOXP1 L327P 位于 FOXP1-FOXP4 界面（图 7G, 图 S8D, 以及视频 S1）——所有变体均一致地削弱了 FOXP1-FOXP4 的关联（图 7, H 和 I），这促使我们优先选择 FOXP1 进行进一步的功能研究。

A 识别结合 ≥ 8 个 hcASD 蛋白的 ASD-PPI 中心相互作用因子

B

C 优先筛选 DCAF7

D 识别与 DCAF7 BioGRID 相互作用因子有显著重叠的 hcASD 蛋白

E 确认 DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 相互作用

H

F G

图 5. DCAF7 与多种 hcASD 蛋白形成复合物。(A) 结合 $\ge 8$ 种 hcASD 蛋白的 ASD-PPI “枢纽”相互作用因子。(B) 来自 BioGRID (54) 的枢纽相互作用因子已知相互作用组中 + 的富集情况。虚线表示 OR = 1（无富集）。(C) 枢纽相互作用因子 DCAF7 在 ASD-PPI 中结合 8 种 蛋白。(D) DCAF7 的 BioGRID 相互作用因子与 DCAF7 所结合的 蛋白的 ASD-PPI 相互作用因子之间的重叠。(E) DYRK1A 和 KIAA0232 连续免疫沉淀的 MS 序列覆盖率。(F) 针对 Dcaf7、Dyrk1a 或 Kiaa0232 的单侧单导向 RNA (sgRNA) 注射与非靶向对照 (sgNTC) 后，非洲爪蟾端脑的大小。比例尺为 50 μm。(G) 在相应细胞系的 NPC 中，DYRK1A（粉色）、DCAF7（紫色）和 KIAA0232（蓝色）mRNA 的 CRISPR KD 情况。(H) KD NPC 中的定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 显示 PAX6、SOX2 和 FOXG1 的表达与 NTC 表达的对比。数据通过 Fisher 精确检验（单侧，大于）[(B) 和 (D)]、配对 t 检验 (F) 或单因素方差分析 (ANOVA) (H) 进行分析。P 值未经调整 (B) 或使用 Bonferroni (D) 或 Dunnett (H) 方法进行了校正。对于 (B) 到 (D) 中的点线图，点代表 OR，线代表 95% CI。对于柱状图，数据为平均值 $\pm$ SEM (n = 3 个生物学重复)。n.s. 表示不显著，*0.01 < P < 0.05，**0.001 < P < 0.01，且 ***P < 0.001。

总的来说，我们对 WT 和突变网络的分析揭示了一种双层分子收敛。首先，WT ASD-PPI 识别出稳定的“分子十字路口”——如 DCAF7 等枢纽相互作用因子，它们将不同的 蛋白连接成统一的复合物。其次，$ASD_{mut}$-PPI 揭示了患者来源变异的“功能收敛”；

A

D

图 6. 患者来源的 基因错义突变改变蛋白质相互作用。(A) ASD 患者来源突变网络 ($ASD_{mut}$-PPI) 构建概览。(B) 突变型与 蛋白之间的相互作用变化，按 x 轴上标记有突变的 蛋白分组。显著减弱（蓝色）或增强（红色）的 蛋白相互作用被突出显示，突变型特有或 特有的相互作用分别绘制在 $\log_{2}FC$（倍数变化）= $\infty$ 和 $-\infty$ 处。(C) 差异蛋白质相互作用的量化，显示 突变富集的相互作用（红色）和 富集的相互作用（蓝色）。(D) $ASD_{mut}$-PPI 中显著差异相互作用的网络视图。边颜色反映相互作用的特异性（蓝色在 中更强；红色在突变型中更强），虚线边表示突变型或 特有的相互作用。CORUM 蛋白复合物（黄色）和 GO 生物过程（蓝色）突出了在 蛋白内部及之间被破坏的功能模块。在 (B) 到 (D) 中，数据通过对强度值进行汇总 t 检验分析，FDR 使用 Storey's q 方法估算；$ / \log_{2}FC(\text{Mut} / \text{}) / \geq 1$、FDR < 0.1, 且 P < 0.05 的相互作用因子被认为具有显著差异。

同一基因（例如 MKX、STXBP1 和 AP2S1）中的不同突变，或不同基因（例如 FOXP1 和 FOXP2）中的突变，在其各自的功能模块内驱动相似的方向性相互作用强度变化。这表明，尽管 ASD 风险在遗传上具有异质性，但这些突变的分子后果最终收敛于一组有限的脆弱蛋白系统。

hcASD 基因突变改变皮层神经元分化

FOXP1 编码一种在早期大脑发育中表达的含 forkhead box 结构域的转录因子 (72–75)。为了鉴定被 ASD 患者变异所干扰的神经发育过程，我们构建了带有 FOXP1 $^{R513H}$ 等位基因的等基因 iPSC 细胞系，选择该等位基因是基于其预测的高致病性（图 8, A 和 B；以及图 S8F）。我们确认了

A B

D

C

G

H

1 图 7. AF 将 hcASD 基因突变映射到蛋白质结构和相互作用界面。(A) 使用 AP-MS 和 AF 结构预测来优先筛选受 hcASD 基因突变影响的蛋白质相互作用的工作流程。(B, D, 和 F) PPP2R5D $^{E198K}$ (B)、GNAI1 $^{I319T}$ (D) 以及 FOXP1 $^{R513H}$、FOXP1 $^{R513℃}$ 和 FOXP1 $^{L327P}$ (F) 的差异 ASD ${mut}$ -PPI 网络。边颜色和显著差异相互作用与图 6D 相同。(C, E, 和 G) AF 预测的相互作用：PPP2R5D-PPP4℃ 且 E198 位于相互作用界面 (C)，GNAI1-RIC8A 且 I319 位于相互作用界面 (E)，以及 FOXP1-FOXP4（黄绿色）复合物模型，该模型通过间隔的内在无序区域（线圈）介导，可视化了结构化 DNA 结合域和卷曲螺旋域（以表面渲染显示）的相对灵活性。红色突出显示的是 FOXP1 残基 R513（位于 FOXP1 DNA 结合界面）和 L327（位于 FOXP1-FOXP4 二聚化界面）(G)。(H) HEK293T 细胞中未转染对照 (NTC) 或带有 Strep 标签的 FOXP1 $^{WT}$、FOXP1 $^{R513℃}$、FOXP1 $^{R513H}$ 或 FOXP1 $^{L327P}$ 的 IP-Western 印迹。(I) (H) 中数据的定量分析。数据以平均值 ± SEM 表示 (n = 3 个生物学重复)。数据通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 并使用 Dunnett 校正进行分析；调整后的 $P(P{\mathrm{adj}}) = 0.0011(\mathrm{FOXP1^{R513℃}})$、$P_{adj} = 0.0018(\mathrm{FOXP1^{R513H}})$ 以及 $P_{adj} = 0.0141(\mathrm{FOXP1^{L327P}})$。

FOXP1 $^{R513H / WT}$ iPSC 衍生 NPC 中 FOXP1-FOXP4 相互作用的缺失 (图 S9A)，并使用免疫染色在对应于早期（第 39 天）和晚期皮层神经发生（第 101 天）的时间点评估类器官中的细胞类型组成 (76)。在早期神经发生期间，我们发现与 FOXP1 $^{ / }$ 相比，FOXP1 $^{R513H / }$ 中 PAX6 $^{+}$ 前体细胞减少，而 BCL11B $^{+}$ 第 V 层神经元和 TBR1 $^{+}$ 第 VI 层 / 亚板神经元的丰度均增加（图 8B）。在第 101 天，我们发现 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中 PAX6 $^{+}$ 细胞的丰度没有差异，但 BCL11B $^{+}$ 细胞减少（图 8B）。FOXP1 $^{R513H / }$ 中 TBR1 $^{+}$ 细胞的丰度低于 FOXP1 $^{ / }$，但在多重比较校正后，这一差异未达到统计学显著性。同时，D101 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官表现出 SATB2 $^{+}$ 神经元的增加 (图 S10B)。这些结果表明 FOXP1 $^{R513H}$ 前脑类器官中皮层神经元发生了早熟分化，这与之前在多种体内、体外和计算机模拟模型中的发现一致 (22, 59, 77, 78)。

[⚠ 低质量翻译，建议复核]

B

D101

E

C

F

G

H

I

J

K 图 8. hcASD 变异改变前脑类器官中的深层皮质神经发生。(A) 等基因 iPSC 的生成和分化工作流程及验证（R513H；右侧）。(B) 免疫荧光图像显示 FOXP1 R513H / WT 与 WT 在第 39 天和第 101 天的 PAX6+、TBR1+ 和 BCL11B+ 细胞的免疫组化及定量。EGF，表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；IHC，免疫组化；SB，SB431542（神经营养因子-3 和脑源性神经营养因子）；IWR，IWR-1-endo（小分子）；LDN，LDN-193189（小分子）；WB，蛋白质印迹。 (C 和 D) CUT&Tag 分析显示 FOXP1 和 FOXP4 的 DNA 结合重叠 (C) 和基因组分布 (D)。(E 和 F) 111 个类器官的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 均匀流形近似与投影 (UMAP) 可视化 (E) 和细胞类型特异性差异表达基因 (DEGs) (F)。

(G) 免疫荧光图像显示 FOXP4 敲除 (KO) 可挽救 FOXP1 R513H / WT 在第 39 天的分化表型。(H 和 I) 多电极阵列记录 (H) 和代表性光栅图 (I)。(J) 免疫荧光图像显示 FOXP1 L327 等位基因系列（野生型 WT、杂合子、纯合子）在第 39 天和第 101 天的免疫组化及定量。(K) 不同变异之间 EN-3 DEGs 的 Pearson 相关性。在 (B)、(G) 和 (J) 中，数据通过线性混合模型（39 天）或线性回归（101 天）进行分析，随后进行置换检验和 Benjamini-Hochberg 校正；n = 10 到 13 个类器官 [(B); 39, 101]，n = 2 到 6 [(G); 39, 101]，n = 8 到 11 [(J); 39]，以及 n = 5 到 8 [(J); 101]。(F) 中的数据通过 Wilcoxon 秩和检验并进行 Bonferroni 校正分析，(I) 中的数据通过单侧 Mann-Whitney U 检验分析，n = 6 个类器官。

柱状图数据为平均值 ± 标准误 (SEM)。比例尺为 50 μm。CP，皮质板；VZ，类脑室区。n.s. 表示不显著；*0.01 < P < 0.05；**0.001 < P < 0.01；以及 ***P < 0.001。

为了评估该突变是否改变了 DNA 结合，我们对 FOXP1 和 FOXP4 进行了 CUT&Tag 分析 (79)（图 S9B 和表 S8）。在 FOXP1 $^{WT / WT}$ 类器官中，94.7% 的 FOXP4 峰与 FOXP1 峰重叠（图 8℃），这与其作为异二聚体的功能一致。相比之下，在 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中，仅有 67.4% 的 FOXP4 峰与 FOXP1 结合峰重叠（图 8℃）。尽管 FOXP1 $_{R513H / }$ 类器官中 85% 的 FOXP1 峰与在 FOXP1 $^{ / }$ 中观察到的峰重叠，但 FOXP1 $^{R513H / }$ 的 FOXP4 峰中仅有 37% 与 FOXP1 $^{ / }$ 中的峰重叠，且 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中有 4700 个 FOXP4 峰在对照组中未被发现（图 8D）。这些发现表明，FOXP1 错义变异会影响 FOXP4 的功能，FOXP1-FOXP4 物理相互作用的缺失导致 FOXP4 在新的基因组位点产生获得性结合。

利用 scRNA-seq，我们鉴定了兴奋性神经元（ENs）中突变类器官与 类器官之间的差异表达基因（DEGs）。我们沿成熟轨迹鉴定了三个 EN 簇：皮层深层 6 层和亚板神经元（EN-3：SOX5、NR4A2、TBR1 高表达），深层 5 / 6 层神经元（EN-2：FOXP2、PBX3 和 MEIS2 高表达），以及深层 5 层神经元（EN-1：FOXP1、ROBO1 和 BCL11B 高表达）。数量最多的 DEG 出现在 EN-3 簇中（图 8, E 和 F；以及图 S9, C 和 D），这与在 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中显示出过早分化的群体相对应（图 8B）。EN-3 中的 DEG 在 FOXP1 和 FOXP4 靶基因中富集（图 S9E），且在 CUT&Tag 中 FOXP1 结合减少的上调基因在 hcASD+ 中富集（图 S9F 和表 S8）。在 EN-3 的 DEG 中，分别有 43% 和 32% 显示出新的 FOXP1 和 FOXP4 结合。此外，21% 表现出从

丢失 FOXP1 结合到产生新 FOXP4 结合的“切换”（图 S9, F 和 G；以及表 S8）。这些发现表明，FOXP4 在 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中出现了功能获得或特异性丢失，这可能补偿或加剧了这些位点 FOXP1 结合的丢失。

为了确定被破坏的 FOXP1-FOXP4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是否会导致皮层神经发生表型（图 S9A），我们在 FOXP1 $^{R513H / }$ 背景下构建了具有 FOXP4 功能缺失突变的双突变 iPSC 细胞系（FOXP1 $^{R513H / }$ -FOXP4 $^{KO}$；图 S9H）。前脑类器官显示出与对照组相似的深层神经元比例（图 8F）。这些数据表明，FOXP4 功能的获得可能是 FOXP1 $^{R513H}$ 类器官中皮层神经发生缺陷的原因。因此，R513H 突变不仅代表简单的 FOXP1 功能缺失，而且对其被破坏的相互作用因子 FOXP4 产生了一种致病性的功能获得。尽管具体的救援机制仍需确定，但这些数据证明了 FOXP4 的缺失可以抑制 FOXP1 突变表型。

为了将 FOXP1 $^{R513H / }$ 中的细胞缺陷与功能特性联系起来，我们使用多电极阵列记录了类器官中的神经活动。FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官的平均放电率始终高于同基因对照类器官（图 8, H 和 I；以及图 S9I）。对群体水平参数的进一步分析未发现尖峰时间平铺系数（spike time tiling coefficient）、尖峰间隔以及各种爆发指标（burst metrics）发生变化（图 S9, J 和 K），这表明改变的是基线放电而非全网络特性。这些结果表明，在 FOXP1 $^{R513H / }$ 类器官中观察到的皮层神经元分化改变具有功能性后果，这与在携带 hcASD 基因突变的人类干细胞衍生神经元培养物的独立研究中观察到的结果相似 (80, 81)。

最后，我们研究了携带 $\text{FOXP1}^{L327P}$ 突变的 iPSC（图 S10A）是否会模拟在 $\text{FOXP1}^{R513H / WT}$ 类器官中发现的神经发育改变；该突变位于预测的 FOXP1-FOXP4 异源二聚体界面，且同样会导致 FOXP1-FOXP4 相互作用的丧失。与 ${FOXP1}^{R513H / WT}$ 类似，我们发现 ${BCL11B}$ 在神经发生早期增加，在较晚的时间点减少（图 8J），同时在 ${FOXP1^{L327P / L327P}}$ 和 ${FOXP1^{L327P / }}$ 类器官中，${SATB2}^{+}$ 神经元均有所增加（图 S10B），而 ${PAX6}^{+}$ 细胞则有所减少（图 8J）。同样，${TBR1^{+}}$ 细胞在 ${FOXP1^{L327P / L327P}}$ 早期增加，而在 ${FOXP1^{L327P / }}$ 类器官的较晚时间点减少（图 8J）。在神经发生晚期的类器官中，利用 scRNA-seq 识别出的差异表达基因（DEGs）显示，杂合子 ${FOXP1^{L327P / }}$ 和 ${FOXP1^{R513H / }}$ 基因型在 EN-3 簇中的效应大小和方向性是一致的（图 8K 和图 S10℃）。含有 $\gamma$-氨基丁酸（GABA能）神经元的丰度在携带 ${FOXP1^{L327P}}$ 或 ${FOXP1^{R513H}}$ 突变的类器官中均未发生改变（图 S10D），这表明表型仅限于兴奋性谱系。因此，破坏 FOXP1 蛋白不同结构域的突变通过使 FOXP1-FOXP4 异源二聚体不稳定而相互模拟，导致前体细胞过早耗尽和深层神经发生异常的趋同表型。最后，为了测试在其他 ASD 突变的情况下是否能检测到皮层神经发生表型，我们将预测致病性较高的 E198K 变体（图 S7E）引入 $PPP2R5D$ (82) 的内源性位点。与 FOXP1 突变的结果一致，在神经发生早期，${PPP2R5D^{E198K / E198K}}$ 类器官显示出 ${PAX6^{+}}$ 细胞减少和 ${BCL11B^{+}}$ 细胞增加（图 S10, E 和 F）。

讨论

尽管在定义自闭症谱系障碍（ASD）的遗传架构方面取得了实质性进展，但确定因果分子机制和治疗靶点仍然是一项核心挑战 $(10, 83)$。旨在识别高置信度 ASD（hcASD）基因之间趋同生物学的努力在很大程度上依赖于转录组分析和低通量功能研究，使得蛋白质组景观相对缺乏探索。特别是，遗传异质性的 风险基因是否以及如何在蛋白质复合物水平上组织，以及致病突变如何干扰这些相互作用，目前仍定义不清。

在此，我们整合了大规模人类遗传学、亲和纯化-质谱分析（AP-MS）和基于 AlphaFold（AF）的结构预测，以绘制与 相关的蛋白质物理相互作用组。在 HEK293T 细胞中对 100 个 hcASD 基因和 54 个患者来源的错义变异进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）映射，提供了全面相互作用组映射和系统性突变审讯所需的深度、可重复性和规模，这与该方法在多种疾病背景下的先前应用一致 (12–19)。多条正交证据支持这些数据的疾病相关性，包括与神经元相互作用网络的强重叠、在发育中的人类大脑中与 hcASD 基因的高度共表达、对 （而非精神分裂症）风险基因的选择性富集，以及从 HEK293T 细胞到非洲爪蟾（Xenopus）和人类大脑类器官的功能验证。

我们的数据揭示了 底层的双层分子架构： 风险蛋白趋同于稳定且共享的蛋白质复合物，而独立的 相关突变则诱导趋同的相互作用重构模式。这两层共同在遗传变异与神经发育功能障碍之间提供了机制桥梁，并将特定的蛋白质复合物、相互作用和界面提名为候选治疗切入点。-PPI 网络突出了仅凭以基因为中心的遗传学研究难以检测到的分子模块 $(4, 6)$；将 PAF1 复合物识别为核心枢纽，说明了连贯的蛋白质组装如何包含多个 相关组件，而这些组件的个体遗传信号可能低于严格的显著性阈值。

尽管 具有广泛的遗传和表型异质性，但 hcASD 蛋白之间显著的相互作用者重叠表明，相对有限的一组分子通路可能构成了 生物学的核心，特别是对于在大型效应编码突变中显著富集的 谱系严重端 (4, 8, 84, 85)。虽然同一基因中的有害变异具有极高的表型变异性，会导致包括 、癫痫、智力障碍和精神分裂症在内的多种神经发育状况，但此处描述的 网络对 具有特异性，精神分裂症风险基因缺乏富集便证明了这一点。这些发现提出了这样一种可能性：疾病特异性可能并非简单地源于基因身份，而是源于突变在发育相关背景下如何干扰蛋白质网络。

对野生型（WT）和突变型 PPI 的系统比较揭示了多个 hcASD 变异中反复出现的相互作用获得和丢失，突显了遗传截然不同的突变之间共享的分子脆弱性。AF 预测的整合使得能够识别受致病突变影响的候选相互作用界面。虽然 AF 并非为相互作用发现而设计，但它在此背景下的表现——特别是利用预测之间的一致性而非最高分时——优于传统方法，并富集了具有生理相关性的相互作用。在多种细胞背景下观察到的相互作用更有可能表现出高 AF 置信度和突变敏感性，这表明广泛保守的相互作用可能代表核心功能节点。

在人类神经前体细胞（NPCs）和前脑类器官中的功能验证表明，突变诱导的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）重构会对神经发育产生直接影响。FOXP1 变体破坏了 FOXP1-FOXP4 的相互作用，改变了 DNA 结合，并促进了 FOXP4 向额外基因组位点的异位招募。尽管 FOXP1 在神经节隆起中高度表达 (86)，但我们并未检测到 GABA 能神经发生的类似差异，这可能是由于其他 FOXP 家族成员的补偿作用 (87)。我们的数据表明，在皮层而非皮层下前体细胞中高度富集的 FOXP4 (27, 77) 负责导致谷氨酸能神经发生改变。近期使用干细胞衍生 ASD 模型的报告已显示出皮层神经发生的改变 (59, 77)，且我们在携带 PPP2R5D 错义突变的类器官中也检测到了类似的趋势。综上所述，这些发现强调了皮层神经发生时机改变对 ASD 的重要性（图 S10G），这与 hcASD 基因在这些细胞类型中的高共表达 (4, 22) 以及来自死后脑组织的发现 (88) 是一致的。

总而言之，本研究通过 PPI 映射建立了一个可推广的框架，用于对基因组风险进行机制性解释。通过将野生型（WT）和突变体相互作用组与结构建模及人类类器官系统相结合，我们能够在保持更广泛分子景观系统背景的同时，实现单突变分辨率的因果推断。对丢失或减弱以及异常获得或增强的相互作用的识别，勾勒出了互补的治疗策略，包括稳定被破坏的复合物和抑制病理性相互作用。更广泛地说，该平台优先筛选可成药的蛋白质界面和通路，为旨在恢复 ASD 神经发育轨迹和电路级功能的精准疗法提供了理性基础，并为跨神经系统和精神疾病的机制性药物研发建立了一个可推广的蓝图。

材料与方法可见于补充材料。

参考文献与注释

1. C. Lord et al., Autism spectrum disorder. Nat. Rev. Dis. Primers 6, 5 (2020). doi: 10.1038 / s41572-019-0138-4; pmid: 31949163

2. B. Tick, P. Bolton, F. Happé, M. Rutter, F. Rijsdijk, Heritability of autism spectrum disorders: A meta-analysis of twin studies. J. Child Psychol. Psychiatry 57, 585–595 (2016). doi: 10.1111 / jcpp.12499; pmid: 26709141

3. M. J. Maenner et al., Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years – Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 sites, United States, 2020. MMWR Surveill. Summ. 72, 1–14 (2023). doi: 10.15585 / mmwr.ss7202a1; pmid: 36952288

4. F. K. Satterstrom et al., Large-scale exome sequencing study implicates both developmental and functional changes in the neurobiology of autism. Cell 180, 568–584.e23 (2020). doi: 10.1016 / j.cell.2019.12.036; pmid: 31981491

5. B. Trost et al., Genomic architecture of autism from comprehensive whole-genome sequence annotation. 185, 4409–4427.e18 (2022). doi: 10.1016 / j..2022.10.009; pmid: 36368308

6. J. M. Fu et al., Rare coding variation provides insight into the genetic architecture and phenotypic context of autism. Nat. Genet. 54, 1320–1331 (2022). doi: 10.1038 / s41588-022-01104-0; pmid: 35982160

7. X. Zhou et al., Integrating de novo and inherited variants in 42,607 autism cases identifies mutations in new moderate-risk genes. Nat. Genet. 54, 1305–1319 (2022). doi: 10.1038 / s41588-022-01148-2; pmid: 35982159

8. C. Lord et al., The Lancet Commission on the future of care and clinical research in autism. Lancet 399, 271–334 (2022). doi: 10.1016 / S0140-6736(21)01541-5; pmid: 34883054

9. N. Sestan, M. W. State, Lost in translation: Traversing the complex path from genomics to therapeutics in autism spectrum disorder. Neuron 100, 406–423 (2018). doi: 10.1016 / j.neuron.2018.10.015; pmid: 30359605

10. H. R. Willsey, A. J. Willsey, B. Wang, M. W. State, Genomics, convergent neuroscience and progress in understanding autism spectrum disorder. Nat. Rev. Neurosci. 23, 323–341 (2022). doi: 10.1038 / s41583-022-00576-7; pmid: 35440779

11. J. F. Greenblatt, B. M. Alberts, N. J. Krogan, Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease. 187, 6501–6517 (2024). doi: 10.1016 / j..2024.10.038; pmid: 39547210

12. M. Kim et al., A protein interaction landscape of breast cancer. Science 374, eabf3066 (2021). doi: 10.1126 / science.abf3066; pmid: 34591612

13. D. L. Swaney et al., A protein network map of head and neck cancer reveals PIK3CA mutant drug sensitivity. Science 374, eabf2911 (2021). doi: 10.1126 / science.abf2911; pmid: 34591642

14. S. K. Hota et al., Brahma safeguards canalization of cardiac mesoderm differentiation. Nature 602, 129–134 (2022). doi: 10.1038 / s41586-021-04336-y; pmid: 35082446

15. B. Gonzalez-Teran et al., Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease. 185, 794–814.e30 (2022). doi: 10.1016 / j..2022.01.021; pmid: 35182466

16. T. E. Tracy et al., Tau interactome maps synaptic and mitochondrial processes associated with neurodegeneration. 185, 712–728.e14 (2022). doi: 10.1016 / j..2021.12.041; pmid: 35063084

17. J. Batra et al., Protein interaction mapping identifies RBBP6 as a negative regulator of Ebola virus replication. 175, 1917–1930.e13 (2018). doi: 10.1016 / j..2018.08.044; pmid: 30550789

18. D. E. Gordon et al., A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 583, 459–468 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2286-9; pmid: 32353859

19. S. Jäger et al., Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature 481, 365–370 (2011). doi: 10.1038 / nature10719; pmid: 22190034

20. H. J. Kang et al., Spatio-temporal transcriptome of the human brain. Nature 478, 483–489 (2011). doi: 10.1038 / nature10523; pmid: 22031440

[...OMITTED...]

21. GTEx Consortium, Genetic effects on gene expression across human tissues. Nature 550, 204–213 (2017). doi: 10.1038 / nature24277; pmid: 29022597

22. A. J. Willsey et al., Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell 155, 997–1007 (2013). doi: 10.1016 / j.cell.2013.10.020; pmid: 24267886

23. G. Pintacuda et al., Protein interaction studies in human induced neurons indicate convergent biology underlying autism spectrum disorders. Cell Genom. 3, 100250 (2023). doi: 10.1016 / j.xgen.2022.100250; pmid: 36950384

24. N. Murtaza et al., Neuron-specific protein network mapping of autism risk genes identifies shared biological mechanisms and disease-relevant pathologies. Cell Rep. 41, 111678 (2022). doi: 10.1016 / j.celrep.2022.111678; pmid: 36417873

25. Y. Gao et al., Proximity analysis of native proteomes reveals phenotypic modifiers in a mouse model of autism and related neurodevelopmental conditions. Nat. Commun. 15, 6801 (2024). doi: 10.1038 / s41467-024-51037-x; pmid: 39122707

26. T. Singh et al., Rare coding variants in ten genes confer substantial risk for schizophrenia. Nature 604, 509–516 (2022). doi: 10.1038 / s41586-022-04556-w; pmid: 35396579

27. T. J. Nowakowski et al., Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science 358, 1318–1323 (2017). doi: 10.1126 / science.aap8809; pmid: 29217575

28. D. Szklarczyk et al., The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene / measurement sets. Nucleic Acids Res. 49, D605–D612 (2021). doi: 10.1093 / nar / gkaa1074; pmid: 33237311

29. S. A. Aleksander et al., The Gene Ontology knowledgebase in 2023. Genetics 224, iyad031 (2023). doi: 10.1093 / genetics / iyad031; pmid: 36866529

30. D. S. Manoli, M. W. State, Autism spectrum disorder genetics and the search for pathological mechanisms. Am. J. Psychiatry 178, 30–38 (2021). doi: 10.1176 / appi.ajp.2020.20111608; pmid: 33384012

31. K. E. McCluskey et al., Autism gene variants disrupt enteric neuron migration and cause gastrointestinal dysmotility. Nat. Commun. 16, 2238 (2025). doi: 10.1176 / appi.ajp.2020.20111608; pmid: 33384012

32. S. Kaushik et al., A tyrosine kinase protein interaction map reveals targetable EGFR network oncogenesis in lung cancer. bioRxiv 2020.07.02.185173 [Preprint] (2020); https: / doi.org / 10.1101 / 2020.07.02.185173.

33. D. Halder et al., Suppression of Sin3A activity promotes differentiation of pluripotent cells into functional neurons. Sci. Rep. 7, 44818 (2017). doi: 10.1038 / srep44818; pmid: 28303954

34. A. Roopra et al., Transcriptional repression by neuron-restrictive silencer factor is mediated via the Sin3-histone deacetylase complex. Mol. Cell. Biol. 20, 2147–2157 (2000). doi: 10.1128 / MCB.20.6.2147-2157.2000; pmid: 10688661

35. M. Quevedo et al., Mediator complex interaction partners organize the transcriptional network that defines neural stem cells. Nat. Commun. 10, 2669 (2019). doi: 10.1038 / s41467-019-10502-8; pmid: 31209209

36. N. Ding et al., Mediator links epigenetic silencing of neuronal gene expression with x-linked mental retardation. Mol. Cell 31, 347–359 (2008). doi: 10.1016 / j.molcel.2008.05.023; pmid: 18691967

37. M. J. Jurynec et al., The Paf1 complex and P-TEFb have reciprocal and antagonist roles in maintaining multipotent neural crest progenitors. Development 146, dev180133 (2019). doi: 10.1242 / dev.180133; pmid: 31784460

38. C. Zhang et al., The X-linked intellectual disability protein PHF6 associates with the PAF1 complex and regulates neuronal migration in the mammalian brain. Neuron 78, 986–993 (2013). doi: 10.1016 / j.neuron.2013.04.021; pmid: 23791194

39. N. J. Krogan et al., RNA polymerase II elongation factors of Saccharomyces cerevisiae: A targeted proteomics approach. Mol. Cell. Biol. 22, 6979–6992 (2002). doi: 10.1128 / MCB.22.20.6979-6992.2002; pmid: 12242279

40. E. C. Ung, N. A. Borja, LEO1 haploinsufficiency is associated with developmental delays and autism spectrum disorder. J. Hum. Genet. 71, 109–111 (2026). doi: 10.1038 / s10038-025-01410-5; pmid: 40993282

41. R. Evans et al., Protein complex prediction with AlphaFold-Multimer. bioRxiv 2021.10.04.463034 [Preprint] (2022); https: / doi.org / 10.1101 / 2021.10.04.463034.

42. P. Bryant, G. Pozzati, A. Elofsson, Improved prediction of protein-protein interactions using AlphaFold2. Nat. Commun. 13, 1265 (2022). doi: 10.1038 / s41467-022-28865-w; pmid: 35273146

43. S. G. Choi et al., Maximizing binary interactome mapping with a minimal number of assays. Nat. Commun. 10, 3907 (2019). doi: 10.1038 / s41467-019-11809-2; pmid: 31467278

44. Y.-C. Chen, S. V. Rajagopala, T. Stellberger, P. Uetz, Exhaustive benchmarking of the yeast two-hybrid system. Nat. Methods 7, 667–668 (2010). doi: 10.1038 / nmeth0910-667; pmid: 20805792

45. V. J. Heintz, L. Wang, D. J. LaCount, NanoLuc luciferase as a quantitative yeast two-hybrid reporter. FEMS Yeast Res. 21, foab069 (2021). doi: 10.1093 / femsyr / foab069; pmid: 34940882

46. X. Peng, J. Wang, W. Peng, F.-X. Wu, Y. Pan, Protein-protein interactions: Detection, reliability assessment and applications. Brief. Bioinform. 18, 798–819 (2017). pmid: 27444371

47. P. Braun et al., An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods 6, 91–97 (2009). doi: 10.1038 / nmeth.1281; pmid: 19060903

48. P. Magini et al., Loss of SMPD4 causes a developmental disorder characterized by microcephaly and congenital arthrogryposis. Am. J. Hum. Genet. 105, 689–705 (2019). doi: 10.1016 / j.ajhg.2019.08.006; pmid: 31495489

49. D. Yu, C. Cattoglio, Y. Xue, Q. Zhou, A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Res. 47, 4462–4475 (2019). doi: 10.1093 / nar / gkz162; pmid: 30864669

50. F. Glenewinkel et al., The adaptor protein DCAF7 mediates the interaction of the adenovirus E1A oncoprotein with the protein kinases DYRK1A and HIPK2. Sci. Rep. 6, 28241 (2016). doi: 10.1038 / srep28241; pmid: 27307198

51. Y. Miyata, E. Nishida, Identification of FAM53℃ as a cytosolic-anchoring inhibitory binding protein of the kinase DYRK1A. Life Sci. Alliance 6, e202302129 (2023). doi: 10.26508 / Isa.202302129; pmid: 37802655

52. D. Polioudakis et al., A single-cell transcriptomic atlas of human neocortical development during mid-gestation. Neuron 103, 785–801.e8 (2019). doi: 10.1016 / j.neuron.2019.06.011; pmid: 31303374

53. A. Bhaduri et al., An atlas of cortical arealization identifies dynamic molecular signatures. Nature 598, 200–204 (2021). doi: 10.1038 / s41586-021-03910-8; pmid: 34616070

54. R. Oughtred et al., The BioGRID database: A comprehensive biomedical resource of curated protein, genetic, and chemical interactions. Protein Sci. 30, 187–200 (2021). doi: 10.1002 / pro.3978; pmid: 33070389

55. J. Xiang et al., DYRK1A regulates Hap1-Dcaf7 / WDR68 binding with implication for delayed growth in Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1224–E1233 (2017). doi: 10.1073 / pnas.1614893114; pmid: 28137862

56. Q. Wang et al., WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 33, 206–214 (2018). doi: 10.1016 / j.scr.2018.10.023; pmid: 30448639

57. M. Lasser et al., Pleiotropy of autism-associated chromatin regulators. Development 150, dev201515 (2023). doi: 10.1242 / dev.201515; pmid: 37366052

58. H. R. Willsey et al., The neurodevelopmental disorder risk gene DYRK1A is required for ciliogenesis and control of brain size in Xenopus embryos. Development 147, dev189290 (2020). doi: 10.1242 / dev.189290; pmid: 32467234

59. A. Jourdon et al., Modeling idiopathic autism in forebrain organoids reveals an imbalance of excitatory cortical neuron subtypes during early neurogenesis. Nat. Neurosci. 26, 1505–1515 (2023). doi: 10.1038 / s41593-023-01399-0; pmid: 37563294

60. S. Frendo-Cumbo et al., DCAF7 regulates cell proliferation through IRS1-FOXO1 signaling. iScience 25, 105188 (2022). doi: 10.1016 / j.isci.2022.105188; pmid: 36248734

61. S. Najas et al., DYRK1A-mediated cyclin D1 degradation in neural stem cells contributes to the neurogenic cortical defects in Down syndrome. EBioMedicine 2, 120–134 (2015). doi: 10.1016 / j.ebiom.2015.01.010; pmid: 26137553

62. A. Recasens et al., Global phosphoproteomics reveals DYRK1A regulates CDK1 activity in glioblastoma cells. Cell Death Discov. 7, 81 (2021). doi: 10.1038 / s41420-021-00456-6; pmid: 33863878

63. V. Graham, J. Khudyakov, P. Ellis, L. Pevny, SOX2 functions to maintain neural progenitor identity. Neuron 39, 749–765 (2003). doi: 10.1016 / S0896-6273(03)00497-5; pmid: 12948443

64. N. C. Hettige et al., FOXG1 dose tunes cell proliferation dynamics in human forebrain progenitor cells. Stem Cell Reports 17, 475–488 (2022). doi: 10.1016 / j.stemcr.2022.01.010; pmid: 35148845

65. S. F. Bellmaine et al., Inhibition of DYRK1A disrupts neural lineage specification in human pluripotent stem cells. eLife 6, e24502 (2017). doi: 10.7554 / eLife.24502; pmid: 28884684

66. K. E. Samocha et al., Regional missense constraint improves variant deleteriousness prediction. bioRxiv 148353 [Preprint] (2017); https: / doi.org / 10.1101 / 148353.

67. E. L. Huttlin et al., The BioPlex Network: A systematic exploration of the human interactome. Cell 162, 425–440 (2015). doi: 10.1016 / j.cell.2015.06.043; pmid: 26186194

68. M. Y. Hein et al., A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances. Cell 163, 712–723 (2015). doi: 10.1016 / j.cell.2015.09.053; pmid: 26496610

69. A. Calderone, L. Castagnoli, G. Cesareni, mentha: A resource for browsing integrated protein-interaction networks. Nat. Methods 10, 690–691 (2013). doi: 10.1038 / nmeth.2561; pmid: 23900247

70. K. Luck et al., A reference map of the human binary protein interactome. Nature 580, 402–408 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2188-x; pmid: 32296183

71. G. G. Tall, A. M. Krumins, A. G. Gilman, Mammalian Ric-8A (synembryn) is a heterotrimeric Gα protein guanine nucleotide exchange factor. J. Biol. Chem. 278, 8356–8362 (2003). doi: 10.1074 / jbc.M211862200; pmid: 12509430

72. C. A. Pearson et al., Foxp1 regulates neural stem cell self-renewal and bias toward deep layer cortical fates. Cell Rep. 30, 1964–1981.e3 (2020). doi: 10.1016 / j.celrep.2020.01.034; pmid: 32049024

73. C. Bacon et al., Brain-specific Foxp1 deletion impairs neuronal development and causes autistic-like behaviour. Mol. Psychiatry 20, 632–639 (2015). doi: 10.1038 / mp.2014.116; pmid: 25266127

74. X. Li et al., Foxp1 regulates cortical radial migration and neuronal morphogenesis in developing cerebral cortex. PLOS ONE 10, e0127671 (2015). doi: 10.1371 / journal.pone.0127671; pmid: 26010426

75. A. Ortiz et al., Cell type-specific roles of FOXP1 in the excitatory neuronal lineage during early neocortical murine development. Cell Rep. 44, 115384 (2025). doi: 10.1073 / pnas.1315710110; pmid: 24277810

76. T. Kadoshima et al., Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 20284–20289 (2013). doi: 10.1073 / pnas.1315710110; pmid: 24277810

77. B. Paulsen et al., Autism genes converge on asynchronous development of shared neuron classes. Nature 602, 268–273 (2022). doi: 10.1038 / s41586-021-04358-6; pmid: 35110736

78. H. R. Willsey et al., Parallel in vivo analysis of large-effect autism genes implicates cortical neurogenesis and estrogen in risk and resilience. Neuron 109, 788–804.e8 (2021). doi: 10.1016 / j.neuron.2021.01.002; pmid: 33497602

79. H. S. Kaya-Okur et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat. Commun. 10, 1930 (2019). doi: 10.1038 / s41467-019-09982-5; pmid: 31036827

80. D. Trudler et al., Dysregulation of miRNA expression and excitation in MEF2℃ autism patient hiPSC-neurons and cerebral organoids. Mol. Psychiatry 30, 1479–1496 (2025). doi: 10.1038 / s41380-024-02761-9; pmid: 39349966

81. F. P. McCready et al., Hypersynchronous iPSC-derived SHANK2 neuronal networks are rescued by mGluR5 agonism. Stem Cell Reports 20, 102718 (2025). doi: 10.1016 / j.stemcr.2025.102718; pmid: 41270748

82. C. Loveday et al., Mutations in the PP2A regulatory subunit B family genes PPP2R5B, PPP2R5℃ and PPP2R5D cause human overgrowth. Hum. Mol. Genet. 24, 4775–4779 (2015). doi: 10.1093 / hmg / ddv182; pmid: 25972378

83. A. J. Willsey et al., The Psychiatric Cell Map Initiative: A convergent systems biological approach to illuminating key molecular pathways in neuropsychiatric disorders. Cell 174, 505–520 (2018). doi: 10.1016 / j.cell.2018.06.016; pmid: 30053424

84. I. lossifov et al., The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature 515, 216–221 (2014). doi: 10.1038 / nature13908; pmid: 25363768

85. S. J. Sanders et al., Insights into autism spectrum disorder genomic architecture and biology from 71 risk loci. Neuron 87, 1215–1233 (2015). doi: 10.1016 / j.neuron.2015.09.016; pmid: 26402605

作者感谢 T. Tolpa 和 A. Olmsted 在图表图形设计方面提供的支持，以及精神病学细胞图谱计划（Psychiatric Cell Map Initiative, PCMI; U01MH115747）的所有成员所提供的宝贵讨论与支持。T.J.N. 是纽约干细胞基金会罗伯逊神经科学研究员（New York Stem Cell Foundation Robertson Neuroscience Investigator），H.R.W. 是 Biohub–旧金山研究员。作者在准备本手稿期间使用了 ChatGPT-3 和 Gemini 来缩减文本部分。在使用该工具和服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版内容承担全部责任。资金支持：本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目包括 U01MH115747（授予 N.J.K.、A.J.W.、M.W.S.、T.I. 和 T.J.N.）、U01MH116487（授予 A.J.W. 和 M.W.S.）、10T2OD032742（授予 N.J.K. 和 T.I.）、U54CA274502（授予 N.J.K. 和 T.I.）、R01MH128364（授予 T.J.N.）、R01NS123263（授予 T.J.N.）、SF810018（授予 T.J.N.）、R25MH060482（授予 N.J.K.、A.J.W.、M.W.S.、T.I. 和 T.J.N.）以及 DP2OD040906（授予 H.R.W.）；Weill 神经科学研究所启动资金（授予 A.J.W.）；Weill 神经科学研究所先驱奖（Trailblazer Award，授予 A.J.W.）；Weill 神经科学研究所 Weill 临床科学家奖（授予 B.W.）；QBI Bold and Basic 奖（授予 A.J.W.）；加利福尼亚再生医学研究所（CIRM）DISC4-16322（授予 T.J.N. 和 N.J.K.）；Overlook 国际基金会（授予 M.W.S. 和 A.J.W.）；Schmidt Futures（授予 T.J.N.）；William K. Bowes, Jr. 基金会（授予 T.J.N.）；以及 Sorensen 基金会儿童与青少年精神病学职业奖（授予 B.W.）。作者贡献：N.J.K. 为首席联系人。概念化：M.W.S.、N.J.K.；方法论：B.W.、R.V.、Z.Z.C.N.、K.M.H.、B.J.P.、A.B.、M.B.、U.C.、J.A.K.、L.S.、D.L.S.、T.J.N.、R.H.、A.J.W.；软件：B.W.、Z.Z.C.N.、K.M.H.、B.J.P.、A.B.、M.B.、Y.Zh.、J.M.、K.Z.G.、P.W.、M.C.、M.G.、D.F.B.、S.A.、P.P.、D.P.；验证：B.W.、R.V.、K.M.H.、B.J.P.、P.K.、M.D.S.、A.V.K.；形式分析：B.W.、R.V.、Z.Z.C.N.。

让您的知识绽放

立即访问《科学》定制出版（Science Custom Publishing）网站，通过丰富的手册、播客、海报、赞助专题和网络研讨会来增长您的知识！

手册

播客

海报

赞助专题

网络研讨会

由《科学》 / AAAS 定制出版办公室为您提供。

Science AAAS

扫描二维码，开始探索科学与技术创新的最新进展！

加拿大西部诱发地震中的前震生产率与破裂成核

Bei Wang*, Honn Kao*, Hongyu Yu*, Yan Jiang, Qiang Lin, Wenli Zhang, Jun Hua, Yushi Bai, Zhilong Chen, Peng Zhang, Ya Liu, Ryan Visser

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aed9893

引言：与水力压裂（HF）及其他地下流体作业相关的诱发地震（IIEs）为地震灾害缓解带来了日益严峻的挑战。红绿灯协议（TLP）是许多缓解诱发地震风险的监管框架的核心。TLP 的运行效能取决于一个假设，即破坏性的主震之前会出现可检测到的前震，从而为修改或停止流体注入提供关键的时间窗口。然而，这一假设的有效性，特别是考虑到前震生产率的变异性以及支配诱发地震成核的底层断层加载过程，仍然缺乏足够的约束。

基本原理：区分前震生产率与主震对于短期预测和工业风险管理至关重要。我们研究了加拿大西部沉积盆地中水力压裂诱发地震之前的前震活动。利用 2014 年至 2024, 年的连续波形数据，我们构建了一个包含约 70,000 次地震的增强目录，并识别出 77 次局部震级 $(M_{\mathrm{L}})\geq 3$ 的水力压裂诱发主震。在操作定义上，我们将前震定义为在每次主震前 $5\mathrm{km}$ 范围内且 5 天内发生的事件，这与 TLP 的决策时限相匹配。我们结合了注入记录、地震产生指数（SI）制图、动态触发分析、地质力学和地震震源参数、干涉合成孔径雷达（InSAR）形变测量、重复地震和混合频率波形地震（EHW）诊断以及库仑应力建模。这些分析共同使我们能够约束前震的时间、前震生产率的区域控制因素，以及从前震到主震破裂过渡期间由流体介导的断层加载过程。

结果：在加拿大西部的 $M_{L} \geq 3$ 诱发主震之前，前震普遍存在。77 次主震中有 71 次（约 92%）在操作定义的 5 天、5-km 窗口内伴有前震。这些模式以时间集中和速率加速为特征，在不同的时空窗口下均具有鲁棒性，且不能仅用背景变异性来解释。

然而，前震生产率的差异极大，从没有前震到超过 700 次事件不等。流体注入是启动这些序列的必要条件，但不能单独解释这种变异性：注入速率和累积体积与前震生产率之间没有明显的一阶关系。相反，丰富的前震集中在高 SI 区域和具有动态触发证据的单元中，这与单位注入体积的强地震响应以及处于临界应力状态的断层片相一致。没有动态触发的低 SI 区域倾向于产生极少或没有前震。

针对特定序列的分析表明，诱发前震通过三种流体介导的加载路径触发主震。在“流体驱动且震源不对称面弱化”的预滑移模型中，无震滑动和前震同时发生在最终破裂片内部及其周围，随着破裂区被弱化而逐渐对其加载。在“流体驱动且震源不对称面完整”的预滑移模型中，无震滑动和附近的前震加载一个锁定片，该锁定片在失效前基本保持完整。在“流体驱动级联触发”模型中，迁移的

加拿大西部的诱发地震事件（IIEs）的前震生产率与流体介导的破裂成核。(A) 在 $77$ 次 $M_{L} \geq 3$ 的水力压裂（HF）诱发主震中，有 71 次在主震前出现了前震；柱状图高度表示 5 天、5 公里操作窗口内的前震数量，阴影部分显示地震指数。(B) 三条推断路径：伴随源区不均匀体（asperity）弱化的流体驱动预滑移、伴随源区不均匀体完好的流体驱动预滑移，以及流体驱动级联。LOS，视线；Repeating Eq.，重复地震；Eq.-Eq. interaction，地震间相互作用。

前震通过在孔隙压力扩散的辅助下产生的地震间相互作用，增加了最终震源处的库仑应力。包括 InSAR、重复地震、EHWs 以及精确的震源重定位在内的多项观测结果有助于约束这些模型。

结论：前震的高流行率支持了交通灯协议（TLP）的一个核心假设，但其高度可变的生产率表明，预警能力在空间上是有条件的。前震丰富的区域可能提供有用的短期预警，但同时也需要对误报进行妥善管理；而低生产率区域可能会在实时地震监测几乎没有预警的情况下产生更大规模的事件。这些结果表明，对于某些区域而言，主动规避可能是减轻诱发地震风险的一种有效策略。TLP 的决策应根据地震易感性、实时地震-大地测量观测以及基于物理的成核模型来确定区域条件，以约束演化的断层加载并指导操作响应。□

诱发地震

加拿大西部注入诱发地震的前震生产率与破裂成核

Bei Wang $^{1}$ , Honn Kao $^{2}$ , Hongyu Yu $^{3*}$ , Yan Jiang $^{2}$ , Qiang Lin $^{4}$ , Wenli Zhang $^{1}$ , Jun Hua $^{5}$ , Yushi Bai $^{1}$ , Zhilong Chen $^{1}$ , Peng Zhang $^{1}$ , Ya Liu $^{1}$ , Ryan Visser $^{2}$

前震活动是交通灯协议（TLP）中减轻注入诱发地震（IIEs）地震风险的关键考量因素。然而，IIE 前震的地震成核过程仍不为人所知。利用增强的加拿大西部目录（2014–2024），我们分析了 77 个 IIE 序列，以统计界定局部震级（ $M_{L}$ ）≥ 3 主震之前的前震模式。我们发现 92% 的主震之前有前震，且前震的生产率和时空模式反映了流体注入、地震指数与断层应力状态之间的相互作用。针对特定序列的分析阐明了三种成核模型：伴有弱化震源粗糙度的流体驱动预滑移、伴有完整震源粗糙度的流体驱动预滑移以及流体驱动级联，突显了流体在主震破裂前促成无震滑移和事件间应力传递中的核心作用。这些结果表明，IIE 监测策略应根据前震生产率在空间上进行条件化调整。

注入诱发地震（IIEs）是指与水力压裂（HF）、废水处置、地热开发或碳封存相关的地震事件，由于其发生频率增加且偶尔升级为破坏性震级，引起了公众和监管机构的广泛关注。几起震级 $\geq5$ 的 IIE 已导致附近社区的结构损坏 (1-3)。作为回应，大多数监管机构采取了缓解策略，并实施了交通灯协议（TLP）作为管理诱发地震风险的工具 (4-7)。然而，TLP 的核心假设是：(i) 潜在的破坏性地震之前会有较小的事件（前震）；(ii) 在检测到此类前震时停止注入操作可以降低随后发生（推测为更大规模的）主震的可能性。尽管人们对 IIE 的震源过程了解日益增加 (8-10)，但 IIE 前震的发生模式仍缺乏有效约束，且这些操作假设的有效性尚未经过系统评估。

更广泛地说，前震被广泛认为是大型地震最具有信息量的短期前兆之一 $(11-14)$，但将其与主震破裂成核联系起来的物理机制仍未得到充分解决。通常引用两种极端模型：预滑移模型，其中无震滑移逐渐加载成核区 $(12, 14)$；以及级联模型，其中地震到地震的触发驱动剪切位错向最终主震进行时空迁移 (11, 15)。特别是对于预滑移模型，由于预滑移信号的微妙性质、观测能力的限制以及多种前震产生过程的共存，大多数大型地震仍缺乏直接的观测证据 (11, 13, 16, 17)。阐明这些过程对于改进短期地震预报和增强灾害缓解策略至关重要 (13, 18, 19)。在仪器配备完善且操作可控的环境中发生的 IIE，可为系统地探测和验证地震成核过程提供理想场所。

西加拿大沉积盆地（WCSB）是全球非常规油气资源产量最高的地区之一，该地区的大多数诱发地震（IIEs）与水力压裂（HF）刺激相关 $(20)$。为了应对与水力压裂相关的诱发地震的大幅增加，区域监测网络在过去十年中得到了显著的扩展和增强 $(21)$。区域地震数据在质量和数量上的显著提升，使得能够以前所未有的分辨率检测并定位诱发地震的前震活动，这为研究诱发地震前震的发生模式及其对主震震源过程的影响提供了绝佳机会。

在本研究中，我们利用十年的连续波形数据，来表征 WCSB 中重大诱发地震 [当地震级 $(M_{\mathrm{L}}) \geq 3$，由水力压裂诱发] 之前的前震模式。我们测量了在这些主震之前、与操作相关的时间窗内，可检测事件发生的频率，并测试了前震生产力在整个区域内是否有所不同。随后，我们评估了这种变异性是否能由操作和地质力学因素来解释，包括注入活动、注入地震响应（通过震源指数，即 SI 来量化）、源断层的应力状态以及主震的震源特性。最后，我们检查了将前震活动与破裂启动联系起来的特定序列断层加载过程，以评估为构造地震开发的概念性“前震-主震”框架是否适用于诱发地震，并将交通灯协议（TLP）的关井指令置于一个机械且可验证的语境中。

WCSB 地区 $M_{L} \geq 3$ 的诱发地震（IIE）主震前通常伴有前震

为了测试交通灯协议（TLP）的一个关键假设，即 IIE 主震之前会出现前震，我们结合使用了 EQTransformer (22) 和基于导航自动相位拾取（S-SNAP）方法的地震活动扫描法 (23)，对当地地震站记录的连续地震波形进行分析，以搜寻 2014–2024 年间在西加拿大沉积盆地（WCSB）发生的地震。针对研究区域建立了一个包含 $\sim$ $ 70,000 个事件的目录，其中蒙特尼油气田北部（NMP）、蒙特尼油气田南部（SMP）和阿尔伯塔省西部的估计完备震级（$M_{c}$）分别为 1.0, 0.7, 和 1.2（图 1, 1A，图 S1 及补充文本 S1）。

我们首先识别了在时空上与水力压裂（HF）作业相关的主震，并排除了余震以及在较大事件之前发生的较小地震（图 S2）；随后，我们将分析范围限制在 $M_{L} \geq 3$ 的主震，因为这一震级范围在 TLP 下具有操作可执行性（例如，SMP 的 M 3 红灯），并且能够进行详细的单序列特征分析（补充文本 S2.1）。总体而言，我们在研究期间在 WCSB 地区共获取了 $77 个 $M_{L} \geq 3$ 的主震（图 1A 和表 S1）。

我们定义了一个 5 公里和 5 天的时空窗口，将前震与选定的 77 个主震中的每一个相关联。我们是在操作性的、回顾性的意义上使用“前震”一词，用以表示在每个 $M_{L} \geq 3$ 主震之前、且处于该规定时空窗口内发生的地震。这种用法反映了一种基于窗口的定义，旨在与大多数 TLP 保持一致，因为监管行动必须依赖于实时观测。采用 5 公里和 5 天的时空窗口是基于操作相关性和 TLP 短暂的决策周期（例如，监管机构要求在 NMP 和 SMP 发生红灯事件后停工 5 天）。为了确保我们的结论不对这一选择敏感，我们还进行了敏感性分析，纳入了更长且更大的时空窗口（5 到 30 天以及 5 到 10 公里）、对局部背景地震活动的月度尺度诊断，以及基于作业条件的临时零假设检验（补充文本 S2 和 S3）。为了进一步提高前震检测的完备性，我们采用了模板匹配法来识别每个主震之前未被记录的事件（补充文本 S4）。

图1. 2014–2024年加拿大西部沉积盆地（WCSB）中与诱发地震事件（IIEs, $M_{L} \geq 3$）相关的前震活动。(A) 研究区域地图，涵盖北部蒙特尼油气田（NMP）、南部蒙特尼油气田（SMP）和阿尔伯塔省西部。本研究分析的 77 次主震的空间分布（彩色星号），以及地震台站（蓝色三角形）。主震的颜色与图例（底部表格）中列出的标识符相对应。右上角插图显示了 WCSB 的研究区域（黑色轮廓）；粉色轮廓的插图显示了位于 NMP 的主震放大图。红线和蓝线分别标出了蒙特尼组（Fm.）和杜弗奈组的边界，这两者在 1500 至 3500 米以及 2500 至 4000 米的深度进行商业开发 (54,55)。(B) 累积前震计数（在每次主震前 5 公里和 5 天的窗口内）。配色方案与 (A) 一致。红色垂直虚线标出主震发生的时间。(插图) 77 次主震在 5 天内的前震计数直方图（30 天窗口的数据见图 S11）。(C) 每次主震前 5 天的累积前震矩。每条线代表一个序列，配色方案与 (A) 一致。(插图) 在 5 天和 5 公里的时空窗口内，至少有一个震级高于规定阈值的前震在先的主震比例。

前震在 WCSB 中普遍存在，77 次主震中有 71 次（$\sim92\%$）在之前的 5 天内伴有前震（图 1B）。这种普遍性在区域上同样成立：NMP 的 53 次主震中有 50 次（$\sim94\%$）、SMP 的 8 次主震中有 7 次（$\sim88\%$）以及阿尔伯塔省西部的 16 次主震中有 14 次（$\sim88\%$）伴有前震。大约 70% 的主震之前至少有一个 $M_{L} \geq 2$ 的前震（且 $\sim90\%$ 之前至少有一个 $M_{L} \geq 1$ 的前震；图 1℃）。无论时空窗口如何（5 至 30 天；5 至 10 公里），敏感性分析均得出一致结果（补充文本 S2 和图 S3 至 S5）。这些观察结果也与仅含背景噪声的零模型不相符，因为该模型预测的具有前置事件的 $M_{L} \geq 3$ 主震数量要少得多，且在最后 5 天内没有类似的比率增加。此外，基于操作条件的临时零检验结果表明，这种高普遍性不仅反映了先前事件的存在，而是反映了与水力压裂（HF）相关的序列产出被压缩到短期的活跃区间内，表现为在前置的、具有操作相关性的固定时间窗口内，前震在时间上的集中和速率的加速（补充文本 S3 和图 S6 至 S8）。

然而，前震的产出在不同主震之间存在显著差异。例如，2020 年 9 月 11 日发生的 $M_{L}$ 3.3 事件（事件编号 21）之前有 700 多个前震，而大多数其他主震之前的前震少于 100 个，差异近 10 倍（图 1B 和表 S1）。因此，我们的观察结果强调了水力压裂诱发主震在前震产出方面存在强烈的序列间差异。

影响前震发生模式的物理因素

为了分离并绘制影响诱发地震（IIE）前震发生的物理控制因素，我们研究了构造前震中常用的经典因素以及诱发注入系统特有的因素。

注入是必要条件，但不足以解释前震的生产率

流体注入从根本上将诱发地震与构造地震区分开来，它通过提高孔隙压力、传递孔隙弹性应力以及促进无震滑动，在地震发生过程中发挥重要作用 (10, 24–28)。为了探究流体注入与诱发地震前震发生模式之间的关系，我们搜索了在预定义时空窗口内进行的液压压裂（HF）刺激。

对于有前震伴随的主震，这些事件与流体注入活动表现出明显的时空相关性（图 S9 至 S11），尽管液压压裂刺激与前震序列开始之间的时间滞后可能从几天到几周不等。注入参数（如注入速率和累积体积）在不同主震之间大致相当，与前震生产率或主震震级之间没有明显的一阶关系。在 NMP 和 SMP 区域内，前震丰富的序列似乎聚集在特定的注入深度区间，尽管这些区间并非前震丰富行为所独有（图 S12）。因此，尽管流体注入是触发诱发地震序列的必要条件，但观察到的前震行为变异性表明，在成核过程中还存在其他控制因素。

SI 绘制前震敏感性图谱

我们利用 SI (29, 30) 对注入流体引起的地下地震响应进行了量化。 衡量的是单位注入体积的地震活动生产率，较高的 意味着超过预设震级阈值的可能性更高 (30)。在我们研究区域内，每个 $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ 网格（见材料与方法）的 值显示， 可能与前震的生产率相对应（图 2A）。

具体而言，六次缺乏前震的主震（事件编号 4, 14, 25, 38, 64 和 69）位于 值相对较低（-2.5 至 -3.4）的区域。这些低 区域还分布着大多数前震较少的主震。相比之下，前震活动丰富的主震倾向于发生在 较高的区域，例如 SMP 南部、NMP 中部以及阿尔伯塔省中西部（ 为 -1.8 至 -2.1）。

先前的研究表明，相对较高的 值可能与该地区的特定地质结构有关，例如 Montney 产区的 Fort St. John 地堑复合体 (31) 以及 Duvernay 产区的 Leduc 礁和喀斯特结构 (32, 33)，这些结构与增强的断层异质性一致。此外，在不列颠哥伦比亚省东北部 (NEBC) 特定注入深度（图 S12）出现的前震丰富序列集群，有助于识别具有高度地震潜力的地层或结构域，例如中下 Montney 地层 (34)。因此，观察到的 与前震之间的关系支持了这样一种观点，即在注入诱发环境下，断层异质性调节着前震的敏感性。

图 2. 主震位置（ $M_{L} \geq 3$ ）、相关前震丰度及潜在控制因素图。(A) 带有前震的主震以星号表示；柱状图高度表示前震数量，颜色与图 1 对应。没有前震的主震以矩形表示，其事件编号由粉色圆圈和粉色箭头标出。背景阴影代表每个 $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ 网格（见材料与方法）内计算出的地震指数 () 值。（插图）每个事件的前震数量（ $M \geq M_{c}$ ，其中 $M_{c}$ 表示区域完备震级）与累积流体注入量（用于计算 值）的双对数图。所有插图共享相同的轴定义、单位和范围（标注在左下角插图中）。(B) 与 (A) 类似，但背景阴影显示每个网格内动态触发的 $\beta$ 值。顶部插图（地球仪）标出了选定的远震事件位置。下方三个插图展示了围绕三次远震地震的详细时间地震分布，包括 SMP 南部（ $\beta > 10$ ；2019 年 M 6.4 阿拉斯加事件，其中该网格内的四次主震表现出 >300 次前震：事件编号 9, 19, 21 和 40）、NMP 中部（ $\ \sim 4.2$ ；2018 年 M 6.8 温哥华岛事件）以及阿尔伯塔省中西部（ $\ \sim 4$ ；2017 年 M 7.7 指挥官群岛事件）；每个网格中的虚线标出了这三次远震事件发生的时间。每个网格中的 $\$ 值源自不同的远震事件。

动态触发探测震源断层的应力状态

动态触发在探测断层面沿线的应力状态方面已有详尽记录，特别是对于接近临界状态的断层片区（35–37）。在受流体注入影响的区域，动态触发的出现可能表明，大量断层片区已被注入相关的加载过程推至接近失效的状态。应力状态的变化会使它们容易受到来自远震地震的小规模瞬时应力扰动而触发地震滑动（38–40）。

在此，我们在 $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ 的网格单元中（图 2B 及材料与方法）使用 $\beta$ 值 >2 作为动态触发的统计证据（37, 41, 42）。值得注意的是，显示出动态触发证据的三个网格单元在空间上与几乎所有具有丰富前震特征的主震震源区相重合（图 2B 以及图 S13 和 S14）。特别是，位于 $\beta$ 值最高的南部 SMP 网格单元内的所有四次主震均有超过 300 次前震。相比之下，伴随少量或无前震的主震通常位于缺乏动态触发证据的区域。这种正相关关系表明，断层应力状态是决定前震产出率的另一个关键因素。

地震震级、深度、断层类型以及区域热流（补充文本 S5）等变量与 IIE 前震的总数之间没有显示出明显的关联（图 S15 至 S19）。

与 IIE 前震相关的断层加载过程

交通灯协议（TLP）的一个关键假设是，停止注水作业可以降低随后发生潜在更大规模主震的可能性。这一假设取决于操作变更是否能修改断层加载轨迹，并延迟甚至阻止破裂核化；而这反过来又要求识别将前震与主震破裂启动联系起来的断层加载过程。用于解释构造前震的级联模型（cascade models）和预滑移模型（preslip models）能否充分解释 IIE 主震的加载过程仍是一个开放性问题，因为流体注入引入了诱发地震特有的物理过程，而这些过程并不一定存在于所有构造事件中。为了解决这个问题，我们检查了前震的时空分布，寻找了无震滑移（aseismic slip）的特征，并对主震震源处由同震滑移和流体注入共同引起的库仑应力变化（$\Delta$ CFS）进行了建模（材料与方法）。

我们首先使用干涉合成孔径雷达（InSAR）来检测表明无震滑移的地面变形，以此作为预滑移模型的证据 $(43)$。在 InSAR 约束有限的情况下，我们通过短时间间隔（分钟到天）内重复前震的出现来推断无震滑移，因为无震滑移可以在极短的时间内恢复同一区域重复破裂所需的应力水平 $(12)$。此外，我们在单个前震序列中寻找具有混合频率波形（EHWs）的地震，这是新近被认可的地震信号，体现了流体注入环境下从无震滑移到有震滑移的转变 $(44)$。

直接预滑移与多个 IIE 序列相关，在这些序列中，主震前由 InSAR 观测到的地面变形（与无震滑移一致）得到了清晰的解析（例如，事件 no. 28, 和 45；图 3, A 和 B）。无震滑移事件 no. 28 和 45 的地震矩分别对应约矩震级（$M_{\mathrm{w}}$）5.0 和 $M_{\mathrm{w}}$ $ 3.8, 的等效震级，在各自主震的震源处产生了 $\sim 10$ kPa 和 $\sim 0.4$ kPa 的库仑应力增加（图 S20 和 S21 以及补充文本 S7）。此外，频谱比分析得出主震的破裂半径分别为 $\sim 210$ m 和 $\sim 230$ m（补充文本 S6）。这些估计表明，相对位置不确定度在 $100\mathrm{m}$ 量级的多个重新定位前震落在事件 no. 28 的推断破裂区内，而事件 no. 45 的破裂区内则无法解析出前震。

相比之下，从 InSAR 观测结果来看，2020 年 9 月 11 日 $M_{L}$ $ 3.3 主震（事件 no. 21）之前是否发生无震滑移尚无定论。尽管如此，其前震分布在较广的区域（图 3℃），具有重复地震和 EHWs 的特征。与事件 no. 21 相关的几个重新定位前震似乎落在其推断的破裂区内。

同时也观察到了与级联模型一致的序列，尽管其动力学过程明显受到了流体注入的修改。对于 2022 年 9 月 19 日 $M_{L}$ $ 3.3 主震（事件 no. 34），前震发生在主震 $\sim$ $ 2 km 范围内并向西北方向迁移（图 3D）。前震序列期间震源处演化的 $\Delta$ CFS 进一步支持了级联触发过程的解释（补充文本 S7）。此外，我们的数值模拟显示，流体注入引起的 $\Delta$ CFS 在地震发生过程中也起到了重要作用（补充文本 S8 和图 S23）。

由注入流体引起的应力扰动、无震滑动（aseismic slip）的发生以及前震-主震几何结构之间复杂的相互作用表明，传统的前震-主震模型是不充分的。因此，我们形式化了三种导致主破裂的流体介导加载模型：（i）流体驱动的预滑动且源区不均匀体（asperity）被削弱模型（preslip-WSA）；（ii）流体驱动的预滑动且源区不均匀体完好的模型（preslip-ISA）；以及（iii）流体驱动的级联模型，如图 4 示意图所示。

在 -WSA 模型中，前震活动和无震滑动不仅发生在最终主震破裂区周围，还发生在其内部，在破裂发生前逐渐降低断层强度。在这种情景下，前震不仅仅是在主震之前发生，它们还“刺穿”了主震的成核区，创建了局部弱点，从而累积地降低了有效正应力和内聚力，进而使向动态破裂的转变变得更加容易（类似于图 3, A 和 C）。虽然滑动弱化通常被公式化为摩擦力随滑动的本构减少 (45)，但我们的观察表明存在一种斑块尺度的弱化机制，其中离散的前震破裂和无震滑动共同作用以削弱成核区。

对于 -ISA 模型，注入的流体最初在包括主震成核区在内的扩展区域 $(12, 14)$ 促进无震滑动。至关重要的是，主震斑块本身在很大程度上保持锁定且在机械上完好。随着加载的继续，锁定斑块周围的无震滑动和附近的前震提高了斑块内的 $\Delta$ CFS，驱动其超过临界状态（也称为成核阈值；图 3B）。

相比之下，对于流体驱动的级联模型，流体注入最初促进了一个小事件的破裂，随后通过连续的静态应力传递触发额外的前震，并最终触发主震（图 3D）。

没有任何前震的序列难以用级联模型和 -WSA 模型来解释，因为这两者都需要前置的前震活动来加载和 / 或削弱源区。在这种情况下，-ISA 模型提供了一个更合理的解释。例如，事件 no. 4（2015 年 8 月 17 日 $M_{L}$ 4.6）没有检测到前震，但解析出了与该序列相关的地表形变信号。尽管干涉图跨越了主震，因此可能包含一些同震位移，但我们的反演结果倾向于一次无震滑动事件（图 S24），这与 -ISA 的解释一致。

在本研究涵盖的 77 个案例中，5 个可归类为 -WSA，23 个为 -ISA，28 个为级联序列（表 S1）。然而，由于观测限制，例如 InSAR 可检测的地表形变不足，以及地震网络覆盖稀疏且波形质量有限，有 21 个案例无法自信地归入上述任何一种拟议模型。

对 TLP 和 IIE 风险管理的启示

在大多数观察到的 IIE 序列中广泛存在的前震，支持了 TLP 的核心假设——即持续监测通常能在较大的主震发生前提供可检测的短期预警。

C

D 图 3. 诱发主震前由前震控制成核的直接 InSAR 观测和地震证据。(A) 事件 28 号。(左) 主震前 2021 年 12 月 15 日至 27 日的 Sentinel-1 上行干涉图（第二幅 Sentinel-1 图像在主震前约 19.5 小时获取）。颜色表示视线（LOS）位移（蓝色到红色；单位见色标）。紫色星号标记主震震中；灰色圆圈表示重复前震。HF well，水力压裂井；cc，互相关系数。(右上) 重复前震和具有混合频率波形（EHWs）地震的示例。(右下) 使用频谱比方法估算的主震破裂半径（补充文本 S6）；蓝色圆圈是位于主震破裂区内的前震，灰色圆圈位于区外。(B) 事件 45 号的情况与 (A) 相同，不同之处在于主震前在推断的破裂区内未观察到重复前震或 EHW。(左) 2023 年 7 月 2 日至 14 日的 Sentinel-1 上行干涉图。(右上) 使用频谱比方法估算的主震角频率。(C) 事件 21 号通过重复前震和 EHW 推断的无震滑动。(左) 前震分布图，颜色根据相对于主震（紫色星号）的时间而定；黑线表示 HF 井。(右) 面板如图 (A) 所示；角频率估算见图 S22。(D) 事件 34 号通过地震到地震的应力传递实现的级联加载。(左) 按时间顺序编号的前震。Eq.，地震。(右) 主震深度处库仑应力变化 ($\Delta$ CFS) 的演变，在前震序列的连续阶段进行评估（补充文本 S7）。在每次 $\Delta$ CFS 快照之前发生的前震显示为灰色圆圈，而在快照之后发生的前震显示为黑色圆圈。

然而，前震的产出率存在显著差异，这意味着交通灯协议（TLP）策略应根据局部地震发生环境而定。在以低地震指数（SI）且无动态触发证据为特征的区域，我们观察到前震产出率系统性较低甚至为零，在这种情况下，基于前震序列的预警可能非常有限甚至缺失；也就是说，基于序列的预警可能提供的提前量极少，而首次检测到的事件可能已经是规模最大的事件。在这种情景下，TLP 或其他策略在进行监管决策时，不应完全依赖于实时地震信号。相反，诱发地震风险管理应将增强的测地学和地下形变实时监测与更广泛的预防策略相结合，例如在无法接受意外大型事件后果的情况下，采用基于排除或规避的方法 (46)。相反，在高 SI 区域，丰富的前震可能提供可靠的早期预警，但 应明确管理漏报事件与误报之间的权衡。这也凸显了一个内在的矛盾：低 SI 区域通常表现出较低的危险性（这是有利的），但发生无预警大型事件的可能性更高（这构成了相当大的风险）。因此，挑战在于如何平衡低地震活动区域危险性降低的益处与意外大型事件风险增加之间的关系，并设计出既能响应前震概率又能应对潜在的大规模、不可预测破裂的 策略。

在评估 强制要求的注水关井是否能防止随后的大型事件时，三种流体介导的破裂成核模型可提供有用的指导。在级联型序列中， 的有效性取决于关井是否发生在系统进入自维持的“地震触发地震”机制之前；而在流体驱动的预滑移情景中， 关井的实际问题是，减少或停止注水是否能在注水驱动的无震滑移实质性地加载最终主震片区之前将其遏制。理论、数值和水力力学模型表明，注水驱动的无震滑移在关井后仍可能持续并继续传播 (47, 48)；相比之下，实验室注水实验表明，在某些水力及摩擦条件下，关井可以迅速遏制滑移并使断层重新锁定 (49)。这些推论主要源自建模和实验室实验，而工业环境下关井后无震滑移的演化过程仍缺乏足够的约束。

A 前震发生模式：

B 断层加载过程：

图 4. 诱发地震（IIE）中前震发生模式和成核机制的概念模型。(A) 前震产出率的控制因素。（左）情景 1（丰富的前震），具有高 SI 和动态触发证据区域的特征。小圆圈表示潜在的前震片区；最大的圆圈标记最终的主震片区。实心圆表示处于临界应力状态的片区；空心圆表示非临界片区。虚线表示断层；蓝色箭头显示流体迁移和孔隙压力路径。（右）情景 2（极少或无前震），以低 SI 和缺乏动态触发为典型；符号与左图一致。(B) 断层加载与成核模型。（左）具有弱化源区粗糙体的流体驱动预滑移，其中

孔隙压力扩散（蓝色箭头）驱动了主震破裂区（即震源不对称体；虚线椭圆）内部及周围的无震滑动（粉色阴影）和前震活动（灰色星号）。无震滑动由重复地震（Eq.；绿色星号）、慢地震波（EHWs；黄色星号）以及 InSAR 视线方向（LOS）位移所指示。多个前震发生在震源不对称体内部，在失效前逐渐削弱主震斑块。红色星号表示主震的震源。为了清晰起见，无震滑动和地震序列显示在同一个断层面上。（中）具有完整震源不对称体的流体驱动预滑模型，其中注入诱发的无震滑动和附近的前震共同加载主震破裂区。所有可分辨的前震均未发生在震源不对称体内部，这意味着该区域在失效前保持完整且锁定状态。（右）流体驱动级联模型，其中初始的小规模事件通过静态应力传递触发随后的前震，并由孔隙压力扩散（蓝色箭头）辅助，该序列最终以主震破裂而告终。示意图非按比例绘制。Eq.-Eq. Interaction：地震与地震之间的相互作用。

需要开展前瞻性的、操作可控的研究，将密集地震和大地测量监测集成到交通灯协议（TLP）决策框架中，以评估关井效果并改进短期危险预报。

为什么只有部分地震伴有前震的问题仍未解决。我们的结果表明，前震的生产率可能由断层异质性和断层斑块的应力状态共同控制（图 4）。从概念上讲，前震代表了小型断层斑块的失效，类似于普通的微小地震 (11, 13)。在我们的研究区域中，表现出高 SI 的区域可能反映了更高程度的断层异质性，这可能是由具有大量预存断层的特定地质结构引起的 (31–34, 50)。此外，动态触发的出现表明存在大量处于临界应力状态的断层斑块，这种情况可能由与注入相关的应力变化所促进 (36)。综上所述，高前震率需要两个要素：显著的异质性和处于应力状态的断层斑块群体，而缺失其中任何一个条件都可能抑制前震的发生。

关于无震滑动在主震成核中的参与，有三点考虑值得强调。首先，通过 InSAR 直接观测无震滑动在本质上仍然具有挑战性，因为变形信号微小且在空间上较为紧凑。事实上，即使对于较大的构造地震，无震前兆也更多是通过重复地震或系统性的前震迁移推断出来的，而非由 InSAR 直接分辨 (51, 52)。其次，取决于断层与卫星的几何关系，以走滑为主的破裂可能会产生无法分辨的 InSAR 信号 (43)。第三，由于位置的不确定性，我们不能排除无震滑动、前震和主震发生在不同断层结构上的可能性。如果确实如此，流体驱动的无震滑动可能会在断层网络中重新分布应力，并加速相邻结构的失效。

可能还存在其他影响或调节前震生产率的因素 [例如，有界的震级增长 (53)]，并且可能会出现断层加载过程共同促成主震破裂成核的混合场景。总体而言，需要一个更细致的定量框架来评估无震滑动和地震间相互作用在触发诱发主震中的相对作用。

基于观察到的前震模式、其控制因素以及推导出的三种流体介导的破裂成核模型，我们认为，如果监管决策是基于局部和区域地震发生条件的空间变化而非固定的震级阈值，那么交通灯协议（TLP）的效能将得到显著提升。这种基于区域条件的监测策略，结合全面的实时地震和大地测量观测，可以有效地约束应力加载状态并据此指导运行响应。综上所述，通过基于物理的模型（级联模型、预滑移-WSA模型和预滑移-ISA模型）将回顾性指标（地震指数 SI、动态触发）与前瞻性观测（密集阵列、InSAR 和全球导航卫星系统）联系起来，提供了一条从事后解释转向定量短期预测的切实路径，使我们更接近于最大限度减少破坏性诱发地震事件（IIEs）的发生并减轻其相关地震风险的目标。

材料与方法可见补充材料。

参考文献与注释

1. X. Lei, Z. Wang, J. Su, The December 2018 ML 5.7 and January 2019 ML 5.3 Earthquakes in South Sichuan Basin Induced by Shale Gas Hydraulic Fracturing. Seismology. Res. Lett. 90, 1099–1110 (2019). doi: 10.1785 / 0220190029

2. K.-H. Kim et al., Assessing whether the 2017 $M_{w}$ 5.4 Pohang earthquake in South Korea was an induced event. Science 360, 1007–1009 (2018). doi: 10.1126 / science.aat6081; pmid: 29700224

3. K. M. Keranen, H. M. Savage, G. A. Abers, E. S. Cochran, Potentially induced earthquakes in Oklahoma, USA: Links between wastewater injection and the 2011 Mw 5.7 earthquake sequence. Geology 41, 699–702 (2013). doi: 10.1130 / G34045.1

4. H. Kao, R. Visser, B. Smith, S. Venables, Performance assessment of the induced seismicity traffic light protocol for northeastern British Columbia and western Alberta. Leading Edge 37, 117–126 (2018). doi: 10.1190 / tle37020117.1

5. R. Schultz, G. Beroza, W. Ellsworth, J. Baker, Risk-Informed Recommendations for Managing Hydraulic Fracturing-Induced Seismicity via Traffic Light Protocols. Bull. Seismol. Soc. Am. 110, 2411-2422 (2020). doi: 10.1785 / 0120200016

6. R. Schultz, G. C. Beroza, W. L. Ellsworth, A risk-based approach for managing hydraulic fracturing-induced seismicity. Science 372, 504–507 (2021). doi: 10.1126 / science.abg5451; pmid: 33926953

7. W. Zhou et al., Managing Induced Seismicity Risks From Enhanced Geothermal Systems: A Good Practice Guideline. Rev. Geophys. 62, e2024RG000849 (2024). doi: 10.1029 / 2024RG000849

8. P. Segall, S. Lu, Injection-induced seismicity: Poroelastic and earthquake nucleation effects. J. Geophys. Res. Solid Earth 120, 5082–5103 (2015). doi: 10.1002 / 2015JB012060

9. D. W. Eaton, R. Schultz, Increased likelihood of induced seismicity in highly overpressured shale formations. Geophys. J. Int. 214, 751–757 (2018). doi: 10.1093 / gji / ggy167

10. T. S. Eyre et al., The role of aseismic slip in hydraulic fracturing-induced seismicity. Sci. Adv. 5, eaav7172 (2019). doi: 10.1126 / sciadv.aav7172; pmid: 31489366

11. W. L. Ellsworth, F. Bulut, Nucleation of the 1999 Izmit earthquake by a triggered cascade of foreshocks. Nat. Geosci. 11, 531–535 (2018). doi: 10.1038 / s41561-018-0145-1

12. C. Tape et al., Earthquake nucleation and fault slip complexity in the lower crust of central Alaska. Nat. Geosci. 11, 536–541 (2018). doi: 10.1038 / s41561-018-0144-2

13. R. E. Abercrombie, J. Mori, Occurrence patterns of foreshocks to large earthquakes in the western United States. Nature 381, 303–307 (1996). doi: 10.1038 / 381303a0

14. D. A. Dodge, G. C. Beroza, W. L. Ellsworth, Detailed observations of California foreshock sequences: Implications for the earthquake initiation process. J. Geophys. Res. 101 (B10), 22371–22392 (1996). doi: 10.1029 / 96JB02269

15. W. Sun et al., Rupture Cascade Initiated by Wastewater Disposal: Nucleation and Domino Effect of Canada's Largest Induced Earthquake. Geophys. Res. Lett. 53, e2025GL118405 (2026). doi: 10.1029 / 2025GL118405

16. X. Chen, P. M. Shearer, Analysis of Foreshock Sequences in California and Implications for Earthquake Triggering. Pure Appl. Geophys. 173, 133–152 (2016). doi: 10.1007 / s00024-015-1103-0

17. S. Seif, J. D. Zechar, A. Mignan, S. Nandan, S. Wiemer, Foreshocks and Their Potential Deviation from General Seismicity. Bull. Seismol. Soc. Am. 109, 1–18 (2018). doi: 10.1785 / 0120170188

18. L. M. Jones, Foreshocks (1966-1980) in the San Andreas system, California. Bull. Seismol. Soc. Am. 74, 1361–1380 (1984).

19. J. Mori, R. E. Abercrombie, Depth dependence of earthquake frequency-magnitude distributions in California: Implications for rupture initiation. J. Geophys. Res. 102, 15081–15090 (1997). doi: 10.1029 / 97JB01356

20. G. M. Atkinson, D. W. Eaton, N. Igonin, Developments in understanding seismicity triggered by hydraulic fracturing. Nat. Rev. Earth Environ. 1, 264–277 (2020). doi: 10.1038 / s43017-020-0049-7

21. A. M. Farahbod, J. F. Cassidy, H. Kao, D. Walker, Collaborative studies of regional seismicity in northeast British Columbia. Can. Soc. Explo. Gephys. Recorder 39, 40–44 (2014).

22. S. M. Mousavi, W. L. Ellsworth, W. Zhu, L. Y. Chuang, G. C. Beroza, Earthquake transformer—an attentive deep-learning model for simultaneous earthquake detection and phase picking. Nat. Commun. 11, 3952 (2020). doi: 10.1038 / s41467-020-17591-w; pmid: 32770023

23. F. Tan, H. Kao, E. Nissen, D. Eaton, Seismicity-Scanning Based on Navigated Automatic Phase-Picking. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 3802–3818 (2019). doi: 10.1029 / 2018JB017050

24. H. Yu et al., Well Proximity Governing Stress Drop Variation and Seismic Attenuation Associated With Hydraulic Fracturing Induced Earthquakes. J. Geophys. Res. Solid Earth 125, e2020JB020103 (2020). doi: 10.1029 / 2020JB020103

25. G. M. Atkinson et al., Hydraulic fracturing and seismicity in the Western Canada Sedimentary Basin. Seismol. Res. Lett. 87, 631–647 (2016). doi: 10.1785 / 0220150263

26. M. Weingarten, S. Ge, J. W. Godt, B. A. Bekins, J. L. Rubinstein, High-rate injection is associated with the increase in U.S. mid-continent seismicity. Science 348, 1336–1340 (2015). doi: 10.1126 / science.aab1345; pmid: 26089509

27. K. Deng, Y. Liu, R. M. Harrington, Poroelastic stress triggering of the December 2013 Crooked Lake, Alberta, induced seismicity sequence. Geophys. Res. Lett. 43, 8482–8491 (2016). doi: 10.1002 / 2016GL070421

28. H. Yu, R. M. Harrington, Y. Liu, B. Wang, Induced Seismicity Driven by Fluid Diffusion Revealed by a Near-Field Hydraulic Stimulation Monitoring Array in the Montney Basin, British Columbia. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 4694–4709 (2019). doi: 10.1029 / 2018JB017039

29. S. A. Shapiro, C. Dinske, C. Langenbruch, F. Wenzel, Seismogenic index and magnitude probability of earthquakes induced during reservoir fluid stimulations. Leading Edge 29, 304–309 (2010). doi: 10.1190 / 1.3353727

30. R. M. H. Dokht, H. Kao, A. Babaie Mahani, R. Visser, Spatiotemporal analysis of seismotectonic state of injection-induced seismicity clusters in the Western Canada Sedimentary Basin. J. Geophys. Res. Solid Earth 126, e2020JB021362 (2021). doi: 10.1029 / 2020JB021362

31. B. Wang, H. Kao, H. Yu, R. Visser, S. Venables, Physical factors controlling the diverse seismogenic behavior of fluid injections in Western Canada. Earth Planet. Sci. Lett. 589, 117555 (2022). doi: 10.1016 / j.epsl.2022.117555

32. R. Schultz et al., Linking fossil reefs with earthquakes: Geologic insight to where induced seismicity occurs in Alberta. Geophys. Res. Lett. 43, 2534–2542 (2016). doi: 10.1002 / 2015GL067514

33. E. Galloway, T. Hauck, H. Corlett, D. Pană, R. Schultz, Faults and associated karst collapse suggest conduits for fluid flow that influence hydraulic fracturing-induced seismicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E10003–E10012 (2018). doi: 10.1073 / pnas.1807549115; pmid: 30297421

34. B. Wang et al., Unveiling key factors governing seismogenic potential and seismogenic productivity of hydraulic fracturing pads: Insights from machine learning in the Southern Montney Play. Earth Planet. Sci. Lett. 626, 118511 (2024). doi: 10.1016 / j.epsl.2023.118511

35. D. P. Hill et al., Seismicity remotely triggered by the magnitude 7.3 Landers, California, earthquake. Science 260, 1617–1623 (1993). doi: 10.1126 / science.260.5114.1617; pmid: 17810202

36. E. E. Brodsky, N. J. van der Elst, The Uses of Dynamic Earthquake Triggering. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 42, 317–339 (2014). doi: 10.1146 / annurev-earth-060313-054648

37. D. P. Hill, S. G. Prejean, Treatise on Geophysics, G. Schubert, Ed. (Elsevier, 2007), pp. 257–291.

38. N. J. van der Elst, H. M. Savage, K. M. Keranen, G. A. Abers, Enhanced remote earthquake triggering at fluid-injection sites in the midwestern United States. Science 341, 164–167 (2013). doi: 10.1126 / science.1238948; pmid: 23846900

39. A. Peña Castro, S. L. Dougherty, R. Harrington, E. S. Cochran, Delayed dynamic triggering of disposal-induced earthquakes observed by a dense array in northern Oklahoma. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 3766–3781 (2019). doi: 10.1029 / 2018JB017150

40. B. Wang et al., Isolated cases of remote dynamic triggering in Canada detected using cataloged earthquakes combined with a matched-filter approach. Geophys. Res. Lett. 42, 5187–5196 (2015). doi: 10.1002 / 2015GL064377

41. M. V. Matthews, P. A. Reasenberg, Statistical methods for investigating quiescence and other temporal seismicity patterns. Pure Appl. Geophys. 126, 357–372 (1988). doi: 10.1007 / BF00879003

42. P. A. Reasenberg, R. W. Simpson, Response of regional seismicity to the static stress change produced by the Loma Prieta earthquake. Science 255, 1687–1690 (1992). doi: 10.1126 / science.255.5052.1687; pmid: 17749422

43. R. Bürgmann, P. A. Rosen, E. J. Fielding, Synthetic Aperture Radar Interferometry to Measure Earth's Surface Topography and Its Deformation. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 28, 169–209 (2000). doi: 10.1146 / annurev.earth.28.1.169

44. H. Yu, R. M. Harrington, H. Kao, Y. Liu, B. Wang, Fluid-injection-induced earthquakes characterized by hybrid-frequency waveforms manifest the transition from aseismic to seismic slip. Nat. Commun. 12, 6862 (2021). doi: 10.1038 / s41467-021-26961-x; pmid: 34824197

45. Y. Ito, M. J. Ikari, Velocity- and slip-dependent weakening in simulated fault gouge: Implications for multimode fault slip. Geophys. Res. Lett. 42, 9247–9254 (2015). doi: 10.1002 / 2015GL065829

46. G. M. Atkinson, Strategies to prevent damage to critical infrastructure due to induced seismicity. Facets 2, 374–394 (2017). doi: 10.1139 / facets-2017-0013

47. A. B. Jacquey, R. C. Viesca, Nucleation and Arrest of Fluid-Induced Aseismic Slip. Geophys. Res. Lett. 50, e2022GL101228 (2023). doi: 10.1029 / 2022GL101228

48. A. Sáez, B. Lecampion, Post-injection aseismic slip as a mechanism for the delayed triggering of seismicity. Proc.-Royal Soc., Math. Phys. Eng. Sci. 479, 20220810 (2023). doi: 10.1098 / rspa.2022.0810

49. L. Wang, G. Kwiatek, E. Rybacki, M. Bohnhoff, G. Dresen, Injection-Induced Seismic Moment Release and Laboratory Fault Slip: Implications for Fluid-Induced Seismicity. Geophys. Res. Lett. 47, e2020GL089576 (2020). doi: 10.1029 / 2020GL089576

50. A. F. Peña Castro et al., Stress Chatter via Fluid Flow and Fault Slip in a Hydraulic Fracturing-Induced Earthquake Sequence in the Montney Formation, British Columbia. Geophys. Res. Lett. 47, e2020GL087254 (2020). doi: 10.1029 / 2020GL087254

51. A. Kato et al., Propagation of slow slip leading up to the 2011 $M_{w}$ 9.0 Tohoku-Oki earthquake. Science 335, 705–708 (2012). doi: 10.1126 / science.1215141; pmid: 22267578

52. M. Bouchon et al., Extended nucleation of the 1999 $M_{w}$ 7.6 Izmit earthquake. Science 331, 877–880 (2011). doi: 10.1126 / science.1197341; pmid: 21330536

53. R. Schultz et al., The bound growth of induced earthquakes could de-risk hydraulic fracturing. Commun. Earth Environ. 6, 995 (2025). doi: 10.1038 / s43247-025-02881-2; pmid: 41377648

54. Alberta Energy Regulator / Alberta Geological Survey (AER / AGS), "Energy Briefing Note: The ultimate potential for unconventional petroleum from the Montney Formation of British Columbia and Alberta" (AER / AGS Information Series 144, 2013); https: / www.cer-rec.gc.ca / en / data-analysis / energy-commodities / natural-gas / report / archive / ultimate-potential-montney-formation / the-ultimate-potential-unconventional-petroleum-from-montney-formation-british-columbia-alberta-energy-briefing-note.pdf.

55. A. Preston, G. Garner, K. Beavis, O. Sadiq, S. Stricker, Duvernay Reserves and Resources Report: A Comprehensive Analysis of Alberta's Foremost Liquids-Rich Shale Resource (2016); https: / static.aer.ca / prd / documents / reports / DuvernayReserves_2016.pdf.

56. R. M. H. Dokht, H. Kao, S. Venables, GSC-BCER 诱发地震研究, 国际数字地震仪网络 (2018); https: / doi.org / 10.7914 / fz33-f679.

57. Y. Liu, J. McKenzie, R. Harrington, McGill Dawson-Septimus 诱发地震研究, 国际数字地震仪网络 (2017); https: / doi.org / 10.7914 / fj0y-da31.

58. 加拿大地质调查局, 公共安全地球科学计划加拿大研究网络, 国际数字地震仪网络 (2013); : / . / 10.7914 / SN / PQ.

59. 阿尔伯塔地质调查局 / 阿尔伯塔能源监管局, 阿尔伯塔区域地震研究观测网络, 国际数字地震仪网络 (2013); : / . / 10.7914 / SN / RV.

60. 加拿大自然资源部, 加拿大国家地震仪网络, 国际数字地震仪网络 (1975); : / . / 10.7914 / SN / CN.

61. 美国地质调查局, 地震灾害计划, 高级国家地震系统 (ANSS) 地震事件与产品综合目录 (USGS, 2017); : / . / 10.5066 / F7MS3QZH.

62. R. Visser, H. Kao, B. Wang, H. Yu, 2014–2024 年间不列颠哥伦比亚省东北部和阿尔伯塔省西部的地震目录, v2 版本, Zenodo (2026); : / . / 10.5281 / zenodo.20698725.

63. P. Wessel 等, 通用制图工具 (Generic Mapping Tools) 第 6 版. Geochem. Geophys. Geosyst. 20, 5556–5564 (2019). : 10.1029 / 2019GC008515

64. G. D. Mossop, I. Shetsen, 主编, 西加拿大沉积盆地地质图集 (加拿大石油地质学家协会和阿尔伯塔研究委员会, 1994).

致谢

我们感谢 G. Atkinson、R. Schultz 以及一位匿名审稿人提出的建设性意见和建议，这些建议极大地提高了本研究的质量。我们感谢担任本文 NRCan 内部审稿人的 T. Sun，以及 Y. Xu、Y. Liu、S. Venables、R. Dokht 和 J. Gosselin 提供的富有洞察力的讨论。资金支持：本研究得到了国家重点研发计划 2024ZD1002702-2 (B.W.)、浙江工业大学启动基金 (B.W.)、NRCan 环境地球科学计划 (H.K.)、NRCan 地质能源计划 (H.K.)、国家自然科学基金项目 42374056 和 92479202 (H.Y.)、加拿大自然科学与工程研究委员会 RGPIN-2022-04724 (Y.J.) 以及国家自然科学基金项目 U24A20319 (Q.L.) 的支持。作者贡献：概念化：B.W., H.K., H.Y.;

方法论：B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., P.Z., Y.L., R.V.; 调查：B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., P.Z., Y.L., R.V.; 可视化：B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., R.V.; 资金获取：B.W., H.K., H.Y., Y.J.; 项目管理：H.K.; 监督：B.W., H.K., H.Y.; 初稿撰写：B.W., H.K., H.Y., Y.J.; 审阅与编辑：B.W., H.K., H.Y., Y.J. 竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：连续波形由加拿大国家地震台网（FDSN 网络代码 CN）、加拿大地质调查局和阿尔伯塔地质调查局建立的区域研究网络（PQ, 1E 和 RV）以及由麦吉尔大学和波鸿鲁尔大学运营的几个宽频地震站 (XL 和 RU) (56–60) 记录。所有波形数据均可在地球科学促进地震学设施（SAGE, NSF 奖项 2435260）在线获取。流体注入数据检索自 BC 能源监管局 (BCER) (https: / www.bc-er.ca / , 最后访问日期 2025 年 4 月 30 日) 和阿尔伯塔能源监管局 (AER) (https: / www.aer.ca / data-and-performance-reports / activity-and-data / lists-and-activities / hydraulic-fracture-fluid-data, 最后访问日期 2025 年 8 月 20 日) 维护的在线数据库。远震事件获取自 USGS 地震目录 (https: / earthquake.usgs.gov / earthquakes / search / , 最后访问日期 2025 年 8 月 15 日) (61)。NEBC 的原始目录可作为加拿大地质调查局公开文件报告在线获取 (https: / www.earthquakescanada.nrcan.gc.ca / pprs-pprp / index-en.php)，该目录的增强版本存档于 Zenodo (62)。

阿尔伯塔省西部的原始目录获取自 https: / geology-ags-aer.opendata.arcgis.com / datasets / ags-aer:.alberta-earthquakes / about。用于 InSAR 的 Copernicus Sentinel-1 SAR 场景（Level-1 SLC, IW 模式）是通过 Vertex (ASF 数据搜索) 门户从 NASA 的阿拉斯加卫星设施分布式活跃存档中心 (ASF DAAC) 下载的。地图使用 Generic Mapping Tools 生成 (63)。地质背景源自在线的《西加拿大沉积盆地地质图集》(https: / ags.aer.ca / publications / atlas-western-canada-sedimentary-basin) (64)。评估本文结论所需的所有其他数据均包含在正文或补充材料中。本研究未产生或收集任何物理材料或样本。许可信息：版权 © 2026 作者；独家许可方为美国科学促进会，受限于：加拿大皇室版权，© 2026 代表自然资源部部长的加拿大国王陛下。不对美国政府原始作品主张权利。所有其他权利由美国科学促进会保留。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

材料与方法；补充文本 S1 至 S8；图 S1 至 S24；表 S1 至 S4；参考文献 (65–124)

提交日期 2025年11月26日；接收日期 2026年6月24日

利用祖先重组图恢复古人类基因渗入的特征信号

Yulin Zhang*, Arjun Biddanda*, Sarah A. Johnson, Colm O'Dushlaine, Priya Moorjani*

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aef8874

引言：尼安德特人和丹尼索瓦人基因组的测序揭示了现代人类与现已灭绝的古人类之间广泛的杂交，这改变了我们对人类进化历史的理解。然而，许多对现代人类祖先有所贡献的古人类群体——特别是那些缺乏保存完好的化石或 DNA 的群体——仍未被表征。现有的计算方法无法检测这些贡献，因为它们依赖于古人类参考基因组或未混血的外群。因此，古人类基因渗入的完整程度和复杂性仍然未知。

原理：祖先重组图（ARGs）编码了基因组中一组样本的完整谱系历史，提供了随时间变化的祖先群体关系的记录。来自深度分化的古人类来源的基因流预计会在 ARG 中留下两个独特的特征信号：(i) 异常深的合并分支，反映了渗入谱系与接收群体之间长期的进化分离；(ii) 基因组中长段的渗入谱系以连续单倍型形式存在，反映了自基因流事件以来重组事件次数有限。我们开发了 TRACE（通过 ARG 估计追踪古人类贡献），这是一种无需参考基因组和外群的方法，通过扫描推断的 ARGs 以寻找这些特征信号，从而识别当代基因组中的渗入古人类片段。

结果：我们通过广泛的模拟验证了 TRACE，结果表明在多种人口统计场景和参数下，它具有高精确度和低假发现率。将 TRACE 应用于 1000 Genomes Project（千人基因组计划）的数据，它恢复了所有非非洲人中已知的尼安德特人基因渗入信号，以及亚洲人和大洋洲人中已知的丹尼索瓦人基因渗入信号，其群体水平模式与之前的估计一致。

除了这些已确立的信号外，TRACE 在非洲和非非洲人群中均识别出大量来自此前未表征的人类谱系的幽灵血统片段。我们发现，幽灵血统在尼安德特人和丹尼索瓦人的“血统沙漠”中依然存在，这些基因组区域此前被解释为缺乏古人类基因渗入，并被认为仅限于智人（Homo sapiens）。这挑战了对这些区域的主流解释，并表明针对渗入血统的选择压力在所有古人类来源中并非统一。在大洋洲人群中，与尼安德特人片段相比，TRACE 在丹尼索瓦人血统片段中检测到异常深合并谱系的显著富集，这与通过丹尼索瓦人进入现代人类的“超级古人类”基因流模型一致。总之，这些结果表明，直接渗入以及通过其他古人类群体介导的渗入等多层基因渗入共同塑造了现代人类基因组。

TRACE 在无需参考基因组的情况下推断古人类血统。（上图）TRACE 使用推断的 ARGs 来表征整个基因组中的古人类血统（尼安德特人，蓝色；丹尼索瓦人，橙色；幽灵血统，红色；超级古人类，绿色）。（中图）TRACE 恢复了已知的渗入信号，检测到古人类沙漠中的幽灵血统，并识别出在大洋洲丹尼索瓦人片段中富集的超级古人类基因流。（下图）人类进化过程中基因渗入事件的示意系统发育图。

结论：TRACE 是一种基于谱系的方法，无需古人类参考基因组即可绘制古人类血统图谱，揭示了我们进化历史中隐藏的层面。该方法仅利用从现代基因组推断出的祖先重组图（ARG），即可恢复那些没有可用 DNA 的古人类（包括幽灵血统和超古人类谱系）的基因渗入信号。随着 ARG 重建技术的不断进步，TRACE 将日益深化我们对灭绝种群对现代人类遗传多样性影响的理解。□

基因渗入

利用祖先重组图恢复古人类基因渗入的特征

Yulin Zhang $^{1}$ †, Arjun Biddanda $^{2,3}$ †, Sarah A. Johnson $^{1}$ , Colm O'Dushlaine $^{3‡}$ , Priya Moorjani $^{1,4*}$

现代人类与已灭绝古人类之间的杂交塑造了现今个体的基因组，但由于古人类样本以及未杂交的外群人群的匮乏，重建这段历史一直受到限制。我们推出了 TRACE，一种无需参考基因组和外群的分析方法，它利用祖先重组图（ARG）的特征来识别古人类血统。模拟实验表明，TRACE 具有高精确度和低假阳性率。在应用于千人基因组计划（1000 genomes）时， 恢复了已知的尼安德特人和丹尼索瓦人基因渗入，并揭示了非洲人和非非洲人中来自未表征古人类的“幽灵”杂交。幽灵血统在尼安德特人和丹尼索瓦人的血统缺失区（ancestry deserts）中依然存在，这挑战了将这些区域解释为智人特有区域的观点。在大洋洲人中， 发现深层谱系在丹尼索瓦人区域比在尼安德特人区域更为富集，支持了超古人类基因渗入的观点。 使得在没有古人类参考基因组的情况下绘制古人类基因渗入图谱成为可能。

尼安德特人和丹尼索瓦人基因组的测序改变了我们对人类进化的认识，揭示了现代人类与古人类之间基因流动的证据 (1-5)。大多数现今生活的非非洲人拥有 1 到 $2\%$ 的尼安德特人血统，而亚洲人和大洋洲人则携带 $\sim 0.1$ 到 $5\%$ 的丹尼索瓦人血统 (6, 7)。古人类血统对人类的适应性和疾病产生了重大影响，促成了包括皮肤色素沉着、高海拔适应和免疫功能在内的一系列特征 (8-14)。然而，迄今为止，仅公布了六个高覆盖度的古人类基因组——四个尼安德特人和两个丹尼索瓦人——且全部来自欧亚大陆。因此，我们对于欧亚大陆以外以及更深时间尺度上古人类血统的进化历史及其影响的认知仍然是不完整的 (1-3, 5, 15, 16)。

多项研究假设，来自其他未知古人类（目前尚无基因组序列）的基因流动可能在非洲内部和外部均曾发生 (17–31)。对现今非洲人群的遗传分析识别出了高度分化的单倍型，这些单倍型无法用已知的种群历史来解释，暗示了“幽灵”基因渗入 (17–29, 31)。在更深的时间尺度上，对阿尔泰丹尼索瓦人基因组的分析表明，他们携带来自一个高度分化种群的血统，被称为“超古人类”，该种群在大约 0.9 到 140 万年前 (Mya) 与现代人类分离 (2, 3, 32)。幽灵谱系广义上是指任何对现代基因组有贡献但未被采样到的古人类种群，而超古人类血统则特指来自在现代人类与尼安德特人 / 丹尼索瓦人的共同祖先之前就已分化出的谱系的贡献。超古人类血统可能通过丹尼索瓦人的基因流动渗入到现代人类中，因此可能存在于亚洲人和大洋洲人中。然而，由于大多数研究古人类基因渗入的现有方法依赖于已测序的古人类基因组 (33)、没有古人类血统的外群种群 (18, 34–36) 或两者兼有 (6, 37)，这些历史仍不为人所熟知。由于非洲最古老的古代基因组年龄不足 20,000 年 (26)，且在永冻土之外恢复百万年以上的古人类 DNA 几乎不可能 (38)，因此需要无需此类要求的方法。

随着重建祖先重组图（ARGs）的新方法的出现 (39–42)，现在可以通过计算可行的方式推断一组序列的完整进化历史。ARG 提供了所有合并（coalescence）和重组事件的完整记录，并指定了基因组中每个位置的完整谱系 (43–46)。重要的是，来自深度分化谱系的基因流预计会在 ARG 中留下独特的特征——例如异常深层的合并事件——这些特征可用于检测渗入，即使在缺乏古人类参考基因组的情况下也是如此 (42)。

我们推出了 TRACE（通过 估计追踪古人类贡献），这是一种通过利用仅由当代基因组构建的 特征，来识别现代人类基因组中古人类血统足迹的方法，它既不需要古人类参考基因组，也不需要无混血的外群人群。我们进行了广泛的模拟，使用真实和推断的 来表征 TRACE 在一系列人口统计场景下的可靠性。随后，我们将 TRACE 应用于全球人群个体的全基因组序列，以重建现代人类中古人类基因流的进化历史及其遗产。

结果

TRACE 利用 ARG 识别古人类基因流

TRACE 通过利用编码在 ARG 中的谱系信息来推断古人类血统。其核心观点是，古人类的渗入在 的边缘树序列中会留下两个特征标志：长分支和长单倍型。首先，长分支的出现是因为来自深度分化种群的渗入引入了比非渗入谱系在时间上更早聚合的谱系 (47)。在 中，这表现为具有深层聚合时间的分支，这些分支跨越了古人类谱系与现代人类谱系的分化时间 ($T_{archaic}$) 与杂交事件时间 ($T_{admix}$) 之间的间隔（图 1A）(42)。其次，由于杂交发生的时间比分化更晚，渗入片段预计将比由不完全谱系分选 (ILS) 产生的片段更长，因为自杂交以来，重组分解血统片段所经过的时间较短 (48)。

TRACE 被实现为一个具有两种状态（古人类和现代人类）的隐马尔可夫模型。作为输入，它使用从当代个体相位化全基因组序列中推断出的 。对于每棵边缘树和目标单倍型，我们检查 (i) 在时间 t 时目标样本祖先分支的长度，以及 (ii) 树上落在同一时间窗内的其他聚合事件数量（图 1B 和图 S1）。参数 t——定义了识别“长”分支的时间截断点——由用户指定，并代表渗入谱系之间分化时间的代理值。当 t 接近真实分化时间 $T_{archaic}$ 时，TRACE 可达到最佳性能；如果 t 设置得比 $T_{archaic}$ 早得多，那么如果渗入的古人类谱系在 t 之前与现代人类谱系聚合，某些真实信号可能会被遗漏。相反，如果 t 设置得太晚，古人类推断结果可能会对其他近期的人口统计事件较为敏感（图 S3）。

为了验证 TRACE，我们模拟了包括非洲人、非非洲人和尼安德特人在内的三个种群的基因组序列，其中纳入了出非洲说 (OOA) 瓶颈效应以及 $\sim2\%$ 的尼安德特人基因流进入非非洲人群 (22, 49)。我们应用 TRACE，利用非非洲人的真实 来检测非非洲人中的古人类血统（目标，n = 100）

B

D

图 1. TRACE 的概念概述与验证。(A) 在渗入的人口统计情景下，涉及四个单倍型的局部谱系示意图，其中影响目标单倍型（绿点）的渗入创建了该样本的祖先长分支（橙色分支）。具体而言，该长分支跨越了 t 代的时间点，这是一个由用户定义的时间尺度，用于识别由 TRACE 推断的古人类事件；在本图中，该分支显示在古人类谱系与现代人类谱系的分化时间 ($T_{archaic}$) 与杂交事件时间 ($T_{admix}$) 之间的间隔中。没有古人类血统的个体（黑点）在祖先种群中以标准速率聚合，在橙色分支的时间跨度内产生聚合事件，这

在单基因谱系发射分布中建模。请注意，时间间隔并非按比例绘制。(B) 示意图展示了树序列如何与焦点分支长度的发射分布以及非焦点合并事件的数量相关联。被纳入每个边缘树发射分布的合并事件以蓝色显示（这些事件发生在与 $t$ 重叠的橙色分支跨度期间）。对于恒定规模模型（实线）和出非洲（OOA）模型（虚线）的模拟，我们展示了在 TRACE 中应用不同单倍型长度截断值（x轴）时，使用 (C) 地面真值 ARG 和 (D) SINGER 推断的 ARG 的精确率（紫色）、召回率（粉色）和 FDR（棕色）。精确率和召回率在 0 和 1 之间，显示在左侧 y 轴的“率”中；FDR 在 0 和 0.02 之间，显示在右侧 y 轴。另请参阅补充文本 S1 至 S3 节。

以及非洲人 $n = 100$。我们跨人群共同构建 ，以尽量减少人群瓶颈对推断的影响（图 S2 至 S6）。应用 $t = 15,000$ 代（接近尼安德特人与现代人类的分化时间 (4)），并重点关注长度超过 0.05 厘摩尔根 (cM) 的祖先片段以区分渗入片段与不完全谱系分选 (50)，我们发现 TRACE 表现出高准确率和高召回率（分别为 92 和 71%）。如将 应用于没有古人类血统的人群所示，误报率非常低（FDR < 0.25%）（图 1℃ 和补充文本 S1.3 节）。与已发表的古人类推断方法 hmmix (34)、Sprime (35) 和 IBDmix (33) 相比， 不需要测序的古人类基因组或未混血的外群。在模拟中，我们观察到即使是进入外群的少量古人类基因流也会使 hmmix 和 Sprime 等无参考方法产生偏差，而 则保持了高灵敏度和高特异性（图 S7）。基于参考的方法（如 IBDmix）不适用于幽灵血统推断，且在模拟中只能恢复 $<0.1\%$ 的幽灵血统（表 S8）。 在一系列额外的群体遗传学模型和参数中表现出鲁棒的性能，包括不同的尼安德特人血统比例（0.5 到 10%）、分化时间（$\sim9250$ 到 24,300 代）、渗入时间（725 到 5725 代）、目标样本量（10 到 200）以及参数 $t$ 的设定错误（图 S3 至 S8 和补充文本 S2 节）。

接下来，我们将 应用于使用两种近期发表的方法 SINGER (40) 和 Relate (42) 推断的 。与使用真实 的性能相似， 使用推断的 实现了高精确率（$\sim90\%$）和低 FDR（$<0.25\%$）（图 1, C 和 D，以及图 S9）。然而，与真实 相比，使用推断的 时召回率大幅降低。对于 OOA 模型（图 S2B），使用 Relate 时 恢复的真实片段不足 10%，使用 SINGER 时约为 50%，而使用真实 时的召回率约为 $\sim80\%$（图 S9）。此外，在更复杂的群体遗传学模型下，召回率会进一步下降，尽管在大多数群体遗传学场景下，SINGER 保持的召回率高于 Relate（约为 30%）（图 S10）。因此，我们将 应用于 SINGER 推断的 ，以进行后续的经验数据分析（补充文本 S3 节和图 S9 至 S14）。

出非洲（OOA）迁徙前现代人类群体中存在幽灵血统的证据

我们利用 SINGER 重构的祖先重组图（ARG）（未包含古人类基因组），分析了来自千人基因组计划（1000G）的 503 个相位全基因组序列。为了识别古人类渗入信号，我们应用了 TRACE，设置 $t = 15,000$ 代 [即 420,000 年，假设一代时间为 28 年 (51)]，这与现代人类和尼安德特人之间估计的分化时间接近 (4)。为了最大限度地减少不完全谱系分选（ILS）的影响，我们保留了长度超过 50 kb（千碱基对）且大于 0.05 cM 的古人类片段（在模拟中，这相当于 FDR < 0.2%，图 1D）。随后，我们将推断出的古人类片段上的变异与四个高覆盖度测序的古人类基因组 [三个尼安德特人 (2, 3, 5) 和一个丹尼索瓦人 (1)] 进行对比，以确定古人类血统的来源。为了进行比较，我们还应用了 IBDmix（使用阿尔泰尼安德特人和阿尔泰丹尼索瓦人基因组）和 hmmix（使用 426 名撒哈拉以南非洲人作为外群）（补充文本第 S4 节）。

血统——来自一个与尼安德特人和丹尼索瓦人亲缘关系更远的古人类谱系的渗入——存在于所有研究的现代人类群体中。我们在各群体中检测到平均 0.5% 到 1.1% 的幽灵血统（图 2A）。在非非洲人中发现的大多数幽灵血统片段与撒哈拉以南非洲人共有，而东非人和西非人则拥有更多样化的独特幽灵片段，这与出非洲（OOA）瓶颈效应导致非非洲人遗传多样性降低的情况一致（图 2B 以及图 S23 和 S24）。幽灵片段在边缘树中表现出深层分化，并且对已测序的尼安德特人和丹尼索瓦人基因组显示出几乎相同的遗传亲和力，这表明它们起源于一个与这两个古人类群体亲缘关系相当的未测序谱系（图 2℃ 以及图 S17 至 S19）。根据渗入片段推断，幽灵片段与现代人类片段之间的平均合并时间约为 0.83 Mya（95% CI：0.83 至 0.84 Mya，表 S6）。

其他几项证据支持我们关于现代人类中存在幽灵血统的结果。首先，我们发现含有幽灵血统的基因组区域表现出较高的杂合度水平，这一模式在尼安德特人和丹尼索瓦人片段中也被观察到（图 S25）。杂合度的升高与来自深层分化谱系的渗入模型一致 $(56)$，且值得注意的是，这表明幽灵血统信号并非 ARG 推断的人为误差。其次，在所有测试群体中，幽灵血统片段比尼安德特人和丹尼索瓦人片段更短，反映出这是一个早于尼安德特人基因流的更古老的渗入事件（图 S26）。此外，我们在模拟中验证，在缺乏幽灵渗入的模型中，TRACE 推断出的幽灵血统水平可以忽略不计（0.07%，95% CI：0 至 0.3%），明显低于实测数据的估计值。相比之下，包含幽灵谱系的模拟结果与实测观察结果高度匹配（表 S7 至 S9，图 S27 和 S28，以及补充文本第 S5 节）。此外，

A

在非非洲人群中，TRACE 识别出欧洲人、东亚人和南亚人每人的尼安德特人血统比例为 0.8 至 1%（图 2A）。我们在欧洲人中检测到极少量的丹尼索瓦人血统（0.03%），而在东亚人和南亚人中的比例较高（各为 0.10%），这与已发表的结果一致 (35, 52–55)。由 TRACE 识别的尼安德特人片段中超过 90% 以及丹尼索瓦人片段中 70% 的部分也被 hmmix 或 IBDmix 推断出（表 S4）。在西非人和东非人中， 检测到每人的尼安德特人和丹尼索瓦人综合血统低于 0.1%。 在撒哈拉以南非洲人中识别出的尼安德特人片段中，约有一半也被 IBDmix 推断出（表 S4；由于撒哈拉以南非洲人没有可靠的外群，因此未应用 hmmix）。我们注意到，与之前的一些研究 (33, 54, 55) 相比， 恢复的尼安德特人和丹尼索瓦人总血统较少，这归因于

推断的 ARG 召回率较低，尽管恢复的片段相对于 hmmix 和 IBDmix 识别的片段没有明显的偏差（补充文本第 S4.3 和 S5.2 节，表 S7，图 S10、S15 和 S16）。尽管如此， 稳健地重建了全球人群中尼安德特人和丹尼索瓦人基因渗入的主要特征。

除了尼安德特人和丹尼索瓦人血统外， 还揭示了“幽灵”古人类血统。我们计算了 识别的古人类片段上变异的位点频率谱 (SFS) 和条件位点频率谱 (cSFS)（图 S20 至 S22）。虽然尼安德特人和丹尼索瓦人片段显示出预期的“U形” (17)，但幽灵片段显示出截然不同的 SFS 和 cSFS 模式，这与模拟中出非洲 (OOA) 之前的幽灵基因渗入模型一致（图 S29 和 S30）。

B

C

图 2. 全球人群中的古人类血统。(A) 1000G 人群中，由 使用 t = 15,000 代、长度 >50 kbp 且 >0.05 cM 恢复的每个基因组的古人类血统比例。古人类片段根据与已测序的尼安德特人和丹尼索瓦人基因组的等位基因共享情况，被分类为尼安德特人（蓝色）、丹尼索瓦人（橙色）和幽灵（红色）（补充文本第 S4.2 节）。(B) 西非人与非非洲人之间每个基因组的总（深色）和共享（浅色）幽灵古人类血统量。(C) 西非人中幽灵片段对尼安德特人（x 轴）和丹尼索瓦人（y 轴）基因组的亲和力，计算为片段上与尼安德特人和丹尼索瓦人序列共享的衍生突变比例。

综合这些发现表明，一个在 500,000 年前就已分化的未知古人类群体，在出非洲 (OOA) 迁徙之前渗入了所有现代人类的共同祖先中，导致非非洲人和非洲人中出现了类似的幽灵血统模式。

现代人类中幽灵血统的分布格局

为了探索现代人类中幽灵血统的遗产，我们研究了全球人群中幽灵血统的全基因组分布。通过 TRACE 在所有人群（撒哈拉以南非洲人和非非洲人）中识别出的所有幽灵单倍型，我们回收了 1548.75 Mbp，即可访问基因组的 71.54%（图 3, 补充文本第 S6 节）。广义而言，幽灵血统片段的全基因组模式与深度分化谱系之间杂交所预期的模式相似 (57–59)。我们发现，幽灵血统在靠近功能元件的区域 [较低的 B 分数 (60)；$\rho_{Spearman} = 0.45$ , $P < 10^{-5}$ ] 以及低重组区域 ( $\rho_{Spearman} = 0.34$ , $P < 10^{-5}$ ) 呈下降趋势，这反映了这些区域中更强的连锁选择效应 (61, 62)。这些模式模拟了在尼安德特人和丹尼索瓦人渗入图谱 (6, 53) 以及

A

非人类物种杂交模式 (59) 中观察到的现象（图 S31 和 S32，表 S10，以及补充文本第 S6.1 节）。

我们还扫描了幽灵血统的“峰值”，定义为幽灵血统频率超过该人群全基因组平均值两个标准差的区域。在所有测试人群中，我们识别出 1932 个幽灵血统峰值（平均长度 61 kbp，标准差 SD 64 kbp）（补充文本第 S6.2 节，图 3, 和表 S13）。这一结果与尼安德特人和丹尼索瓦人血统分别仅有的 1155 个和 160 个峰值（平均长度分别为 84.97 和 76.54 kbp）形成对比。我们发现，相对于非非洲人群，幽灵血统峰值在撒哈拉以南非洲人群中分布过多，这与非非洲人较低的遗传多样性一致（图 S33 和 S34）。若干基因与高频幽灵血统峰值相交，例如 CSMD1 和 RBFOX1，且在免疫和代谢复合物方面具有整体功能富集，

包括主要组织相容性复合物和脂蛋白复合物（使用二项分布检验，$P < 10^{-5}$；图 S35 和 S36）。我们还识别出 97 个幽灵血统“沙漠”（即长度至少为 10 Mbp 且幽灵血统频率低于 0.1% 的区域）。这些沙漠仅在非非洲人群中被发现，且近一半 (43.3%) 在不同的非非洲群体之间共有，这可能是由于 OOA 瓶颈期形成的（补充文本第 S6.3 节以及图 S37 和 S38）。我们在撒哈拉以南非洲人中未识别出任何幽灵血统沙漠（尽管这可能取决于所采用的具体频率和单倍型长度阈值）。总体而言，我们发现幽灵血统片段在全基因组的分布中存在巨大的异质性。

图 3. 使用 TRACE 表征古人类血统的分布。(A) TRACE 估算的古人类血统峰值——包括幽灵血统——在所有人群中的汇总情况。被掩盖为着丝粒的基因组区域或没有调用变异的基因组区域（排除在 ARG 推断之外）以白色显示。先前估算的古人类（尼安德特人和丹尼索瓦人）血统沙漠以灰色高亮显示。(B) 在 7 号染色体古人类沙漠 [在 (A) 中以灰色虚线框显示] 中，非非洲人群的尼安德特人和丹尼索瓦人血统频率，以及所有人群的幽灵血统频率。顶端面板的 y 轴反映了尼安德特人和丹尼索瓦人血统的频率，而底端面板的 y 轴反映了该区域内幽灵血统的频率。

尼安德特人和丹尼索瓦人的基因沙漠通常被认为是智人（Homo sapiens）特有区域的候选地 (7, 63)。我们检查了两项先前研究确定的五个尼安德特人和丹尼索瓦人共有沙漠中的幽灵血统（图 S39 至 S45，表 S11 和 S12，以及补充文本第 S6.4 节）(7, 53)。我们在其中两个沙漠中重复验证了两种血统的缺失，但在其他一些沙漠中发现了不可忽视的尼安德特人或丹尼索瓦人血统，这与近期的研究一致 (7, 53, 54, 63, 65)。尽管如此，所有五个区域都包含大量的幽灵血统，即使在限制为更长且推断更可靠的片段（>100 kbp；图 3B，图 S39 和 S40，以及表 S11）之后依然如此。例如，包含 FOXP2 基因的 7 号染色体共有古人类沙漠的幽灵血统频率峰值为 $13.3\%$（图 3B），而 3 号染色体上的尼安德特人沙漠包含一个频率约为 $20\%$ 且与 CSNK2A2IP 重叠的幽灵血统峰值（图 S40）。我们的研究结果表明，幽灵血统经常存在于先前定义的古人类沙漠中，这为推测的智人特有进化变化提供了额外的背景信息。

检测大洋洲人群中的超古人类血统

先前关于尼安德特人、丹尼索瓦人与现代人类之间等位基因共享模式的研究表明，丹尼索瓦人可能携带来自一个超古人类（super-archaic）种群的血统 $(1, 2, 32)$。在现代人类中，大洋洲人和东南亚人的丹尼索瓦人血统比例最高 $(52)$。因此，我们推论一部分超古人类血统可能通过丹尼索瓦人的基因流遗传下来，并可能在现今大洋洲人的丹尼索瓦人渗入片段中持续存在。为了验证这一点，我们分析了 92 份来自大洋洲个体的高覆盖度全基因组序列，其中包括 25 份来自巴布亚新几内亚 $(65)$ 以及 67 份来自瓦努阿图和圣克鲁斯群岛 (52) 的样本。我们使用 SINGER 结合 1000G YRI 个体重建了祖先重组图（ARG），并应用 TRACE（设定 t = 15,000 代）来检测古人类血统（见补充文本第 S7.1 节）。

在大洋洲个体中，TRACE 推断出平均含有 0.73% 的尼安德特人血统、0.66% 的丹尼索瓦人血统和 0.33% 的幽灵血统（图 4A），这一数值低于先前研究 (52) 以及其他 1000G 非非洲人群的估计值（图 2A 和图 S46）。由于尼安德特人和丹尼索瓦人在与现代人类合并之前已相互合并 [t = 13,600 至 16,900 (2)]，因此当使用 t = 15,000 代作为时间截断值时，许多长分支无法被检测到。较高的古人类渗入比例进一步加剧了这一效应，因为更大比例的合并事件发生在古人类谱系之间（见补充文本第 S7.2 节、表 S15 以及图 S47 和 S57）。模拟大洋洲人人口历史的仿真实验复制了这种低估现象（见补充文本第 S8 节以及表 S15 和 S16）。尽管召回率较低，但 TRACE 检测到的 90% 以上的尼安德特人和丹尼索瓦人片段与 hmmix 或 IBDmix 的结果重叠（表 S14）。TRACE 检测到的古人类片段显示出与 1000G 数据一致的古人类亲缘模式（图 S48）和位点频率谱（SFS / cSFS，图 S49）。此外，大洋洲人的幽灵片段与 1000G 人群中检测到的片段重叠（图 S50），这与现代人类共同的起源相一致。

为了识别超古人类渗入，我们在丹尼索瓦人渗入片段中筛选“超深”合并事件，设定 t = 31,500 代（推断的超古人类谱系与现代人类之间的分化时间）$(32)$，并要求片段长度至少为 10 kbp 且长度为 0.01 cM 以将其与不完全谱系分选（ILS）区分开来；同时对尼安德特人渗入片段进行相同的分析以作对比。我们发现，丹尼索瓦人片段中超深谱系的比例显著高于尼安德特人片段（使用二项分布检验，$P < 10^{-5}$；图 4 和补充文本第 S7.3 节）。模拟结果显示，这种模式与缺乏超古人类渗入的模型不一致，但可以通过包含超古人类渗入丹尼索瓦人的模型来重现（图 4℃，图 S56、S58 和 S59，以及表 S15 和 S16）。此外，渗入的丹尼索瓦人片段中的超古人类片段表现出明显的遗传特征，使其与背景丹尼索瓦人血统区分开来，包括：与现代人类的合并时间深得多、基因组长度长于尼安德特人深层谱系的平均 ILS 长度，以及与尼安德特人和丹尼索瓦人参考基因组的亲缘关系均较低（假设在已测序的丹尼索瓦人相同位点没有超古人类血统，见补充文本第 S8.4 节、图 S60 和表 S17）。利用这些特征，我们在模拟中检测超古人类片段的准确率为 70.2%（95% CI: 66.4 至 74.1%，见补充文本第 S8.5 节）。

A

B

C

图 4. 使用 TRACE 在大洋洲（OCN）基因组中检测到的超古人类血统。(A) 所有采样的大洋洲个体中尼安德特人、丹尼索瓦人和幽灵血统的总比例。(B) 在丹尼索瓦人血统背景下检测到的 MHC 区域内的超古人类血统。(C) 丹尼索瓦人片段中超深谱系（super-deep lineages）的比例显著高于尼安德特人片段，这一信号在模拟数据（$P < 10^{-5}$）、真实大洋洲数据（$P = 1.00$）以及超古人类模拟数据（$P < 10^{-5}$）中分别有所体现；使用二项分布检验）。

将该方法应用于大洋洲基因组，我们推断嵌入在丹尼索瓦人血统片段中的超古人类片段长度在 20 到 83 kbp 之间（平均值：37.6 kbp），且约占大洋洲人检测到的丹尼索瓦人总血统的 0.3%（表 S18 和图 S51）。由于我们的分析仅限于丹尼索瓦人渗入区域，且要求片段至少达到 20 kbp，并排除了测序的丹尼索瓦人本身携带超古人类血统的位点，因此该估计值构成了真实超古人类血统比例的一个非常保守的下限（图 S60 和 S61 以及补充文本第 S7.4 节）。我们验证了超古人类片段与现代人类（撒哈拉以南非洲人）以及阿尔泰丹尼索瓦人的核苷酸分歧度均较高（与其他丹尼索瓦人渗入区域相比），这表明该信号并非 ARG 推断的人为误差（图 S52）。利用 SINGER 的边际树，我们估计超古人类谱系与现代人类谱系的合并时间约为 1.77 Mya（95% CI: 1.69 到 1.83 Mya），这与之前的报道一致 (2, 32)。

我们通过表征共同的基因注释和功能富集模式，评估了从大洋洲基因组中恢复的超古人类片段的潜在功能影响（图 4B）。几个基因区域含有高比例（ $>70\%$ ）的超古人类片段，例如主要组织相容性复合体（MHC）中的 RNF39、PPP1R11 和 POLR1H（图 4B 和图 S53），以及 CYP24A1，后者属于细胞色素 P450 家族，是人类维生素 D 降解的关键调节因子（图 S54）(30, 66–69)。基因本体分析显示，在经过多重假设检验后，包括 MHC 和活动相关细胞骨架在内的多个通路存在显著富集（图 S55）。

讨论

我们推出了 TRACE，这是一个用于从仅由当代基因组推断出的 ARG 中检测古人类基因渗入的框架。TRACE 的无参考且无外群设计使其能够重建难以用现有方法解决的渗入历史，包括幽灵血统（ghost）和超级古人类（super-archaic）的渗入。与任何基于 ARG 的方法一样， 的性能取决于底层 推断的准确性和可扩展性；与基准真值谱系相比，使用推断出的 会降低召回率。随着 重建方法的不断进步， 的可靠性和分辨率将得到提高，从而揭示人类及其他缺乏直接基因组参考物种的进化历史片段。

将 应用于现代人类数据，它恢复了已知的尼安德特人和丹尼索瓦人血统，并识别出人类历史上不同时间点此前未被表征的古人类血统特征。我们发现了至少一次早于 OOA 扩张的幽灵渗入证据，该事件为所有现代人群贡献了血统。这一发现与文献 (17) 中描述的离散渗入事件最为一致，但扩展了该模型，证明该事件影响了所有现代人类人群，而非仅局限于西非人。鉴于我们推断的幽灵谱系的分化时间大约在尼安德特人与现代人类分化之时（表 S6），它代表了一个比拟议的深层结构场景更近的事件；后者涉及一次人群分化（>1.5 Mya），随后通过大约 300 kya 的单次重新结合事件 (23) 或多次“合并”事件 (27) 进行整合。最后，我们推断出大洋洲人群的丹尼索瓦人血统中嵌入了深度分化的谱系，这与超级古人类对现代人类的额外间接贡献相一致。这些结果表明，直接渗入以及通过其他古人类群体介导的渗入等多层渗入共同塑造了现代人类基因组。

除了这些渗入事件的时间和人口统计背景外，其古人类来源仍是一个开放性问题。考古记录记载了许多古人类形式，但它们对现代人类的潜在贡献量（如果有的话）尚不明确 (30, 66, 67)。分化时间与尼安德特人相似的幽灵谱系，可能对应于中更新世的直立人（Homo）群体 (70–72) 或在 OOA 分散前与现代人类祖先直接杂交的非洲海德堡人（Homo heidelbergensis）人群 (73–75)。对于超级古人类谱系，一个潜在的候选者——与约 1.8 Mya 的分化时间相兼容——是直立人（Homo erectus），正如早先研究 (2, 16, 32) 所建议的那样。

还揭示了古人类血统在现代人类中持久的基因组遗产。幽灵血统和超级古人类血统在功能区域中均显著富集，凸显了它们在人类适应中的作用。此外，幽灵血统在先前被识别为尼安德特人和丹尼索瓦人渗入“沙漠”的基因组区域内依然存在。这些“沙漠”通常被解释为由于对智人（Homo sapiens）特有变异的正向选择，或对古人类渗入等位基因的强纯化选择，导致其无法耐受古人类渗入的区域 (57–59)。相反，深度分化的幽灵血统在这些区域的持续存在表明，这里是对尼安德特人和丹尼索瓦人渗入的谱系特异性选择，而非对现代人类变异的正向选择。这种模式意味着，与尼安德特人和丹尼索瓦人谱系相关的遗传负荷差异或上位性不兼容性——而非仅仅是分化时间——塑造了尼安德特人和丹尼索瓦人的血统沙漠。

仍有几个开放性问题尚待解决：首先，推断出的幽灵血统渗入事件的数量、时间和地理位置仍不确定；尽管我们的结果支持至少存在一次影响所有现代人类人群的出非洲（OOA）前渗入事件，但在结构化的非洲人群之间可能还发生了额外的基因流，但目前的数据难以对其进行解析。其次，超古老谱系的起源和地理范围仍未解决，包括这种血统是仅通过丹尼索瓦人进入现代人类，还是也通过与现代人类祖先的直接杂交进入。我们预计，未来的研究（包括新的丹尼索瓦人参考基因组）可能有助于进一步精准定位这些超古老序列的时间和起源 (75)。最后，虽然我们检测到了影响基因组中幽灵血统分布的选择信号，但渗入的古人类区域的功能影响（包括它们在免疫和代谢中的作用）尚未得到全面表征。未来整合更深时间尺度、特别是来自非洲和亚洲的更多古基因组的研究，对于完善这些渗入事件的时间、来源及其进化后果至关重要。

材料与方法见补充材料。

参考文献与注释

1. M. Meyer et al., A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science 338, 222–226 (2012). doi: 10.1126 / science.1224344; pmid: 22936568

2. K. Prüfer et al., The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains. Nature 505, 43–49 (2014). doi: 10.1038 / nature12886; pmid: 24352235

3. K. Prüfer et al., A high-coverage Neandertal genome from Vindija Cave in Croatia. Science 358, 655–658 (2017). doi: 10.1126 / science.aao1887; pmid: 28982794

4. R. E. Green et al., A draft sequence of the Neandertal genome. Science 328, 710–722 (2010). doi: 10.1126 / science.1188021; pmid: 20448178

5. F. Mafessoni et al., A high-coverage Neandertal genome from Chagyrskaya Cave. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 117, 15132–15136 (2020). doi: 10.1073 / pnas.2004944117; pmid: 32546518

6. S. Sankararaman et al., The genomic landscape of Neanderthal ancestry in present-day humans. Nature 507, 354–357 (2014). doi: 10.1038 / nature12961; pmid: 24476815

7. B. Vernot et al., Excavating Neandertal and Denisovan DNA from the genomes of Melanesian individuals. Science 352, 235–239 (2016). doi: 10.1126 / science.aad9416; pmid: 26989198

8. F. Racimo, S. Sankararaman, R. Nielsen, E. Huerta-Sánchez, Evidence for archaic adaptive introgression in humans. Nat. Rev. Genet. 16, 359–371 (2015). doi: 10.1038 / nrg3936; pmid: 25963373

9. A. J. Sams et al., Adaptively introgressed Neandertal haplotype at the OAS locus functionally impacts innate immune responses in humans. Genome Biol. 17, 246 (2016). doi: 10.1186 / s13059-016-1098-6; pmid: 27899133

10. M. Dannemann, J. Kelso, The Contribution of Neanderthals to Phenotypic Variation in Modern Humans. Am. J. Hum. Genet. 101, 578–589 (2017). doi: 10.1016 / j.ajhg.2017.09.010; pmid: 28985494

11. E. Huerta-Sánchez et al., Altitude adaptation in Tibetans caused by introgression of Denisovan-like DNA. Nature 512, 194–197 (2014). pmid: 25043035

12. X. Wei et al., The lingering effects of Neanderthal introgression on human complex traits. eLife 12, e80757 (2023). doi: 10.7554 / eLife.80757; pmid: 36939312

13. H. Zeberg, S. Pääbo, The major genetic risk factor for severe COVID-19 is inherited from Neanderthals. Nature 587, 610–612 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2818-3; pmid: 32998156

14. F. L. Mendez, J. C. Watkins, M. F. Hammer, Neandertal origin of genetic variation at the cluster of OAS immunity genes. Mol. Biol. Evol. 30, 798–801 (2013). doi: 10.1093 / molbev / mst004; pmid: 23315957

15. D. Massilani et al., A high-coverage Neandertal genome from the Altai Mountains reveals population structure among Neandertals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 123, e2534576123 (2026). doi: 10.1073 / pnas.2534576123; pmid: 41871248

16. S. Peyrégne et al., A high-coverage genome from a 200,000-year-old Denisovan, bioRxiv 2025.10.20.683404 [Preprint] (2025); doi: 10.1101 / 2025.10.20.683404

17. A. Durvasula, S. Sankararaman, Recovering signals of ghost archaic introgression in African populations. Sci. Adv. 6, eaax5097 (2020). doi: 10.1126 / sciadv.aax5097; pmid: 32095519

18. V. Plagnol, J. D. Wall, Possible ancestral structure in human populations. PLOS Genet. 2, e105 (2006). doi: 10.1371 / journal.pgen.0020105; pmid: 16895447

19. J. D. Wall, A. Ratan, E. Stawiski, GenomeAsia 100K Consortium, Identification of African-Specific Admixture between Modern and Archaic Humans. Am. J. Hum. Genet. 105, 1254–1261 (2019). doi: 10.1016 / j.ajhg.2019.11.005; pmid: 31809748

20. M. F. Hammer, A. E. Woerner, F. L. Mendez, J. C. Watkins, J. D. Wall, Genetic evidence for archaic admixture in Africa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15123–15128 (2011). doi: 10.1073 / pnas.1109300108; pmid: 21896735

21. J. Hey et al., Phylogeny estimation by integration over Isolation with Migration models. Mol. Biol. Evol. 35, 2805–2818 (2018). doi: 10.1093 / molbev / msy162; pmid: 30137463

22. A. P. Ragsdale, S. Gravel, Models of archaic admixture and recent history from two-locus statistics. PLOS Genet. 15, e1008204 (2019). doi: 10.1371 / journal.pgen.1008204; pmid: 31181058

23. A. P. Ragsdale et al., A weakly structured stem for human origins in Africa. Nature 617, 755–763 (2023). doi: 10.1038 / s41586-023-06055-y; pmid: 37198480

24. J. Lachance et al., Evolutionary history and adaptation from high-coverage whole-genome sequences of diverse African hunter-gatherers. Cell 150, 457–469 (2012). doi: 10.1016 / j.cell.2012.07.009; pmid: 22840920

25. P. Hsieh et al., Model-based analyses of whole-genome data reveal a complex evolutionary history involving archaic introgression in Central African Pygmies. Genome Res. 26, 291–300 (2016). doi: 10.1101 / gr.196634.115; pmid: 26888264

26. M. Lipson et al., Ancient DNA and deep population structure in sub-Saharan African foragers. Nature 603, 290–296 (2022). doi: 10.1038 / s41586-022-04430-9; pmid: 35197631

27. T. Cousins, A. Scally, R. Durbin, A structured coalescent model reveals deep ancestral structure shared by all modern humans. Nat. Genet. 57, 856–864 (2025). doi: 10.1038 / s41588-025-02117-1; pmid: 40102687

28. P. Skoglund et al., Reconstructing prehistoric African population structure. Cell 171, 59–71.e21 (2017). doi: 10.1016 / j.cell.2017.08.049; pmid: 28938123

29. B. Lorente-Galdos et al., Whole-genome sequence analysis of a Pan African set of samples reveals archaic gene flow from an extinct basal population of modern humans into sub-Saharan populations. Genome Biol. 20, 77 (2019). doi: 10.1186 / s13059-019-1684-5; pmid: 31023378

30. E. M. L. Scerri et al., Did our species evolve in subdivided populations across Africa, and why does it matter? Trends Ecol. Evol. 33, 582–594 (2018). doi: 10.1016 / j.tree.2018.05.005; pmid: 30007846

31. S. Fan et al., Whole-genome sequencing reveals a complex African population demographic history and signatures of local adaptation. Cell 186, 923–939.e14 (2023). doi: 10.1016 / j.cell.2023.01.042; pmid: 36868214

32. M. J. Hubisz, A. L. Williams, A. Siepel, Mapping gene flow between ancient hominins through demography-aware inference of the ancestral recombination graph. PLOS Genet. 16, e1008895 (2020). doi: 10.1371 / journal.pgen.1008895; pmid: 32760067

33. L. Chen, A. B. Wolf, W. Fu, L. Li, J. M. Akey, Identifying and interpreting apparent Neanderthal ancestry in African individuals. Cell 180, 677–687.e16 (2020). doi: 10.1016 / j.cell.2020.01.012; pmid: 32004458

34. L. Skov et al., Detecting archaic introgression using an unadmixed outgroup. PLOS Genet. 14, e1007641 (2018). doi: 10.1371 / journal.pgen.1007641; pmid: 30226838

35. S. R. Browning, B. L. Browning, Y. Zhou, S. Tucci, J. M. Akey, Analysis of human sequence data reveals two pulses of archaic Denisovan admixture. Cell 173, 53–61.e9 (2018). doi: 10.1016 / j.cell.2018.02.031; pmid: 29551270

36. A. Durvasula, S. Sankararaman, A statistical model for reference-free inference of archaic local ancestry. PLOS Genet. 15, e1008175 (2019). doi: 10.1371 / journal.pgen.1008175; pmid: 31136573

37. M. Steinrücken, J. P. Spence, J. A. Kamm, E. Wieczorek, Y. S. Song, Model-based detection and analysis of introgressed Neanderthal ancestry in modern humans. Mol. Ecol. 27, 3873–3888 (2018). doi: 10.1111 / mec.14565; pmid: 29603507

38. L. Orlando et al., Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse. Nature 499, 74–78 (2013). doi: 10.1038 / nature12323; pmid: 23803765

39. J. Kelleher et al., Inferring whole-genome histories in large population datasets. Nat. Genet. 51, 1330–1338 (2019). doi: 10.1038 / s41588-019-0483-y; pmid: 31477934

40. Y. Deng, R. Nielsen, Y. S. Song, Robust and accurate Bayesian inference of genome-wide genealogies for hundreds of genomes. Nat. Genet. 57, 2124–2135 (2025). doi: 10.1038 / s41588-025-02317-9; pmid: 40921789

41. M. D. Rasmussen, M. J. Hubisz, I. Gronau, A. Siepel, Genome-wide inference of ancestral recombination graphs. PLOS Genet. 10, e1004342 (2014). doi: 10.1371 / journal.pgen.1004342; pmid: 24831947

42. L. Speidel, M. Forest, S. Shi, S. R. Myers, A method for genome-wide genealogy estimation for thoUSA.nds of samples. Nat. Genet. 51, 1321–1329 (2019). doi: 10.1038 / s41588-019-0484-x; pmid: 31477933

43. R. C. Griffiths, Neutral two-locus multiple allele models with recombination. Theor. Popul. Biol. 19, 169–186 (1981). doi: 10.1016 / 0040-5809(81)90016-2

44. R. R. Hudson, Properties of a neutral allele model with intragenic recombination. Theor. Popul. Biol. 23, 183–201 (1983). doi: 10.1016 / 0040-5809(83)90013-8; pmid: 6612631

45. D. Y. C. Brandt, X. Wei, Y. Deng, A. H. Vaughn, R. Nielsen, Evaluation of methods for estimating coalescence times using ancestral recombination graphs. Genetics 221, iyac044 (2022). doi: 10.1093 / genetics / iyac044; pmid: 35333304

46. R. Nielsen, A. H. Vaughn, Y. Deng, Inference and applications of ancestral recombination graphs. Nat. Rev. Genet. 26, 47–58 (2025). doi: 10.1038 / s41576-024-00772-4; pmid: 39349760

47. M. S. Hibbins, M. W. Hahn, Phylogenomic approaches to detecting and characterizing introgression. 220, iyab173 (2022). doi: 10.1093 / iyab173; pmid: 34788444

48. P.-R. Loh et al., Inferring admixture histories of human populations using linkage disequilibrium. 193, 1233–1254 (2013). doi: 10.1534 / .112.147330; pmid: 23410830

49. F. Baumdicker et al., Efficient ancestry and mutation simulation with msprime 1.0. 220, iyab229 (2022). doi: 10.1093 / iyab229; pmid: 34897427

50. S. Sankararaman, N. Patterson, H. Li, S. Pääbo, D. Reich, The date of interbreeding between Neandertals and modern humans. PLOS Genet. 8, e1002947 (2012). doi: 10.1371 / journal.pgen.1002947; pmid: 23055938

51. P. Moorjani et al., A genetic method for dating ancient genomes provides a direct estimate of human generation interval in the last 45,000 years. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113, 5652–5657 (2016). doi: 10.1073 / pnas.1514696113; pmid: 27140627

52. J. Choin et al., Genomic insights into population history and biological adaptation in Oceania. Nature 592, 583–589 (2021). doi: 10.1038 / s41586-021-03236-5; pmid: 33854233

53. S. Sankararaman, S. Mallick, N. Patterson, D. Reich, The combined landscape of Denisovan and Neanderthal ancestry in present-day humans. Curr. Biol. 26, 1241–1247 (2016). doi: 10.1016 / j.cub.2016.03.037; pmid: 27032491

54. E. Kerdoncuff et al., 50,000 years of evolutionary history of India: Impact on health and disease variation. Cell 188, 3389–3404.e6 (2025). doi: 10.1016 / j.cell.2025.04.027; pmid: 40578318

55. L. Skov et al., The nature of Neanderthal introgression revealed by 27,566 Icelandic genomes. Nature 582, 78–83 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2225-9; pmid: 32494067

56. L. Li, T. J. Comi, R. F. Bierman, J. M. Akey, Recurrent gene flow between Neanderthals and modern humans over the past 200,000 years. Science 385, eadi1768 (2024). doi: 10.1126 / science.adi1768; pmid: 38991054

57. I. Juric, S. Aeschbacher, G. Coop, The strength of selection against Neanderthal introgression. PLOS Genet. 12, e1006340 (2016). doi: 10.1371 / journal.pgen.1006340; pmid: 27824859

58. K. Harris, R. Nielsen, The genetic cost of Neanderthal introgression. 203, 881–891 (2016). doi: 10.1534 / .116.186890; pmid: 27038113

59. B. M. Moran et al., The genomic consequences of hybridization. eLife 10, e69016 (2021). doi: 10.7554 / eLife.69016; pmid: 34346866

60. G. McVicker, D. Gordon, C. Davis, P. Green, Widespread genomic signatures of natural selection in hominid evolution. PLOS Genet. 5, e1000471 (2009). doi: 10.1371 / journal.pgen.1000471; pmid: 19424416

61. S. Myers, L. Bottolo, C. Freeman, G. McVean, P. Donnelly, A fine-scale map of recombination rates and hotspots across the human genome. Science 310, 321–324 (2005). doi: 10.1126 / science.1117196; pmid: 16224025

62. G. Coop, X. Wen, C. Ober, J. K. Pritchard, M. Przeworski, High-resolution mapping of crossovers reveals extensive variation in fine-scale recombination patterns among humans. Science 319, 1395–1398 (2008). doi: 10.1126 / science.1151851; pmid: 18239090

63. A. B. Wolf, J. M. Akey, Outstanding questions in the study of archaic hominin admixture. PLOS Genet. 14, e1007349 (2018). doi: 10.1371 / journal.pgen.1007349; pmid: 29852022

64. L. N. M. Iasi et al., Neanderthal ancestry through time: Insights from genomes of ancient and present-day humans. Science 386, eadq3010 (2024). doi: 10.1126 / science.adq3010; pmid: 39666853

65. A.-S. Malaspinas et al., A genomic history of Aboriginal Australia. Nature 538, 207–214 (2016). doi: 10.1038 / nature18299; pmid: 27654914

66. E. Y. Hallett et al., Major expansion in the human niche preceded out of Africa dispersal. Nature 644, 115–121 (2025). doi: 10.1038 / s41586-025-09154-0; pmid: 40533559

67. E. Armstrong, M. Tallavaara, P. O. Hopcroft, P. J. Valdes, North African humid periods over the past 800,000 years. Nat. Commun. 14, 5549 (2023). doi: 10.1038 / s41467-023-41219-4; pmid: 37684244

68. D. R. Nelson, The cytochrome p450 homepage. Hum. Genomics 4, 59–65 (2009). doi: 10.1186 / 1479-7364-4-1-59; pmid: 19951895

69. G. Jones, D. E. Prosser, M. Kaufmann, Cytochrome P450-mediated metabolism of vitamin D. J. Lipid Res. 55, 13–31 (2014). doi: 10.1194 / jlr.R031534; pmid: 23564710

70. M. Roksandic, P. Radović, X.-J. Wu, C. J. Bae, Resolving the “muddle in the middle”: The case for Homo bodoensis sp. nov. Evol. Anthropol. 31, 20–29 (2022). doi: 10.1002 / evan.21929; pmid: 34710249

71. W. B. Reiner et al., OH 83: A new early modern human fossil cranium from the Ndutu beds of Olduvai Gorge, Tanzania. Am. J. Phys. Anthropol. 164, 533–545 (2017). doi: 10.1002 / ajpa.23292; pmid: 28786473

72. A. A. Mturi, New hominid from lake ndutu, Tanzania. Nature 262, 484–485 (1976). doi: 10.1038 / 262484a0

73. A. Mounier, M. Mirazón Lahr, Virtual ancestor reconstruction: Revealing the ancestor of modern humans and Neandertals. J. Hum. Evol. 91, 57–72 (2016). doi: 10.1016 / j.jhevol.2015.11.002; pmid: 26852813

74. C. Stringer, The status of Homo heidelbergensis (Schoetensack 1908). Evol. Anthropol. 21, 101–107 (2012). doi: 10.1002 / evan.21311; pmid: 22718477

75. D. L. G. Miedzianogora, C. Shipton, M. Pope, Homo heidelbergensis and the origins of The Middle Stone Age: The Kabwe (Broken Hill) lithic assemblage. Afr. Archaeol. Rev. 42, 659–682 (2025). doi: 10.1007 / s10437-025-09642-8

76. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_software (Zenodo, 2026); https: / doi.org / 10.5281 / zenodo.21541833.

77. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_pipline (, 2026); https: / doi.org / 10.5281 / .20213447.

78. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_data (, 2026); https: / doi.org / 10.5281 / .19685110.

致谢

我们感谢 R. Nielsen, N. Patterson, D. Reich, T. Wang, I. Hariharan 以及 Moorjani 和 McCoy 实验室的成员提供的有益讨论。感谢 Y. Deng 在 SINGER 方面的技术支持，以及 L. Skov 在 hmmix 和 IBDmix 相关讨论中提供的帮助。感谢 N. Patterson, M. Slatkin, E. Kerdoncuff, S. Joseph, M. Tassia, J. Ross-Ibarra 和 R. McCoy 对手稿提出的建议。资金支持：P.M. 由 Burroughs Wellcome Fund（科学界面职业奖）资助；P.M. 和 Y.Z. 由美国国家科学基金会资助（授予 P.M. 的 CAREER 2338710）。S.J. 由 NHGRI 培训资助金 (5T32HG000047-22) 资助。作者贡献：概念化：Y.Z., A.B., C.O.D., 和 P.M.；数据整理：Y.Z., S.A.J., A.B., C.O.D., 和 P.M.；形式分析：Y.Z., A.B.；资金获取：P.M.；方法论：Y.Z., A.B., 和 P.M.；软件：Y.Z. 和 A.B.；监督：

C.O.D., P.M.；验证：Y.Z., 和 P.M.；撰写——初稿：Y.Z., A.B., 和 P.M.；撰写——审阅与编辑：Y.Z., A.B., S.A.J., C.O.D., 和 P.M.。竞争利益：Y.Z., A.B., S.A.J., 和 P.M. 声明没有竞争利益。C.O.D. 目前受雇于位于美国加利福尼亚州旧金山 94080 的 insitro 公司。insitro 未参与本研究的设计或实施。数据、代码和材料可用性：本研究未产生新材料。本研究中使用的所有资源均列在表 S1 和 S2 中并可供获取。TRACE 的软件实现可在 Zenodo (76) 上获取。用于复制手稿中图表的完整流水线同样可见 (77)，过滤后的群体特异性古人类血统片段可在 Zenodo (78) 上获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为

美国科学促进会（American Association for the Advancement of Science）。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / content / page / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

补充文本；图 S1 至 S61；表 S1 至 S18；参考文献 (79–101)；

2026 年 2 月 6 日提交；2026 年 6 月 25 日接收；2026 年 7 月 30 日在线发表

10.1126 / science.aef8874

不同的性染色体招募

基因组预置与性染色体演化方向相关

Yang Zhou†, Jiazheng Jin†, 等

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aec3449

引言：脊椎动物的性别决定系统具有高度多样性，涵盖了从环境性别决定（ESD）到遗传性别决定（GSD）的范围，其中 GSD 通常表现为雄性异配体（XY）或雌性异配体（ZW）。性染色体在谱系内部及谱系之间演化迅速，这引发了一个问题：为什么特定的祖先染色体会被反复招募为性染色体。

基本原理：尽管性染色体形成和分化的底层过程已得到广泛研究，但与不同性别决定系统之间转换相关的因素仍然难以捉摸。理论模型表明，环境的不稳定性可能有利于从 ESD 向 GSD 的转换，但实证支持有限。目前尚不清楚为什么某些谱系演化出 XY 系统，而其他谱系则演化出 ZW 系统。壁虎为解决这些问题提供了一个异常具有信息量的模型：该演化支在性别决定方面表现出极高的多样性，包括温度依赖性性别决定（TSD）以及处于不同分化阶段的多个独立演化的 XY 和 ZW 系统。我们结合了染色体级别的基因组组装、系统发育重建和比较转录组学，以探索塑造性染色体演化的环境压力、基因组架构和演化约束之间的相互作用。

结果：我们为 19 种壁虎进行了染色体级别的基因组组装，涵盖了所有七个现存科，并捕捉到了 TSD、XY 和 ZW 系统。结合已发表的三例壁虎基因组，祖先核型重建显示，20 个 GSD 物种中的 22 个性染色体系统独立起源于 17 条祖先染色体。尽管具有这种独立性，它们的起源却是

性染色体演化的受限路径

大多数壁虎的性染色体独立起源于不同的祖先染色体。在 11 个可追溯日期的起源中，有 5 个与中新世中期气候转型（MMCT）[约 1000 万 年前 (Mya)] 接近。祖先状态中富含 TPEG 的区域倾向于演化为 ZW 系统，而缺乏此类基因的区域则倾向于演化为 XY——这一模式在多种独立起源的羊膜动物性染色体中均有观察到。[壁虎剪影版权归 Stuart V. Nielsen 所有]

时间上的非随机性：在 11 个可追溯日期的谱系中，有 5 个在 700 万 到 1200 万 年的时间窗口内开始进行性染色体分化，这与中新世中期气候转型（MMCT）相吻合。演化方向同样是非随机的。对最古老的性分化区域（SDRs）进行比较转录组分析显示，祖先基因含量与随后的性染色体轨迹相关：相对于基因组背景，含有过量睾丸特异性表达基因（TPEGs）的区域倾向于演化为 ZW 系统，而 TPEG 比例较低的区域则倾向于演化为 XY——这一模式在多种独立起源的羊膜动物性染色体中均有观察到。在壁虎谱系中，Y 和 W 染色体表现出依赖于年龄的基因保留模式，且大多数壁虎通过在异配配子性别中上调性连锁基因，实现了性别间的部分剂量平衡。

结论：我们的结果表明，壁虎性染色体重复的独立起源反映了外部环境背景与内在基因组含量的共同影响。重大的气候变化可能创造了有利于从环境性别决定（ESD）向基因性别决定（GSD）转变的条件，而祖先基因表达的预先差异则似乎与随后演化出雄性异配或雌性异配相关。总之，这些发现表明，性染色体的演化遵循由祖先基因组倾向和更广泛的环境背景所塑造的受限路径，而非纯粹的随机过程。□

通讯作者：Peng Shi (ship@mail.kiz.ac.cn)；Guojie Zhang (guojiezhang@zju.edu.cn) †这些作者对本工作贡献均等。本文引用格式为 Y. Zhou et al., Science 393, eaec3449 (2026). DOI: 10.1126 / science.aec3449

外部环境波动 + 内在基因组倾向与性染色体演化相关

基因组预置与性染色体演化的方向相关

Yang Zhou $^{1,2\dagger}$ , Jiazheng Jin $^{3\dagger}$ , Chuan Jiang $^{4}$ , Olga Dudchenko $^{5,6,7}$ , Brendan J. Pinto $^{8,9\dagger}$ , Zane Colaric $^{5}$ , Ruqayya Khan $^{5}$ , Arina D. Omer $^{5}$ , Xuemei Li $^{10}$ , Zhenzhen Song $^{10,11}$ , Li Han $^{12}$ , Wanyi Chen $^{1,10}$ , Lichun Jiang $^{13}$ , Zhangyue Song $^{13}$ , David Weisz $^{5,6,7}$ , Yun Xia $^{14}$ , Yin Qi $^{14}$ , Zhengqing Cao $^{1,15}$ , Yudian Peng $^{1,16}$ , Zexian Zhu $^{17}$ , Qi Zhou $^{17}$ , Yan Liu $^{18}$ , Xiaosong Gu $^{18}$ , Stuart V. Nielsen $^{19}$ , Aaron H. Griffing $^{8,20,21}$ , Tariq Ezaz $^{22}$ , Arthur Georges $^{23}$ , Ian Brennan $^{24}$ , Erez Lieberman Aiden $^{5,6,7,25}$ , Tony Gamble $^{8,26,27}$ , Peng Shi $^{28,29}$ , Guojie Zhang $^{17,30}$

性染色体演化是脊椎动物中最具动态性的基因组创新之一，但为何某些谱系演化出 XY 系统而其他谱系演化出 ZW 系统仍不清楚。通过对 19 种壁虎的染色体级基因组进行研究，我们发现壁虎的性染色体独立起源于 16 条祖先染色体。其起源在时间和方向上均是非随机的。在 11 个可测定日期的起源中，有 5 个与中中新世气候转型期（约 1000 万 years ago）相吻合。祖先基因含量与演化方向相关：睾丸富集区域倾向于演化为 ZW，而睾丸缺失区域倾向于演化为 XY，这一模式在多种羊膜动物性染色体的起源中均有观察到。具有遗传性别决定机制的壁虎通过在异配性别中上调表达，重复地演化出部分剂量平衡。因此，性染色体演化遵循祖先基因组预置和环境背景的约束。

脊椎动物的性别决定系统极其多样，涵盖了从环境性别决定（ESD）到遗传性别决定（GSD）的范围。这些系统之间的转换多次发生，但导致这些转换的因素尚未被完全理解 $(1-3)$。尽管理论模型预测 ESD 应在稳定的环境条件下演化，而 GSD 应在波动的条件下演化 $(1)$，但实证支持有限。此外，当 GSD 演化时，决定出现雄性异配（XY）还是雌性异配（ZW）系统的因素在很大程度上仍是未知的 $(4)$。关键的未解决问题包括：什么触发了 GSD 的演化 $(1, 5)$，为什么特定的基因组区域被重复地招募为性染色体 $(6-8)$，以及什么决定了向 XY 或 ZW 演化的方向 $(9, 10)$。

性染色体演化的基因组后果远超性别决定本身，影响着基因调节、剂量补偿和基因组组织等基本方面 (11–14)。一个尚未解决的问题是，祖先区域的基因组内容是否影响其作为性染色体的演化命运，或者性别偏向的基因表达模式是否仅在性染色体建立之后才出现 (2, 4, 12)。此外，在 Y 和 W 染色体逐渐退化的过程中，控制基因生存的机制在不同物种之间差异巨大，有些物种保留了大部分祖先基因，而另一些则经历了广泛的基因丢失 (2, 15, 16)。

壁虎的性别决定系统表现出显著的变异，包括温度依赖性性别决定，以及处于不同分化阶段的 XY 和 ZW 遗传系统 $(17-19)$。这种多样性涵盖了从近期演化的同形性状性别染色体到古老的、高度分化的系统 $(20)$。壁虎中不同性别决定系统的系统发育分布表明，环境性别决定（ESD）与遗传性别决定（GSD）之间发生了多次独立的转换，这为测试驱动性别染色体演化的生态和基因组因素相关假设提供了机会 $(18, 19)$。在本研究中，我们分析了 19 种壁虎，涵盖了目前所有壁虎科中约 $70\%$ 已知的独立性别染色体起源，捕捉到了记录在案的性别决定机制的多样性 $(18, 19)$。通过将染色体级别的基因组组装与针对这种自然多样性的比较转录组分析相结合，我们探讨了塑造性别染色体演化的环境压力、基因组架构以及演化约束。

壁虎谱系中的染色体级基因组组装与性染色体鉴定

我们采用了一种综合方法，结合 PacBio 长读段（连续长读段或圆形一致性测序）、10X Genomics 链接读段 [或单管长片段读段 $(21)$ ] 以及 Hi-C 测序技术，为代表壁虎所有七个科（壁虎下目 Gekkota）的 19 种壁虎生成了高质量的染色体级组装（图 1 和表 S1 至 S3）。该数据集为三种主要的脊椎动物性别决定系统提供了高质量的基因组覆盖：温度依赖性性别决定（TSD；3 种）、XY 系统（5 种）和 ZW 系统（11 种），涵盖了从同形到高度异形状态的性染色体分化全频谱 $(17-19)$ 。与已发表的壁虎组装相比，我们新生成的数据集在序列连续性和完整性方面均有显著提高（图 S1 和表 S3），

其平均 scaffold N50 为 132.83 Mb，BUSCO 完整度为 93.74%，缺口率为 0.08%（表 S3）。每个组装中约 96% 的序列被分配到染色体上（表 S3）。除 Nephrurus levis（$\sim$ 3 Gb）外，大多数物种的基因组大小在 1.6 到 2.5 Gb 之间，后者的基因组扩增主要源于长末端重复序列和长散在核元件的大量增殖（图 S2 和表 S4、S5）。

图 1. 壁虎基因组组装、系统发育及性连锁序列数据集。壁虎的基因组系统发育图，分支长度代表分化时间。J，侏罗纪；K，白垩纪；Pg，古近纪；N，新近纪。物种名称颜色：红色为本研究生成；黑色为已发表。性别决定系统（SDS）也显示在叶节点：蓝色为 XY；橙色为 ZW；灰色为 TSD。气泡图展示了关键的组装和性染色体参数。气泡大小已针对每个面板进行缩放，各面板之间不可比。[除 Lepidodactylus listeri（由 Luis Mata 根据 CC BY-NC 4.0 版权所有）和 Thamnophis elegans（由 Inklein 根据 CC BY-SA 3.0 版权所有）外，所有壁虎照片的版权均属于 Stuart V. Nielsen, Aaron H. Griffing 或 Tony Gamble]

通过对性别偏向的测序深度模式和 Hi-C 相互作用信号的综合分析，我们在 16 种基因性别决定（GSD）物种中的 12 种中鉴定出了推测的 X 和 Y（或 Z 和 W）染色体及其性别分化区域（SDRs）（表 S6 和图 S3）。对于三种具有同形性染色体的物种（22–24）——Thecadactylus rapicauda、Heteronotia binoei 和 Gekko japonicus，我们未能解析出两条性染色体（图 S4 至 S6），这可能是由于性染色体对之间的序列分化极低。尽管如此，我们利用多个雄性和雌性个体的重测序或限制性位点相关 DNA 测序数据鉴定出了它们的 SDR（方法及图 S4 至 S6）。在具有 XX / XY 系统的 Pygopus nigriceps 中（25），我们组装了完整的 X 染色体并鉴定出了其 SDR 和伪常染色体区（PAR）（图 S7），但在基因组或转录组数据中均未发现可检测到的雄性特异性序列（补充文本），这表明 Y-SDR 已经经历了极端的退化。Hi-C 接触图揭示了两种物种中存在多种性染色体系统的证据，分别是 Sphaerodactylus inigoi (XX / XY1Y2) 和 Coleonyx brevis (X1X1X2X2 / X1X2Y)（图 S8），这可能源于性染色体与常染色体的融合（26–28）。

我们性染色体组装的质量和生物学相关性得到了多项证据的验证。我们组装的性染色体从 10 个物种（18, 28–30）之前的细胞遗传学和分子研究中恢复了已知的性连锁标记（表 S6）。性连锁序列组装具有高度连续性，在 15 个 GSD 物种中，超过 95% 的 X 或 Z 连锁序列被组装进单个支架（scaffolds）中。尽管由于重复元件的复杂性，Y 或 W 连锁序列显得相对碎片化，但在 16 个 GSD 物种中的 8 个物种中，仍有超过 90% 的序列被组装进单个支架中（图 1 和表 S6）。与已发表的核型（22–24, 31–36）对比进一步确认了我们 Y / W 数据集的高度完整性（图 1 和表 S7）。

基于同源蛋白证据以及两性大脑、眼睛、尾部和性腺组织的 RNA 测序数据，对这些高质量组装结果进行注释，每个物种平均产生 20,319 个蛋白质编码基因（表 S8）。鉴定出的配子同源基因（gametolog）对的数量在不同物种之间差异巨大，从指趾虎（Hemidactylus frenatus）的仅 14 对到 Sphaerodactylus inigoi 的 1506 对不等，且配子同源基因对与 X / Z-SDR 总基因的比例从 11.23%（Nephrurus levis）到 >90%（Correlophus 属）不等（表 S9 和 S10）。

为了建立比较分析的进化框架，我们利用 19 个染色体级组装结果的全基因组比对，以及三个已发表的壁虎基因组（Sphaerodactylus townsendi、Paroedura picta 和 Lepidodactylus listeri）和两个外类群（Lacerta agilis 和 Thamnophis elegans）构建了一棵系统发育树。我们基于 89.84 Mb 全基因组比对（表 S11）的系统发育分析强有力地支持（局部后验概率 = 1.00）已确立的壁虎亲缘关系，同时通过化石校准（37, 38）提供了精确的分化时间估计（图 1 和图 S9）。该分析表明，壁虎在大约 1.91 亿年前（Mya）与所有其他蛇类和蜥蜴分化，随后在晚白垩世到早古近纪期间经历了快速辐射演化（图 1）。

壁虎性染色体的独立起源及其有限的同源性

壁虎类群中性决定系统和性染色体的多样性长期以来一直表明其具有极强的进化不稳定性 (18, 19, 39)。

先前的研究表明，在该演化支中，性染色体是从温度依赖性性别决定（TSD）的祖先多次独立起源的，而非源于频繁的性染色体更替事件 (3)。然而，这些独立起源在多大程度上是真正随机的、是否存在特定的染色体被优先重复利用，以及在性决定区域（SDR）层面保留了多少同源性，这些问题仍未得到解决。

我们利用 22 个染色体级别的壁虎基因组组装结果以及两个外类群物种，并以 Correlophus sarasinorum 为参考，推断了壁虎的祖先核型演化。我们的重建结果显示，壁虎的最近共同祖先拥有 2n = 38 条染色体（图 2A 和表 S11 至 S13），这证实了从细胞遗传学数据推断出的祖先核型 (40)。这种核型配置在现存物种中基本保持完整，例如 Correlophus 属和 Nephrurus levis，它们相对于祖先状态没有检测到染色体间重排（图 S10 和 S11）。与早期的研究一致，我们的比较基因组分析提供了强有力的证据，证明壁虎的性染色体在不同谱系中是独立起源的。通过纳入另外三个已发表且具有 SDR 数据的基因性别决定（GSD）壁虎（Saltuarius cornutus、Coleonyx elegans 和 Cyrtodactylus pharbaungensis）(19, 41, 42)，我们发现 20 个 GSD 物种中的 22 个性染色体系统源自 17 条不同的壁虎祖先染色体（GACs）（图 2B 和图 S12）。这种在壁虎谱系中重复招募性染色体的模式，证实了先前研究确立的性染色体起源广泛独立性的结论，同时通过染色体规模的组装以及在更广泛的系统发育范围内的明确 SDR 鉴定，显著扩展了我们的认知。

图 2. 壁虎性染色体的重复独立起源。(A) 重建的 Gekkota 祖先核型以及每个 GSD 物种中性染色体的演化。从分支到末端的颜色根据演化为性染色体的 GACs 为每个 GSD 物种进行编码。对于大多数 GSD 物种，显示了三条染色体（从左到右）：原性染色体、X 或 Z，以及 Y 或 W。在性染色体分化程度较低的物种中，显示原性染色体（左）和性染色体（XY 或 ZW）的合并表示（右）。性染色体演化过程中发生的染色体重排以黄色（反位）和橙色（易位）标出。从原性染色体到当前性染色体推断出的重排数量按反位、易位、分裂和融合的顺序显示。人类、鸭嘴兽、鸡和蛇的性染色体与 GACs 之间的同源性显示在顶部。(B) 在所有研究的壁虎中被检测为 SDR 的保守区块分布。方框根据 (A) 中的 GAC 进行颜色编码。保守区块被用作 SDR 的次数标在右侧。具有显著非随机性的保守区块（FDR 校正前）用红色星号标出。当区块较小且彼此接近时，我们仅使用一个星号来标记基因组中由多个连续显著区块组成的区域。(C) X 或 Z 连锁 SDR 上一对一正交基因的 Upset 图。左侧条形图的颜色与 GACs 对应。

在这种整体的独立起源模式中，性染色体的招募表现出一定的基因组预置效应（图 2B）。例如，GAC16 在四个独立的谱系中独立演化成了 ZZ / ZW 系统：Correlophus 属、Nephrurus levis、Cyrtodactylus pharbaungensis 和 Gehyra insulensis。而 Nephrurus levis 从 GAC16 采用了 ZZ / ZW 系统，其姐妹谱系 Pygopus nigriceps 则独立地从 GAC11 建立了 XX / XY 系统。同样，GAC11 在亲缘关系较远的 Hemidactylus mabouia 中也被征用为 XX / XY 系统；GAC2 在两种 Sphaerodactylus 物种中均独立演化为 XX / XY 系统；GAC5 在 Hemidactylus frenatus 和 Thecadactylus rapicauda 中趋同演化为 ZZ / ZW 系统，尽管后者经历了一次分裂事件，仅保留了 GAC5 的一部分作为其性染色体（图 2A）。这些发现与在 Gekko hokouensis 和鸟类之间观察到的平行性相呼应，两者均使用同源的祖先染色体进行性别决定 (43)。此外，我们观察到相同的 GAC 可以产生具有相反异配子模式的性染色体。例如，GAC10 在 Aristelliger praesignis 中演化为 ZZ / ZW，但在 Coleonyx brevis 中演化为 XX / XY（图 S12）。类似的情况可见于 Gekko japonicus 的 X 染色体与由 GAC9 和 GAC18 融合而成的 Christinus marmoratus Z 染色体的一部分之间，以及由 GAC13 演化而来的 Coleonyx brevis X2 与 Saltuarius cornutus Z 之间。

尽管在染色体水平上存在广泛的独立性染色体招募且具有一定的预置效应，但底层的性别决定区域（SDR）在很大程度上仍然是非同源的（图 S13）。例如，虽然 Nephrurus levis 和 Correlophus 属的性染色体均演化自 GAC16，但它们的伪常染色体区（PAR）位于染色体的相反两端。在 Aristelliger praesignis 中，SDR 几乎跨越了整个 GAC10，而在 Coleonyx brevis 中，SDR 仅覆盖了同一祖先染色体的 $\sim$ 10%，其余部分作为 PAR。Hemidactylus mabouia 和 Pygopus nigriceps 的 SDR 尽管均起源于 GAC11，但重叠部分仅为 $\sim$ 23%。在极端情况下，如 Hemidactylus frenatus 与 Thecadactylus rapicauda，以及 Christinus marmoratus 与 Gekko japonicus 之间，尽管共享相同的祖先染色体来源，但 SDR 没有任何重叠。

为了排除涉及不同染色体的性染色体更替（turnover）的可能性——这可能是由先前常染色体位点上的新性别决定突变或祖先性别决定基因易位到另一条染色体所导致的 (3) ——我们比较了不同物种间性染色体的序列分歧和基因含量。X / Y（或 Z / W）对之间的性染色体同一性在不同物种间差异显著，范围从 88.65 到 $99.97\%$（图 3A），其中分歧最大的性染色体见于 Paroedura stumpffi 的 Z / W，而最相似的见于 Correlophus 属和 Heteronotia binoei（同一性 $>95\%$；图 3A）。所有观察到的 X / Y（或 Z / W）序列分歧均远低于我们在采样中观察到的彼此最亲近亲缘物种之间的分歧水平（图 S14），从而排除了先涉及一条祖先性染色体随后更替到不同染色体的情景。基因水平的分析为独立起源提供了进一步支持。在任何给定物种中，大多数 SDR 基因与其它壁虎物种中的常染色体基因相对应；而当存在共享的 SDR 基因时，它们按物种聚集，而非按性染色体同一性聚集（图 2℃，图 S15 至 S18，以及表 S9 和 S14 至 S16）。这些系统发育模式提供了反对性染色体更替情景的证据，并支持重复独立招募模型。

我们的研究结果还解决了在测试非随机性性染色体进化理论时一个关键的方法学问题。之前的研究通常将整个染色体视为分析单位，而没有将性决定区域（SDRs）与伪常染色体区（PARs）区分开来（8, 44–46），这可能会掩盖进化的复杂性，因为 PARs 保留了类似于常染色体的特征，包括重组和剂量效应（47）。为了克服这一局限性，我们使用进化上保守的共线性区块作为单位，为测试非随机招募模式提供了前所未有的分辨率。在 23 个具有可靠识别 SDRs 的物种中，我们观察到 98 个保守的共线性区块独立且重复地（两次或更多次）进化成了 SDRs。当每个区块与其自身的长度校正空分布进行对比评估时，在进行多重检验校正之前，98 个区块中仅有 12 个显示出过量招募，而在经过错误发现率（FDR）校正后，没有一个区块保持显著性（表 S13）。这表明，在共线性区块水平上，特定基因组区域的招募通常较弱或不存在。当我们使用整个染色体作为单位重复此分析时，我们观察到 GAC16 显著富集，但也检测到 GAC18 上的假阳性，而在 Christinus marmoratus 和 Gekko japonicus 之间，其 SDRs 实际上并不具有同源性（图 S13）。

壁虎性染色体分化的时间分布

壁虎谱系中性染色体多次独立起源，为研究驱动从祖先环境性别决定（ESD）向基因性别决定（GSD）转变的进化力量提供了一个天然实验（11, 15）。为了探讨此类创新是随机发生的还是由共同的环境压力驱动的，我们在对每个谱系中的男性突变偏差进行校正后（方法），利用性染色体分化前后非编码区域的替代率，估算了所有 GSD 壁虎物种性染色体分化的时间。我们发现，性染色体的年龄差异很大，从 Phyllodactylus wirshingi 的 590 万年（Myr）到 Aristelliger praesignis 的 54.45 Myr 不等（图 3A，图 S19 至 S22，以及表 S17 和 S18）。为了验证我们的分化时间估算，我们使用四倍简并位点独立估算了地层年龄，得到了高度一致的结果 [皮尔逊相关系数 $(r) = 0.97, P = 6.99 \times 10^{-13}$；表 S18]。我们还使用 RAxML（随机加速最大似然法）从全基因组比对中推断了从头突变率，并在校正男性突变偏差后（方法），通过将 X / Y（或 Z / W）分化度除以推断的从头突变率来计算年龄，得到了高度一致的结果（皮尔逊 r = 0.99, $P = 3.98 \times 10^{-16}$；表 S18）。

尽管起源于不同的祖先染色体，并且在 733 万年至 8762 万年前就已分化的远缘壁虎谱系中独立进化（图 1），但许多壁虎物种的性染色体在相对狭窄的时间窗口内开始分化（图 3A）。具体而言，在 11 个具有 GSD 的物种中，有 5 个物种的性染色体分化时间集中在 7 到 12 Mya 之间，平均值为 9.55 Mya（图 3A 和表 S18）。为了测试这种时间集中度是否偏离随机预期，我们进行了系统发育约束的蒙特卡罗模拟（方法）。空复制样本在 7 至 12 Mya 窗口内产生如此多起源的情况极少（P < 0.01；图 S23），这支持了非随机的时间分布。虽然这种集群现象并不代表所有壁虎的普遍模式，但它确实表明性染色体

分化在多个独立谱系中同时发生。这种在 10 Mya（百万年前）左右的时间聚集与中中新世气候转型（MMCT）相吻合，那是一个全球显著冷却、干旱化和栖息地碎片化的时期，深刻影响了全球的陆地生态系统 (48)。这一古气候事件与许多脊椎动物谱系的生物地理重组相关联 (49–51)，这增加了这样一种可能性：该时期的环境变化可能产生了选择压力，从而有利于从温度依赖型性别决定（TSD）向基因型性别决定（GSD）的转变。

为了评估这一模式的更广泛普遍性，我们对羊膜动物中 32 个独立的性染色体起源估算进行了元分析，其中包括本研究中的 11 个稳健估算和 21 个已发表的估算（表 S19 和图 S24）。该数据集凸显了当前可用数据的一个关键局限：由于许多系统的完全解析的 X–Y（或 Z–W）序列和定义明确的进化地层仍然

B

C

图 3. Gecko sex chromosome divergence and evolution. (A) 壁虎的分化时间与估算的性染色体年龄。条形颜色由进化为性染色体的 GACs 决定（图 2）；半透明区域表示 $95\%$ 置信区间。历史温度数据 (88) 以每 1.5 Myr 的平均变化显示（粉色为变暖；绿色为变冷）。中间面板显示幸存的配子同源基因对（gametolog pairs）百分比，右侧面板显示 X / Y（或 Z / W）序列一致性分布。(B) 相对于基因组背景，在最古老的 X / Z-SDR 上睾丸（左）和卵巢（右）优先表达基因的比例。红点表示目标壁虎，黑点表示由其他壁虎差异所指示的祖先状态。背景颜色表示比例显著较高（红色）、较低（蓝色）或无差异（白色）。Wilcoxon 秩和检验 $ * P < 0.01$ 且 $P < 0.05$。(C) XY 和 ZW 物种中祖先基因转变为组织优先表达的比例。XY 物种显示更多基因进化为卵巢偏向性表达，而 ZW 物种显示更多基因进化为睾丸偏向性表达。在其他组织进化出偏向性表达或普遍表达的基因中未观察到显著差异。Wilcoxon 秩和检验 $ * P < 0.01$ 且 $P < 0.05$。

不可获得，因此稳健的时间推断仅限于壁虎之外的四个谱系（表 S19 和图 S24）。在这些限制下，我们观察到羊膜动物的性染色体在时间分布上似乎是非随机的，集中在之前被记录的 (52) 早白垩世区间，以及在 $\sim30$ Mya 左右，涉及 Siebenrockiella、Saltuarius、Paroedura stumpffi、Nephrurus levis 和 Furcifer（表 S19 和图 S24）。然而，考虑到样本量有限、分子定年的不确定性、区域气候的异质性以及谱系特有的进化轨迹，我们无法正式测试同步性或就普遍模式得出确定结论。尽管如此，随着基因组资源的扩展，这些初步观察为未来的比较分析奠定了基础，并表明在壁虎中观察到的时间聚集可能代表了一个可测试的框架，用于理解整个羊膜动物的性别决定进化 (11, 15)。

接下来，我们试图探讨性染色体随后演化的分子机制。根据演化理论，性染色体可以通过两种主要机制演化：连续的逐步重组抑制，从而产生离散的“演化层”（evolutionary strata）$(53)$；或者染色体序列的逐渐分化 $(2)$。我们的分析显示，在七种壁虎物种中存在明显的演化层，而五种物种则表现出逐渐分化的模式（图 S25 至 S28 及表 S17）。基因组重排通常被认为是层形成的主要驱动力之一，它可以引发性染色体之间的重组抑制 $(11, 13)$。我们观察到重排模式存在显著的不对称性：X（或 Z）染色体与其常染色体同源片段之间的共线性保存良好，这表明大多数与层相关的重排专门发生在 Y 和 W 染色体上（图 2A）。我们仅在 Pygopus nigriceps 中发现了 X 连锁反位，在 Aristelliger praesignis 中发现了 Z 连锁反位（图 2A）。这一模式与哺乳动物的观察结果相似，即 Y 特异性重排占主导地位 (53, 54)，但与鸟类相反，鸟类的 Z 和 W 染色体均会发生重排 (55)。X 与 Y 或 Z 与 W 之间的大多数重排都与层相关，且重排出现在层边界附近（图 S25），这与其在重组抑制中的作用一致。在壁虎的重排中，反位占据绝对主导地位，分别占 X / Z 和 Y / W 染色体重排的 75% 和 73%，突显了它们在建立重组抑制中的基础作用（图 2A）。我们还发现了复杂的性染色体结构案例，包括通过独立融合事件产生的多种性染色体系统，见于 Sphaerodactylus inigoi (XX / XY1Y2) 和 Coleonyx brevis (X1X1X2X2 / X1X2Y)（图 2A 及补充文本）。这些基因组重排以及随后 Y / W 染色体上的基因退化，可能创造了演化上稳定的“陷阱”，从而维持基因决定性（GSD）系统，而不会逆转为环境决定性（ESD）或转换为不同的性染色体。

性染色体分化的速率从根本上受到性别特异性突变模式的影响。“男性更快”假说提出，由于精子发生过程中细胞分裂次数增加，男性积累突变的速度高于女性 $(56, 57)$。在男性突变偏差较高的脊椎动物中，性染色体（尤其是 Y 或 W）上突变的积累导致了快速分化，且在许多情况下导致非重组染色体的渐进性退化 $(16)$。我们的分析显示，与哺乳动物 (2.0 至 2.6) 和鸟类 (2.5 至 4.1) 相比 $(58)$（表 S18），壁虎表现出相对较低的男性突变偏差 (0.74 至 1.51)。壁虎较低的男性突变偏差可能会减缓性染色体分化和退化的进程。这种降低的突变偏差或许可以解释为何壁虎在长期的演化时间尺度上能维持相对同形的性染色体 $(20)$ 和较低的性二态性 $(59–66)$。尽管我们观察到 XY 壁虎倾向于比 ZW 壁虎具有更高的男性突变偏差（Wilcoxon 秩和检验，P = 0.0112；图 S29），但这可能反映了估算上的挑战或性别间突变过程的谱系特异性变异，而非性染色体系统之间系统性的生物学差异 $(57)$。

祖先基因含量与性染色体演化方向相关

壁虎中多次独立向 GSD 系统的转变表明，某些祖先染色体倾向于演化为 XY，而另一些则优先产生 ZW（图 2B）。例如，所有五个将 GAC16 招募为性染色体的壁虎都演化成了 ZW 系统，而两种 Sphaerodactylus 则将 GAC2 招募进了 XY 系统。这种非随机模式提出了一个根本性问题：常染色体区域的祖先基因含量是否使其倾向于特定的性别决定系统。

为了回答这个问题，我们进行了比较转录组分析，重点研究最古老的 SDR 内部的基因，因为这些基因最能保留性染色体建立之前存在的祖先基因组背景。我们排除了来自较年轻 SDR 的基因，因为它们的表达模式可能会受到 XY 或 ZW 建立后出现的性别特异性选择压力的干扰 (67–69)。我们根据组织表达偏好对基因进行了分类（方法），并比较了最古老 SDR 与基因组背景（即常染色体和 PAR）之间具有组织偏好基因的比例。与基因组背景相比，Z 染色体一致地含有更高比例的睾丸优先表达基因 (TPEGs)，而 X 染色体则表现出 TPEG 比例较低的趋势（图 3B）。这一观察结果提出了两种可能的解释：要么这些差异代表了影响性染色体演化的预先存在的祖先状态，要么基因在性染色体形成后经历了男性化或女性化。

为了区分这两种可能性，我们检查了其他壁虎物种中这些区域仍为常染色体时同源基因的表达谱，从而将其作为祖先状态的代理。分析显示，在其他壁虎中，有 10 个最古老区域的 TPEG 比例与基因组背景相比有显著差异，表明这些区域在演化为性染色体之前就已经具有偏向性的基因含量（Wilcoxon 秩和检验 P < 0.05；图 3B 和表 S20）。在 TPEG 比例显著高于基因组背景的区域中，83.33% (5 / 6) 演化成了 ZW 系统（图 3B，红底橙色方框）。相反，在 TPEG 比例显著较低的区域中，75.00% (3 / 4) 演化成了 XY 系统（图 3B，蓝底蓝色方框）。尽管这种关联尚未达到统计学显著性（Yates 校正卡方检验 P = 0.236），这可能是由于样本量有限，但这一趋势促使我们评估这种关联是否在更广泛的脊椎动物中具有普适性。

我们将分析范围扩展到壁虎之外，检查了涵盖主要脊椎动物谱系的 39 个物种，代表了 15 次独立的羊膜动物性染色体起源和 24 次非羊膜动物起源（图 S30 和表 S21）。在多个独立演化出性染色体的羊膜动物谱系中，我们观察到了一致的模式。在具有 XY 系统的物种中，包括真兽类哺乳动物（人类）、单孔目（鸭嘴兽）、蛇（Eryx tataricus）和龟（Staurotypus triporcatus），其 SDR 的祖先 TPEG 比例一致地显著低于基因组背景（Wilcoxon 秩和检验 P < 0.05；图 S30）。相反，在具有 ZW 系统的鸟类（鸡）中，其最古老的 SDR 显示出较高的祖先 TPEG 比例，尽管这一差异未达到统计学显著性 (P = 0.1232；图 S30)。从定量来看，这种模式存在于所有分析的羊膜动物中，其中 6 个中的 5 个

在 TPEG 显著较高的区域中，有部分区域演化成了 ZW 系统，而在 TPEG 显著较低的区域中，有 8 个区域中的 7 个演化成了 XY 系统（Yates 校正卡方检验 P = 0.0353）。相比之下，这种关联关系在两栖动物和鱼类中较弱或不存在（图 S30）。在研究的 16 种青蛙中，祖先 SDR 的 含量与性染色体类型之间没有一致的对应关系，XY 和 ZW 系统均可由 比例升高或降低的区域演化而来。在鱼类中，我们未检测到相对于基因组背景 比例有显著变化的祖先 SDR。这些分类学上的差异表明，祖先基因表达的预测能力可能仅限于羊膜动物，而非在所有脊椎动物中通用。一种可能的解释是，羊膜动物采用体内受精（70, 71），这可能会增强交配后的性选择，并放大睾丸表达基因含量的演化意义。相比之下，两栖动物和鱼类通常通过产生大量配子的体外受精进行繁殖（70, 71），这可能会放宽此类选择压力。

虽然我们的分析主要集中在睾丸偏向性基因上，但我们也检查了包括卵巢在内的其他组织中的表达模式。在卵巢和非性腺组织中具有偏向性表达的区域似乎是随机演化为 XY 或 ZW 系统的，缺乏在睾丸偏向性基因中观察到的预测能力（图 3B，图 S31 和表 S20）。这种特异性可能反映了与睾丸功能相关的独特演化压力，由于剧烈的性选择和精子竞争，睾丸是演化最快的组织类型之一（72, 73）。

我们的研究结果还揭示了性染色体建立后二次演化过程的证据。与其它物种的同源区域相比，许多物种在当前的 SDR 中表现出更为极端的 比例（图 3℃），这表明在建立后发生了男性化或女性化。当我们比较 XY 和 ZW 物种之间的表达变化时，我们发现

Z 染色体中基因演化为睾丸偏好表达的速率显著更高，而 X 染色体中基因演化为卵巢偏好表达的速率更高。值得注意的是，表达偏好向体细胞组织转变的基因在 XY 和 ZW 系统之间没有显著差异（图 3℃），这表明在 SDR 中观察到的演化偏向是针对性腺而非通用组织表达演化的。

需要注意的是，祖先基因含量并不决定性染色体的命运。在我们的数据集中，有 6 个区域与背景相比 含量没有偏向，但仍然演化成了性染色体（4 个 XY 和 2 个 ZW）（图 3B），这表明其他因素也影响这一演化过程。尽管如此，这项工作提供了系统性的经验证据，证明祖先基因组背景与性染色体演化的方向相关，并为在不同分类群中观察到的性决定系统（即 XY 或 ZW）的非随机模式提供了一种潜在解释。

Y / W 染色体中一种依赖于年龄的基因保留机制

性染色体的进化轨迹以重组抑制和异配染色体的渐进性退化为特征 (16)，然而，在这一过程中控制基因生存的机制尚未被完全理解。我们对性染色体及其祖先常染色体对应物之间的基因数量进行了比较，结果显示不同壁虎物种的退化程度存在差异（图 3A）。这种差异遵循预期的时间模式，即基因丢失在进化早期阶段迅速发生，随后随时间推移而显著减速（图 S32），这与理论预测 (74) 以及其他脊椎动物谱系的实证研究 (55, 75) 一致。

为了理解控制基因生存的进化力量，我们研究了在哺乳动物、鸟类和蛇类古老性染色体系统研究中提出的两个主要假设 (42, 54)。第一个假设认为，对异配性别有利的基因会被优先保留并可能被扩增。第二个假设则认为，对于维持性别间表达平衡至关重要的剂量敏感基因会免于退化。尽管这些性染色体演化自不同的基因组背景，但生存下来的基因一致显示出在基础细胞功能（如核酸结合和杂环化合物结合）方面的富集，但在性腺发育或其他性别特异性角色方面缺乏富集（表 S22）。这一模式支持剂量敏感性而非性别特异性效用是壁虎基因保留的主要驱动因素。这一发现与在鸟类和蛇类中观察到的模式一致，表明蜥形类动物（sauropsids）具有共同的进化策略，这与哺乳动物中的混合保留策略形成对比 (54, 76)。

为了进一步剖析基因保留的潜在机制，我们对 X / Z 染色体上保留了 Y / W 配对同源基因（gametologs）的基因与丢失了这些基因的基因进行了详细的比较分析。我们检查了此前与基因保留相关的三个关键特征：单倍剂量不足（HI）、表达广度以及进化约束（dN / dS，即非同义替换率与同义替换率之比）(54, 76)（表 S23）。在性染色体分化程度较高的物种中，特别是 Aristelliger praesignis 和 Paroedura stumpffi，保留了同源基因对的基因比没有同源基因对的基因显示出显著更高的 HI 分数、更广泛的表达模式以及更低的 dN / dS（图 4A 和表 S23）。这一模式镜像了在哺乳动物、鸟类和先进蛇类（caenophidian snakes）古老性染色体系统中的观察结果 (54, 76)，表明尽管起源独立，但向相似保留机制的进化具有趋同性。然而，Nephrurus levis 表现出一种中间模式，其 HI 分数和表达广度有显著差异，但 dN / dS 则没有（图 4A 和表 S23），这表明这些因素的相对重要性可能会在性染色体进化过程中发生转移。

大多数具有较年轻性染色体的壁虎物种在这些特征上，保留同源基因对的基因与没有同源基因对的基因之间没有显著差异。仅出现少数例外：Sphaerodactylus inigoi 和 Phyllodactylus wirshingi 在表达广度上存在差异，而 H. mabouia 在 HI 分数上存在差异（图 4A 和表 S23）。这种保留机制中依赖于年龄的变异表明，性染色体分化的早期阶段可能受不同的选择压力支配，或者说尚未有足够的时间让强选择作用于基因保留。这一观察结果表明，保留机制在性染色体进化的所有阶段可能并非统一，并强调了研究处于不同进化阶段系统的重要性。

即使在估计年龄相近（700 万 到 1300 万 年）的壁虎物种之间，Y / W 基因的保留率也存在巨大差异，范围从 20 到 97%（图 3A）。这种差异无法用 HI、表达广度或进化约束的差异来解释，因为我们发现这些因素与保留率之间没有显著相关性（图 S33；P > 0.05）。这些物种拥有非同源 SDRs 这一事实表明，祖先基因含量可能会影响保留模式 (77, 78)，尽管我们目前的分析尚不能确定这种关系。其他影响因素，如有效群体大小、重组景观、交配系统或谱系特有的生物学约束的差异，可能会以我们目前的分析框架无法捕捉的方式影响保留模式 (79)。壁虎物种间 SDRs 的非同源特性意味着每个系统在开始时具有不同的祖先基因互补集，即使在相似的选择机制下，也可能产生截然不同的进化轨迹。未来需要结合群体基因组数据和扩大系统发育采样，以理清这些因素的相对贡献。

剂量平衡程度多样且异配配子体上调一致

性染色体的退化导致了性别之间根本性的基因组失衡，因为异配配子体性别仅携带一份功能性基因副本，而同配配子体性别则携带两份 $12, 80, 81$。Y / W 染色体上基因的丢失会导致剂量失衡，进而可能对生物体的适应性产生有害影响 $82$。虽然不同类群在剂量平衡（DB）和剂量补偿（DC）的程度与机制上存在差异，但主导这种多样性的潜在原理尚未被完全理解 $80$。

我们研究了 12 种具有完全解析的性决定区域（SDRs）的基因决定性别（GSD）壁虎物种在性别间的 DB 情况。通过对比多种体细胞组织中同配配子体和异配配子体性别之间性连锁基因的表达水平，我们发现大多数壁虎表现出部分 ，其 X:XX（或 Z:ZZ）的表达比率通常在 0.5 到 1 之间（图 4B 和表 S24）。然而，三种壁虎（Christinus marmoratus、Hemidactylus mabouia 和 Sphaerodactylus inigoi）似乎表现出完全的 ，性别间的表达水平相似（图 4B 和表 S24）。 的程度在物种之间存在显著差异，但与性染色体分化水平不相关（图 S34；P > 0.05），且在 XY 和 ZW 系统之间没有差异（图 4B）。即使在共享同源 SDRs 的物种之间，这种模式依然存在，例如 Aristelliger praesignis (ZW) 和 Coleonyx brevis (XY)，尽管它们演化出了相反的异配配子体系统，但表现出相似水平的 （图 S35）。综上所述，这些结果表明 的程度可能由谱系特异性或基因层面的特性决定，而非由性染色体系统或年龄决定。

为了进一步探索基因间的差异，我们将 X / Z 基因分为保留配子同源基因对（gametolog pairs）的基因和不含配子同源基因对的基因。在不同物种中，不含配子同源基因对的基因在性别间通常表现出比保留配子同源基因对的基因更强的 （图 4B 和图 S36；配对 Wilcoxon 符号秩检验 P < 0.05）。当计入 Y / W 配子同源基因的表达时，异配配子体性别中保留配子同源基因对的基因（即 X / Z+Y / W）达到了与同配配子体性别相当的表达水平，并表现出

A

图 4. 壁虎 Y / W 染色体基因生存因素的检查。(A) 具有配子同源基因对的 X / Z 基因 (X / ZGP) 与不含配子同源基因对的 X / Z 基因 (X / ZOP) 之间 HI 分数、表达广度和 dN / dS 的比较。与在人类和鸟类中的观察结果不同，只有少数壁虎在 XZ / GP 和 X / ZOP 之间表现出显著差异。物种按性染色体年龄排序。**P < 0.01, *P < 0.05。(B) 壁虎剂量平衡的模式。比较壁虎体细胞组织（脑、眼和尾部）中同配配子体 (hom) 性别与异配配子体 (het) 性别之间表达水平的比率。对于 Sphaerodactylus inigoi，左头和右头的表达比率模式分别显示在脑和眼行中。Log₂(hom / het) 为零表示完全剂量补偿，Log₂(hom / het) 为一表示没有剂量补偿。

与没有配对配子同源基因（gametolog pairs）的基因相比，其剂量平衡（DB）更强（图 4B 和图 S36；配对 Wilcoxon 符号秩检验 P < 0.05）。这一模式与一种缓冲模型一致，在该模型中，当缺失一个同源基因时，基因调节网络会部分补偿减少的拷贝数，而当两个拷贝均存在时，则实现接近正常的表达 (82)。这种基于配子同源基因可用性的基因级剂量平衡差异，进一步支持了内在网络韧性在应对剂量失衡中的作用，而染色质可及性等因素可能介导了这种调节灵活性 (83)。

为了确定剂量平衡（DB）背后的调节方向，我们通过将当前的性连锁基因水平与从相关物种的正交常染色体基因中推断出的祖先水平进行比较，从而将剂量补偿（DC）与剂量平衡（DB）区分开来 (80)。这种系统发育方法揭示了壁虎的剂量补偿（DC）是通过异配性别（heterogametic sex）的上调而非同配性别（homogametic sex）的下调来实现的。同配性别的表达水平与祖先常染色体状态相似，而异配性别则显示出性连锁基因的表达升高，其补偿率通常超过预期剂量差异的 0.5 倍（图 S37 和表 S24）。无论物种表现出的是部分还是完全的剂量平衡（DB），都观察到了这一模式，且与鸟类和蛇类中报道的调节模式平行 (13, 84)。这表明，异配性别的部分上调代表了一种进化上常见的调节响应，这种响应可以在不同类群中持续存在，而无需必然进化为完整的全染色体补偿。

讨论

我们对 19 种壁虎进行的比较基因组分析，为性染色体系统的演化动态提供了见解。

壁虎的性染色体由 16 条不同的祖先染色体独立演化而来，在 11 个可确定日期的起源中，有 5 个与中新世中期气候转变（MMCT，约 $ 10 Mya）的时间点接近。经蒙特卡洛模拟支持，壁虎基因性别决定（GSD）起源在时间分布上的非随机性与 MMCT 相吻合，这提出了大规模环境变化与性别决定系统一致性转变之间存在关联的可能性。这一模式表明，共同的环境背景可能会影响多个独立演化的壁虎谱系在性染色体分化时间上的同步性。通过增加环境变异性并降低温度信号的可靠性，此类事件可能使 GSD 成为稳定性别比例的一种有利机制 (1, 85, 86)。

我们的分析还表明，祖先基因表达与演化轨迹相关，睾丸富集（testis-enriched）的基因组区域优先演化为 ZW 系统，而睾丸匮乏（testis-depleted）的区域则倾向于 XY 演化。这种模式的机制基础可能反映了在向基因性别决定转变过程中，对性别偏向性基因表达的演化优化。睾丸富集区域可能被优先招募进 ZW 系统，因为随后的 W 染色体退化对雄性特有功能的影响最小，而 Z 染色体可以维持必要的雄性偏向表达模式。相反，睾丸匮乏区域更容易演化为 XY 系统，因为 Y 染色体的退化会对雄性生殖功能产生更多影响。这一模式在哺乳动物、部分蛇类和龟类中的延伸表明，基因组预设可能是羊膜动物性染色体演化方向的一个促成因素。尽管如此，我们承认该测试在统计上仍有局限（$n = 14$），需要更广泛的数据集在正式的支系平衡采样下测试其鲁棒性。

基于这些发现，我们提出了一个统一的演化模型，将环境压力、基因组预设和演化约束整合到一个连贯的框架中，以理解性染色体的演化（图 5），该模型由四个阶段组成。在阶段 1（“环境不稳定化”）中，重大的气候转变增加了环境的方差和不可预测性，产生了使温度性别决定（TSD）不稳定并有利于 GSD 演化的选择压力。在阶段 2（“偏向性基因组招募”）中，向 GSD 的转变并非随机，而是反映了基因组预设，其中睾丸富集的染色体区域优先被招募进 ZW，而睾丸匮乏区域被招募进 XY，从而优化性别偏向性基因表达的维持。在阶段 3（“渐进式分化”）中，招募后，性染色体通过重组抑制经历分化，形成离散的演化地层或渐进的分化模式。而在阶段 4（“演化稳定化”）中，Y / W 染色体的渐进式退化，结合剂量补偿机制的演化，产生了稳定性染色体系统并防止其更替的演化约束。该框架超越了描述性叙述，将环境背景与祖先基因内容联系起来。它表明，脊椎动物中性染色体的多样性可能反映了在基因组结构约束下，对环境压力的非随机响应。该模型整合了从环境触发因素到分子机制的多个演化尺度，为基础基因组创新如何在自然种群中产生并持续存在提供了更深入的理解。

有几个领域值得未来进一步研究。高度同质的性染色体对在组装方面存在挑战，限制了我们完全解析其结构以及估算部分物种性染色体年龄的能力，而长读长测序的进步将有助于克服这些限制。要建立古气候事件与性别决定转变之间的直接机制联系，需要更多可独立定年的基因性别决定（GSD）起源以及互补的谱系特异性古气候内容。大多数壁虎物种的性别决定系统仍然未知 $(18, 19)$，更广泛的分类学采样可能会揭示额外的系统，从而细化时间分布模式并评估本文报道模式的普适性。尽管我们的分析表明祖先 TPEG 的丰度与 XY 与 ZW 的演化之间可能存在关联，但其潜在的调控机制仍需深入研究。尽管某些壁虎的性别决定区域（SDR）中存在常染色体位置的经典脊椎动物性别决定基因，但这些基因在 SDR 中却缺失（见补充文本和表 S25），这表明壁虎的性别决定途径可能使用了新的分子机制，而我们的初步候选基因为功能验证提供了重要的切入点。

图 5. 性染色体演化模型。假设祖先羊膜动物具有环境性别决定，例如温度依赖性性别决定（TSD）(17,18)。环境的不稳定性可能会触发从 TSD 到 GSD 系统的转变。TPEG 的比例影响演化出 XY 还是 ZW 系统。具体而言，TPEG 比例高于基因组背景的区域或染色体倾向于演化为 ZW 系统，而 TPEG 比例低于基因组背景的区域或染色体则倾向于演化为 XY 系统。在 GSD 系统建立后，Z 染色体将通过演化出更多在睾丸中优先表达的基因而进一步男性化，而 X 染色体则通过演化出更多在卵巢中优先表达的基因而女性化。尽管 Y / W 染色体发生了退化，但某些基因可能仍在该染色体上存续。然而，不同物种中 Y / W 染色体基因的存续可能会受到其性染色体年龄差异和不同选择压力的影响。[壁虎剪影版权归 Stuart V. Nielsen 所有]

材料与方法见补充材料。

参考文献与注释

1. J. J. Bull, Sex determining mechanisms: An evolutionary perspective. Experientia 41, 1285–1296 (1985). doi: 10.1007 / BF01952071; pmid: 3899710

2. B. L. S. Furman et al., Sex chromosome evolution: So many exceptions to the rules. Genome Biol. Evol. 12, 750–763 (2020). doi: 10.1093 / gbe / evaa081; pmid: 32315410

3. B. Vicoso, Molecular and evolutionary dynamics of animal -chromosome turnover. Nat. Ecol. Evol. 3, 1632–1641 (2019). doi: 10.1038 / s41559-019-1050-8; pmid: 31768022

4. L. Kratochvil et al., Expanding the classical paradigm: What we have learnt from vertebrates about chromosome evolution. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200097 (2021). doi: 10.1098 / rstb.2020.0097; pmid: 34304593

5. S. D. Sarre, T. Ezaz, A. Georges, Transitions between -determining systems in reptiles and amphibians. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 12, 391–406 (2011). doi: 10.1146 / annurev-genom-082410-101518; pmid: 21801024

6. T. Ezaz, K. Srikulnath, J. A. Graves, Origin of amniote chromosomes: An ancestral super- chromosome, or common requirements? J. Hered. 108, 94–105 (2017). doi: 10.1093 / jhered / esw053; pmid: 27634536

7. D. Bachtrog et al., Are all chromosomes created equal? Trends Genet. 27, 350–357 (2011). doi: 10.1016 / j.tig.2011.05.005; pmid: 21962970

8. L. Kratochvil, T. Gamble, M. Rovatsos, chromosome evolution among amniotes: Is the origin of chromosomes non-random? Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200108 (2021). doi: 10.1098 / rstb.2020.0108; pmid: 34304592

9. E. Adkins-Regan, H. K. Reeve, Sexual dimorphism in body size and the origin of -determination systems. Am. Nat. 183, 519–536 (2014). doi: 10.1086 / 675303; pmid: 24642496

10. T. Lesaffre, J. R. Pannell, C. Mullon, An explanation for the prevalence of XY over ZW determination in species derived from hermaphroditism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 121, e2406305121 (2024). doi: 10.1073 / pnas.2406305121; pmid: 39316051

11. A. E. Wright, R. Dean, F. Zimmer, J. E. Mank, How to make a chromosome. Nat. Commun. 7, 12087 (2016). doi: 10.1038 / ncomms12087; pmid: 27373494

12. Z. Zhu, L. Younas, Q. Zhou, Evolution and regulation of animal chromosomes. Nat. Rev. Genet. 26, 59–74 (2025). doi: 10.1038 / s41576-024-00757-3; pmid: 39026082

13. J. A. M. Graves, Evolution of vertebrate chromosomes and dosage compensation. Nat. Rev. Genet. 17, 33–46 (2016). doi: 10.1038 / nrg.2015.2; pmid: 26616198

14. P. A. Saunders, A. Muyle, chromosome evolution: Hallmarks and question marks. Mol. Biol. Evol. 41, msae218 (2024). doi: 10.1093 / molbev / msae218; pmid: 39417444

15. D. Bachtrog et al., determination: Why so many ways of doing it? PLOS Biol. 12, e1001899 (2014). doi: 10.1371 / journal.pbio.1001899; pmid: 24983465

16. D. Bachtrog, Y-chromosome evolution: Emerging insights into processes of Y-chromosome degeneration. Nat. Rev. Genet. 14, 113–124 (2013). doi: 10.1038 / nrg3366; pmid: 23329112

17. M. Pokorná, L. Kratochvíl, Phylogeny of -determining mechanisms in squamate reptiles: Are chromosomes an evolutionary trap? Zool. J. Linn. Soc. 156, 168–183 (2009). doi: 10.1111 / j.1096-3642.2008.00481.x

18. T. Gamble et al., Restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq) reveals an extraordinary number of transitions among gecko -determining systems. Mol. Biol. Evol. 32, 1296–1309 (2015). doi: 10.1093 / molbev / msv023; pmid: 25657328

19. B. Augstenová, E. Pensabene, M. Veselý, L. Kratochvíl, M. Rovatsos, Are geckos special in determination? Independently evolved differentiated ZZ / ZW chromosomes in carphodactylid geckos. Genome Biol. Evol. 13, evab119 (2021). doi: 10.1093 / gbe / evab119; pmid: 34051083

20. T. Gamble, A review of determining mechanisms in geckos (Gekkota: Squamata). Dev. 4, 88–103 (2010). doi: 10.1159 / 000289578; pmid: 20234154

21. O. Wang et al., Efficient and unique cobarcoding of second-generation sequencing reads from long DNA molecules enabling cost-effective and accurate sequencing, haplotyping, and de novo assembly. Genome Res. 29, 798–808 (2019). doi: 10.1101 / gr.245126.118; pmid: 30940689

22. M. Schmid, C. Steinlein, T. Haaf, A. Mijares-Urrutia, Nascent ZW sex chromosomes in Thecadactylus rapicauda (Reptilia, Squamata, Phyllodactylidae). Cytogenet. Genome Res. 143, 259–267 (2014). doi: 10.1159 / 000366212; pmid: 25247775

23. C. Moritz, Parthenogenesis in the endemic Australian lizard Heteronotia binoei (Gekkonidae). Science 220, 735–737 (1983). doi: 10.1126 / science.220.4598.735; pmid: 17813878

24. Y. Shibaike et al., Chromosome evolution in the lizard genus Gekko (Gekkonidae, Squamata, Reptilia) in the East Asian islands. Cytogenet. Genome Res. 127, 182–190 (2009). doi: 10.1159 / 000303334; pmid: 20339290

25. M. Rovatsos et al., Do male and female heterogamety really differ in expression regulation? Lack of global dosage balance in pygopodid geckos. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200102 (2021). doi: 10.1098 / rstb.2020.0102; pmid: 34304587

26. B. J. Pinto et al., Chromosome-level genome assembly reveals dynamic sex chromosomes in neotropical leaf-litter geckos (Sphaerodactylidae: Sphaerodactylus). J. Hered. 113, 272–287 (2022). doi: 10.1093 / jhered / esac016; pmid: 35363859

27. M. Pokorná et al., Differentiation of sex chromosomes and karyotypic evolution in the eye-lid geckos (Squamata: Gekkota: Eublepharidae), a group with different modes of sex determination. Chromosome Res. 18, 809–820 (2010). doi: 10.1007 / s10577-010-9154-7; pmid: 20811940

28. S. E. Keating, E. Greenbaum, J. D. Johnson, T. Gamble, Identification of a cis-sex chromosome transition in banded geckos (Coleonyx, Eublepharidae, Gekkota). J. Evol. Biol. 35, 1675–1682 (2022). doi: 10.1111 / jeb.14022; pmid: 35665979

29. S. E. Keating, A. H. Griffing, S. V. Nielsen, D. P. Scantlebury, T. Gamble, Conserved ZZ / ZW sex chromosomes in Caribbean croaking geckos (Aristelliger: Sphaerodactylidae). J. Evol. Biol. 33, 1316–1326 (2020). doi: 10.1111 / jeb.13682; pmid: 32662190

30. S. V. Nielsen, J. D. Daza, B. J. Pinto, T. Gamble, ZZ / ZW sex chromosomes in the endemic Puerto Rican leaf-toed gecko (Phyllodactylus wirshingi). Cytogenet. Genome Res. 157, 89–97 (2019). doi: 10.1159 / 000496379; pmid: 30685761

31. V. A. Trifonov et al., Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843–855 (2011). doi: 10.1007 / s10577-011-9241-4; pmid: 21987185

32. K. McBee, J. Bickham, J. Dixon, Male heterogamety and chromosomal variation in Caribbean geckos. J. Herpetol. 21, 68–71 (1987). doi: 10.2307 / 1564380

33. M. Koubová et al., Sex determination in Madagascar geckos of the genus Paroedura (Squamata: Gekkonidae): are differentiated sex chromosomes indeed so evolutionary stable? Chromosome Res. 22, 441–452 (2014). doi: 10.1007 / s10577-014-9430-z; pmid: 25056523

34. K. Matsubara et al., Non-homologous sex chromosomes in two geckos (Gekkonidae: Gekkota) with female heterogamety. Cytogenet. Genome Res. 143, 251–258 (2014). doi: 10.1159 / 000366172; pmid: 25227445

35. E. Pensabene, B. Augstenová, L. Kratochvíl, M. Rovatsos, Differentiated sex chromosomes, karyotype evolution, and spontaneous triploidy in carphodactylid geckos. J. Hered. 115, 262–276 (2024). doi: 10.1093 / jhered / esae010; pmid: 38366660

36. M. Pokorná et al., Strong conservation of the bird Z chromosome in reptilian genomes is revealed by comparative painting despite 2.75 亿 years divergence. Chromosoma 120, 455–468 (2011). doi: 10.1007 / s00412-011-0322-0; pmid: 21725690

37. J. D. Daza, V. R. Alifanov, A. M. Bauer, A redescription and phylogenetic reinterpretation of the fossil lizard Hoburogekko suchanovi Alifanov, 1989 (Squamata, Gekkota), from the Early Cretaceous of Mongolia. J. Vertebr. Paleontol. 32, 1303–1312 (2012). doi: 10.1080 / 02724634.2012.702706

38. R. R. Reisz, J. Müller, Molecular timescales and the fossil record: A paleontological perspective. Trends Genet. 20, 237–241 (2004). doi: 10.1016 / j.tig.2004.03.007; pmid: 15109777

39. M. Stöck et al., A brief review of vertebrate sex evolution with a pledge for integrative research: Towards 'sexomics'. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200426 (2021). doi: 10.1098 / rstb.2020.0426; pmid: 34247497

40. M. King, Unbuckling the cladistic straight jacket: An exercise in elementary cytogenetics and a reply to Kluge (1994). Herpetologica 50, 222–237 (1994).

41. E. Pensabene, L. Kratochvil, M. Rovatsos, Independent evolution of sex chromosomes in eublepharid geckos, a lineage with environmental and genotypic sex determination. Life 10, 342 (2020). doi: 10.3390 / life10120342; pmid: 33322017

42. S. E. Keating et al., Sex chromosome turnover in bent-toed geckos (Cyrtodactylus). Genes 12, 116 (2021). doi: 10.3390 / genes12010116; pmid: 33477871

43. A. Kawai et al., The ZW sex chromosomes of Gekko hokouensis (Gekkonidae, Squamata) represent highly conserved homology with those of avian species. Chromosoma 118, 43–51 (2009). doi: 10.1007 / s00412-008-0176-2; pmid: 18685858

44. D. L. Jeffries et al., A rapid rate of sex-chromosome turnover and non-random transitions in true frogs. Nat. Commun. 9, 4088 (2018). doi: 10.1038 / s41467-018-06517-2; pmid: 30291233

45. A. El Taher, F. Ronco, M. Matschiner, W. Salzburger, A. Böhne, Dynamics of sex chromosome evolution in a rapid radiation of cichlid fishes. Sci. Adv. 7, eabe8215 (2021). doi: 10.1126 / sciadv.abe8215; pmid: 34516923

46. K. A. Behrens, S. Koblmueller, T. D. Kocher, Diversity of sex chromosomes in vertebrates: Six novel sex chromosomes in basal haplochromines (Teleostei: Cichlidae). Genome Biol. Evol. 16, evae152 (2024). doi: 10.1093 / gbe / evae152; pmid: 39073759

47. S. P. Otto et al., About PAR: The distinct evolutionary dynamics of the pseudoautosomal region. Trends Genet. 27, 358–367 (2011). doi: 10.1016 / j.tig.2011.05.001; pmid: 21962971

48. T. Westerhold et al., An astronomically dated record of Earth's climate and its predictability over the last 6600 万 years. Science 369, 1383–1387 (2020). doi: 10.1126 / science.aba6853; pmid: 32913105

49. J. L. Blois, E. A. Hadly, Mammalian response to Cenozoic climatic change. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 37, 181–208 (2009). doi: 10.1146 / annurev.earth.031208.100055

50. J. Agustí, L. Cabrera, M. Garcés, M. Llenas, “Mammal turnover and global climate change in the late Miocene terrestrial record of the Vallès-Penedès Basin (NE Spain)” in The Evolution of Neogene Terrestrial Ecosystems in Europe, J. Agustí, L. Rook, P. Andrews, Eds., vol. 1 of Hominoid Evolution and Climate Change in Europe (Cambridge Univ. Press, 1999), pp. 397–412.

51. V. Hernández-Ballarín, P. Peláez-Campomanes, Impact of global climate in the diversity patterns of middle Miocene rodents from the Madrid Basin (Spain). Palaeogeogr. Palaeoclimatol. Palaeoecol. 472, 108–118 (2017). doi: 10.1016 / j.palaeo.2017.01.029

52. R. Marin et al., Convergent origination of a Drosophila-like dosage compensation mechanism in a reptile lineage. Genome Res. 27, 1974–1987 (2017). doi: 10.1101 / gr.223727.117; pmid: 29133310

53. B. T. Lahn, D. C. Page, Four evolutionary strata on the human X chromosome. Science 286, 964–967 (1999). doi: 10.1126 / science.286.5441.964; pmid: 10542153

54. D. W. Bellott et al., Mammalian Y chromosomes retain widely expressed dosage-sensitive regulators. Nature 508, 494–499 (2014). doi: 10.1038 / nature13206; pmid: 24759411

55. Q. Zhou et al., Complex evolutionary trajectories of sex chromosomes across bird taxa. Science 346, 1246338 (2014). doi: 10.1126 / science.1246338; pmid: 25504727

56. C.-I. Wu, A. W. Davis, Evolution of postmating reproductive isolation: The composite nature of Haldane's rule and its genetic bases. Am. Nat. 142, 187–212 (1993). doi: 10.1086 / 285534; pmid: 19425975

57. T. Miyata, H. Hayashida, K. Kuma, K. Mitsuyasu, T. Yasunaga, Male-driven molecular evolution: A model and nucleotide sequence analysis. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52, 863–867 (1987). doi: 10.1101 / SQB.1987.052.01.094; pmid: 3454295

58. L. A. Bergeron et al., Evolution of the germline mutation rate across vertebrates. Nature 615, 285–291 (2023). doi: 10.1038 / s41586-023-05752-y; pmid: 36859541

59. L. Kratochvil, D. Frynta, Body size, male combat and the evolution of sexual dimorphism in eublepharid geckos (Squamata: Eublepharidae). Biol. J. Linn. Soc. Lond. 76, 303–314 (2002). doi: 10.1111 / j.1095-8312.2002.tb02089.x

60. B. E. Dial, L. C. Fitzpatrick, The energetic costs of tail autotomy to reproduction in the lizard Coleonyx brevis (Sauria: Gekkonidae). Oecologia 51, 310–317 (1981). doi: 10.1007 / BF00540899; pmid: 28310013

61. A. Atzori et al., Advances in methodologies of sexing and marking less dimorphic gekkonid lizards: The study case of the Moorish gecko, Tarentola mauritanica. Amphib. Reptil. 28, 449–454 (2007). doi: 10.1163 / 156853807781374719

62. J. G. Phillips, T. J. Hagey, M. Hagemann, E. Gering, Analysis of morphological change during a co-invading assemblage of lizards in the Hawaiian Islands. Evol. Biol. 51, 257–268 (2024). doi: 10.1007 / s11692-024-09631-w

63. R. A. How, M. A. Cowan, R. J. Teale, L. H. Schmitt, Environmental correlates of reptile variation on the Houtman Abrolhos archipelago, eastern Indian Ocean. J. Biogeogr. 47, 2017–2028 (2020). doi: 10.1111 / jbi.13881

64. J. F. Husak, Sex, size & gender roles: Evolutionary studies of sexual size dimorphism. Ornithol. Appl. 112, 183–185 (2010). doi: 10.1525 / cond.2010.112.1.183

65. L. A. Anjos, C. F. D. Rocha, Reproductive ecology of the invader species gekkonid lizard Hemidactylus mabouia in an area of southeastern Brazil. Iheringia Ser. Zool. 98, 205–209 (2008). doi: 10.1590 / S0073-47212008000200006

66. D.-I. Kim et al., Patterns of morphological variation in the Schlegel's Japanese gecko (Gekko japonicus) across populations in China, Japan, and Korea. J. Ecol. Environ. 43, 34 (2019). doi: 10.1186 / s41610-019-0132-5

67. A. Y. Albert, S. P. Otto, Sexual selection can resolve sex-linked sexual antagonism. Science 310, 119–121 (2005). doi: 10.1126 / science.1115328; pmid: 16210543

68. H. K. Reeve, D. W. Pfennig, Genetic biases for showy males: Are some genetic systems especially conducive to sexual selection? Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1089–1094 (2003). doi: 10.1073 / pnas.0337427100; pmid: 12540829

69. I. M. Hastings, Population genetics: XYZW as nature's language of love? Heredity 96, 278–279 (2006). doi: 10.1038 / sj.hdy.6800795; pmid: 16508665

70. A. F. Kahrl, R. R. Snook, J. L. Fitzpatrick, Fertilization mode drives sperm length evolution across the animal tree of life. Nat. Ecol. Evol. 5, 1153–1164 (2021). doi: 10.1038 / s41559-021-01488-y; pmid: 34155385

71. A. F. Kahrl, R. R. Snook, J. L. Fitzpatrick, Fertilization mode differentially impacts the evolution of vertebrate sperm components. Nat. Commun. 13, 6809 (2022). doi: 10.1038 / s41467-022-34609-7; pmid: 36357384

72. D. Brawand et al., The evolution of gene expression levels in mammalian organs. Nature 478, 343–348 (2011). doi: 10.1038 / nature10532; pmid: 22012392

73. Z. Y. Wang et al., Transcriptome and translatome co-evolution in mammals. Nature 588, 642–647 (2020). doi: 10.1038 / s41586-020-2899-z; pmid: 33177713

74. D. Bachtrog, The temporal dynamics of processes underlying Y chromosome degeneration. Genetics 179, 1513–1525 (2008). doi: 10.1534 / genetics.107.084012; pmid: 18562655

75. J. F. Hughes et al., Strict evolutionary conservation followed rapid gene loss on human and rhesus Y chromosomes. Nature 483, 82–86 (2012). doi: 10.1038 / nature10843; pmid: 22367542

76. D. W. Bellott, D. C. Page, Dosage-sensitive functions in embryonic development drove the survival of genes on sex-specific chromosomes in snakes, birds, and mammals. Genome Res. 31, 198–210 (2021). doi: 10.1101 / gr.268516.120; pmid: 33479023

77. D. Charlesworth, The timing of genetic degeneration of sex chromosomes. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200093 (2021). doi: 10.1098 / rstb.2020.0093; pmid: 34247501

78. D. Crowson, S. C. H. Barrett, S. I. Wright, Purifying and positive selection influence patterns of gene loss and gene expression in the evolution of a plant sex chromosome system. Mol. Biol. Evol. 34, 1140–1154 (2017). doi: 10.1093 / molbev / msx064; pmid: 28158772

79. J. A. Graves, Sex chromosome specialization and degeneration in mammals. Cell 124, 901–914 (2006). doi: 10.1016 / j.cell.2006.02.024; pmid: 16530039

80. L. Gu, J. R. Walters, Evolution of sex chromosome dosage compensation in animals: A beautiful theory, undermined by facts and bedeviled by details. Genome Biol. Evol. 9, 2461–2476 (2017). doi: 10.1093 / gbe / evx154; pmid: 28961969

81. S. Ohno, Sex Chromosomes and Sex-Linked Genes, vol. 1 of Monographs on Endocrinology (Springer, 2013).

82. J. A. Birchler, N. C. Riddle, D. L. Auger, R. A. Veitia, Dosage balance in gene regulation: Biological implications. Trends Genet. 21, 219–226 (2005). doi: 10.1016 / j.tig.2005.02.010; pmid: 15797617

83. A. Catalán, J. Merondun, U. Knief, J. B. W. Wolf, Chromatin accessibility, not 5mC methylation covaries with partial dosage compensation in crows. PLOS Genet. 19, e1010901 (2023). doi: 10.1371 / journal.pgen.1010901; pmid: 37747941

84. D. R. Schield et al., The origins and evolution of chromosomes, dosage compensation, and mechanisms underlying venom regulation in snakes. Genome Res. 29, 590–601 (2019). doi: 10.1101 / gr.240952.118; pmid: 30898880

85. M. W. Pennell, J. E. Mank, C. L. Peichel, Transitions in sex determination and sex chromosomes across vertebrate species. Mol. Ecol. 27, 3950–3963 (2018). doi: 10.1111 / mec.14540; pmid: 29451715

86. N. Valenzuela, V. A. Lance, Eds., Temperature-Dependent Sex Determination in Vertebrates (Smithsonian Institution Scholarly Press, 2004).

87. J. Jin, Dived-Jin / Gecko_Sexchromosome: Gecko_sexchromosome, v1.0.0, Zenodo (2026); https: / doi.org / 10.5281 / zenodo.18973980.

88. J. Hansen, M. Sato, G. Russell, P. Kharecha, Climate sensitivity, sea level and atmospheric carbon dioxide. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A 371, 20120294 (2013). doi: 10.1098 / rsta.2012.0294; pmid: 24043864

致谢

我们感谢 P. Doughty 在野外工作和许可办理方面提供的帮助。我们同样衷心感谢 K.C. Wong 教育基金会的支持。我们还感谢浙江大学信息技术中心和中国移动浙江公司（杭州分公司）提供的计算资源。基因组组装是与 DNA Zoo 联盟（www.dnazoo.org）合作完成的，该联盟得到了 Illumina、IBM 和 Pawsey 超级计算中心的资助。

资金支持：本研究得到了中国国家自然科学基金（资助号 32388102，资助 G.Z. 和 P.S.）、深圳市科技计划（资助号 RCBS20231211090513005）以及中国科协（CAST）青年精英科学家赞助计划（2023QNRC001，资助 Y.Z.）、中国教育部基础与交叉学科突破计划（JYB2025XDXM508）、NSF-DEB 1657662（资助 T.G.），以及通过 XPLORER 奖项的新基石科学基金、K.C. Wong 教育基金会和浙江大学全球合作伙伴基金（资助 G.Z.）的支持。E.L.A. 得到了 Welch 基金会（Q-1866）、NIH DNA 元素图谱映射中心奖（UM1HG009375）、美以双边科学基金会奖（2019276）、行为可塑性研究所（NSF DBI-2021795）以及 NSF 物理前沿中心奖（NSF PHY-2019745）的支持。

作者贡献：概念化：G.Z., T.G., P.S., Y.Z.；资源：T.G., B.J.P., X.G., Y.L., S.V.N., A.H.G., T.E., A.G., I.B.；数据生成：Zhe.S., O.D., Z.Co., R.K., A.D.O., L.J., Zha.S.；形式分析：Y.Z., J.J., C.J., X.L., Zhe.S., L.H., W.C., B.J.P., O.D., D.W., E.L.A., Y.X., Y.Q., Z.Co., Z.Ca., Y.P., Z.Z., Q.Z.；论文初稿撰写：Y.Z., J.J.；论文审阅与编辑：G.Z., Y.Z., T.G., B.J.P., A.H.G.；可视化：Y.Z., J.J., C.J., W.C., A.H.G.；监督：G.Z., Y.Z., E.L.A.；资金获取：P.S., G.Z., T.G., Y.Z., E.L.A.

竞争利益：E.L.A. 和 O.D. 持有与 Hi-C 相关的专利。E.L.A. 是 Colossal Biosciences 的科学顾问委员会成员。

数据、代码和材料可用性：壁虎基因组和转录组数据已提交至 GenBank（项目登录号 PRJNA1288340）和 CNGBdb（登录号 CNP0005488）。Hi-C 数据可在 NCBI 的 PRJNA512907 下获取（登录号 SRR35123232–SRR35123304）。本研究使用的公共数据库包括 NCBI (https: / www.ncbi.nlm.nih.gov / )、UniProt (https: / www.uniprot.org / ) 和 Repbase (: / www.girinst.org / repbase / )。本研究产生的重要数据可在 Figshare (: / figshare.com / s / 31833ea74℃36f3f36fdd) 获取。本研究使用的内部脚本可在 GitHub (: / github.com / Dived-Jin / Gecko_Sexchromosome) 和 Zenodo (87) 上获取。本研究未产生新材料。

许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会（AAAS）。美国政府原始作品不主张权利。: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

.org / doi / 10.1126 / .aec3449

材料与方法；补充文本；图 S1 至 S37；表 S1 至 S25；参考文献 (89–177)；MDAR 可重复性检查清单

2025 年 9 月 16 日提交；2026 年 3 月 15 日重新提交；2026 年 6 月 24 日接收

10.1126 / .aec3449

AAAS 的会员社区是科学家和 STEM 爱好者的一个站式目的地。这里是“科学社交之所”：一个事实至上、思想宏大，且总有理由来此交流、分享、讨论和探索的社区。

会员社区 AAAS

化学修饰 tRNA 的非病毒递送可挽救囊性纤维化中的无义突变

全文及作者所属机构列表：https: / doi.org / 10.1126 / science.aeb0054

Jingan Chen†, Muye Zhou†, Songtao Dong†, Fanglin Gong, Rasangi Tennakoon, Breanna Y. Seto, Ziyan Rachel Chen, Zhichang Peter Zhou, Jingyi Pan, Yue Xu, Sijin Luozhong, Colette Maya Macarios, Santiago Tijaro-Bulla, Tanja Gonska, Jim Hu, Haissi Cui*, Bowen Li*

引言：无义突变在信使 RNA (mRNA) 中引入了提前终止密码子 (PTC)，从而阻止全长蛋白质的产生，约占人类遗传疾病的 $ 11%。目前的治疗策略仍然有限：基因编辑方法在递送、免疫原性和脱靶效应方面面临挑战，而药理学读穿剂（readthrough agents）的疗效有限或具有相当大的毒性。抑制性转移 RNA (sup-tRNAs) 的反密码子经过工程化设计可读穿 PTC，提供了一种在不改变基因组的情况下恢复内源性蛋白质合成的 层面策略。这种可逆性、转录水平的作用、有限的可检测脱靶活性，以及在共享相同无义密码子的疾病中的潜在适用性，使得 sup-tRNAs 成为极具吸引力的治疗候选药物。然而，由于读穿效率不佳、免疫激活、功能持续时间短以及向疾病相关组织递送效率低，其治疗转化受到了限制。

原理： 修饰已成为 稳定性、翻译、免疫原性和治疗性能的关键调节因子。成熟的内源性 tRNA 经过广泛修饰，以塑造 的折叠、稳定性、氨基酰化、解码以及与翻译机器的相互作用。因此，我们假设在工程化 -tRNAs 中引入特定的化学修饰可以提高其活性及其作为药物的适用性。与此同时， 疗法的有效转化需要量身定制的递送载体，能够高效地将结构化 分子运输到疾病相关组织。我们将位点特异性 工程与大规模脂质纳米颗粒 (LNP) 筛选相结合，开发了一个针对 - 载荷优化的非病毒递送平台。我们使用囊性纤维化 (CF) 作为疾病模型来评估该 - 平台的治疗功效，因为囊性纤维化跨膜电导调节因子 (CFTR) 基因中的无义突变代表了一种尚未满足的临床需求。

结果：我们合成了多种化学修饰的 -tRNAs，并系统测试了位点特异性修饰的效果。在第 57 或 58 位引入 $N^{1}$-甲基腺苷 ($m^{1}A$) 提高了 - 的功能，对于 1 种精氨酸 -，其 PTC 读穿率提高了高达 10.6 倍。这种修饰还改善了氨基酰化，增加了功能持续时间，降低了先天免疫激活，并使携带不同氨基酸的 -tRNAs 受益。通过筛选 1000 多种可电离脂质，确定了 TTP-3 (-tailored pulmonary delivery-3)，这是一种针对 - 载荷优化的 LNP。在小鼠体内进行气管内给药后，TTP-3 LNPs 将 -tRNAs 高效递送到气道上皮细胞和祖细胞中，并显示出初步的气溶胶化兼容性。Mango II 适配体的插入实现了 - 生物分布的体内追踪，揭示了其递送至与 CFTR 表达和气道修复相关的上皮祖细胞。在 CFTR 突变的支气管上皮细胞中，修饰后的 -tRNAs

利用 LNP 递送化学修饰的 sup-tRNAs 以挽救肺部无义突变。sup-tRNAs 通过解码 PTC 来克服无义突变。化学 RNA 修饰通过增强 PTC 读穿和功能持久性，同时降低免疫激活，从而提高了 -tRNA 疗法的功效。一种定制的 LNP 在气管内给药后将修饰后的 -tRNAs 递送到气道上皮细胞，恢复了全长 CFTR 的产生和氯离子通道功能。ARS，氨酰-tRNA 合成酶。[图表由 BioRender.com 创建]

恢复了 CFTR 蛋白的表达和通道活性。在 R553X 小鼠模型中，LNP-- 治疗改善了肠道类器官中依赖于 的肿胀情况。在携带复杂 基因型的 CF 患者来源类器官模型中，-tRNAs 与 Trikafta 的联合治疗恢复了 功能，这与蛋白产生和调节剂响应的 活性的互补恢复一致。

结论：这项工作建立了一个化学修饰、非病毒递送的 - 平台，用于挽救致病性无义突变。位点特异性的 m $^{1}$ A57 / 58 修饰为增强 - 的活性、持久性和耐受性提供了一种化学策略，而 TTP-3 LNPs 则阐明了针对结构化 治疗药物进行货物特异性递送设计的重要性。适配体标记方法进一步提供了一种在体内追踪 生物分布和细胞类型靶向的通用方法。这些发现为未来基于 的药物开发提供了广泛适用的工程学见解。□

化学修饰 tRNA 的非病毒递送可挽救囊性纤维化中的无义突变

Jingan Chen $^{1,2}$ †, Muye Zhou $^{1}$ †, Songtao Dong $^{1}$ †, Fanglin Gong $^{1,2}$ , Rasangi Tennakoon $^{3}$ , Breanna Y. Seto $^{1,3}$ , Ziyan Rachel Chen $^{4,5}$ , Zhichang Peter Zhou $^{4}$ , Jingyi Pan $^{4}$ , Yue Xu $^{1}$ , Sijin Luozhong $^{1}$ , Colette Maya Macarios $^{3}$ , Santiago Tijaro-Bulla $^{3}$ , Tanja Gonska $^{4,6}$ , Jim Hu $^{4,5}$ , Haissi Cui $^{3,}$ , Bowen Li $^{1,2,3,7,}$

抑制 tRNA (sup-tRNAs) 可以通过促进提前终止密码子 (PTCs) 的读穿来挽救导致疾病的无义突变。然而，由于活性不足和体内递送效率低，其临床转化受到了限制。在这项工作中，我们将 sup-tRNAs 的位点特异性化学修饰与针对载荷定制的肺部脂质纳米颗粒 (LNP) 工程相结合，以克服这些障碍。在 - 中引入 $N^{1}$-甲基腺苷改善了 PTC 读穿，增强了 tRNA 的氨酰化，延长了功能持久性，并降低了先天免疫激活。通过高通量可电离脂质筛选和配方优化，我们鉴定出一种专为 -tRNA 定制的 LNP，能够高效地将化学修饰的 - 递送到肺部。该方法在支气管上皮细胞、小鼠模型和患者来源的类器官中恢复了囊性纤维化跨膜电导调节因子 (CFTR) 的表达和功能。因此，由 LNP 递送的化学工程 - 代表了一个治疗无义突变的潜在治疗平台。

无义突变在 mRNA 中引入了提前终止密码子 (PTCs)，导致 mRNA 翻译提前终止，从而产生截短的、无功能的蛋白质。这些突变大多源于编码区内的单核苷酸替换，约占人类遗传疾病的 11%，通常导致功能缺失表型 (1–3)。药理学读穿药物通常表现出疗效有限且具有剂量限制性毒性，而基因替代和基因组编辑策略则需要仔细评估免疫原性、脱靶效应和长期安全性 (4–6)。转运 RNA () 通过将氨基酸递送到核糖体来解码 mRNA 密码子，已成为一种广泛适用的治疗模式 (7, 8)。通过更换反密码子以识别 PTCs， 可以被工程化为抑制 tRNA (-)，它们由内源性氨酰-tRNA 合成酶 (ARSs) 进行氨酰化，并通过翻译读穿恢复全长蛋白质的合成（图 1A）(9–11)。- 还可以通过防止无义介导的衰减来间接稳定目标转录本，同时极少干扰正常的翻译终止，这使其成为治疗无义突变的一种潜在精准且安全的策略 (12, 13)。

之前的研究已经证明，使用由腺相关病毒 (AAV) 递送的 DNA 编码 - 或由脂质纳米颗粒 (LNPs) 递送的未修饰体外转录 - 可以实现无义突变的治疗性挽救 $(14-21)$。然而，临床转化仍受限于疗效不足和递送效率低。读穿效率取决于局部序列环境、翻译速度以及插入氨基酸的种类，即使是经过序列优化的 - 也经常无法实现具有治疗意义的挽救 $(21-26)$。内源性成熟 包含广泛的转录后核苷修饰，这些修饰调节着折叠、稳定性、解码和翻译保真度（图 1B）$(27-33)$。我们假设，在治疗性 - 中引入确定的化学修饰将增强其稳定性和读穿活性。

高效的体内递送是 sup-tRNA 疗法的第二个主要障碍。尽管 AAV 载体可以提供持久的表达，但其免疫原性和有限的重复给药能力限制了其临床应用 $(34, 35)$。脂质纳米颗粒（LNPs）提供了一种经过临床验证的非病毒替代方案，具有多功能的货物封装能力、低免疫原性以及与重复给药的兼容性 $(36-38)$。然而，现有的 LNP 介导的 sup-tRNA 递送依赖于针对肝脏 mRNA 递送而优化的配方，使得高效的肝外 tRNA 递送在很大程度上尚未得到探索。这一限制与囊性纤维化（CF）尤为相关，在该病中，约 $10\%$ 的患者在囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）基因中携带无义突变，无法从已批准的 CFTR 调节剂（如 Trikafta）中获益 $(39)$。在这项工作中，我们通过将 sup-tRNAs 的位点特异性化学修饰与肺部 LNP 工程相结合，解决了这些挑战。

特定化学修饰可提高 sup-tRNA 的 PTC 读取效率并降低免疫原性

为了测试化学修饰对 sup-tRNA 的影响，我们首先研究了它们对 Gly-- 的作用。我们选择 GlyTGAchr19trna2 (14) 作为甘氨酰-- 介导的 UGA 读取蓝图，因为之前的序列优化方法带来的提升有限 (21, 26)。首先，我们合成了多种化学修饰的 -，在 的不同结构区域引入了天然存在的修饰和其他修饰 (40)。修饰被安装在 D 环、T 环、反密码子环和受体茎中（图 1℃）。D 环变体包括 tGM1 [第 9 位的 1-甲基鸟苷 $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{G}9)]$、tGM2 [1-甲基腺苷 $({m}^{1}{A}26)]$、tGM3 $({m}^{1}{G}9$ 和 ${m}^{1}{A}26)$ 以及 tGM4 $({m}^{1}{A}14)$。${m}^{1}{G}9$ 和 ${m}^{1}{A}26$ 在 中可以单独出现或共同出现 (28)。T 环变体包括 tGM5 $[5,2^{\prime}$ -O-二甲基尿苷 $({m}^{5}{Um}54)]$ 和 tGM6 $({m}^{1}{A}57 / 58)$。通常，T 环的 ${m}^{1}{A}$ 修饰发生在 的第 57 或 58 位，由于 GlyTGAchr19trna2 在第 58 位缺乏腺嘌呤，我们在第 57 位引入了 ${m}^{1}{A}$ 修饰。反密码子环变体包括 tGM7 [5-甲基胞苷 $({m}^{5}{C}32)]$、tGM8 $[2^{\prime}$ -O-甲基腺苷 (Am37)] 和 tGM9 [N6-甲基腺苷 $({m}^{6}{A}37)]$。受 mRNA 治疗中假尿苷 $(\Psi)$ 降低免疫原性效果的启发，我们还创建了一个仅含 $\Psi$ 的变体（tGM10, $100$ $\Psi$）。此外，我们设计了另一个变体 (tGM11)，专门在反密码子的第 34 位引入 $\Psi$，因为 PTC 处 mRNA 的假尿苷化可增强近认知 的读取 (41)。最后，我们合成了在 CCA 末端附近包含 ${m}^{1}{A}72$ 的 tGM12。

为了评估这些化学修饰的 - 变体在解码 PTC 方面的效率，我们基于 BEAS-2B（肺上皮细胞）构建了一个报告细胞系，该细胞系表达带有 PTC (UGA) 的 NanoLuc 荧光酶 (NLuc) $(14)$（图 1D），并使用 Lipofectamine MessengerMAX 转染 - 以进行读取分析。与未修饰的对照组相比，在变体 tGM1、tGM2、tGM3 和 tGM6 中添加到 的修饰成功提高了读取效率（图 S1）。基于这些结果，我们通过结合有益修饰来探索潜在的协同效应，从而设计了 tGM13 (m $^{1}$ G9, m $^{1}$ A26, 和 m $^{1}$ A57) 和 tGM14 (m $^{1}$ G9, m $^{1}$ A26, m $^{6}$ A37, 和 m $^{1}$ A57)。随后，我们在相同的剂量水平下对所有 14 个变体进行了共同测试。在治疗 24 小时后，观察到 tGM1 (2.2-fold)、tGM2 (2.1-fold)、< 0.0001 / < 0.0001 / 0.1372 / < 0.0001 / > 0.9999 / < 0.0001 / 0.3657 / < 0.0001 / < 0.0001 的 PTC 读取有所增加。

A B D

E

F

G

图 1. RNA 化学修饰对 sup-tRNA 读穿效率和免疫原性的影响。(A) 通过 sup-tRNA 介导的 PTC 读穿以恢复全长蛋白质合成的示意图。(B) 中天然存在的化学修饰。(C) 经过工程化改造、带有 5'-UCA-3' 反密码子以解码 UGA 终止密码子的甘氨酸 - 示意图，其中包含各种位点特异性 RNA 修饰 (tGM1 至 tGM14)。(D) 用于评估 - 变体读穿效率的 NanoLuc 荧光酶 (NLuc) 带有 PTC 的报告系统方案。(E) 在不同时间点（治疗后 12, 24, 和 48 小时），使用相同剂量水平（每 $10^{5}$ 个细胞 300 ng），在 NLuc-PTC 报告系统中对 - 变体的读穿活性进行比较评估。读穿分析在 Lipofectamine MessengerMAX 介导的 转染后进行。数值代表相对于未处理对照组的倍数变化。$n = 4$ 个独立重复样本。(F 和 G) 在 THP-1 双报告细胞中对 - 变体的免疫原性进行分析，该细胞可监测 IRF 通路 (F) 和 NF- $\kappa$ B 信号通路 (G) 的激活。- 变体使用 SM-102 LNPs 进行递送。数据为平均值 $\pm$ 标准差 (SDs)；$n = 4$ 个独立重复样本。在 (E) 中，24 小时数据的 $P$ 值是通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 结合 Dunnett 多重比较检验与未修饰的 - 进行计算的。在 (F) 和 (G) 中，$P$ 值是通过单因素方差分析结合 Tukey 多重比较检验计算的。ns，无显著差异。

相对于未修饰的 -，tGM3 (2.1 倍)、tGM6 (2.4 倍)、tGM9 (1.1 倍) 和 tGM13 (1.9 倍) [有所提升] (图 1E)。其中，tGM6 显示出最大的提升 (2.4 倍)。相比之下，tGM4 (0.9 倍)、tGM5 (0.3 倍)、tGM8 (0.2 倍)、tGM10 (0.2 倍)、tGM11 (0.6 倍)、tGM12 (0.5 倍) 和 tGM14 (0.4 倍) 降低了读穿活性，而 tGM7 产生的读穿水平与未修饰的对应物相当。这一趋势在三个时间点（治疗后 12, 24, 和 48 小时）保持一致。我们进一步在其他细胞系（包括 HepG2、C2℃12 和 THP-1）中评估了所有变体。尽管绝对 PTC 读穿值在不同细胞系之间存在差异，但变体的相对性能在很大程度上是保守的，这表明读穿效率在不同细胞环境下得以保持 (图 S2)。

接下来，我们在 THP-1 双报告细胞（人类单核细胞）中评估了 - 变体的免疫原性，该细胞能够同时监测核因子 $\kappa$ B (NF- $\kappa$ B) 和干扰素调节因子 (IRF) 通路的激活。为了区分由递送载体引起与由 变体引起的免疫原性影响，该库被制成含有两种具有不同炎症特性的可电离脂质（SM-102 [较低的炎症潜力] 或 cKK-E12 [较高的炎症潜力]）的 LNPs，且采用相同的配方。在读穿分析中所使用的 剂量下，通过引起极小内在免疫激活的 SM-102 LNPs 递送显示，未修饰的 - 激活了 IRF 通路，而所有化学修饰的变体均未触发可检测到的 IRF 激活 (图 1F)。NF- $\kappa$ B 信号仅被

tGM13 和 tGM14，两者均包含多种修饰（图 1G）。为了进一步表征这些炎症反应，我们在进行细胞活力测量的同时进行了剂量反应分析。所有变体和剂量下的细胞活力均保持在较高水平，这表明观察到的反应并非由细胞毒性引起（图 S3）。在 SM-102 和 cKK-E12 制剂中观察到的类似趋势表明，差异主要反映了不同的 tRNA 修饰，而非 LNP 诱导的免疫原性。这种非预期的 NF- $\kappa$ B 激活可能解释了为何在结合了多种单独有益修饰的变体中，未观察到读穿活性的协同增强。综上所述，这些结果强调了位点特异性修饰（尤其是 m $^{1}$ A57 / 58）在提高 PTC 读穿效率的同时，维持良好免疫特性的重要性。

m $^{1}$ A58 修饰提高氨酰化效率并延长 PTC 读取持续时间

tRNA 由氨酰-tRNA 合成酶（ARS）加载正确的氨基酸，这一过程的效率影响着 mRNA 的翻译和细胞稳态 (42)（图 2A）。高效的氨酰化对于抑制子 （sup-）疗法而言，是发挥功能的关键前提。然而，为了产生 sup- 而改变反密码子可能会降低 ARS 的识别能力，从而降低针对 - 的氨酰化活性。因此，我们使用重组人甘氨酰- 合成酶 (GARS1) 评估了修饰后的 Gly-- 变体的氨酰化效率 (43)。通过与 GARS1 进行体外孵育，随后利用酸凝胶分析 的加载水平（图 2B 和图 S4）显示，$84\%$ 的天然 Gly- 实现了氨酰化。相比之下，由于反密码子在 Gly- 中充当身份基序，正如预期，将反密码子突变为 - 后，氨酰化水平有所下降（$\sim 30\%$）(44, 45)。在几种 - 变体中，化学修饰导致其加载量较未修饰的 - 显著增加，包括 tGM1（$\sim 55\%$）、tGM2（$\ 51\%$）、tGM3（$\ 68\%$）、tGM6（$\ 63\%$）和 tGM13（$\ 57\%$）。其他变体的加载情况与未修饰的 - 相似（tGM7，$\ 35\%$；tGM8，$\ 29\%$；以及 tGM9，$\ 30\%$），而某些修饰则导致 氨酰化降低（tGM5，$\ 13\%$；tGM10，$\ 11\%$；以及 tGM12，$\ 16\%$）。总体而言，在细胞实验中，氨酰化效率高的 变体表现出更高的读取报告基因活性，这表明 氨酰化是 - 效力的限制因素。与此一致，具有 100% U→Ψ 替换的 tGM10 氨酰化程度最低，这表明广泛的 Ψ 修饰严重干扰了 ARS 的识别，从而解释了在细胞中观察到的低读取率。值得注意的是，tGM13 和 tGM14 分别结合了多种修饰，其加载效率低于单修饰变体。这一降低结果与我们在基于细胞的报告基因实验中的观察结果相吻合，凸显了结合多种修饰可能会在无意中损害氨酰化，从而在激活 NF-κB 通路之外，限制治疗功效（图 1G）。此外，我们探讨了 - 中 5' 单磷酸的重要性 (46)。我们合成了最有效变体 tGM6 的一个具有 5' 羟基的替代版本，与 5' 单磷酸对应物相比，其读取能力显著降低（图 2℃）。这一发现强调了正确的 5' 端在维持 - 高治疗效率中的关键作用。

为了评估甘氨酸 - 中修饰的有益效果是否能扩展到其他 -，我们合成了 $m^{1}A58$ 修饰的精氨酸和色氨酸 - 版本。Arg-- 序列源自先前优化的变体 tRT6 (21)。我们用 $m^{1}A58$ 对 tRT6 进行了修饰（在本研究中称为 tRM6）。引入 $m^{1}A58$ 修饰显著增强了 Arg-- 和 Trp-- 的 PTC 读取效率（图 2D 和图 S5），尽管两种支架的增强幅度有所不同。值得注意的是，tRM6 的 PTC 读取效率增加了 $\ 10.6$ 倍。为了准确量化 $m^{1}A58$ 修饰对 - 氨酰化动力学的影响，我们使用放射性标记的氨基酸进行了滤膜结合实验。与天然精氨酸 (tR) 和未修饰的 Arg-- (tRT6) 相比，$m^{1}A58$ 修饰的 Arg-- 变体 tRM6 的氨酰化效率更高。tRM6 的加载效率比 tR 高 2.3 倍，比 tRT6 高 1.7 倍（图 2, E 和 F）。

接下来，我们研究了 m $^{1}$ A58 化学修饰是否能延长 tRNA 的半衰期，以及在体外和体内延长 sup-tRNA 介导的 PTC 读穿（readthrough）活动的持续时间。经修饰的 tRM6 处理的报告细胞在 30 天后仍能产生 NLuc 信号，而未修饰的 tRT6 组信号则迅速下降（图 2G）。为了直接评估 sup- 的持久性，我们在使用 tRM6 或 tRT6 处理囊性纤维化（CF）人类支气管上皮（HBE）细胞后，进行了 测序（-seq）。修饰后的 sup- 随时间推移保持较高的丰度，且在第 35 天的保留率显著高于未修饰的 ；其估计表观半衰期约为 $ 29 天（tRM6），而 tRT6 约为 $ 12 天（图 S6）。此外，tRM6 中的 m $^{1}$ A58 位点在整个时间进程中保持修饰状态，其水平与内源性精氨酸 在 58 位的修饰程度相当。相比之下，未修饰的 tRT6 仅显示出极少量的修饰，表明递送后的内源性甲基化有限。tRM6 在较晚的时间点仍主要处于氨酰化状态，表明其完整性和活性得到了维持。这些结果表明，m $^{1}$ A58 修饰增强了功能性

B

E F

○ 无 □ tR (native) ▽ tRT6 (unmodified) △ tRM6 (m $^{1}$ A $_{58}$ modified)

G

H

图 2. 化学修饰 sup- 的氨酰化、通用性和持久性表征。(A) 由 ARS 催化 氨酰化的简化示意图。甘氨酰- 合成酶与 Gly- 复合物的结构描述改编自 PDB ID 4KR2 (RCSB Protein Data Bank)。(B) 由甘氨酰- 合成酶 (GARS1) 催化的 (+) Gly- 变体与非氨酰化对照组 (−) 的氨酰化效率对比。氨酰化 （空心圆）的电泳迁移速度比非氨酰化 （实心圆）慢。n = 3 或 4 次独立重复。(C) 5'-羟基 (-OH) 和 5'-单磷酸 (-P) 末端对 sup- 读穿效率的影响，通过 NLuc_PTC 报告基因评估。n = 5 次独立重复。(D) 增强的读穿

在不同 sup-tRNA（精氨酸和色氨酸 sup-tRNA；请注意使用了不同的 y 轴刻度）中安装 m $^{1}$ A58 后的读通效率。n = 5 个独立重复样本。(E 和 F) 使用放射性标记氨基酸测定的精氨酸 - 变体的氨酰化动力学 (E) 以及 30 分钟时氨酰化效率的定量比较 (F)。n = 3 个独立重复样本。(G 和 H) 通过 NLuc_PTC 报告基因在细胞培养的体外 (G) 以及 LumA-PTC 报告基因小鼠品系肝脏的体内 (H) 环境中，评估未修饰 (tRT6) 和 m $^{1}$ A58 修饰 (tRM6) - 的功能持久性。n = 3 个生物学重复样本。(C)、(D) 和 (G) 中的基于细胞的读通和 - 持久性分析采用 Lipofectamine MessengerMAX 介导的转染；(H) 中的体内持久性在肝脏 LNP 递送后进行评估。数据为平均值 ± 标准差 (SDs)。P 值在 (C) 和 (D) 中通过双尾非配对 Student's t 检验计算，在 (F) 中通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 及 Tukey 多重比较检验计算。

持久性。我们还将修饰后的 - 与外源性 NLuc 编码 mRNA 进行了比较。在 NLuc_PTC 报告细胞系中，在 14 天的时间跨度内，递送 tRM6 产生的报告基因发光比直接递送 NLuc 编码 mRNA 更持久（图 S7）。与这一功能差异一致，到第 14 天，NLuc 的丰度下降至第 1 天水平的 $1\%$ 以下，表明修饰后的 - 具有比 更优越的稳定性。这些发现支持了基于 - 的疗法在治疗由无义突变引起的疾病方面，相比于基于 的基因替代疗法，具有通过延长内源性蛋白质恢复而产生的优势。

为了进行体内验证，我们使用了一种转基因 LumA 小鼠模型，该模型包含一个带有 UGA PTC (R387X) 的萤火虫荧光素酶 (FLuc) 基因 $(47)$。静脉注射后，tRM6 处理组小鼠肝脏中的 FLuc 发光信号显著高于 tRT6 处理组动物，且持续时间超过 30 天（图 2H），这强调了 m $^{1}$ A58 修饰的 - 在体内的持久疗效。重复给药进一步凸显了化学 修饰的优势。在第 0, 14, 和 28, 天给药后，修饰后的 - 组在每次给药后均显示出快速反弹，并在所有三个给药周期中保持相当的峰值活性，而未修饰组在随后的每次给药中反应逐渐减弱（图 S8）。这种差异表明，化学修饰提高了重复给药的耐用性，这可能是通过增加 RNA 稳定性并减少先天免疫感知（这种感知可能会在重复递送 RNA 后抑制 翻译）来实现的。

开发用于 sup-tRNA 肺部递送的 LNP 高通量筛选

接下来，我们选择开发一套专门针对 sup-tRNA 的递送系统。LNP 通常由可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和 PEG 化脂质组成，其中可电离脂质是决定递送效力、生物相容性和细胞特异性的关键成分 $(48)$；因此，脂质是最常被调整的成分。由于对脂质结构-活性关系的认识有限，我们采用了高通量方法来筛选用于 LNP 开发的多种脂质 $(49–51)$。为了专门针对肺部 sup-tRNA 递送优化 LNP，我们利用 Ugi 四组分反应 (Ugi-4CR) $(52, 53)$ 将简单的构建模块相结合，从而实现了化学多样性可电离脂质的快速一锅法合成（图 3A）。通过系统地组合 10 种胺基头基、5 种醛基连接子、5 种羧酸尾基和 4 种异氰化物尾基（图 3B），我们利用自动化机器人合成，在一天之内高效地合成了一个包含 1000 种结构截然不同的可电离脂质库。为了确定是否存在最大化 sup-tRNA 递送的特定 LNP 设计考量，我们使用 sup-tRNA（一种小型且高度结构化的 RNA）或 mRNA（一种较大的 RNA）并行筛选了同一个包含 1000 个成员的可电离脂质库。这 1000 种可电离脂质与辅助脂质、胆固醇和 PEG 化脂质一起用于相同的 LNP 配方，以封装 sup-tRNA 或 mRNA（图 3℃），并递送到 BEAS-2B 细胞中。这两次筛选产生了显著不同的结构-活性图谱，且整个库的性能显示 sup-tRNA 和 mRNA 的递送之间仅存在弱相关性（图 3, D 和 E，以及图 S9）。因此，高效递送的结构要求在不同 RNA 模态之间存在实质性差异，这证明了进行货物特异性筛选的必要性。

在囊性纤维化 (CF) 患者中，浓稠的粘液屏障阻碍了向肺上皮细胞的递送。因此，我们使用了一个与 CF 相关的气-液界面 (ALI) 培养模型，其中支气管上皮报告细胞被人工粘液覆盖，以真实地评估 LNP 的粘液穿透能力和细胞转染效率（图 3F）。在该 ALI 模型中，我们进一步测试了初步筛选中确定的前 10 种可电离脂质，并最终确定了最具潜力的可电离候选物，此后命名为 TTP-3 (tRNA-tailored pulmonary delivery-3)（图 S10）。在相同的配方测试中，TTP-3 表现出优于商业基准脂质的转染性能，包括为肺部 mRNA 递送开发的 A10-LIN，以及经 FDA 批准、专为小干扰 RNA (siRNA) 递送设计的 MC3 (Onpattro)（图 3G）。值得注意的是，尽管 A10-LIN 的效果不如 TTP-3，但相对于二次筛选中的几个顶尖候选物，其表现仍然良好。这表明 mRNA 的递送性能并不是 sup-tRNA 递送效率的可靠预测指标，从而支持针对特定货物的 LNP 开发，而非在不同 RNA 模态之间进行推演。为了进一步优化 TTP-3 LNP 的配方，我们采用了实验设计 (DoE) 方法 $(54, 55)$ 来系统地评估已知影响 LNP 转染效率的七个关键参数：(i) 可电离脂质与 RNA 的质量比，(ii) 可电离脂质的摩尔比，(iii) 辅助脂质的类型，(iv) 辅助脂质的摩尔比，(v) 甾醇的类型，(vi) 甾醇的摩尔比，以及 (vii) PEG 化脂质的摩尔比（图 3H）。我们在覆盖有粘液的 ALI 模型中测试了各种具有统计代表性的 LNP 配方，这使我们能够 [...OMITTED...]

将上皮细胞转染和气道黏液屏障同时纳入优化工作流中。通过使用一个定义为在各种条件下实验观察到的最大转染效率的期望函数，获得了优化后的 LNP 配方。最终用于肺部 sup-tRNA 递送的最佳配方由 13.5:1 的可电离脂质与 tRNA 质量比组成，其中包含 $60\%$ 的 TTP-3、$10\%$ 的 DOPE、$27.5\%$ 的 $\beta$-谷甾醇和 $2.5\%$ 的 PEG 化脂质（图 3I）。相比之下，携带 mRNA 的 TTP-3 LNP 的并行 DoE 优化收敛于一个不同的配方（图 S11），这表明可电离脂质的选择和最佳 组成均取决于载荷。在充满黏液的平行通道分析中，采用优化 配方的 -3 显示出最高的扩散率，超过了根据 Onpattro 配方制备的 -3 配方以及在相同基准配方下的 MC3（图 S12），这证明了其在气道黏液中扩散的适用性。这种优化的 -3 配方通过在 LumA (FLuc R387X) 转基因报告小鼠模型中进行气管内给药，证明了其在体内具有卓越的 sup-tRNA 肺部递送能力，显著优于 A10-LIN 和 MC3 （图 3, J 和 K，以及图 S13）。

通过吸入方式实现 sup-tRNA 递送的适配对于临床转化至关重要，特别是考虑到患者的接受度和重复给药（56–58）。因此，我们还评估了装载 sup-tRNA 的 -3 的雾化可行性，并确认雾化后的配方在 NLuc_PTC 报告细胞系统中仍保留 PTC 读取能力，尽管其程度低于未经雾化处理的制剂（图 S14）。为了在雾化过程中保护 ，我们考虑将聚乙二醇 (PEG) 的含量提高到 2.5 mol % 以上；然而，较高的 PEG 水平逐渐降低了转染效率。添加

A C B

D

E

F

G H

| | 配方优化

J LumA 小鼠模型 (Luciferase R387X)

K

图 3. 用于 sup-tRNA 肺部递送的可电离脂质库的高通量合成、筛选和优化。(A) Ugi 四组分反应示意图。该库由多种胺（头基）、醛（连接基）、羧酸尾部（尾部 A）和异氰化物尾部（尾部 B）合成。(B) 合成库中四个组分的化学结构。(C) LNP 组装及随后的高通量筛选示意图。(D) 脂质库的高通量筛选结果。（上图）用 LNP-sup-tRNA 处理的 BEAS-2B 报告细胞。（下图）用 -FLuc mRNA 处理的 BEAS-2B 细胞。热图显示归一化后的发光强度 ($\log_{2}$ RLU)，代表转染效率。(E) 筛选库中 sup-tRNA 与 mRNA 递送的脂质性能对比的 Pearson 相关性分析。(F) 包含人工黏液的 ALI 培养模型示意图，旨在模拟囊性纤维化 (CF) 肺部环境特有的黏稠黏液。(G) 在模拟 CF 的 ALI 培养中，对初步筛选出的前 10 名性能最佳的可电离脂质进行评估。n = 3 次独立重复实验。(H) 性能最佳的可电离脂质 (TTP-3) 的化学结构以及 配方优化的关键实验参数摘要。(I) 响应面图，显示基于期望函数 (desirability function) 的 TTP-3 配方参数优化，确定了 sup-tRNA 递送的最佳条件。(J) LumA_PTC 转基因小鼠模型 (Fluc R387X) 示意图，用于通过测量功能性荧光素酶蛋白的恢复来评估肺部 sup-tRNA 的转染效率。(K) 气管内给药 -tRM6 (1.25 mg / kg) 且使用不同可电离脂质后，第 3 天获取的肺部代表性 IVIS 结果。所有使用的 均采用基于 DoE 研究 (I) 优化的相同配方。n = 3 或 4 个生物学重复。数据为平均值 ± 标准差 (SDs)。(K) 中的 P 值通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 及 Tukey 多重比较检验计算得出。

poloxamer 188 可在雾化过程中稳定 (59)，它提高了雾化后的包裹效率，并更好地保留了 sup-tRNA 的活性（图 S14）。这些初步结果支持其与气溶胶化的兼容性；然而，进一步优化 配方和雾化条件可能有利于通过吸入进行递送。总体而言，这些发现强调了定制化 平台对于实现 sup-tRNAs 有效肺部递送以治疗遗传性肺部疾病的重要性。

基于荧光适配体的追踪证明了 sup-tRNA 可高效递送至肺上皮细胞和 CFTR 驻留前体细胞

为了追踪用于 tRNA 递送的优化 LNP 的生物分布和细胞靶向效率，我们将 Mango II 荧光适配体 (60, 61) 插入到 sup- 序列的可变环中。在与荧光团配体结合后，该适配体能显著增强其荧光，从而实现对 分子的直接可视化（图 4A）。为了确认适配体的插入没有损害 - 的功能，我们在 NLuc_PTC 报告细胞中评估了其性能。Mango II 修饰的 - 保留了显著的读穿活性，尽管与单独的 - 相比，其活性降低了 $\sim 30$ 到 $40$（图 S15）。适配体的插入对细胞活力、LNP 封装效率或颗粒大小没有可检测到的影响，这表明该修饰并未改变与递送和生物分布相关的关键物理化学性质。因此，Mango II 修饰的 - (_Aptamer) 被用作后续体内生物分布研究中的荧光追踪探针。

在对小鼠进行 LNP-_Aptamer 复合物的气管内给药后，我们利用流式细胞术分析了 _Aptamer 在肺中的细胞分布（图 4B 和图 S16）。在接受 TTP-3 LNP 处理的动物中，所有 _Aptamer 阳性细胞中约 60% 为上皮细胞，而免疫细胞和内皮细胞分别约占 9% 和 8%（图 4, C 和 D）。这种以上皮细胞为主的转染概况对 CF 治疗非常有益，因为 CFTR 突变主要影响肺上皮细胞。相比之下，MC3 LNPs (Onpattro) 主要转染内皮细胞（$\sim 50\%$）和免疫细胞（$\sim 15\%$），阳性上皮细胞则少得多（$\sim 19\%$）。在上皮细胞群体中，接受 TTP-3 LNP 处理后约 32% 的细胞为 _Aptamer 阳性，而 MC3 LNP 处理后仅为 13%（图 4E）。接下来，我们评估了 TTP-3 LNPs 向 CFTR 相关气道上皮群体（图 S17）的细胞递送情况，包括纤毛细胞、棒状细胞、离子细胞和基底干细胞 (56, 62)。由于基底细胞在气道上皮中具有较长的寿命和再生能力，它们是获得持久治疗效益的关键靶细胞 (63, 64)。如 _Aptamer 内化所示，TTP-3 LNPs 在这些群体中实现了强有力的递送，靶向了 22% 的纤毛细胞、19% 的棒状细胞和 32% 的基底细胞（图 4F）。离子细胞虽然稀少，但表现出约 15% 的转染效率——考虑到其高水平的内源性 CFTR 表达，这是一个显著的结果（图 S18）。肺组织的免疫荧光染色进一步证实了 TTP-3 LNP 介导的递送可到达小气道和支气管中的这些关键上皮细胞和前体细胞（图 4G）。综上所述，这些发现证明了基于荧光适配体的 标记可作为一种通用追踪平台，用于研究基于 的治疗药物的生物分布和细胞类型特异性定位。

化学修饰 sup-tRNA 在 CF 疾病模型中的治疗功效

我们接下来评估了化学修饰 sup-tRNA 在 CF 疾病模型中的治疗功效。首先，我们使用 tGM6 处理携带 CFTR G542X 变异的 16-HBEge (HBE) 细胞（图 5A），但仅观察到中度的 CFTR 蛋白恢复。鉴于 tRM6 在 NLuc_PTC 报告系统中具有更卓越的读穿效率（图 2D），我们随后测试了 tRM6 在 HBE G542X 细胞中恢复 的效果。尽管 tRM6 在 PTC 位点引入的是精氨酸而非甘氨酸，但之前的研究表明 G542R 仍具有功能 (17, 65)。免疫印迹分析证实，与 tGM6 相比，tRM6 具有更好的 恢复效果（图 5, B 和 C），这凸显了实现预期治疗结果对高 - 读穿效率的依赖性。

接下来，我们将研究扩展到携带 R1162X 变异的 HBE 细胞，其中 tRM6 强效地恢复了 蛋白（图 5, D 和 E，以及图 S19），并在治疗 40 天后仍维持较高的 水平（图 S20）。通过使用基于荧光的膜电位变化分析（FLIPR）(66, 67) 进行的功能验证，证实了 tRM6 处理的 HBE R1162X 细胞中 离子通道活性增强（图 5, F 和 G）。为了确定 - 介导的 表达是否伴随着更广泛的细胞恢复，我们对 - 处理的 HBE R1162X 细胞进行了 RNA-seq，并将其与未处理的 R1162X 和野生型 (WT) HBE 细胞进行了比较。- 处理将 转录本丰度提高至 WT 水平的 $>10\%$（图 S21 和 S22）。与治疗相关的基因表达变化在离子转运、细胞外组织和上皮稳态相关过程中富集，且与区分 WT 和未处理突变细胞的通路部分重叠（图 5, H 至 J）。因此，- 介导的 表达和功能的挽救与向恢复健康基因表达的更广泛转变相关联。

我们还检查了在标准终止密码子处潜在的脱靶读穿情况。对 - 处理的 HBE R1162X 细胞进行核糖体图谱分析显示，核糖体占用率仍集中在编码区内，在注释的标准终止密码子下游的 3' 非翻译区 (3'UTR) 信号较低，且相对于未处理细胞没有全局性增加（图 S23）。在全转录组以及内源性 转录本中均可见极少的脱靶读穿。这种选择性可能源于标准终止密码子与 PTC 不同的序列上下文：天然终止密码子位于 3'UTR / poly(A) 相关信使核糖核蛋白 (mRNP) 上下文中，其中 poly(A) 结合蛋白 (PABP) 在功能上与 eRF1 / eRF3-鸟苷 5'-三磷酸 (GTP) 协同作用以加速终止，使释放因子能够高效地竞争过 - (68)。相比之下，PTC 发生在编码区内，且距离 poly(A) 结合的 PABP 较远，这使得它们更容易被 - 介导的解码所渗透。

接下来，我们评估了在小鼠中气管内给药 LNP-- 的肺部和全身安全性。BALF 和血清细胞因子分析显示，在第 1 天出现了短暂的、剂量依赖性的炎症反应，在 5 和 $10\mathrm{mg / kg}$ 剂量下最为明显，而 1 和 $3\mathrm{-mg} / $ kg 处理组则接近磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 对照组；在所有组中，细胞因子水平在第 14 天基本恢复到基线（图 S24）。肺组织病理学、BALF 补体激活。

F

E

G

图 4. 基于适配体的可视化揭示了 TTP-3 LNP 递送的 sup-tRNAs 在体内的上皮趋向性。(A) 通过将其可变环与 Mango II 适配体融合来修饰 sup-tRNA 的示意图。该适配体特异性结合噻唑橙 (TO)-生物素，产生适用于追踪 sup-tRNA 在体内生物分布的荧光信号。(B) 将封装在 LNP 中的 tRNA_Aptamer 递送到小鼠肺部的气管内给药和分析工作流程，剂量为 $1\mathrm{mg / kg}$，共给药三次。(C 和 D) 均匀流形近似与投影 (UMAP) 图 (C) 及相应的饼图 (D)，用于描述由 TTP-3 或 MC3 LNP 配方递送后，小鼠肺中 tRNA_Aptamer 阳性细胞的身份和百分比。$n = 3$ 个生物学重复。饼图中的数据以平均值显示。(E) 代表性流式细胞术直方图及相应的定量分析，比较了小鼠肺中上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞群体中 tRNA_Aptamer 阳性细胞的分布。$n = 3$ 个生物学重复。(F) 流式细胞术实验的门控方案，显示了上皮细胞亚群中 tRNA_Aptamer 阳性百分比的代表性定量，包括纤毛细胞 (acetylated tubulin+)、Club 细胞 $(\mathrm{CCSP + })$ 和基底细胞 $(\mathrm{KRT5 + })$ 。$n = 3$ 个生物学重复。(G) 肺切片的代表性免疫荧光成像，证明了 tRNA_Aptamer 在小气道和支气管上皮亚群中的定位。比例尺：$500~{\mu\mathrm{m}}$（全肺概览）和 $100~{\mu\mathrm{m}}$（小气道和支气管图像）。数据为平均值 $\pm$ 标准差 (SDs)。$P$ 值在 (E) 中通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 结合 Tukey 多重比较检验计算，在 (F) 中通过双尾未配对 Student's $t$ 检验计算。

A

E

C

H HBE R1162X 处理组 / 未处理组

J HBE CFTR 野生型 / R1162X (未处理)

K CFTR R553X 小鼠模型

L

M

N

0

P

R CF 患者来源的肠道类器官

Q

图 5. sup-tRNAs 在细胞、小鼠及患者来源的 CF 模型中的治疗功效。(A) CFTR 突变 HBE 细胞的治疗示意图。(B 至 E) 治疗后 HBE G542X [(B) 和 (C)] 以及 R1162X [(D) 和 (E)] 细胞中 CFTR 恢复情况的免疫印迹和密度定量分析。(F 和 G) R1162X 细胞中福斯高林（forskolin）刺激的 活动的代表性 FLIPR 轨迹及定量分析。(H 至 J) Poly(A)-RNA-seq 分析。[(H) 和 (I)] 治疗组与未治疗组的 R1162X 细胞。(J) 未治疗的 WT 细胞与未治疗的 R1162X 细胞。在火山图 (H) 中，垂直虚线表示两倍变化，水平虚线表示调整后的

P < 0.05。差异表达基因的分层聚类和基因本体（gene ontology）富集分析。(K 和 L) R553X 小鼠的气管内给药方案以及治疗后的肺部 mRNA 表达情况。(M) 展示 R553X 纯合子 CF 小鼠来源的肠道类器官中 功能离体救援的实验工作流程。(N 和 O) 代表性的明场和钙黄绿素-AM（calcein-AM）荧光图像。归一化肠道类器官肿胀程度的定量分析 (n = 5)。未裁剪图像的比例尺为 1 mm。(P) 从具有复杂 突变的 CF 患者建立肠道类器官及其通过 Ussing 腔功能评估的工作流程。(Q) Ussing 腔分析中，经 DMSO（对照）、G418、Trikafta、LNP-sup-tRNA 或 LNP-sup-tRNA 与 Trikafta 联合治疗的患者来源肠道类器官的代表性电生理电压轨迹。(R) Ussing 腔分析报告的 介导的离子转运响应定量分析。数据为平均值 ± 标准差（SDs）。对于 (C)、(E)、(G) 和 (L) 中的定量分析，n = 3 个生物学重复；P 值通过单因素方差分析（one-way ANOVA）并使用 Dunnett 多重比较检验与所示对照组计算得出。在 (R) 中，n = 3 或 4 个来自一名 CF 参与者独立制备的类器官来源单层重复样本；P 值通过单因素方差分析并使用 Tukey 多重比较检验针对所示成对比较计算得出。ns，无显著差异。

以及免疫细胞分析显示出类似的模式，急性炎症和白细胞招募在较高剂量给药后早期达到峰值，并在第 14 天基本消退（图 S25）。各组间的血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 和天门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 未发生变化，表明未检测到肝毒性。综上所述，这证明了 LNP-sup-tRNA 在治疗剂量下的耐受性，其全身毒性有限，且肺部炎症为一过性且呈剂量依赖性。

随后，我们使用 CFTR R553X 小鼠模型 (62) 评估了体内治疗功效。小鼠接受了 3 次气管内 LNP-sup-tRNA 治疗。在最后一次治疗 2 天后采集的肺组织显示，tRM6 和 TTP-3 的组合产生了最显著的 CFTR mRNA 增加，而基于未修饰的 tRT6 或 MC3 的对照组则显示出较弱的挽救效果（图 5, K 和 L）。由于 CF 小鼠模型缺乏明显的肺部病理特征 (69)，我们评估了源自 R553X 小鼠的肠道类器官中 的功能挽救情况（图 5M）(70)。 活性通过福斯高林诱导肿胀 (FIS) 进行测定，结果显示在 tRM6-TTP-3 治疗后， 介导的离子和水分流入类器官腔内的程度最高，而在使用未修饰 sup-tRNA 或非优化 LNP 的组别中较低（图 5, N 和 O，以及图 S26）。增强了内在 PTC 读取通过能力的优化修饰 tRM6，与改善了 RNA 载荷递送的 sup-tRNA 定制 TTP-3 LNP 相结合，产生了最理想的结果。

此外，我们测试了 sup-tRNAs 在源自一名具有复杂 突变 (S466X / R1070Q / R553X / 1716G / A) 的 CF 患者类器官中的治疗功效（图 5P）。该变体涵盖了多种类别的 缺陷，包括两个无义突变、一个错义突变和一个多态性，代表了治疗干预中一个极具挑战性的临床场景。临床批准的 调节剂 (Trikafta) 和诱导读取通过的氨基糖苷类药物 G418 被纳入用于对比。tRM6 和丝氨酸 sup-tRNA (tSA2T5) (21) 被用于抑制无义突变。Ussing 室测量显示，单独使用 G418 或 Trikafta 均未能有效恢复患者类器官中的 功能（图 5Q）。这些结果与临床观察一致，即缺乏足够全长 蛋白产出的 CF 患者无法从现有的 调节剂中获益。I 类无义突变减少或消除了全长 的产生，从而限制了 介导的校正和增强作用。值得注意的是，将 LNP-sup-tRNAs 与 结合使用导致 功能显著增加（图 5R）。虽然单独使用 LNP-sup-tRNAs 相对于未治疗对照组仅产生轻微且不显著的增加，但联合疗法利用了互补的挽救机制：sup-tRNAs 恢复了全长 蛋白的合成，从而使 能够支持恢复蛋白的折叠、运输和 / 或通道活性。这一发现展示了一种极具前景的互补治疗方法，并强调了结合多种疗法以挽救复杂 基因型的重要性。

讨论

抑制 tRNA（sup-tRNAs）通过促进提前终止密码子（PTC）的读穿而不改变基因组，为治疗由无义突变引起的疾病提供了一种极具吸引力的 RNA 层面策略 (71, 72)。与基因编辑方法不同，sup-tRNAs 是可逆的，且能避免永久性的基因组改变，从而减少了与非预期脱靶编辑或生殖系传递相关的担忧，并且它们不需要针对特定基因的引导 RNA (gRNA) 优化。虽然 mRNA 介导的蛋白质替代在给定基因内与突变类型无关，但 -tRNA 疗法具有独特的优势，包括恢复内源性基因表达、延长功能持久性以及在多种疾病中的广泛适用性，同时能规避因蛋白质水平升高而产生的副作用。值得注意的是，单一的 -tRNA 潜力地可以针对多个致病基因中的同一种无义突变。例如，精氨酸到 UGA 的无义突变约占所有已知致病 PTC 的 24% (1, 73)，这表明单一的精氨酸 -tRNA 可应用于广泛的遗传性疾病。这些特性使得 - 在需要从内源性转录本恢复天然全长蛋白质时显得尤为具有吸引力。

在本研究中，我们证明了与未修饰的 - 相比，位点特异性化学修饰显著改善了 - 的治疗效果和安全性。当使用定制的、针对肺部优化的 LNP 系统递送时，这些修饰后的 - 在多种囊性纤维化（CF）疾病模型中恢复了 CFTR 的表达和功能，支持其用于治疗性的无义突变读穿。值得注意的是，在具有复杂基因型的患者来源类器官模型中，联合使用修饰后的 - 和 Trikafta 实现了 CFTR 的功能救回。在这种情况下，- 抑制无义突变以恢复全长 的合成，而 Trikafta 则支持 的折叠、运输和活性。这种互补性在临床上具有重要意义，因为包括 Trikafta 在内的 调节剂需要能够响应调节剂的全长 蛋白质才能发挥作用，

这限制了它们在 I 类无义突变主导或复杂基因型中的应用。值得注意的是，本研究仅聚焦于一名 CF 参与者，因此应将其视为一项原理验证；未来还需要在具有不同基因型的患者来源模型中进行进一步测试，以支持该联合策略的普适性。尽管如此，这些发现支持了这样一个观点，即修饰后的 - 可以恢复全长 的表达，以便随后进行药理学调节，凸显了基因型告知的联合疗法对于目前 疗法覆盖不足的患者的潜力。为了实现 tRNA 的规模化生产，可以通过固相合成获取化学修饰的 -，从而实现对 5' 末端和位点特异性修饰的控制。其他方法，如体外转录后进行酶促修饰 (74)，可能会进一步

提高可扩展性和成本效益。这些制造策略可以支持修饰 tRNA 的规模化生产，并有利于 tRNA 药物研发的更广泛发展。

通过对位点特异性 RNA 修饰的系统研究，本研究揭示了不同修饰如何影响抑制性 tRNA（sup-tRNAs）治疗性能的机制。这些发现强调了保留天然 tRNA 结构的重要性，并支持将结构导向工程作为 sup- 优化的指导原则 $(75, 76)$。尽管 RNA 修饰日益被认为是细胞、发育和疾病过程的调节因子 $(77, 78)$，但它们在治疗性 中的潜力尚未得到充分挖掘。本研究的一个局限性在于仅测试了定义好的部分修饰子集。在 RNA-seq 和化学合成进步的助力下，对其他 RNA 修饰的持续研究应当能揭示更多增强疗效并扩大基于 技术治疗范围的修饰模式 $(79, 80)$。此外，尽管某些修饰在多种 支架中可能具有广泛的用途，但最优设计可能取决于序列上下文、氨基酸身份和疾病环境。临床转化还需要高效的细胞和 / 或组织特异性递送、对重复给药的支持以及最大限度地减少脱靶暴露。 工程和递送方面的进展可能会将基于 的疗法从无义抑制扩展到其他遗传改变，包括错义和移码突变，以及在翻译控制和 片段介导的调节通路中的新兴应用 $(81, 82)$，从而有助于为下一代 疗法奠定基础。

材料与方法 tRNA 合成

化学修饰的 sup-tRNA 由 GenScript 公司采用固相 RNA 寡核苷酸合成法合成，其中包含 5' 单磷酸末端并根据需要加入特定的 RNA 修饰，随后通过无 RNase 的 HPLC 进行纯化。未修饰的 tRNA 通过体外转录 (IVT) 生成。序列详见表 S1 (14, 21)。对于 IVT，编码所需 tRNA 序列的 DNA 寡核苷酸购自 IDT (Integrated DNA Technologies)。这些 模板使用 Phusion 高保真 聚合酶 (NEB, 编号 M0531S) 通过聚合酶链式反应 (PCR) 进行扩增。扩增后的 产物作为 的模板，使用 HiScribe T7 RNA 合成试剂盒 (NEB, 编号 E2040) 进行操作，并添加鸟苷单磷酸 (GMP) 至最终浓度 1.8 mM，以确保 5' 单磷酸末端。 反应在 37℃ 下孵育 16 小时。

产物通过凝胶电泳切胶纯化。具体而言，使用酵母 tRNA (Invitrogen, 编号 15401011) 作为分子量标准 (图 S1)，从 10% TBE-尿素凝胶 (Bio-Rad, 编号 4566033) 中切下对应所需长度的 RNA 条带。切下的凝胶块在低 pH 缓冲液 (20 mM Tris, 200 乙酸钠, 5 EDTA, pH 5.0) 中于 37℃ 下孵育过夜。过夜孵育后，通过添加乙酸钠至最终浓度 300 ，随后加入 2.5 倍体积的冰冷 100% 乙醇使 RNA 沉淀。样本充分混合并于 -80℃ 保存 1 小时。随后通过离心收集 RNA 沉淀，用 70% 乙醇洗涤一次，风干，并重新悬浮于超纯水中。为了使 tRNA 正确折叠，样本首先在热循环仪中于 80℃ 下变性，然后以 0.1℃ / s 的速率逐渐冷却至 65℃。在 65℃ 时，加入 MgCl₂ 以达到 10 的最终浓度。样本轻轻混合，并在热循环仪中以相同的受控速率 (0.1℃ / s) 缓慢冷却至室温，以促进 RNA 折叠。

NLuc_PTC 报告细胞系构建

在 pB-EF1a-Nluc-IRES-Puro 质粒 (Addgene 编号 130936) 的 NanoLuc (NLuc) (14) 氨基酸位置 160 处引入 opal 终止密码子 TGA，从而构建 pB-EF1a-Nluc V160X-IRES-Puro (PB_PTC_Nluc) 载体。该构建体被转化到 NEB 10-beta 感受态大肠杆菌细胞 (NEB, 编号 C3019) 中，甘油菌株储存于 $-80^{\circ}\mathrm{C}$ 以备后用。后续实验和哺乳动物测定中使用的质粒使用 PureYield 质粒小量提取系统 (Promega, 编号 A1222) 进行纯化，该系统包含一个内毒素去除步骤。质粒维持和实验筛选所需的抗生素购自 InvivoGen。为了建立报告细胞系，将 BEAS-2B 细胞以每孔 $1\times 10^{6}$ 个细胞的密度接种到 6 孔板中。使用 FuGENE 6 转染试剂对细胞进行转染，比例为每 1 $\mu$ g 使用 $3\mu l$ 试剂，遵循制造商的方案。每次转染包含 0.2 $\$ g 的 super PiggyBac 转座酶载体 (System Biosciences) 和 0.6 $\$ g 的 PB_PTC_Nluc 质粒 。转染三天后，将培养基更换为添加了 2 $\$ g / ml 嘌呤霉素 (InvivoGen, 编号 58-58-2) 的新鲜培养基，以筛选转染细胞。孵育 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞两次，并提供新鲜培养基。存活的嘌呤霉素耐药细胞被命名为 NLuc_PTC BEAS-2B 报告细胞。为了测试 tRNA 诱导的读穿以及 sup-tRNA 变体的体外动力学研究，使用 Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen, 编号 LMRNA008) 对这些 NLuc_PTC 报告细胞进行转染。

细胞培养

人肺上皮（BEAS-2B）细胞和 HBE (16HBE14o-) 细胞由 J. Hu 赠送。CFF-16HBEge CFTR G542X 和 CFF-16HBEge CFTR R1162X 细胞由 H. Valley 和囊性纤维化基金会治疗实验室（Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics Lab）提供。所有上皮细胞均维持在补充有 10% 胎牛血清 (FBS) (Gibco) 和 1% 青霉素 / 链霉素 (Gibco) 的 Eagle 最小必需培养基 (MEM) 中。THP-1 Dual 细胞（人单核细胞）购自 InvivoGen (no. thpd-nfis)。THP-1 双报告细胞维持在 RPMI 1640 ()、2 mM L-谷氨酰胺、25 mM HEPES、10% 热灭活 FBS ()、100 $\mu$ g / ml Normocin (InvivoGen, no. ant-nr-1) 和 1% 青霉素 / 链霉素 () 中。细胞生长在含有 5% CO $_{2}$、温度为 37℃ 的加湿培养箱中。本研究中涉及的所有细胞系均使用支原体 PCR 检测定期监测支原体污染，结果一致为阴性。

免疫原性报告基因检测

将 THP-1 双报告细胞以每孔 $1 \times 10^{5}$ 个细胞的密度接种到 U 型底 96 孔板中。为了评估 tRNA 变体的免疫原性，用 LNP 封装的 sup-tRNA 或空 LNP 对照处理细胞。在 $37^{\circ}\mathrm{C}$ 下孵育 24 小时后，将 $20~\mu \mathrm{l}$ 细胞上清液与 $180~\mu {l}$ QUANTI-Blue 试剂 (InvivoGen, no. rep-qbs) 混合并孵育 1 小时。使用 Cytation 1 细胞成像多模式阅读器 (BioTek) 测量 $630~{nm}$ 处的光密度 (OD) 以定量 SEAP 活性，该活性指示 NF- $\kappa$ B 通路的激活。同时，将另外 $20~\mu {l}$ 上清液与 $50~\mu {l}$ QUANTI-Luc 试剂 (InvivoGen, no. rep-qlc1) 在白色不透明板中结合，并使用相同的 Cytation 1 板阅读器测量发光强度。发光值以相对发光单位 (RLUs) 报告，对应于 IRF 通路的激活。

用于体外氨酰化检测的酸-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)

使用 2 $\mu$ g tRNA 的氨酰化反应在 100 Hepes (pH 7.5)、20 KCl、2 二硫苏糖醇 (DTT)、10 MgCl $_{2}$、1 腺苷 5'-三磷酸 (ATP) 和 2 $\mu$ M 纯化重组人 GARS1 中进行。tRNA 在 37℃ 下氨酰化 30 分钟，随后将样本与 2× 酸性 RNA 上样染料（8 M 尿素、0.05% 溴酚蓝、0.05% 齐兰蓝色 FF 和 0.1 M NaOAc, pH 5）混合。带电荷和不带电荷的 tRNA 通过 20 cm 酸性变性 PAGE [4% 浓缩胶和 6.5% 分离胶 (19:1) 丙烯酰胺:双丙烯酰胺，8 M 尿素，以及 0.1 M NaOAc, pH 5] 在 4℃ 下分离。随后使用 SYBR Green II RNA 凝胶染料 (Invitrogen, no. S7564) 对 tRNA 进行可视化。

放射性标记氨酰化检测

包含 100 Hepes (pH 7.5)、20 KCl、2 DTT、10 MgCl $_{2}$、1 ATP、20 $\mu$ M L-精氨酸、5 $\mu$ M L-[3H] 精氨酸和 5 $\mu$ M tRNA 的样本由 4 $\mu$ M 纯化重组人 RARS1 启动，并在 37℃ 下孵育。在指定时间点取出等分试样，并将其淬灭到含有 0.5 mg / ml 剪切 DNA 和 100 EDTA 的 300 NaOAc (pH 3) 过滤板中。随后使用 20% 冷三氯乙酸使 tRNA 沉淀，并用 5% 三氯乙酸和 100 L-精氨酸的冷溶液洗涤四次。过滤板在用 95% 乙醇冲洗后干燥。用 0.1 M NaOH 水解氨酰-tRNA 以释放放射性标记的氨基酸，将其离心至含有 OptiPhase HiSafe 3 (Revvity) 的白色 96 孔板中，使用 Hidex Sense Beta Plus 微孔板阅读器 $(83)$ 进行闪烁计数。

动力学研究

在体外动力学研究中，报告细胞以每孔 $2 \times 10^{4}$ 个细胞的密度接种于 96 孔板中。24 小时后（定为第 0 天），使用 Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen, 编号 LMRNA008) 将 500 ng 的未修饰或化学修饰的 sup-tRNA 转染至细胞中。转染 24 小时后，将所有孔中的培养基更换为新鲜培养基，以去除残留的 Lipofectamine 试剂。在指定的时间点，使用 Cytation 1 酶标仪 (BioTek) 和 Nano-Glo 荧光素酶检测系统 (Promega, 编号 N1120) 测量每组条件下 $ 4 孔的发光强度。每个时间点的发光值均相对于未处理的对照孔进行了归一化处理。

在体内动力学研究中，通过尾静脉注射给 LumA-PTC 小鼠（约 4 周龄）注射剂量为 1.25 mg / kg 的 SM-102 LNP 封装的未修饰或修饰的 sup-tRNA。选择 SM-102 LNPs 是因为其具有肝脏靶向特性，其可电离脂质 / DSPC / 胆固醇 / PEG-脂质的摩尔比为 50 / 10 / 38 / 1.5。在指定的时间点，给小鼠腹腔注射 0.2 ml D-荧光素溶液（10 mg / ml 溶于 DPBS；PerkinElmer）。对于全身发光成像，将同一批小鼠（不进行处死）用 2.5% 的异氟烷氧气麻醉，并在注射荧光素 10 分钟后进行成像。使用体内成像系统 (IVIS) (PerkinElmer) 获取并量化肝脏区域的发光信号。

tRNA-seq 文库构建与分析

tRNA-seq 在表达 CFTR R1162X 的 16HBEge 细胞中进行，共设三种条件，每组三个生物学重复：未处理组、经修饰 sup-tRNA (tRM6) 处理组，或经未修饰 sup-tRNA (tRT6) 处理组。细胞以每孔 $1.5 \times 10^{6}$ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。接种 24 小时后（第 0 天），处理组细胞每孔接收 $2\mu \mathrm{g}$ 的 tRM6 或 tRT6。第 1 天收获的未处理细胞作为阴性对照。tRM6 处理组在第 1, 7, 14, 21, 和 35 天收集样本，tRT6 处理组在第 1, 14, 和 35 天收集样本。对于第 14 天之后的收集，细胞从原始 6 孔板传代至 $100\mathrm{-mm}$ 培养皿中，以防止与过度汇合相关的细胞死亡。在每个指定时间点，用冷 PBS 洗涤细胞两次，并使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen, no. 15596026) 提取总 RNA。

小 RNA-seq 文库根据先前研究 (84) 描述的方案并经过微调而构建。如上所述从所有样本中分离总 ，每样本使用 $1\mu \mathrm{g}$ 总 作为输入。为了保持氨酰化状态， 在整个制备过程中维持在酸性条件下。总 经过一锅法过碘酸盐氧化和 $\beta$-消除反应，以选择性地去除未充电 tRNA 的末端 $3^{\prime}$ 核苷酸。随后使用 T4 多核苷酸激酶 (NEB) 进行 $3^{\prime}$ 端修复。随后，使用 T4 连接酶 I (NEB) 将带有条形码的生物素化捕获发夹寡核苷酸连接到 $3^{\prime}$ 端。然后将样本汇总并固定在链霉亲和素涂层的 MyOne C1 Dynabeads (ThermoFisher) 上。所有下游处理步骤均在磁珠上完成，包括脱磷酸化、在延长孵育条件下使用 SuperScript IV VILO (ThermoFisher) 进行逆转录、RNase H 消化 (NEB)、过碘酸盐氧化以灭活未连接的接头，以及第二次接头连接。文库使用 Q5 高保真 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增，随后使用 $10\%$ Tris-硼酸-EDTA PAGE (Invitrogen) 进行尺寸筛选，以去除末端转移酶副产物。随后通过凝胶提取和乙醇沉淀纯化 DNA。最终文库在多伦多病童医院的应用基因组学中心使用 Illumina NovaSeq X 平台通过双端测序进行测序。数据分析按照先前研究 (85) 所述进行，计算支持由多伦多大学和 Compute Canada 运行的 Trillium 高性能计算集群提供。简而言之，双端 reads 被合并并使用 Bowtie2 (86) 比对到人类 tRNA 参考序列。每个核苷酸位置的 reads 使用 Samtools (87) 中的 pileup 函数进行定量，tRNA 水平的 read 计数按照先前所述 (85) 使用 Pysam 确定。差异表达分析使用 DESeq2 (88) 进行。修饰被定义为感兴趣位置的错配和终止百分比，并使用 RStudio 从 Samtools pileup 文件中进行定量。氨酰化水平通过计算第一个 C 之上完整 CCA 的数量来确定，reads 从 Samtools pileup 文件中定量。所有计算分析均在 Trillium 高性能计算集群（多伦多大学，Compute Canada）上或使用 RStudio 完成。

可电离脂质库的合成

利用 Ugi 四组分反应 (Ugi-4CR)，使用胺基头基 $(-NH_{2})$、醛基连接基 (-CHO)、羧酸尾基 (-COOH) 和异氰化物尾基 (-NC) 合成了包含 1000 种可电离脂质的库。所有试剂均购自东京化学工业 (TCI) 或 Sigma-Aldrich。异氰化物尾基使用乙酸乙酯和正己烷的梯度色谱法进行纯化，其结构通过在 $\text{CDCl}_{3}$ 中进行质子核磁共振 ($^{1}\text{H NMR}$) 光谱分析确认。为了进行高通量组合筛选，将反应组分分别溶解在甲醇中，并以 1:1:1:1 的摩尔比（胺:醛:羧酸:异氰化物）在 96 孔 PCR 板中混合。反应在板中于室温下持续摇晃过夜进行。最终的 TTP-3 可电离脂质使用 MeOH 和

DCM 的梯度进行纯化；脂质的纯度和同一性通过 $1{H NMR}$ 光谱验证 [$1{H NMR}$ (400 MHz, ${CDCl}_{3}$) $\delta$ 5.41 - 5.24 (m, 4H), 4.01 (d, $J$ = 2.6 Hz, 2H), 3.68 (s, 1H), 3.39 (s, 1H), 3.23 (s, 1H), 3.04 (s, 1H), 2.73 (d, $J$ = 3.5 Hz, 2H), 2.45 (d, $J$ = 16.8 , 1H), 2.34 - 2.13 (m, 11H), 2.01 (dd, $J$ = 7.0, 2.9 , 4H), 1.65 - 1.20 (m, 45H), 1.00 (d, $J$ = 3.2 , 6H), 0.84 (dtd, $J$ = 7.3, 4.3, 2.2 , 9H)]。

LNP 的制备

为了进行高通量筛选，使用自动化 OT-2 液体处理系统 (Opentrons) 配制 LNP。该过程包括将含有 $10{ mM}$ 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0, Fisher) 中 sup-tRNA 的水相与有机脂质相以 3:1 的体积比和 10:1 的可电离脂质与 RNA 质量比进行混合。有机相由合成的可电离脂质与辅助脂质组成：DOPE (Avanti, no. 850725P)、胆固醇 (Sigma-Aldrich, no. C8667) 和 C14-PEG2000 (Avanti, no. 880150P)，溶解在乙醇中，摩尔比为 35:16:46.5:2.5。对于体内应用，LNP 通过使用由注射泵操作的 T 型接头装置，将水相 sup-tRNA 溶液与有机脂质相混合产生，最小体积为 $300{ }\mu{l}$。随后，LNP 悬浮液使用 $100{ kDa}$ MWCO 透析袋 (Spectra / Por,

ThermoFisher, no. 132670) 在 $4^\circ{C}$ 下对着 PBS 过夜透析。透析后，使用 $100{ kDa}$ MWCO Amicon Ultra-0.5 离心过滤器 (Millipore, no. UFC510096) 通过离心使 LNP 浓缩。对于优化的 TTP-3 LNP 配方，有机相是通过将 TTP-3 可电离脂质与辅助脂质：DOPE (Avanti, no. 850725P)、$\beta$-谷甾醇 (ApexBio, no. B6199) 和 C14-PEG2000 (Avanti, no. 880150P) 以 60:10:27.5:2.5 的摩尔比溶解在乙醇中制备的。含有 $10{ mM}$ 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 中 sup-tRNA 的水相与有机相以 3:1 的体积比混合，保持可电离脂质与 tRNA 的质量比为 13.5:1。在配方优化研究中，评估的其他辅助脂质包括 DSPC (Avanti, no. 850365P) 和 DOTAP (Avanti, no. 890890P)。测试的甾醇脂质包括胆固醇 (Sigma-Aldrich, no. C8667) 和 $\beta$-谷甾醇 (ApexBio, no. B6199)。

ALI 培养

使用 BEAS-2B 细胞制备 ALI 培养遵循 STEMCELL Technologies 的方案。简而言之，首先使用 0.05% 的胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific）将 BEAS-2B 细胞从培养瓶中酶解分离，并以 $2.0 \times 10^{4}$ cells / cm$^{2}$ 的密度接种到 24 孔板中 PET Transwell inserts（孔径 0.4 $\mu$m，直径 6.5 mm；Corning，no. 3470）的顶端。最初，在顶端室加入 0.2 ml、在底端室加入 0.5 ml 的 PneumaCult 完全基础培养基（STEMCELL Technologies，no. 05001）。在细胞达到汇合后，通过移除顶端培养基并仅向底端室提供 PneumaCult 维持培养基（STEMCELL Technologies，no. 05001）将培养转换为 ALI 条件，每 2 天更换一次培养基。在 ALI 条件下培养 28 天后，细胞被准备用于

LNP 转染。在 LNP 转染前，在分化培养物的表面涂抹 5 $\mu$l 的人工痰液培养基（Biochemazone，no. BZ316）以模拟气道黏液。

LNP 配方优化

采用实验设计（DoE）方法来优化已知会影响 LNP 转染效率的关键配方参数，转染效率通过 sup-tRNA 的读穿活性来衡量。系统地评估了七个独立变量：(i) 可电离脂质与 tRNA 的质量比（7.5 至 20），(ii) 可电离脂质的摩尔比（30 至 60%），(iii) 辅助脂质类型（DSPC, DOPE, DOTAP），(iv) 辅助脂质的摩尔比（10 至 30%），(v) 甾醇类型（胆固醇, $\beta$-谷甾醇），(vi) 甾醇的摩尔比（7.5 至 59.5%），以及 (vii) PEG 化脂质的摩尔比（0.5 至 2.5%）。使用 JMP 17.0 软件（SAS Institute）共生成了 38 种不同的配方，涵盖了广泛的参数组合以实现稳健的统计分析。每种配方都测试了 sup-tRNA 的递送效率，所得结果随后被输入 JMP 进行进一步的统计建模和

分析。该过程根据具有统计学显著性的差异确定了表现最优的配方。详细的配方和分析结果汇总在表 S2 中。主实验中使用的所有 RNA 剂量汇总在表 S3 中。

动物实验

所有动物研究均经过审核、批准，并按照大学健康网络动物资源中心（ARC）建立的指南在批准的动物使用方案 AUP6856 下执行。4 至 8 周龄的 C57BL / 6 小鼠购自 Jackson Laboratory。纯合子 C57BL / 6J-Gt(ROSA)26Sor$^{em1Crx}$ / J (LumA-PTC) 小鼠的繁殖对购自 Jackson Laboratory (no. 038165)，并在 ARC 进行维持。此外，杂合子 Cftrem9Cwr（人类外显子 12 替换-R553X）小鼠的繁殖对由凯斯西储大学囊性纤维化小鼠资源中心的 C. A. Hodges 慷慨提供。这些种群随后在 ARC 进行扩增和维持。

LNP 的雾化

为了评估雾化对 LNP-sup-tRNA 制剂的影响，采用了此前所述的 Aeroneb 实验室控制模块及实验室雾化单元（Aerogen，编号 NEB-0801）$(56, 57)$。将 溶液 $(150 \mu l)$ 使用 100 kDa MWCO 透析盒（Spectra / Por, Thermo Fisher, 编号 132670）在 $4^{\circ}C$ 下对 DPBS 进行过夜透析，随后进行雾化处理。生成的气溶胶通过冷凝收集到 1.5 ml 微量离心管中，从而使 以液相形式回收，用于后续分析。收集到的雾化 在标准培养条件下应用于 BEAS-2B 报告细胞。雾化前后的制剂均采用相同的初始 成分制备。使用 RiboGreen 分析法对总 RNA 和包裹 RNA 的浓度进行定量。简而言之，在用 Triton X-100 破坏 后测量总 ，并从完整颗粒中测定包裹 。这些测量结果用于估算 的回收率，并指导后续细胞实验的剂量设定。

表征

使用 Malvern Zetasizer 通过动态光散射 (DLS) 测量流体动力学直径和多分散指数 (PDI)，并报告为强度加权 Z-平均直径和 PDI。Zeta 电位测量在 DPBS 中、 浓度为 1 ng / μl 的条件下使用 Malvern Zetasizer 进行。包裹率 (EE) 通过此前所述的 RiboGreen 分析法进行评估 (49)。简而言之， 样本要么在 37℃ 下用含有 10% Triton X-100 的 TE 缓冲液裂解 30 min，要么直接在 TE 缓冲液中稀释而不进行裂解。将每个样本 (100 μl) 与等体积的 RiboGreen 试剂（1:200 稀释）在 96 孔板中混合，并在室温避光下孵育 5 min。使用 Cytation 1 酶标仪 (BioTek) 测量荧光强度（激发 / 发射：485 / 528 nm）。利用 TE 和 TE / Triton-X100 缓冲液中已知 浓度生成的标准曲线来定量游离 和总 。包裹率计算公式为：EE% = (总 浓度 - 游离 浓度) / 总 浓度 × 100%。

扩散分析

在 Ibidi $\mu$-Slide VI 0.4 (Ibidi 编号 80601) 的微通道中填充 40 $\mu$ l 人工黏液，随后加入包裹 sup-tRNA 且经 DiI 标记（Invitrogen, 编号 D282）的 。1 小时后，使用 Zeiss Axio Imager 显微镜对 在黏液基质中的扩散进行成像。通过测量沿微通道的荧光强度，对跨通道扩散进行半定量分析。

掺入适配体的

将不含钳制区域的 Mango II 适配体 (gaaggagaggagaggaagaggaga) 插入 sup- 的可变环中，以构建 _Aptamer。通过 tRNAscan-SE 2.0 确认，尽管插入了适配体， 结构仍得以保留，且同型特异性模型评分合格 (89, 90)。通过测量 NLuc_PTC 报告细胞中的读穿活性，评估了适配体插入的功能影响。细胞活力分析显示，掺入适配体并未增加细胞毒性。因此，Mango II 修饰的 sup- 被用作体内生物分布研究的荧光追踪探针。

小鼠肺部单细胞悬液的制备

采集小鼠肺部（包括气管），将其置于含有 2% FBS 的 PBS 中。将肺组织剪碎成均匀的糊状，转移至 10 ml 消化培养基中，该培养基由 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 组成，并添加了 300 U / ml 胶原酶 IV 和 100 U / 脱氧核糖核酸酶 (DNase) I。样本在摇床平台上于 $37^{\circ}$ C 下孵育 40 min。孵育后，使用注射器活塞的橡胶端将组织消化液通过 70 $\mu$ m 尼龙网筛，以创建单细胞悬液。使用额外的 10 含 2% FBS 的 PBS 冲洗筛网。随后通过 300g 离心 8 min 使细胞沉淀。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于 5 RBC 裂解缓冲液（Invitrogen，编号 00433357）中，并在室温下孵育 8 以裂解红细胞。通过加入 10 含 2% FBS 的 PBS 终止反应，随后在 300g 下离心 5 。将所得不含红细胞的细胞沉淀重悬于 5 细胞染色缓冲液中，准备进行随后的流式细胞术分析。

流式细胞术

源自小鼠肺部的单细胞悬液首先与抗 CD16 / 32 抗体（BioLegend，编号 101302）共同孵育，以进行 Fc 受体阻断。随后，细胞在冰上使用以下表面标志物染色 40 ：Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD326 / Ep-CAM（BioLegend，编号 118210，1:100）、Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD45（，编号 147719，1:150）、PE / Cyanine7 抗小鼠 CD31（，编号 102524，1:150）以及 Zombie NIR 可固定活力试剂盒（，编号 423106，1:1000）。染色后，用 PBS 洗涤细胞两次，并使用固定缓冲液（BD Bioscience，编号 554714）在冰上固定 50 。固定后的细胞在 300g 下离心 5 沉淀，并用透化缓冲液（BD Bioscience，编号 554714）洗涤。指定进行细胞内染色的细胞与稀释在透化缓冲液中的以下抗体之一共同孵育 40 ：乙酰化 alpha Tubulin 抗体 (6-11B-1) Alexa Fluor 647（Santa Cruz，编号 sc-23950，1:150）、CCSP 抗体 (B-6) Alexa Fluor 488（Santa Cruz，编号 sc-390313，1:150）、或细胞角蛋白 5 抗体 (RCK103) Alexa Fluor 488（Santa Cruz，编号 sc-32721，1:150）、抗小鼠 FOXI1 抗体 Alexa Fluor 647（Novus Biologicals，编号 NBP2-70747）。孵育后，再次用透化缓冲液洗涤细胞。经细胞表面标志物染色的细胞被重悬于补充有 TO3-3PEG-Biotin（Applied Biological Materials，编号 G959，1:100）的 PKM 缓冲液（10 mM 磷酸钠，140 mM KCl，1 mM MgCl₂）中。对于细胞内标志物分析，细胞被重悬于含有 TO1-3PEG-Biotin（Applied Biological Materials，编号 G955，1:100）或 TO3-3PEG- 的 PKM 缓冲液中，选择标准是为了避免与每个组面板中使用的抗体荧光团产生光谱重叠。AF488 偶联的抗体（CCSP 和 KRT5）与 TO3 配对，而 AF647 偶联的抗体（乙酰化 $\alpha$-tubulin 和 FOXI1）与 TO1 配对：TO1-3PEG- 带有 mango 适配体（激发 / 发射：510 / 535），TO3-3PEG- 带有 mango 适配体（激发 / 发射：615 / 658）。细胞孵育 30 ，洗涤，并重悬于 PBS 中进行流式细胞分析 (91)。实验使用单色对照进行适当的补偿，并使用流式细胞仪上的不同检测器设置收集信号。数据采集在 CytoFlex S 流式细胞仪上完成，分析使用 FlowJo 10.10.0 软件进行。本研究中使用的所有抗体均列于表 S4 中。

免疫荧光染色

小鼠肺部用 PBS 洗涤，在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 24 小时，并在 30% 蔗糖溶液中脱水 48 小时。组织被包埋在 OCT 中，冷冻，并使用 Leica CM3050S 冰冻切片机切成 10 $\mu$m 厚度的切片。切片被贴在带电载玻片上，用 PBS 洗涤，并使用封闭缓冲液 [含有 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.1% Triton X-100 的 PBS] 在室温下封闭并通透化 1 小时。切片在 4℃ 下与以下两种抗体组合之一孵育过夜：乙酰化 $\alpha$-Tubulin 抗体 (6-11B-1) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-23950, 1:100) 和 CCSP 抗体 (B-6) Alexa Fluor 647 (Santa Cruz, no. sc-39031, 1:100)，或者 CCSP 抗体 (B-6) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-39031, 1:100) 和细胞角蛋白 5 抗体 (RCK103) Alexa Fluor 594 (Santa Cruz, no. sc-32721, 1:100)。抗体染色后，载玻片

用 PBS 洗涤三次，并在室温下与 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Roche, no. 10236276001, 1:1000) 孵育 20 分钟。再次用 PBS 洗涤后，切片在室温下与含有 TO1-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G955, 1:100) 或 TO3-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G959, 1:100) 的 PKM 缓冲液 (10 mM 磷酸钠, 140 mM KCl, 1 mM MgCl $_{2}$ ) 孵育 30 分钟，随后进行最后一次 PBS 洗涤。在与 Mango 适配体结合后，TO1-3PEG-Biotin 和 TO3-3PEG-Biotin 分别表现出激发 / 发射最大值分别为 510 / 535 nm 和 615 / 658 nm 的荧光。载玻片使用封片剂 (Epredia, no. 4I12) 封片，并使用 Leica Stellaris 5 共聚焦显微镜 (AOMF, UHN) 进行成像。

免疫印迹

带有不同 CFTR 突变的 16HBEge 细胞或 16HBE14o-WT CFTR 细胞被接种在 6 孔板中，每孔密度为 $1.0 \times 10^{6}$ 个细胞，用于 sup-tRNA 处理，共分三个剂量（每孔 1.25 $\mu$g），每隔一天给药一次。在最后一次给药一天后，用 PBS 洗涤细胞，并使用添加了蛋白酶抑制剂 (Roche, no. 04693159001) 的 1× RIPA 缓冲液 (Cell Signaling, no. 9806) 在 4℃ 下轻微搅拌裂解 30 分钟。裂解液在 4℃ 下以 12,000g 离心 20 分钟进行澄清，并使用 Pierce BCA 蛋白分析试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, no. 23227) 测定蛋白浓度。将标准化后的蛋白裂解液与 4× Laemmli 样品缓冲液 (Bio-Rad, no. 1610747) 按 1:1 混合，在 4 到 15% Mini-PROTEAN TGX 预制凝胶 (Bio-Rad, no. 4561084) 上与 PageRuler Plus 预染蛋白标准品 (10 到 250 kDa,

Thermo Fisher Scientific, no. 26619) 一起进行分离。蛋白使用 Bio-Rad TransBlot Turbo 系统转移至硝化纤维膜上。膜在 4℃ 下用 EveryBlot 封闭缓冲液 (Bio-Rad, no. 12010020) 封闭过夜，并与单克隆 CFTR-NBD2 抗体 (UNC, no. 596, 1:2000) 在 4℃ 下孵育过夜。用 TBS-T 洗涤后，膜与 HRP 偶联的山羊抗小鼠二抗 (BioLegend, no. 405306, 1:5000) 在室温下孵育 45 分钟。经过进一步洗涤后，对膜进行显影成像。随后，膜与抗 GAPDH 抗体 (BioLegend, no. 649202, 1:1000) 在室温下孵育 1 小时，然后与相同的二抗孵育。使用 ImageJ 软件对免疫印迹信号进行定量。

RNA-seq 与分析

对三个实验组进行了 RNA-seq 分析：表达 CFTR R1162X 的未处理 16HBEge 细胞（untreated）、经 tRM6 处理的表达 CFTR R1162X 的 16HBEge 细胞（treated），以及 WT CFTR 16HBE14o- 细胞（WT）。细胞以每孔 $1.5 \times 10^{6}$ 个的密度接种于 6 孔板中。处理组每隔一天接受一次 sup-tRNA 给药，共三次（每孔 1.25 $\mu$ g）。在最后一次处理一天后，用 PBS 洗涤细胞，并使用 TRIzol 试剂（Invitrogen, no. 15596026）提取总 ，随后进行异丙醇沉淀。根据制造商说明，使用 NEBNext Poly(A) mRNA 磁珠分离模块（NEB, no. E7490S）从总 中富集 Poly(A)$^{+}$ 。使用 NEBNext Ultra II Library Prep Kit for Illumina（NEB, no. E7770S）构建 -seq 文库，在接头连接过程中加入 USER 酶（NEB, no. M5505S）以打开发夹环结构。测序在多伦多的 Donnelly 测序中心使用 Novaseq6000 SP 200℃ 完成，每样本读取量 >3500 万 reads，读取长度为 100 个核苷酸 (nt)。数据分析由 Compute Ontario、SciNet 和加拿大数字研究联盟（Digital Research Alliance of Canada）提供的计算基础设施支持。简而言之，使用 Trimgalore 对 reads 进行修剪和质量控制，使用 STAR 比对软件 (92) 将其比对至 GRCh38，并使用 DESeq2 (88) 1.38.3 版本确定差异表达的 mRNA。基因本体 (GO) 分析和分子通路富集使用 ShinyGO 0.82（南达科他州立大学）(93) 进行。

核糖体图谱库制备与分析

核糖体图谱库（Ribosome profiling libraries）是使用 QEZ-seq 试剂盒（EzraBio，编号 2603001-6）并按照制造商说明书（94）制备的。对表达 CFTR R1162X 的 16HBEge 细胞分为两个实验组进行分析：未处理组或经修饰 sup-tRNA (tRM6) 处理组，每组包含三个生物学重复。细胞以每孔 $1.5 \times 10^{6}$ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。接种 24 小时后，处理组细胞接受每孔 $2\mu \mathrm{g}$ 的 sup-tRNA 给药。未处理细胞和 sup-tRNA 处理细胞在处理 24 小时后被收获。收获时，细胞在冰上快速冷却，并使用含有环己酰亚胺（cycloheximide）的冰冷核糖体保护片段（RPF）裂解液进行裂解，以稳定翻译中的核糖体。裂解液通过离心澄清，并根据 QEZ-seq 工作流程在 4℃ 下通过核酸酶消化产生核糖体保护片段。

消化后，使用 TRIzol LS 试剂（Invitrogen）提取 RNA 并进行乙醇沉淀。通过 15% 变性 PAGE 对核糖体保护片段进行尺寸筛选，切除并纯化对应于单体核糖体（\~30 nt）的片段。尺寸筛选后的 RNA 片段重新悬浮在无核酸酶水中，并在库制备前进行定量。文库构建采用 QEZ-seq 工作流程。简而言之， 片段经过 3' 端腺苷化，随后连接测序接头。连接接头的 被固定在链霉亲和素涂层磁珠上，并在优化的孵育条件下，使用提供的逆转录混合物在珠上进行逆转录处理。cDNA 合成后，通过酶法去除 ，并使用试剂盒提供的条形码引物通过 PCR 对文库进行扩增。扩增后的文库通过 10% TBE-PAGE 进行尺寸筛选（\~180 个碱基对，对应于插入片段加接头）以去除副产物，随后进行凝胶回收和乙醇沉淀。最终文库在病童医院（Hospital for Sick Children）的应用基因组学中心使用 Illumina NovaSeq X 平台进行双端测序。测序数据使用改编自标准工作流程（94）的核糖体图谱分析管线进行处理。双端 reads 使用 Cutadapt (95) 进行接头修剪和过滤，参数分别为：3' 端修剪 -a AAAAAAAAA-AAAAAA，5' 端修剪 -g GGG。接头匹配过程中允许的最大错误率为 10%，长度短于 15 nt 的 reads 被排除在分析之外。修剪后的 使用 Bowtie2 (86) 比对到 rRNA 参考序列以去除 rRNAs，保留未比对的 用于下游分析。

剩余的 随后使用 STAR (92) 比对到人类基因组 (hg38)。使用 RiboProfiling 和 RibosomeProfilingQC R 软件包 (96) 对 5'UTR、编码序列 (CDS) 和 3'UTR 的 read 分布进行定量。经典核糖体保护片段长度（28 至 33 nt）被用于质量控制分析，包括元基因覆盖度分析，以评估转录本各区域的核糖体占用情况， 按 5'UTR、CDS 和 3'UTR 分组。此外，还评估了链偏好性、转录本区域分布和周期性。从比对后的 BAM 文件中定量基因水平的 read 计数，并使用 DESeq2 (88) 评估不同条件之间的核糖体占用差异。所有计算分析均在 Trillium 高性能计算集群（多伦多大学，Compute Canada）或使用 RStudio 完成。

逆转录定量 PCR (RT-qPCR)

使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，编号 15596026）分离总 RNA，随后用异丙醇进行沉淀。使用 SuperScript IV 逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，编号 18090050）和 50 $\mu$ M 随机六聚体引物对 RNA 进行逆转录。qPCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，编号 4367659）进行。qPCR 所用引物列于表 S5 中。数据采用 $\Delta\Delta$ CT 法进行分析。每个生物学重复均进行两次技术重复测定。

FLIPR 膜电位分析

将细胞接种于黑壁透明底的 96 孔板中，分为三个剂量组（每孔 500 ng）。在分析前，用 PBS 洗涤细胞，然后将其与溶解在无氯缓冲液（10 mM 葡萄糖，20 mM HEPES，136 mM 葡萄糖酸钠，3 mM 葡萄糖酸钾，pH 7.35，300 mOsm）中的 0.5 mg / ml 蓝色膜电位染料（FLIPR Membrane Potential Assay Kit；Molecular Devices）共同在 37℃ 下孵育 30 分钟。随后将孔板转移至维持在 37℃ 的荧光微孔板阅读器（SpectraMax i3X Multi-Mode Microplate Reader；Molecular Devices）中。记录基线荧光（激发波长 530 nm；发射波长 560 nm），随后加入 forskolin（10 $\mu$ M, Sigma-Aldrich, 编号 F6886），并监测荧光以确定 forskolin 刺激的反应。随后加入 CFTRinh-172（10 $\mu$ M, Sigma-Aldrich, 编号 C2992）以确认 CFTR 依赖性信号。CFTR 活性被量化为 forskolin 诱导的相对于基线的荧光变化。

体内安全性评价

使用来自 Jackson Laboratory 的 C57BL / 6J（6 周龄）雌性小鼠。对于肺部安全性评估，在第 0 天通过气管内滴注给予 LNP-sup-tRNA，剂量分别为 1, 3, 5 或 10 mg / kg。PBS 用作阴性对照，脂多糖 (LPS)（每只小鼠 5 $\mu$ g）用作阳性炎症对照。在多个时间点收集样本，以评估急性及亚急性反应。根据终点设定，在给药后 4 小时、第 1 天 (D1) 和第 14 天 (D14) 收集支气管肺泡灌洗液 (BALF)。简而言之，用无菌 PBS 灌洗肺部，回收的液体用于下游分析。通过心穿刺采集血液，并通过离心分离血清。使用 Luminex 多指标分析（Eve Technologies）量化 BALF 和血清中的细胞因子水平。补体激活通过使用 ELISA 试剂盒（C5a: RayBiotech, 编号 ELM-CCC5a-1; C3a: Invitrogen, 编号 EEL091）测量给药后 4 小时 BALF 中的 C5a 和 C3a 水平来评估。在气管内给予 LNP-sup-tRNA 治疗 24 小时后分析 BALF 的细胞组成。在 D1 和 D14 采集肺组织，用福尔马林固定，石蜡包埋，切片，并用苏木精-伊红 (H&E) 染色进行组织病理学评价。

分离的小鼠肠道隐窝肠道类器官培养与处理

按照既定方法，利用 R553X 小鼠生成肠道类器官。简而言之，将小鼠安乐死，采集距离胃部近端的 $\sim$ 20 cm 小肠，用 PBS 冲洗并纵向切开。将肠段进一步切割成 $\sim$ 2 mm 碎片，并彻底洗涤至上清液澄清。将组织碎片重新悬浮于 25 ml 温和细胞解离试剂（STEMCELL Technologies, no. 100-0485）中，在室温下使用摇床以 50 rpm 孵育 15 min。孵育后，将组织重新悬浮于含有 0.1% BSA 的 10 ml 冷 PBS 中，通过 70 $\mu$ m 细胞筛过滤，并收集为四个组分。通过显微镜鉴定富含隐窝的组分（组分 2 至 4），将其离心沉淀，并重新悬浮于 Matrigel（Corning, no. 354234）与 IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse)（STEMCELL Technologies, no. 06005）的 1:1 混合液中。将含有 $\sim$ 1500 个隐窝的约 50 $\mu$ l 样本接种到预热的 24 孔板孔中心。在 37℃ 下固化 15 min 后，加入 750 $\mu$ l 完全 IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse)。类器官在 37℃、5% CO $_{2}$ 条件下培养，每 2 天更换一次培养基，每 7 天传代一次。当汇合度达到 $\sim$ 75% 时，将类器官从 Matrigel 中释放，离心，并使用 Accutase（Gibco, no. A1110501）酶解为单细胞。通过加入补充有 10% FBS 的 DMEM 停止消化。将 IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse) 中的单细胞悬液（每孔 3 × 10 $^{4}$ 个细胞）接种到 Matrigel 涂层的 96 孔板中，每隔一天使用 LNP-sup-tRNA 处理一次，剂量为每孔 500 ng，共处理 3 次。细胞培养 4 到 5 天，直至发育为完全形成的类器官。为了评估 CFTR 活性，进行了 FIS 分析。类器官在 37℃ 下用 Calcein AM（Invitrogen, no. C1430）染色 30 min。在加入 forskolin（最终浓度为 10 $\mu$ M）之前以及 4 小时后，立即使用 Cytation 5 酶标仪（BioTek）采集明场和荧光图像（激发 / 发射：494 / 517 nm）。量化 forskolin 处理 4 小时后的类器官肿胀情况，从而比较处理组和未处理组之间的 CFTR 活性。

患者来源的肠道类器官处理与 Ussing 腔实验

本研究在加拿大多伦多病童医院（SickKids）进行，遵循经批准的研究方案（REB 编号 1000058992，多伦多 SickKids 医院）。患者的 CFTR 突变通过临床基因检测确定为：c.1397℃>G (p.Ser466)、c.3209G>A (p.Arg1070Gln)、c.1657℃>T (p.Arg553) 和 c.1584G>A。携带复杂 CFTR 突变的 CF 患者来源肠道类器官从直肠活检样本中分离，并根据既定培养方案（97, 98）进行培养。生长 7 到 10 天的三维类器官使用 TrypLE（Thermo Fisher Scientific）进行酶解，悬浮在添加了 Y-27632 的生长培养基（IntestiCult Human OGM, STEMCELL Technologies, 编号 06010）中，并接种到预涂有 2% Matrigel（Corning, 编号 356231）的 Transwell 插入件（Costar 3470, 直径 6.5 mm, 孔径 0.4 μm; Corning）上，在顶端侧加入 100 μl 培养基，在基底室加入 500 μl 培养基（第 0 天）。类器官培养物分别接受二甲基亚砜（DMSO）对照组、G418（Sigma-Aldrich, 编号 G8168, 200 μg / ml）、Trikafta、LNP-sup-tRNA 或 LNP-sup-tRNA 与 Trikafta 联合治疗，共分为三个剂量组（tRNA 治疗：每个插入件 1.25 μg）。生长培养基每日更换，并在 Ussing 腔分析前 1 天去除 Y-27632，分析在接种后第 6 到 7 天进行。Trikafta 由 VX-445（elexacaftor; 3 μM, Selleckchem）、VX-661（tezacaftor; 3 μM, Selleckchem）和 VX-770（ivacaftor; 3 μM, Selleckchem）组成。在 Ussing 腔实验期间额外添加了 VX-770。电生理记录使用循环 Ussing 腔系统（EM-CSYS-4; Physiologic Instruments）在开路模式下进行，使用对称的氯-碳酸氢盐缓冲液。CFTR 活性通过测量加入 forskolin（Fsk, 10 μM, 基底侧）后跨上皮电流的变化（定义为 ΔFsk-Ieq）来评估，并通过随后使用 CFTRinh-172（10 μM, 顶端侧）进行抑制来验证。实验在存在 amiloride（100 μM）的情况下进行，以阻断上皮钠通道活性。数据采集和分析使用定制的基于 LabVIEW 的软件（UCP4.4.1, 2015）完成。

统计分析

统计分析使用 GraphPad Prism 软件（版本 10.4.1）进行。除非另有说明，数据以个体数据点表示，并标注平均值 ± 标准差 (SDs)。具体样本量、重复定义和统计检验方法在图注中注明。对于细胞培养实验，生物学重复代表独立制备的培养物；源自同一培养制备的多个孔被视为技术重复，并在统计分析前取平均值。对于动物研究，每只动物被视为一个生物学重复。对于患者来源的类器官实验，生物学重复代表独立制备的类器官衍生单层，或由单个 CF 参与者的材料生成的测量值。除非另有说明，两组之间的比较采用双尾非配对 Student's t 检验。对于三组或更多组之间的比较，采用单因素或双因素方差分析 (ANOVA)，随后根据图注中的说明进行事后多重比较检验。当多个治疗组与单个对照组进行比较时，使用 Dunnett's 检验；所有两两比较则使用 Tukey's 检验。P < 0.05 被认为具有统计学显著性；对于测序和富集分析，除非另有说明，调整后的 P < 0.05 被认为具有显著性。实验前未进行正式的样本量或功效计算；样本量由先前的研究、模型可行性以及动物或患者来源材料的可获得性决定。未采用正式的随机化或盲法程序；治疗分配基于基因型、样本可用性和实验可行性。患者来源的类器官实验是一项 n-of-1 的原理验证研究，因为其使用了来自单个 CF 研究参与者的材料。

参考文献与注释

1. J. Coller, Z. Ignatova, tRNA therapeutics for genetic diseases. Nat. Rev. Drug Discov. 23, 108–125 (2024). doi: 10.1038 / s41573-023-00829-9; pmid: 38049504

2. M. Mort, D. Ivanov, D. N. Cooper, N. A. Chuzhanova, A meta-analysis of nonsense mutations causing human genetic disease. Hum. Mutat. 29, 1037–1047 (2008). doi: 10.1002 / humu.20763; pmid: 18454449

3. R. E. Stanley, T. M. Lowe, Z. Ignatova, The regulation, function and disease relevance of cytoplasmic tRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10.1038 / s41580-026-00963-3 (2026). doi: 10.1038 / s41580-026-00963-3; pmid: 42014620

4. M. Dabrowski, Z. Bukowy-Bieryllo, E. Zietkiewicz, Advances in therapeutic use of a drug-stimulated translational readthrough of premature termination codons. Mol. Med. 24, 25 (2018). doi: 10.1186 / s10020-018-0024-7; pmid: 30134808

5. J. Hordeaux et al., Adeno-Associated Virus-Induced Dorsal Root Ganglion Pathology. Hum. Gene Ther. 31, 808–818 (2020). doi: 10.1089 / hum.2020.167; pmid: 32845779

6. J. R. Mendell et al., Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol. Ther. 29, 464–488 (2021). doi: 10.1016 / j.ymthe.2020.12.007; pmid: 33309881

7. T. Anastassiadis, C. Köhrer, Ushering in the era of tRNA medicines. J. Biol. Chem. 299, 105246 (2023). doi: 10.1016 / j.jbc.2023.105246; pmid: 37703991

8. E. Dolgin, tRNA therapeutics burst onto startup scene. Nat. Biotechnol. 40, 283–286 (2022). doi: 10.1038 / s41587-022-01252-y; pmid: 35210613

9. J. C. Chang, G. F. Temple, R. F. Trecartin, Y. W. Kan, Suppression of the nonsense mutation in homozygous $\beta^{0}$ thalassaemia. Nature 281, 602–603 (1979). doi: 10.1038 / 281602a0; pmid: 492326

10. G. F. Temple, A. M. Dozy, K. L. Roy, Y. W. Kan, Construction of a functional human suppressor tRNA gene: An approach to gene therapy for $\beta$ -thalassaemia. Nature 296, 537–540 (1982). doi: 10.1038 / 296537a0; pmid: 6803169

11. J. J. Porter, C. S. Heil, J. D. Lueck, Therapeutic promise of engineered nonsense suppressor tRNAs. WIREs RNA 12, e1641 (2021). doi: 10.1002 / wrna.1641; pmid: 33567469

12. A. Weixlbaumer et al., Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science 322, 953–956 (2008). doi: 10.1126 / science.1164840; pmid: 18988853

13. A. Korostelev et al., Crystal structure of a translation termination complex formed with release factor RF2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19684–19689 (2008). doi: 10.1073 / pnas.0810953105; pmid: 19064930

14. J. D. Lueck et al., Engineered transfer RNAs for suppression of premature termination codons. Nat. Commun. 10, 822 (2019). doi: 10.1038 / s41467-019-08329-4; pmid: 30778053

15. S. Albers et al., Repurposing tRNAs for nonsense suppression. Nat. Commun. 12, 3850 (2021). doi: 10.1038 / s41467-021-24076-x; pmid: 34158503

16. W. Ko, J. J. Porter, M. T. Sipple, K. M. Edwards, J. D. Lueck, Efficient suppression of endogenous CFTR nonsense mutations using anticodon-engineered transfer RNAs. Mol. Ther. Nucleic Acids 28, 685–701 (2022). doi: 10.1016 / j.omtn.2022.04.033; pmid: 35664697

17. W. Ko et al., ACE-tRNAs are a platform technology for suppressing nonsense mutations that cause cystic fibrosis. Nucleic Acids Res. 53, gkaf675 (2025). doi: 10.1093 / nar / gkaf675; pmid: 40650978

18. J. J. Porter et al., Anticodon-edited transfer RNAs (ACE-tRNAs) encoded as therapeutic nonviral minimal DNA vectors. Nucleic Acids Res. 54, gkag082 (2026). doi: 10.1093 / nar / gkag082; pmid: 41641696

19. J. Wang et al., AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Nature 604, 343–348 (2022). doi: 10.1038 / s41586-022-04533-3; pmid: 35322228

20. M. Xu et al., An engineered UGA suppressor tRNA gene for disease-agnostic AAV delivery. Nat. Biotechnol. 10.1038 / s41587-025-02982-5 (2026). doi: 10.1038 / s41587-025-02982-5; pmid: 41555020

21. S. Albers et al., Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo. Nature 618, 842–848 (2023). doi: 10.1038 / s41586-023-06133-1; pmid: 37258671

22. J. M. Schrader, S. J. Chapman, O. C. Uhlenbeck, Tuning the affinity of aminoacyl-tRNA to elongation factor Tu for optimal decoding. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5215–5220 (2011). doi: 10.1073 / pnas.1102128108; pmid: 21402928

23. O. C. Uhlenbeck, J. M. Schrader, Evolutionary tuning impacts the design of bacterial tRNAs for the incorporation of unnatural amino acids by ribosomes. Curr. Opin. Chem. Biol. 46, 138–145 (2018). doi: 10.1016 / j.cbpa.2018.07.016; pmid: 30059836

24. N. Bharti et al., Translation velocity determines the efficacy of engineered suppressor tRNAs on pathogenic nonsense mutations. Nat. Commun. 15, 2957 (2024). doi: 10.1038 / s41467-024-47258-9; pmid: 38580646

25. S. E. Pierce et al., Prime editing-installed suppressor tRNAs for disease-agnostic genome editing. Nature 648, 191–202 (2025). doi: 10.1038 / s41586-025-09732-2; pmid: 41261131

26. J. J. Porter, W. Ko, E. G. Sorensen, J. D. Lueck, Optimization of ACE-tRNAs function in translation for suppression of nonsense mutations. Nucleic Acids Res. 52, 14112–14132 (2024). doi: 10.1093 / nar / gkae1112; pmid: 39673265

27. V. de Crécy-Lagard et al., Matching tRNA modifications in humans to their known and predicted enzymes. Nucleic Acids Res. 47, 2143–2159 (2019). doi: 10.1093 / nar / gkz011; pmid: 30698754

28. T. Suzuki, The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 375–392 (2021). doi: 10.1038 / s41580-021-00342-0; pmid: 33658722

29. T. Pan, Modifications and functional genomics of human transfer RNA. Cell Res. 28, 395–404 (2018). doi: 10.1038 / s41422-018-0013-y; pmid: 29463900

30. W. Zhang, M. Foo, A. M. Eren, T. Pan, tRNA modification dynamics from individual organisms to metaepitranscriptomics of microbiomes. Mol. Cell 82, 891–906 (2022). doi: 10.1016 / j.molcel.2021.12.007; pmid: 35032425

31. I. Freund et al., 2'-O-methylation within prokaryotic and eukaryotic tRNA inhibits innate immune activation by endosomal Toll-like receptors but does not affect recognition of whole organisms. RNA 25, 869–880 (2019). doi: 10.1261 / rna.070243.118; pmid: 31019095

32. L. Cui et al., RNA modifications: Importance in immune cell biology and related diseases. Signal Transduct. Target. Ther. 7, 334 (2022). doi: 10.1038 / s41392-022-01175-9; pmid: 36138023

33. T. Ohira, T. Suzuki, Transfer RNA modifications and cellular thermotolerance. Mol. Cell 84, 94–106 (2024). doi: 10.1016 / j.molcel.2023.11.041; pmid: 38181765

34. G. Ronzitti, D. A. Gross, F. Mingozzi, Human Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors. Front. Immunol. 11, 670 (2020). doi: 10.3389 / fimmu.2020.00670; pmid: 32362898

35. E. Basner-Tschakarjan, E. Bijjiga, A. T. Martino, Pre-Clinical Assessment of Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors. Front. Immunol. 5, 28 (2014). doi: 10.3389 / fimmu.2014.00028; pmid: 24570676

36. A. J. Barbier, A. Y. Jiang, P. Zhang, R. Wooster, D. G. Anderson, The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat. Biotechnol. 40, 840–854 (2022). doi: 10.1038 / s41587-022-01294-2; pmid: 35534554

37. X. Hou, T. Zaks, R. Langer, Y. Dong, Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat. Rev. Mater. 6, 1078–1094 (2021). doi: 10.1038 / s41578-021-00358-0; pmid: 34394960

38. K. A. Hajj, K. A. Whitehead, Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nat. Rev. Mater. 2, 17056 (2017). doi: 10.1038 / natrevmats.2017.56

39. P. R. Burgel et al., Elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor in people with cystic fibrosis harbouring two CFTR Class I variants: Real-world data from the French compassionate programme. EClinicalMedicine 88, 103476 (2025). doi: 10.1016 / j.eclinm.2025.103476; pmid: 40932846

40. D. Sordyl et al., MODOMICS: A database of RNA modifications and related information. 2025 update and 20th anniversary. Nucleic Acids Res. 54, D219–D225 (2026). doi: 10.1093 / nar / gkaf1284; pmid: 41277531

41. N. Luo et al., Near-cognate tRNAs increase the efficiency and precision of pseudouridine-mediated readthrough of premature termination codons. Nat. Biotechnol. 43, 114–123 (2025). doi: 10.1038 / s41587-024-02165-8; pmid: 38448662

42. S. Tijaro-Bulla, S. P. Nyandwi, H. Cui, Physiological and engineered tRNA aminoacylation. WIREs RNA 14, e1789 (2023). doi: 10.1002 / wrna.1789; pmid: 37042417

43. X. Qin et al., Cocrystal structures of glycyl-tRNA synthetase in complex with tRNA suggest multiple conformational states in glycylation. J. Biol. Chem. 289, 20359–20369 (2014). doi: 10.1074 / jbc.M114.557249; pmid: 24898252

44. N. Nameki, K. Tamura, H. Asahara, T. Hasegawa, Recognition of tRNA $^{Gly}$ by three widely diverged glycyl-tRNA synthetases. J. Mol. Biol. 268, 640–647 (1997). doi: 10.1006 / jmbi.1997.0993; pmid: 9171287

45. R. Giegé, G. Eriani, The tRNA identity landscape for aminoacylation and beyond. Nucleic Acids Res. 51, 1528–1570 (2023). doi: 10.1093 / nar / gkad007; pmid: 36744444

46. Y. Li et al., Crystal structures and insights into precursor tRNA 5'-end processing by prokaryotic minimal protein-only RNase P. Nat. Commun. 13, 2290 (2022). doi: 10.1038 / s41467-022-30072-6; pmid: 35484139

47. S. Y. Yu et al., A luciferase reporter mouse model to optimize in vivo gene editing validated by lipid nanoparticle delivery of adenine base editors. Mol. Ther. 31, 1159–1166 (2023). doi: 10.1016 / j.ymthe.2023.02.009; pmid: 36793209

48. X. Han et al., An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat. Commun. 12, 7233 (2021). doi: 10.1038 / s41467-021-27493-0; pmid: 34903741

49. B. Li et al., Combinatorial design of nanoparticles for pulmonary mRNA delivery and genome editing. Nat. Biotechnol. 41, 1410–1415 (2023). doi: 10.1038 / s41587-023-01679-x; pmid: 36997680

50. J. Chen et al., Combinatorial design of ionizable lipid nanoparticles for muscle-selective mRNA delivery with minimized off-target effects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120, e2309472120 (2023). doi: 10.1073 / pnas.2309472120; pmid: 38060560

51. Y. Xu et al., AGILE platform: A deep learning powered approach to accelerate LNP development for mRNA delivery. Nat. Commun. 15, 6305 (2024). doi: 10.1038 / s41467-024-50619-z; pmid: 39060305

52. J. Renner et al., Synthesis of Ionizable Lipids for Gene Delivery to the Lung Using an Ugi Four Component Reaction. J. Am. Chem. Soc. 147, 17459–17467 (2025). doi: 10.1021 / jacs.5℃04123; pmid: 40338108

53. Y. Xu et al., LUMI-lab: A foundation model-driven autonomous platform enabling discovery of ionizable lipid designs for mRNA delivery. Cell 189, 1620–1635.e25 (2026). doi: 10.1016 / j.cell.2026.01.012; pmid: 41742414

54. K. J. Kauffman et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery In Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs. Nano Lett. 15, 7300–7306 (2015). doi: 10.1021 / acs.nanolett.5b02497; pmid: 26469188

55. H. H. Ly, S. Daniel, S. K. V. Soriano, Z. Kis, A. K. Blakney, Optimization of Lipid Nanoparticles for saRNA Expression and Cellular Activation Using a Design-of-Experiment Approach. Mol. Pharm. 19, 1892–1905 (2022). doi: 10.1021 / acs.molpharmaceut.2℃00032; pmid: 35604765

56. A. Y. Jiang et al., Combinatorial development of nebulized mRNA delivery formulations for the lungs. Nat. Nanotechnol. 19, 364–375 (2024). doi: 10.1038 / s41565-023-01548-3; pmid: 37985700

57. J. Kim et al., Engineering Lipid Nanoparticles for Enhanced Intracellular Delivery of mRNA through Inhalation. ACS Nano 16, 14792–14806 (2022). doi: 10.1021 / acsnano.2℃05647; pmid: 36038136

58. M. P. Lokugamage et al., Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat. Biomed. Eng. 5, 1059–1068 (2021). doi: 10.1038 / s41551-021-00786-x; pmid: 34616046

59. X. Bai et al., Optimized inhaled LNP formulation for enhanced treatment of idiopathic pulmonary fibrosis via mRNA-mediated antibody therapy. Nat. Commun. 15, 6844 (2024). doi: 10.1038 / s41467-024-51056-8; pmid: 39122711

60. A. Autour et al., Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nat. Commun. 9, 656 (2018). doi: 10.1038 / s41467-018-02993-8; pmid: 29440634

61. A. D. Cawte, P. J. Unrau, D. S. Rueda, Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic Mango II arrays. Nat. Commun. 11, 1283 (2020). doi: 10.1038 / s41467-020-14932-7; pmid: 32152311

62. Y. Sun et al., In vivo editing of lung stem cells for durable gene correction in mice. Science 384, 1196–1202 (2024). doi: 10.1126 / science.adk9428; pmid: 38870301

63. S. Suzuki et al., Highly Efficient Gene Editing of Cystic Fibrosis Patient-Derived Airway Basal Cells Results in Functional CFTR Correction. Mol. Ther. 28, 1684–1695 (2020). doi: 10.1016 / j.ymthe.2020.04.021; pmid: 32402246

64. J. R. Rock et al., Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771–12775 (2009). doi: 10.1073 / pnas.0906850106; pmid: 19625615

65. X. Xue et al., Identification of the amino acids inserted during suppression of CFTR nonsense mutations and determination of their functional consequences. Hum. Mol. Genet. 26, 3116–3129 (2017). doi: 10.1093 / hmg / ddx196; pmid: 28575328

66. S. Ahmadi et al., Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genom. Med. 2, 12 (2017). doi: 10.1038 / s41525-017-0015-6; pmid: 28649446

67. J. X. Jiang et al., A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports 16, 2825–2837 (2021). doi: 10.1016 / j.stemcr.2021.09.020; pmid: 34678210

68. C. Wu, B. Roy, F. He, K. Yan, A. Jacobson, Poly(A)-Binding Protein Regulates the Efficiency of Translation Termination. Cell Rep. 33, 108399 (2020). doi: 10.1016 / j.celrep.2020.108399; pmid: 33207198

69. D. R. McHugh et al., A G542X cystic fibrosis mouse model for examining nonsense mutation directed therapies. PLOS ONE 13, e0199573 (2018). doi: 10.1371 / journal.pone.0199573; pmid: 29924856

70. G. Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR / Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 13, 653–658 (2013). doi: 10.1016 / j.stem.2013.11.002; pmid: 24315439

71. J. D. Lueck, Editing tRNA Genes to Broaden Nonsense Therapeutics. N. Engl. J. Med. 394, 1651–1654 (2026). doi: 10.1056 / NEJMcibr2516957; pmid: 42019025

72. L. DeFrancesco, Genome editing's third act. Nat. Biotechnol. 44, 331–333 (2026). doi: 10.1038 / s41587-026-03058-8; pmid: 41844972

73. M. J. Landrum et al., ClinVar: Improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46, D1062–D1067 (2018). doi: 10.1093 / nar / gkx1153; pmid: 29165669

74. U. Varshney et al., Mycobacterium tuberculosis Rv2118℃ codes for a single-component homotetrameric m $^{1}$ A58 tRNA methyltransferase. Nucleic Acids Res. 32, 1018–1027 (2004). doi: 10.1093 / nar / gkh207; pmid: 14960715

75. V. Y. Väre, E. R. Eruysal, A. Narendran, K. L. Sarachan, P. F. Agris, Chemical and Conformational Diversity of Modified Nucleosides Affects tRNA Structure and Function. Biomolecules 7, 29 (2017). doi: 10.3390 / biom7010029; pmid: 28300792

76. A. Biela et al., The diverse structural modes of tRNA binding and recognition. J. Biol. Chem. 299, 104966 (2023). doi: 10.1016 / j.jbc.2023.104966; pmid: 37380076

77. M. Frye, B. T. Harada, M. Behm, C. He, RNA modifications modulate gene expression during development. Science 361, 1346–1349 (2018). doi: 10.1126 / science.aau1646; pmid: 30262497

78. S. Wang, D. Weissman, Y. Dong, RNA chemistry and therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 24, 828–851 (2025). doi: 10.1038 / s41573-025-01237-x; pmid: 40659813

79. I. A. Roundtree, M. E. Evans, T. Pan, C. He, Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell 169, 1187–1200 (2017). doi: 10.1016 / j.cell.2017.05.045; pmid: 28622506

80. R. Alarcon, D. Köster, S. Behrmann, Z. Ignatova, ADAM-tRNA-seq: An optimized approach for demultiplexing and enhanced hierarchical mapping in direct tRNA sequencing. Nucleic Acids Res. 54, gkag022 (2026). doi: 10.1093 / nar / gkag022; pmid: 41574434

81. I. Barbieri, T. Kouzarides, Role of RNA modifications in cancer. Nat. Rev. Cancer 20, 303–322 (2020). doi: 10.1038 / s41568-020-0253-2; pmid: 32300195

82. S. Delaunay, M. Helm, M. Frye, RNA modifications in physiology and disease: Towards clinical applications. Nat. Rev. Genet. 25, 104–122 (2024). doi: 10.1038 / s41576-023-00645-2; pmid: 37714958

83. K. Beebe, W. Waas, Z. Druzina, M. Guo, P. Schimmel, A universal plate format for increased throughput of assays that monitor multiple aminoacyl transfer RNA synthetase activities. Anal. Biochem. 368, 111–121 (2007). doi: 10.1016 / j.ab.2007.05.013; pmid: 17603003

84. C. P. Watkins, W. Zhang, A. C. Wylder, C. D. Katanski, T. Pan, A multiplex platform for small RNA sequencing elucidates multifaceted tRNA stress response and translational regulation. Nat. Commun. 13, 2491 (2022). doi: 10.1038 / s41467-022-30261-3; pmid: 35513407

85. L. R. Frietze, T. Pan, Bioinformatics of simultaneous, quantitative measurements of full-length tRNA and tRNA fragments by MSR sequencing. Methods Enzymol. 711, 312–323 (2025). doi: 10.1016 / bs.mie.2024.11.009; pmid: 39952712

86. B. Langmead, S. L. Salzberg, Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods 9, 357–359 (2012). doi: 10.1038 / nmeth.1923; pmid: 22388286

87. H. Li et al., The Sequence Alignment / Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078–2079 (2009). doi: 10.1093 / bioinformatics / btp352; pmid: 19505943

88. M. I. Love, W. Huber, S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014). doi: 10.1186 / s13059-014-0550-8; pmid: 25516281

89. T. M. Lowe, P. P. Chan, tRNAscan-SE On-line: Integrating search and context for analysis of transfer RNA genes. Nucleic Acids Res. 44, W54–W57 (2016). doi: 10.1093 / nar / gkw413; pmid: 27174935

90. P. P. Chan, T. M. Lowe, in Gene Prediction: Methods and Protocols, M. Kollmar, Ed., vol. 1962 of Methods in Molecular Biology (Springer, 2019), pp. 1–14.

91. E. E. Bonacquisti et al., Fluorogenic RNA-based biomaterials for imaging and tracking the cargo of extracellular vesicles. J. Control. Release 374, 349–368 (2024). doi: 10.1016 / j.jconrel.2024.07.043; pmid: 39111600

92. A. Dobin et al., STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15–21 (2013). doi: 10.1093 / bioinformatics / bts635; pmid: 23104886

93. S. X. Ge, D. Jung, R. Yao, ShinyGO: A graphical gene-set enrichment tool for animals and plants. Bioinformatics 36, 2628–2629 (2020). doi: 10.1093 / bioinformatics / btz931; pmid: 31882993

94. Y. Mao, L. Jia, L. Dong, X. E. Shu, S.-B. Qian, Start codon-associated ribosomal frameshifting mediates nutrient stress adaptation. Nat. Struct. Mol. Biol. 30, 1816–1825 (2023). doi: 10.1038 / s41594-023-01119-z; pmid: 37957305

95. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10–12 (2011). doi: 10.14806 / ej.17.1.200

96. L. Calviello et al., Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat. Methods 13, 165–170 (2016). doi: 10.1038 / nmeth.3688; prmid: 26657557

97. L. Birimberg-Schwartz et al., Validating organoid-derived human intestinal monolayers for personalized therapy in cystic fibrosis. Life Sci. Alliance 6, e202201857 (2023). doi: 10.26508 / Isa.202201857; pmid: 37024122

98. D. D. Zomer-van Ommen et al., Comparison of ex vivo and in vitro intestinal cystic fibrosis models to measure CFTR-dependent ion channel activity. J. Cyst. Fibros. 17, 316–324 (2018). doi: 10.1016 / j.jcf.2018.02.007; pmid: 29544685

致谢

作者感谢在病童医院（Hospital for Sick Children）参与类器官研究的囊性纤维化（CF）患者。感谢 Z. Ignatova 和 S. Albers-Fomenko 就项目讨论提供的建设性意见。感谢 C. A. Hodges 以及凯斯西储大学（CWRU）的囊性纤维化小鼠资源中心（CFMRC）分享 CF 小鼠种群以建立我们的自有种群。感谢 H. Valley 和囊性纤维化基金会（CFF）治疗实验室提供的细胞和方案。感谢 P. J. Unrau 就 tRNA_Aptamer 设计进行的讨论。作者感谢药物肿瘤中心在流式细胞术和成像方面提供的技术支持，感谢玛格丽特公主癌症中心（Princess Margaret Cancer Centre）提供的核磁共振（NMR）和动物设施，感谢 UHN 的先进光学显微镜设施（AOMF）提供的共聚焦显微镜，以及病童医院的 Donnelly 测序中心和应用基因组学中心。计算分析得到了多伦多大学和 Compute Canada 运行的高性能计算集群的支持。J.C. 感谢纳米药物创新网络（NMIN）提供的博士级研究生奖学金，以及多伦多大学和病童医院（SickKids）提供的 PRiME 奖学金。C.M.M. 感谢 NSERC CGS-M 和 CGRS-D 的支持。B.Y.S. 感谢安大略研究生奖学金的支持。插图使用 Biorender.com 创建。资金支持：本工作由 GSK 讲席教授基金（B.L.）；Leslie Dan 药学院启动基金（B.L.）；玛格丽特公主癌症中心运营基金（B.L.）；Connaught 基金 523859（B.L.）；加拿大研究讲席计划 CRC-2022-00575（B.L.）；加拿大卫生研究院 PJH-185722 和 PJT-195669（B.L.）；加拿大囊性纤维化协会 1188219（B.L.）；研究新前沿基金 NFRFE-2023-00203（B.L.）；加拿大自然科学与工程研究委员会 RGPIN-2023-05124（B.L.）；加拿大自然科学与工程研究委员会 RGPIN-2023-04305（H.C.）；美国国立卫生研究院资助 1R01HL174773（B.L.）；CFF 资助 LI23G0 和 LI23I0（B.L.）；Harrington 发现研究所 HDI-BOWEN-UT_GA_44994（B.L.）；以及 PRiME，下一代精准医学计划 PRMHSC2026-001（J.C.）。作者贡献：概念化：J.C., H.C., B.L.；资金获取：H.C., B.L.；调查：J.C., M.Z., S.D., F.G., R.T., B.Y.S., Z.R.C., Z.P.Z., J.P., Y.X., S.L., C.M.M., S.T.-B.；方法论：J.C., T.G., J.H., H.C., B.L.；项目管理：J.C., H.C., B.L.；监督：H.C., B.L.；可视化：J.C., M.Z., H.C., B.L.；初稿撰写：J.C., H.C., B.L.；

审阅与编辑：J.C., H.C., B.L.。竞争利益：J.C., H.C. 和 B.L. 是由多伦多大学提交的一项发明披露（编号 10004798）的发明人，该披露涵盖了工程化和 / 或修饰的 sup-tRNAs 的组成、方法和用途。J.C., M.Z., S.D. 和 B.L. 是由多伦多大学提交的一项发明披露（编号 10004799）的发明人，该披露涵盖了所述的可电离脂质。作者声明没有其他竞争利益。数据、代码和材料可用性：RNA-seq、核糖体图谱和 tRNA-seq 数据分别存储在 NCBI 基因表达综合数据库（GEO）中，登录号分别为 GSE303837、GSE326898 和 GSE326462。所有其他数据均可在正文或补充材料中获得。材料请求请发送至 B.L.。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

图 S1 至 S26；表 S1 至 S5；MDAR 可重复性检查清单 提交日期 2025年7月28日；重新提交日期 2026年4月20日；接收日期 2026年7月2日

10.1126 / science.aeb0054

光电子学

高效率、长寿命的无铅钙钛矿发光二极管

Wenhao Bai $^{1,2}$ , Tongtong Xuan $^{1,3,4}$ , Guanhua Ren $^{1}$ , Kunjie Song $^{1}$ , Huili Li $^{5}$ , Chengkai Hu $^{6,7}$ , Fandi Mo $^{6,7}$ , Lixin Wang $^{6,7,}$ , Rong-Jun Xie $^{1,3,4*}$

锡卤化物钙钛矿发光二极管 (PeLEDs) 因其溶液可加工性和低毒性而具有前景，但低效率和较差的稳定性阻碍了其实际应用。我们发现，$CsSnI_{3}$ 的电致发光失效主要由过量空穴注入触发的电化学 $Sn^{2+}$ 氧化以及向 $Cs_{2}SnI_{6}$ 的不可逆相变所驱动。通过结合甲脒掺杂与三苯基氧化膦改性的双侧优化策略，以稳定钙钛矿晶格、抑制非辐射复合并平衡载流子传输，我们实现了高效的近红外 PeLEDs。这些无铅器件在 963 纳米波长下实现了 21.2% 的峰值外部量子效率，最大辐射亮度为 195.8 瓦每球面度每平方米 ( $W sr^{-1} m^{-2}$ )。值得注意的是，在 7.1 W $sr^{-1} m^{-2}$ 下，其工作半寿命达到了 920.5 小时，为高性能无铅 PeLEDs 提供了路径。

近红外 (NIR) 锡基钙钛矿发光二极管 (PeLEDs) 是用于监控、光通信、夜视、数据存储和生物医学应用的有前景的光源。这些不含重金属的器件具有低温溶液可加工性、良好的柔韧性和低成本 (1–11)。然而，它们的电致发光 (EL) 性能远落后于量子点 LED (QLEDs) 和铅基 PeLEDs，这归因于 $Sn^{2+}$ 易被氧化以及制备过程中不可控的结晶，从而导致严重的非辐射复合 (12–14)。通过引入还原剂和有机添加剂，已经制备出光致发光量子产率 (PLQY) 高达 45% 的外延异维锡基钙钛矿，例如 $(\mathrm{PEA}){2}\mathrm{FA}{0.9}{Cs}{0.1}{Sn}{2}{I}{7}$ （其中 PEA 为苯乙胺，FA 为甲脒）。这些器件实现了 13.2% 的最大外部量子效率 (EQE) (2, 4, 15)。然而，这些钙钛矿中有机组分的绝缘特性阻碍了电荷的注入和传输，尽管其 EL 效率较高，但限制了辐射亮度和工作寿命 (2, 7, 16, 17)。相反，全无机黑色正交相碘化铯锡钙钛矿 (B-γ $CsSnI{3}$ ) 以高空穴迁移率和相对较强的结构稳定性为特点，能够制备出辐射亮度为 241 瓦每球面度每平方米 (W $sr^{-1} m^{-2}$ ) 的高亮度 PeLEDs。然而，由于严重的非辐射复合，它们效率较低 (EQE 6.6%)，导致 PLQY 约为 25% (18)。尽管通过缺陷钝化和抑制 $Sn^{2+}$ 氧化已大大提高了 $CsSnI_{3}$ 薄膜的效率，但目前最先进的 PeLEDs 仍表现出较低的效率（峰值 EQE 为 10.7%）和较短的半寿命（在 $\sim10~W~sr^{-1}~m^{-2}$ 下 $T_{50}$ 为 23 小时）(19)。此外，目前的研究主要集中在钙钛矿薄膜的加工上，而较少关注其在工作状态 PeLEDs 中的化学结构和光学性质 (3–5, 7, 20, 21)。为了合理构建高效且可靠的锡基近红外发光钙钛矿，需要更好地理解 $CsSnI_{3}$ 钙钛矿在电场下的发光衰减机制 (22–25)。

在此，我们展示了高效、高亮且稳定的锡基近红外钙钛矿发光二极管（NIR-PeLEDs）的开发，其实现方式是通过策略性地抑制工作器件中的钙钛矿相变，并最大限度地减少缺陷辅助的非辐射复合。我们证明，$CsSnI_{3}$ 的电致发光（EL）失效主要是由于在施加电场下，近红外发光的 $CsSnI_{3}$ 钙钛矿相变为不理想的橙红色 $Cs_{2}SnI_{6}$ 双钙钛矿相 (26) 所致。这种转变进一步被空穴载流子过度注入所诱导的电化学氧化反应所加速。因此，这些过程导致了空位缺陷的增加和严重的非辐射复合损失。为了解决这些问题，我们调节了碘化锡钙钛矿的成分，以同时抑制电场下的相变并改善其光学性能。此外，使用三苯基膦氧化物（TPPO）来钝化配位不足的表面缺陷，从而增强辐射复合效率并改善电荷载流子传输，以进一步优化其 PeLEDs 的光电性能。高效且稳定的无铅钙钛矿薄膜使锡基 NIR-PeLEDs 的整体性能优于已报道的溶液法制备的无铅 PeLEDs（图 S1 和表 S1）。

电化学诱导的钙钛矿相变

为了研究使用 $CsSnI_{3}$ 作为发射体的近红外钙钛矿发光二极管（NIR-PeLEDs）电致发光（EL）性能较差的原因，我们制备了器件结构为氧化铟锡 (ITO) / 改性聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸 (m-PEDOT:PSS) / $CsSnI_{3} / 2,2',2'-(1,3,5-苯三基)$ -三(1-苯基-1-H-苯并咪唑) (TPBi) / 氟化锂 (LiF) / 铝 (Al) 的锡基 NIR-PeLEDs。这些 PeLEDs 表现出不理想的 EL 性能（图 1A 和图 S2），在 3.8 W $sr^{-1}$ $m^{-2}$ 时峰值外量子效率（EQE）为 5.44%（平均峰值 EQE 为 4.67%），且在初始辐射亮度为 8.7 W $sr^{-1}$ $m^{-2}$ 时 $T_{50}$ 为 0.87 小时，这与此前报道的结果相似 (21, 27)。我们将 PeLEDs 效率低且可靠性差的原因不仅归结于 $CsSnI_{3}$ 钙钛矿薄膜相对较低的光致发光量子产率（PLQY）（最大值为 24.8 ± 0.5%；图 1B），还归结于

在无水无氧环境下，钙钛矿在电场作用下的发光衰减。

通过增加电流密度（图 1℃），器件的 EQE 和相应钙钛矿薄膜的 PLQY 均呈现出类似的下降趋势，这表明器件 EL 性能的下降主要是由钙钛矿薄膜的发光淬灭引起的。原位微区 PL 强度成像（图 1D 和图 S3）进一步证实，由于器件运行过程中针孔的快速增殖，$\mathrm{CsSnI}_3$ 薄膜的 PL 强度急剧下降。我们在无水无氧条件下，对电场中的 $\mathrm{CsSnI}_3$ 薄膜进行了随时间变化的 X 射线光电子能谱 (XPS) 和 X 射线衍射 (XRD) 分析（图 S4）。值得注意的是，${Sn}^{2+}$ 与 ${Sn}^{4+}$ 的峰面积比（图 1E 和图 S5）在 $12{min}$ 内从 1.74 下降到 0.08，且 XRD 图谱（图 1F）显示 B-γ ${CsSnI}_3$ 钙钛矿部分降解为不理想的 ${Cs}_2{SnI}_6$。我们还观察到，由焦耳热引起的器件温度升高并未促进钙钛矿相变（图 S6）。此外，PeLEDs 中的空穴载流子迁移率（图 1G 和图 S7）远高于电子载流子迁移率。

A

B

D

E

G

图 1. 导致 $CsSnI_{3}$ 基 PeLEDs 效率低下且稳定性差的钙钛矿相变。(A) $CsSnI_{3}$ 基 PeLEDs 的 EQE-亮度曲线和随时间变化的亮度。(B) $CsSnI_{3}$ 薄膜随激发光功率密度变化的 PLQYs。(C) 基于 $CsSnI_{3}$ 的 PeLEDs 的 EQEs，以及结构为 ITO / perovskite / Al 的相应平面钙钛矿二极管的 PLQYs，两者均作为电流密度的函数进行测量。(D) 在 50 mA cm $^{-2}$ 的电流密度下，$CsSnI_{3}$ 薄膜在不同时间点的原位微区 PL 强度成像。比例尺为 5 $\mu$ m。(E) $CsSnI_{3}$ 薄膜在 50 mA cm $^{-2}$ 下随时间变化的 $Sn^{2+} / Sn^{4+}$ 值。(F) $CsSnI_{3}$ 薄膜在 50 mA cm $^{-2}$ 下随时间变化的 XRD 图谱。(G) $CsSnI_{3}$ 基 PeLEDs 随电场变化的电荷载流子迁移率。(H) 运行中的 PeLEDs 通过不利的电化学反应导致钙钛矿从 $CsSnI_{3}$ 转变为 $Cs_{2}SnI_{6}$ 的示意图，并伴有大量的空位和针孔。

基于这些结果，我们认为观察到的 $CsSnI_{3}$ 基 PeLED 发光失效是由载流子注入不平衡引起的，这诱发了有害的电化学反应，导致运行过程中发生了意外的钙钛矿相变（图 1H）。具体而言，$CsSnI_{3}$ 的空穴过度积累及其 p 型半导体特性导致了 $Sn^{2+}$ 氧化（ $[SnI_{6}]^{4-}-2e\rightarrow[SnI_{6}]^{2-}$ ），而由于电子注入不足， $Sn^{2+}$ 的还原可以忽略不计（图 S5）。这一不可逆的电化学过程加剧了钙钛矿从 $CsSnI_{3}$ 到 $Cs_{2}SnI_{6}$ 的相变，且该过程伴随着大量空位和针孔的形成，这些缺陷尤其集中在阴极侧界面，因为富空穴环境促进了氧化分解。结果导致 Shockley-Read-Hall (SRH) 复合和 Auger 复合大幅增强，最终导致空穴载流子泄漏增加。在高电流密度下观察到的显著发光猝灭（在图 1℃ 中宏观表现为 EQE 滚降），因此成为了载流子不平衡和电化学氧化驱动降解的直接实验证据。

通过 FA$^{+}$ 掺杂优化钙钛矿结构稳定性

钙钛矿的成分直接影响其化学结构稳定性和光学性质 (28)。在高通量密度泛函理论 (DFT) 计算中，我们观察到 $FA^{+}$ 掺杂增加了 $CsSnI_{3}$ 的形成能 ($E_{f}$) 以及 $Sn^{2+}$ 离子周围的电子密度。如图 2A 所示，在 $FA^{+}$ 掺杂进入 $CsSnI_{3}$ 后，$Cs_{1-x}FA_{x}SnI_{3}$ 的晶体形成能有所增加（图 S8），特别是 $Cs_{0.8}FA_{0.2}SnI_{3}$ 的 $E_{f}$ 增强了 0.024 eV / atom。此外，掺杂钙钛矿的缺陷形成能也随之增加（图 S9）。这些发现表明，$FA^{+}$ 掺杂可以同时提高化学结构稳定性和发光性能 (29, 30)。此外，计算得出的 $Sn^{2+}$ 离子周围的电子密度（图 2B 和图 S10）大幅增加，这意味着在

A

B

D

E

C

图 2. $\mathsf{FA}^+$ 掺杂抑制 $\mathrm{CsSnI}3$ 钙钛矿相变。(A) 通过 DFT 计算获得的 $\mathrm{Cs{1 - x}FA_xSnI_3}$（其中 $x = 0,0.05,0.1,0.15,0.2$）的形成能。(B) ${CsSnI}3$ 和 ${Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 的差分电子密度重新分布。(C) ${}3$ 和 ${Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 的原子分辨率 TEM 微观图。(D) ${}3$ 和 ${Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜中 Sn 3d 的高分辨率 XPS 光谱。(E) ${}3$ 和 ${Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 在 $50{mAcm}^{-2}$ 下 PL 强度随时间变化的曲线。插图分别为 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 在 $50{mAcm}^{-2}$ 下 0 和 $40{min}$ 时的 PL 强度映射图。比例尺为 $5\mu {m}$。(F) ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜在 $50{mAcm}^{-2}$ 下不同时间的随时间变化的 XRD 图谱。

$FA^{+}$ 掺杂后，$Sn^{2+}$ 具有强电子局域化，这将有利于抑制钙钛矿相变 (7, 31, 32)。

为了验证理论预测，我们合成了一系列 $Cs_{1-x}FA_{x}SnI_{3}$ 钙钛矿薄膜，发现 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜同时展现出最佳的化学结构稳定性和光电性能。通过扫描电子显微镜 (SEM)、原子力显微镜 (AFM) 和微区 PL 强度成像（图 S11）确认了 $FA^{+}$ 掺杂对钙钛矿薄膜形貌的影响。与 $CsSnI_{3}$ 的树突状晶体和连续薄膜相比，孤立的纳米级且不连续的 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 晶体不仅显示出 PL 强度增加，还提高了器件的光提取效率 (33–35)。原子分辨率未滤波扫描透射电子显微镜-高角环形暗场图像（图 2℃）表明，正交相 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 的平均晶格间距为 6.39 Å，大于 $CsSnI_{3}$ 的晶格间距 (6.37 Å)。这种均匀的晶格膨胀提供了直接证据，证明 $FA^{+}$ 阳离子是以取代方式结合在钙钛矿晶格的 A 位点，而非偏析在表面。

我们进一步获取了 Sn 3d XPS 光谱，以研究 $FA^{+}$ 掺杂对 $Sn^{2+}$ 离子氧化的影响。如图 2D 所示，$^{2+}$ 与 $^{4+}$ 的峰面积比从 $CsSnI_{3}$ 薄膜的 1.74 增加到 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜的 3.86。因此，$FA^{+}$ 掺杂有效地抑制了 $^{2+}$ 的氧化。此外，与纯 $CsSnI_{3}$ 薄膜相比，$Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜在电场下的 PL 稳定性有所提高（图 2E 和图 S12）。纯 $CsSnI_{3}$ 薄膜在 <5 min 内没有明显的发光信号，而 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 在 40 min 后仍保持其初始 PL 强度且无明显针孔。我们将这些结果归因于化学结构的稳定性，它防止了在偏置电压下钙钛矿相从 $CsSnI_{3}$ 向 $Cs_{2}SnI_{6}$ 转变。结构稳定性通过 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜在电场下的随时间变化的 XRD 图谱得到了进一步证实（图 2F）。

钙钛矿薄膜光电性能的提升

$\mathrm{FA^{+}}$ 掺杂还增强了 $\mathrm{CsSnI_3}$ 的发光性能。${CsSnI_3}$ 薄膜的 PL 光谱（图 3A）显示出中心位于 $\sim 929\text{ nm}$ 的宽发射带，半峰全宽为 $83\text{ nm}$。相比之下，${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜的 PL 峰出现了明显的红移，这与带隙计算结果（图 S13）一致，并且具有更大且更均匀的晶畴（图 S11）(5)。钙钛矿薄膜的形貌和光学性质还受到手套箱内前驱体溶液（如 $N,N$-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜）产生的蒸汽的影响（图 S14 和表 S2）。

为了揭示 增强的机制，我们获得了时间分辨 光谱和飞秒瞬态吸收光谱，以研究这些钙钛矿薄膜的激子复合动力学。${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}}$ 薄膜表现出单指数时间分辨 衰减动力学，寿命为 2.24 ns（图 3B），这意味着非辐射复合减少，且带边激子的衰减动力学得到了良好控制 (36, 37)。相比之下，${CsSnI_{3}}$ 薄膜表现出双指数时间分辨 衰减，快速分量为 1.14 和 1.40 ns（表 S3）。

此外，在 $\sim 890\text{ nm}$ 处观察到了基态漂白信号（图 3℃）。钙钛矿在带边波长处的瞬态吸收信号指示了载流子衰减动力学 (38–40)。${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}}$ 薄膜在亚皮秒区域和皮秒至纳秒范围内均表现出较慢的动力学漂白衰减，表明更高比例的载流子保留在带边，而非被陷于体相或表面缺陷态（图 3D 和图 S15）。${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}}$ 中带边载流子保留量的增加通过温度依赖性 光谱得到了进一步证实。随着温度升高，${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}}$ 的 强度仅轻微下降，这证明与 ${CsSnI_{3}}$ 相比（图 S16），${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}}$ 中由非辐射复合驱动的过程得到了有效抑制。

A

B

D

E

C

F

图 3. 高效且稳定的近红外 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$-TPPO 薄膜。(A) ${CsSnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜的 光谱。(B) ${CsSnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜的时间分辨 衰减曲线。(C) ${CsSnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜飞秒瞬态吸收光谱的伪彩色图。(D) ${CsSnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜在皮秒至纳秒范围内，探测波长为 $890\text{ nm}$ 时的动力学轨迹。(E) ${CsSnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 薄膜积分 强度随 $1 / T$ 变化的拟合曲线。(F) ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ 和 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$-TPPO 薄膜随激发光功率密度变化的 PLQY 值。

$Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜的激子结合能 $(E_{\mathrm{b}})$（图 3E 和表 S4）为 128 meV，是 $CsSnI_{3}$ 薄膜（49 meV）的 2.6 倍。这一差异意味着激子解离需要更高的能量阈值，从而极大地促进了 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜中的辐射复合 (2, 41, 42)。因此，$Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜增强的 PL 性能，以及变窄且红移的发射光谱，可归因于 $FA^{+}$ 掺杂，这不仅降低了带隙，还抑制了浅缺陷的形成并减少了陷阱辅助的非辐射复合 (5)。因此，$Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜表现出增强的 PLQY，最高达到 $31.1 \pm 0.4\%$（图 3F）。缺陷物理特性的这种改变重新平衡了宏观载流子传输

(图 S17)，随后抑制了器件运行过程中电化学驱动的 $Sn^{2+}$ 氧化及相关的相变 (图 S18)。结果显示，基于 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 的 PeLEDs 在 $27.0 W sr^{-1} m^{-2}$ 时表现出最高 18.1% 的 EQE，且峰值辐射亮度高达 $160.2 W sr^{-1} m^{-2}$（图 S19 至 S21）。

尽管 $FA^{+}$ 掺杂调节了体缺陷性质，但未配位的表面缺陷依然存在，并阻碍了界面电荷传输和辐射复合效率。为了选择性地钝化这些表面陷阱态，通过 TPPO 的 P=O 基团与钙钛矿表面的欠配位 $Sn^{2+}$ 离子之间的配位引入了 TPPO（图 S22）(43)。该策略将 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 的 PLQY 提高至最高值 $46.4 \pm 1.0\%$（图 S23 和 S24，表 S5，以及图 3F）。TPPO 的加入还明显提高了 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 的电子迁移率，从而有望实现均衡的电荷注入（图 S25 和 S26）。这最终导致了钙钛矿相变的抑制以及载流子泄漏的减少。

高效且稳定的无铅近红外 PeLEDs

我们制备了器件结构为 ITO / m-PEDOT:PSS / $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ -TPPO / TPBi / LiF / Al 的 PeLEDs（图 4A）。器件的截面 TEM 图像（图 4B）显示，钙钛矿发光层具有厚度约为 75 nm 的纳米岛结构，从而提高了其光提取效率。与基于 $\mathrm{CsSnI_3}$ 的 相比，基于 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$-TPPO 的 在 EL 光谱中表现出明显的红移，波长达到 963 nm（图 4℃）。随着驱动电压的增加，基于 ${Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$-TPPO 的 保持了稳定的形状，但 EL 光谱的强度持续增加。

图 4D 展示了代表性 的电流密度-电压-辐射度曲线。这些 的最大辐射度为 $195.8 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$，远高于基于 ${CsSnI_3}$ 的 的 $25.0 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$（图 S2B）。在辐射度为 $43.7 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$ 时，其 EQE 高达 21.2%（图 4E），由厦门市产品质量监督检验研究院提供的第三方认证 EQE 为 20.6%（图 S27）。在近红外（NIR）区域，冠军 在 和辐射度方面均优于此前报道的无铅 、有机发光二极管（OLEDs）和 QLEDs（图 4F，表 S6 和图 S1）。我们器件中的效率衰减（Efficiency roll-off）也得到了缓解。特别是，在高达 $100 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$ 的高辐射度水平下，仍能保持超过 18% 的 。此外， 还表现出良好的重复性。40 个器件的直方图显示，平均峰值 为 $20.2 \pm 0.5\%$，平均峰值辐射度为 $168.7 \pm 29.5 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$（图 4G 和表 S7）。

为了评估 的工作寿命，通过改变电流密度进行了加速测量（图 4H）。在 $25 \, {mA\,cm^{-2}}$（$\sim 19.0 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$）的电流密度下， 的 $T_{50}$ 为 127.0 小时；在 $11 \, {mA\,cm^{-2}}$（$\sim 7.1 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$）的电流密度下，$T_{50}$ 为 920.5 小时。在 $50 \, {mA\,cm^{-2}}$（$\sim 41.5 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$）至 $233 \, {mA\,cm^{-2}}$（$\sim 134.5 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$）的不同电流密度下，进一步评估了 $T_{50}$ 寿命（图 4H，图 S28 和表 S8）。使用一个经验加速寿命方程（16, 44–47），即 $R_0^n T_{50} = \text{constant}$（$n$ 为加速因子），来模拟我们器件的降解行为，结果显示加速因子（$n$）为 1.74（图 4I）。因此，预计器件在 $1.8 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$ 时的 $T_{50}$ 为 7668 小时（$\sim 320$ 天），而在 $0.18 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$ 时可达 421,367 小时（$\sim 48$ 年）。作为参考，亮度为 $100 \, {cd\,m^{-2}}$ 的基于 ${PEA_2(FAPbBr_3)2PbBr_4}$ 的 对应的辐射度为 $0.18 \, {W\,sr^{-1}\,m^{-2}}$（图 S29）。工作 $T{50}$ 似乎代表了对先前报道的无铅 稳定性指标的提升（图 S30 和表 S1）。我们还成功演示了高效、高亮且稳定的无铅近红外 在智能驾驶（图 S31）、夜视与人脸识别（图 S32）以及血管成像（图 S33）中的多样化应用。

A B

D

G

I

图 4. 高效、高亮度且稳定的无铅近红外钙钛矿发光二极管（NIR-PeLEDs）。(A) 冠军 PeLEDs 的能级图示意图。(B) 冠军 的截面 TEM 图像。(C) 冠军 在不同工作电压下的电致发光（EL）光谱。(D) 冠军 的电流密度-电压-辐射度特性。(E) 冠军 的外量子效率（EQE）-辐射度曲线。(F) 已报道的 NIR-LEDs 的峰值 EQE 和 EL 峰值波长，详见表 S6。(G) 40 个器件的峰值 EQE（左）和峰值辐射度（右）直方图。(H) 在电流密度分别为 25 和 11 mA cm $^{-2}$ 时的运行稳定性。(I) $T_{50}$ 寿命随初始辐射度（$R_{0}$）的变化函数。虚线将 (H) 中的 $T_{50}$ 数据拟合至方程 $R_{0}^{n} \times T_{50} = constant$，其中 n 为加速因子（n = 1.74）。实心圆代表已完成的 $T_{50}$ 测量。空心圆表示在中低电流密度下外推的 $T_{50}$ 寿命，预计将在更长时间后最终确定。

讨论

我们已确定过量的空穴注入是导致 $CsSnI_{3}$ 中电致发光（EL）退化的主要驱动因素，这引发了 $Sn^{2+}$ 的电化学氧化，并触发了向 $Cs_{2}SnI_{6}$ 的不可逆相变。在这一机制理解的指导下，我们证明了 $FA^{+}$ 掺杂能有效抑制工作偏压下有害的 $CsSnI_{3} \rightarrow Cs_{2}SnI_{6}$ 相变以及缺陷介导的非辐射复合，从而实现高效且稳定的近红外（NIR）发射。通过引入 TPPO，可以进一步改善 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ 薄膜的光学性质和电子结构。结果显示，基于 $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$-TPPO 的钙钛矿发光二极管（PeLEDs）在 7.1 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ 下表现出高达 21.2% 的外量子效率（EQE）以及 920.5 小时的长运行 $T_{50}$ 寿命。这些发现表明，无铅锡基近红外 PeLEDs 的开发代表了发光技术领域的一个重大进步，既带来了环境效益，又提升了性能指标，使其非常适用于各种前沿应用。

参考文献与注释

1. H. Wang, A. Treglia, M. D. Albaqami, F. Gao, A. Petrozza, ACS Energy Lett. 9, 2500–2507 (2024).

2. D. Han et al., Nature 622, 493–498 (2023).

3. H. Min et al., Nat. Photonics 17, 755–760 (2023).

4. H. Min et al., Nat. Nanotechnol. 19, 632–637 (2024).

5. F. Yuan et al., . Photonics 18, 170–176 (2024).

6. X.-K. Liu et al., . Mater. 20, 10–21 (2021).

7. W. Bai et al., Angew. Chem. Int. Ed. 62, e202312728 (2023).

8. M. Vasilopoulou et al., . Photonics 15, 656–669 (2021).

研究论文

计算机工程

Hypervision：一种用于在线视频速率计算成像的片上高光谱微系统

Liheng Bian*†, Qinghao Meng†, Lianjie Li, Zhen Wang, Yibo Feng, Xuan Peng, Jiajun Zhao, Jingyi Wang, Zhu Yang, Jun Zhang*

在这项工作中，我们解决了高光谱成像中长期存在的海量计算挑战，因为重建和处理大体积的空间-光谱数据立方体需要大量的计算。具体而言，我们设计了一个硬件加速器，将其制造为一个神经处理单元（NPU），在 16 位整数（INT16）运算下能够达到每秒 9.3 万亿次操作（tera operations per second），同时为轻量化重建网络设计了一种拓扑感知的结构化剪枝策略。通过与我们的 HyperspecI 传感器集成，我们展示了一个完全独立的可见光-近红外高光谱微系统（约 950 克），该系统不需要外部电源或计算资源。该微系统实现了实时高光谱成像，帧率可达每秒 32.9 帧（512×512，61 通道）或每秒 24.6 帧（1024×1024，16 通道），且功耗仅为约 25.3 瓦（每瓦 3670 亿次操作 / giga–operations per second）。在智能驾驶和空对地监测中的应用演示突显了其将计算高光谱成像从离线处理推进到集成在线感知的实际潜力。

高光谱成像 (1, 2) 捕捉物理世界的时空信息，并同时获取每个像素在数百个光谱波段上的详细光谱指纹。与传统的红绿蓝（RGB）成像相比，高光谱成像利用其高维信息来超越人类视觉的限制，实现内在的材料识别。凭借这些优势，高光谱成像已广泛应用于食品检验 (3)、手术导航 (4) 和精准农业 (5) 等多个领域。随着光谱编码和压缩感知技术 (6, 7) 的进步，现有方法可以将空间-光谱数据立方体压缩到单个曝光帧中。例如，计算断层扫描成像光谱仪 (CTIS) (8) 和编码孔径快照光谱成像 (CASSI) (9)，它们已经

成功演示了动态场景的实时获取，克服了传统机械推扫成像的速度限制。在过去的十年中，纳米制造的超表面 (10–13)、光子晶体平板阵列 (14)、量子点 (15)、法布里-珀罗（Fabry-Perot）滤波器 (16)、散射介质 (17, 18) 以及其他创新器件，通过精细可调的光谱滤波能力和小型化集成设计，推动了从庞大的光学配置向芯片级集成的转变。尽管各种硬件架构取得了进展，但固有的压缩采集原理依赖于高复杂度的神经网络 (19) 来从单帧中重建大体积的空间-光谱数据，以及随后的用于语义推理的高光谱计算。即使这些计算在高性能计算集群上执行，

每帧的处理延迟仍然很高，难以满足前端数据采集的实时性要求 (12, 13, 20)。

基于现场可编程逻辑门阵列（FPGA）的硬件加速技术通过将计算密集型算法映射到专用硬件逻辑电路，显著提高了计算效率。其核心优势在于硬件层面的固有并行性、深度流水线架构以及定制化的存储层次结构，能够为特定算法实现低延迟和高吞吐量的数据处理。主流神经网络模型，包括卷积神经网络（CNN）、循环神经网络（RNN）、生成对抗网络（GAN）和自注意力架构（Transformer），已在 FPGA 加速器上得到快速部署和验证，并广泛应用于无人系统、自动驾驶和生物医学领域（21–26）。然而，现有的神经网络加速器设计范式与实时高光谱解耦的需求之间仍存在差距。首先，主流研究主要集中在通用神经网络的通用加速器上（21），未针对重建任务中的多维特征提取和光谱注意力机制进行深入优化，且缺乏用于跨模态融合的异构算子设计（27, 28）。其次，现有的通用加速器采用固定的算法设计模式，未能实现由硬件计算逻辑反向驱动的神经网络架构轻量化，这限制了软硬件协同优化的潜力（29, 30）。第三，现有的加速方案大多仍处于 FPGA 原型验证阶段，其架构设计尚未通过流片验证与专用集成电路（ASIC）制造工艺的兼容性。理论能效比与工业级动态场景的吞吐量需求之间存在如此数量级的差距，使得实现在线视频速率的高光谱成像变得十分困难。不同系统的综合性能对比详见补充材料（SM）第 1 和第 2 节。

在这项工作中，我们提出了一种具有软硬件协同设计能力的片上高光谱计算技术，以应对高光谱成像对大规模计算需求的长期挑战。该技术基于一种源自数据局部性理论（31, 32）的新型数据流空间计算原理，这与传统的冯·诺依曼控制流时分复用（33）不同，实现了从通用单元的离散指令粒度堆叠到专用数据流的连续算子粒度调度的转变。遵循这一原理，我们在硬件层面设计了一个双双缓冲加速器（D²BA），该加速器包含一个流水线化的嵌套双缓冲并行架构。该架构在空间、通道和时间维度上采用了三维流水线嵌套方案，实现了加载、计算和存储操作的完全重叠且无气泡（zero-bubble）执行。由此，它将传统的单时间维度双缓冲扩展为一个多层并发且多维的加速框架。硬件算子的计算数据流针对 Transformer-CNN 混合高光谱重建网络进行了进一步优化，在 FPGA 原型验证中，使用半精度 16 位浮点数（FP16）时，单帧处理延迟低于 220 ms，在 200 MHz 下的吞吐量为每秒 2100 亿次浮点运算（GFLOPs）。利用 D²BA 加速器，我们流片了一款名为 HyperN 的 ASIC 工艺高性能神经网络处理单元（NPU）芯片，在 16 位整数（INT16）下可提供 9.3 万亿次运算每秒（TOPS）的峰值计算性能，从而实现了实时高光谱重建。在软件层面，我们

提出了一种计算图拓扑深度优化（CGT-DO）方法，这是一种由硬件计算逻辑驱动的结构化剪枝策略。尽管深度网络增强了光谱特征的抽象能力，但其重复的级联计算会导致硬件中的流水线周期问题。CGT-DO 策略采用灵敏度驱动的结构化剪枝来压缩网络拓扑深度，同时减少参数数量和异构算子的调用频率，从而产生一个针对嵌入式高光谱成像而优化的轻量级高光谱重建网络（Lite-SRNet）。

结果

此外，在计算架构的系统级验证方面，我们将 HyperN 芯片与高光谱采集传感器 (HyperspecI) (1) 集成，开发了一套可见-近红外（400 至 1000 nm）在线视频速率高光谱计算微系统，命名为 Hypervision。HyperspecI 传感器采用了具有不同空间分布的宽带光谱调制材料，实现了空间-光谱域的非均匀压缩编码，并保持了 74.8% 的光学透过率。结合 HyperN 的高效计算能力，Hypervision 微系统实现了在 61 个波长通道、512×512 像素下以 32.9 帧每秒 (fps) 的速度，或在 16 个波长通道、1024×1024 像素下以 24.6 fps 的速度进行实时高光谱成像。该微系统高度集成，无需外部电源或额外的庞大计算平台，

重量仅约 950 g，功耗降低了一个数量级（约 25.3 W），其能效比达到 367 giga-operations per second (GOPS) / W，可与车载航天级芯片和边缘人工智能 (AI) 计算设备相媲美。凭借在线实时能力，Hypervision 微系统在时间敏感型应用中具有巨大潜力。为了进行演示，我们开展了智能驾驶和空对地监测应用。在智能驾驶场景中，Hypervision 实现了动态目标光谱分析、道路障碍物材质识别以及地面状态表征。在空对地监测中，我们将 Hypervision 集成到一台自组装的紧凑型四旋翼无人机 (UAV) 中，成功实现了车载实时高光谱重建。这些应用证明了 Hypervision 在高信噪比、动态光谱采集、实时解耦重建和低功耗方面的突破性

优势，这为下一代集成化、在线化和视频速率的高光谱相机及系统提供了潜力。

HyperspecI 传感器和 HyperN 芯片（图 1A）。HyperspecI 传感器在光谱域对目标场景进行动态编码，将高维光谱信息压缩到单帧采集中。采集到的编码图像被传输至 HyperN 计算芯片。通过使用轻量级混合神经网络 Lite-SRNet，该芯片对

Hypervision 的高光谱成像性能

Hypervision 微系统由两个硬件组件组成：高光谱图像，可实现动态场景的实时可视化。这一闭环工作流将光学编码、数据采集、实时解耦和视觉输出集成到一个完整的微系统中，实现了从传统的“采集设备 + 图形处理单元 (GPU)”向“一体化近传感器计算解决方案”的转变。

B C

D

图 1. Hypervision 在线视频速率高光谱成像的工作性能。(A) Hypervision 微系统由 Hyperspecl 传感器和 HyperN 芯片组成。来自目标场景的光线经 Hyperspecl 传感器调制并采集。采集到的原始数据被输入到 HyperN 计算芯片中，由 Lite-SRNet 实时解耦高光谱图像。(B) Hypervision 微系统的示意图，突出了其无需外部电源或计算需求的一体化集成设计。定制计算芯片 HyperN 与主流快照高光谱成像系统的性能对比。MVoxel 表示百万体素，用于描述高光谱图像的数据量。(C) 左图显示了搭载在无人机上的 Hypervision 系统在实时巡航期间的航拍视图。中图对比了原始数据与合成的 RGB 图像。右图显示了位置 P1 至 P4（黄星）的光谱曲线，验证了在开放环境中的实时分析能力。(D) 左图展示了使用 Hypervision 捕捉火焰枪点火过程的实验配置。中图显示了合成 RGB 格式的重建结果。右图阐明了在整个动态点火过程中同一位置（P1 至 P5 黄星）对应的光谱曲线；阴影区域表示火焰的动态光谱曲线变化。

我们进一步将 Hypervision 微系统集成到一个完整的设备中，该设备具备电源供应、实时高光谱成像和显示等独立功能（图 1B）。该设备采用碳纤维外壳，并配备了一个定制的 15,000 mA·小时电源模块和一个 5 英寸（1 英寸 = 2.54 cm）显示屏。该设备的整体尺寸仅为 92 mm $\times$ 96 mm $\times$ 112 mm，质量为 950 g，具有高度紧凑和轻量化的设计。单次充电可支持长达 6 小时的连续运行。为了满足动态场景中多维信息采集与处理效率的同步需求，Hypervision 支持在运行模式之间灵活切换，能够实现在线视频速率的高光谱成像，模式包括：61 个波长通道、分辨率 $\$512 \times 512$ 像素、帧率为 32.9 fps；或 16 个波长通道、分辨率 $\$1024 \times 1024$ 像素、帧率为 24.6 fps。该设备在极紧凑的形态和低功耗框架内实现了高性能的原位高光谱重建与传感。

为了验证 Hypervision 的成像性能和场景泛化能力，我们在三种具有代表性的光照条件下进行了高光谱成像实验，包括室内受控光照（卤素灯：400 至 1000 nm）、单源室内光照 [发光二极管 (LED)：400 至 700 nm] 以及动态室外光照（阳光：400 至 1000 nm）。高光谱图像的峰值信噪比 (PSNR) 高达 42.97 dB。平均光谱保真度为 99.815%（更多详情见 SM 第 6.1 节）。Hypervision 微系统的高光谱成像结果在室外和室内动态场景中均已获得。室外实验采用了自主研发的无人机 (UAV) 平台，获取了实时巡航任务中的原始数据和合成 RGB 重建图，并附带相应的光谱剖面（图 1℃）。图 1D 展示了火焰枪点火过程的重建高光谱数据（合成 RGB 格式），以及在选定位置提取的光谱。这些结果共同验证了 Hypervision 微系统不仅能在受控的瞬态场景中精确捕捉空-谱信息，而且在复杂的开放环境中也能保持鲁棒的动态高光谱成像能力，证明了其在多种应用平台上的适应性。关于 Hypervision 的全面性能实验详见 SM 第 6 节。

HyperN 的工作原理与性能

HyperN 在 Hypervision 微系统中执行计算任务。其创新之处在于采用了源自数据局部性理论 (31, 32) 的创新数据流空间计算原理，这与传统的冯·诺依曼控制流时分复用原理 (33) 不同。它在物理空间中展开计算图，允许数据在空间分布的算子之间连续流动，而不会被指令边界截断。这种空间数据流消除了流水线气泡，使计算单元保持完全饱和，并在严格的功耗预算下实现了吞吐量的最大化。该架构具有通用性和可重构性，并非针对任何特定网络进行硬连线，因此适用于任何使用支持算子的图像重建和处理任务。

对于硬件算子，我们设计了针对网络异构计算特性量身定制的差异化硬件优化策略（图 S2A 和 SM 第 3.2 节）。图 2A 展示了硬件算子优化策略的定量实验结果，其中查找表 (LUT) 利用率和单次推理延迟是关键性能指标。对于标准卷积（卷积核大小 $3 \times 3$，$1 \times 256 \ 256$ 到 $32 \ 256 \ 256$），与传统的双缓冲实现相比，$\mathrm{D}^2\mathrm{BA}$ 架构使 LUT 占用率增加了 18%，但实现了 55% 的延迟降低（2.25 倍加速）。在具有四个高性能 (HP) 接口并行化的下采样操作（卷积核大小 4×4，32×256×256 到 32×128×128）中，它产生了 27% 的 LUT 开销，但实现了 60% 的延迟提升（2.62 倍加速）。在保持等效 LUT 资源利用率的情况下，针对逐点卷积 (32×256×256) 的参数降维策略实现了 17% (1.21 倍加速) 的延迟降低，而针对深度可分离卷积 (32×256×256) 的基于动态触发的参数加载策略实现了 34% (1.52 倍加速) 的延迟降低。此外，我们针对 Softmax 计算 (4×32×32) 采用的 64 项级数近似将资源使用量降低至 31% (3.19 倍优化)，同时保持了推理延迟，且均方根误差低至 0.49%。

此外，我们报告了用于 Transformer-CNN 混合高光谱重建网络的 $\mathrm{D}^2\mathrm{BA}$ 硬件加速器。图 2B 展示了该加速器的架构，它使用片外 DDR4 内存来管理网络权重、偏置和中间特征图。由 ARM 核心驱动的处理系统端负责全局逻辑控制和数据流调度。通过四个高级可扩展接口 4 (AXI4) HP 接口实现了与可编程逻辑端的高吞吐量数据交换。计算单元由并行化处理单元 (PE) 阵列组成，每个 PE 在逻辑上由缓冲模块、数据流模块和计算模块组成，以实现高效计算。

缓冲模块通过双端口块随机存取存储器 (RAM) 在当前时间步动态激活输入-输出缓冲区，而数据流模块采用了双双缓冲架构，开创了跨空间、通道和时间域的三维流水线叠加。该设计实现了加载、计算和存储的零气泡执行，将传统的单时间维度双缓冲扩展为多级并发且多维的加速框架（$\mathrm{D}^2\mathrm{BA}$ 与传统双缓冲的对比详见 SM 第 3.1 节和图 S1）。在空间维度上，外层循环使用粗粒度双缓冲对块计算和块存储进行流水线处理。在每个块内部，通道维度被进一步分解为瓦片级 (tile-level) 单元，其中一个内部双缓冲流水线并发地

执行分块加载和分块计算，从而在输入-输出通道之间实现内存与计算的重叠。最后，在每个分块核心内部，一个细粒度的时序流水线通过算子级调度确保无停顿执行。这种跨空间、通道和时序流水线的三维协调，使数据流模块能够作为一个多级并发引擎，系统性地隐藏所有粒度的延迟，并超越了传统单级缓冲的效率。计算模块通过一个多级乘加阵列映射底层算术逻辑，并严格遵循知识产权（IP）核心算子设计范式执行计算。该加速器在 Xilinx Zynq AXU15EG 异构 FPGA 上进行了功能验证，对于 FP16 精度的单帧高光谱重建，其端到端延迟低于 220 ms。关于 $D^{2}BA$ 能量和资源分析的更多细节可见 SM 第 3.3 节。

对于 ASIC 实现，$D^{2}BA$ 加速器在寄存器传输级（RTL）进行设计，并被封装为一个具有指令集架构和 AXI4 接口的可综合 NPU IP 核，从而能够标准化地集成到片上系统（SoC）中。该 SoC 使用分层 AXI4 总线来互连四个功能模块（图 2℃）。智能计算模块集成了两个 NPU 处理器，并采用多级时钟门控以提高能效。每个 NPU 占用 27.8 mm $^{2}$，功耗为 12 W，并支持多种数据类型以进行实时推理。基于双四核 ARMv8 处理器 [1.2 GHz, 2.3 Dhrystone 每秒百万条指令 (DMIPS) / MHz] 的中央处理器（CPU）模块负责系统控制、任务调度和后处理。内存模块包含四个 DDR4 控制器 [3200 megatransfers (MT) / s] 用于 NPU 数据缓存，而接口模块则提供了一个外设组件互连快速总线（PCIe；四通道，8.0 GT / s）用于显示连接和低速外设 [通用异步收发传输器 (UART)、串行外设接口 (SPI)、通用输入输出 (GPIO)]。最终的芯片布局（图 2℃）采用了模块化分区和多电源域协同设计，DDR4 控制器布置在边缘以优化信号路由。制造出的 HyperN NPU（图 1A）的晶圆面积为 $279.1\mathrm{mm}^2$，并封装在 4.3 厘米 $\times$ 4.3 厘米的翻转芯片陶瓷柱阵列（CCGA）中。在 1 GHz 频率和 $-0.3$ 至 $+1.1\mathrm{V}$ 的核心电压下运行，仅芯片功耗为

A

B C

D E

图 2. HyperN 的工作原理与性能。(A) 硬件算子优化通过 LUT 使用率（橙色）和推理延迟（蓝色）进行量化和评估。$e^{x}$ 为指数运算。(B) $D^{2}BA$ 硬件加速器使用片外 DDR4 内存来管理网络参数和特征数据，处理系统端负责全局控制，并通过四个 AXI4 HP 接口与可编程逻辑端通信。计算单元由并行 PE 阵列组成，每个 PE 包括缓冲模块 (BM)、数据流模块 (DSM) 和计算模块 (CM)，支持双双缓冲流水线架构，以协调空间、通道和时间维度的并发执行。(C) HyperN SoC 架构集成了智能计算模块、CPU 模块、内存模块和接口模块，使用多层 AXI4 总线进行高效数据传输，芯片布局采用模块化分区策略以优化功耗和时序。(D) 灵敏度引导的通道剪枝分析，可视化 Lite-SRNet 模块中不同组内卷积核的 S 值分布。(E) 基准 SRNet、Lite-（剪枝率：20%）、通道剪枝 -（剪枝率：50%）以及 L1 范数通道剪枝 -（剪枝率：30%）在网络信息（表格）、单帧推理延迟（橙色）、LUT 资源占用（蓝色）和 PSNR（红线）方面的性能对比。插图显示了由不同方法重建的合成 RGB 图像。

在峰值运行条件下功耗为 25.3 W，并提供了 9.3 TOPS (INT16) 的峰值性能，为实时高光谱计算提供了一种高效的芯片级解决方案。关于 HyperN 芯片的更多细节可见 SM 第 4 节。

对于重建算法，我们采用了 CGT-DO 策略（图 S8），通过模块剪枝（剪枝率 20%）构建了一个轻量级网络，称为 -（网络细节参考 SM 第 5.2 节）。与基准 模型 (1) 相比，单帧推理延迟从 309 降低至 220 ms，LUT 资源占用从 329.6 thousand 减少至 243.2 thousand，并保持了 42.97 dB 的高重建 PSNR（图 2E）。为了进一步压缩模型参数，我们对 - 进行了通道剪枝。图 2D 展示了不同组中不同卷积核的 S 值分布。基于此分析，我们应用了剪枝率为 50% 的结构化剪枝，将网络参数减少至 45.7万，计算成本降低至 16.2 GFLOPs。与传统的 L1 范数剪枝 (34) 相比，我们的方法在更高的剪枝率下实现了 41.09 dB 的 PSNR（图 2E），明显优于 L1 剪枝模型 (31.41 dB)。

智能驾驶应用

在智能驾驶系统中，光谱信息的集成可以显著增强多维环境感知能力。通过利用动态光谱特征提取，可以超越传统视觉系统的感知边界，为自动驾驶决策提供跨模态感知能力。图 3 展示了 Hypervision 在智能驾驶演示中的验证实验。我们使用吸盘装置将 Hypervision 微系统安装在车辆上（图 3A）。车辆以 20 km / 小时的速度直线行驶，该微系统实现了包括表面识别、材料识别和道路识别在内的多种条件下的实时感知（图 3A）。条件 1 对比了潮湿和干燥的路面，以验证 Hypervision 在低对比度环境下分析路况的能力。条件 2 涉及人造石和天然石障碍物，以测试基于光谱反射特征的材料真实性辨别能力。条件 3 选择了典型的道路目标（建筑物和树木），以验证系统实时光谱重建和分析的能力。

图 3B 展示了在驾驶过程中的 6 个动态帧中，使用 RepViT 算法 (35) 对高光谱图像进行实时语义分割后的原始测量图像、实时重建的合成 RGB 图像以及融合结果。道路、树木和建筑物等目标成功实现了像素级分割，证明了该微系统在户外环境中的实时感知能力。图 3℃ 显示了在第一种条件下采集的潮湿和干燥路面的重建光谱。通过分析 550 至 900 nm 波长范围内的光谱差异

A

B

C

D E

图 3. 智能驾驶户外验证实验。(A) 左图为通过吸盘装置安装在车辆上的 Hypervision。右图为在 20 km / 小时直线行驶期间捕捉到的三个动态场景。条件 1 对比潮湿和干燥路面。条件 2 对比人造石和天然石障碍物。条件 3 包括典型道路目标（建筑物和树木）。(B) 6 个动态帧显示了原始测量、实时重建的 RGB 图像和实时语义分割结果 (RepViT)，实现了道路、树木和建筑物的像素级分割。(C) 潮湿和干燥路面的重建光谱 (550 至 900 nm)，证明了准确的低对比度表面状态推断。GT，地面真值；RS，重建。(D) 人造石和天然石的重建光谱 (700 至 900 nm)，显示出用于动态材料识别的显著光谱差异。(E) 树木和建筑物的重建光谱 (400 至 1000 nm)，验证了动态条件下实时高光谱成像和目标光谱信息提取的能力。平均光谱保真度为 99.849%。

在该范围内，Hypervision 能够准确推断低对比度环境下的路面状态。图 3D 展示了在第二种条件下采集的人造石和天然石样本的重建光谱。在 700 至 900 nm 的波长范围内，这两个样本表现出显著的光谱差异。Hypervision 实现了动态材料识别，为智能驾驶中的自主避障提供了关键的材料信息。图 3E 显示了路边树木和建筑物的重建光谱。

在 400 至 $1000\mathrm{nm}$ 的全光谱范围内，两者的光谱特征截然不同，进一步验证了 Hypervision 在动态条件下进行实时高光谱成像和目标光谱信息提取的能力。同一场景的地面真值高光谱图像是使用 FigSpec-23 推扫式高光谱相机获取的，将其与 Hypervision 的重建结果进行对比，得出的平均光谱保真度为 $99.849\%$。

空对地监测应用

对于空对地监测应用而言，将实时高光谱成像与分析集成到无人机等轻量化移动平台上仍面临着持续的系统性挑战。传统的推扫式高光谱成像设备对于小型无人机来说过于笨重、沉重且功耗过高。即便成功集成，其线扫描机制在平台移动过程中也容易产生严重的运动伪影和几何畸变，导致光谱和空间信息失真，无法满足动态监测的需求。虽然快照式高光谱相机能够瞬间捕捉图像，但其典型的架构将采集、存储和离线处理分离，导致数据吞吐量高且处理延迟大。这使得其难以支持需要高光谱信息实时反馈的任务。

为了全面评估 Hypervision 设备的实际优势，我们将其集成到一台自组装的紧凑型四旋翼无人机中，成功实现了空对地监测应用中的实时高光谱重建。该无人机采用轻量化且紧凑的设计，整体尺寸为 620 mm by 640 mm by 860 ，最大轴距为 680 ，净质量为 2.5 kg，并利用 HyperspecI 传感器 (1) 开发了一个名为 Hypervision 的集成计算微系统，能够在可见-近红外范围内实现动态场景的在线视频速率高光谱成像。与现有系统相比（表 S3 和 S4），Hypervision 保持了 $92\mathrm{}$ by $96\mathrm{}$ by $112{}$ 的紧凑体积，质量为 $950{g}$，且在无需外部电源或笨重计算平台的情况下可连续运行 6 小时，功耗仅为 $25.3{W}$，比通用 GPU 低一个数量级。我们通过智能驾驶和空对地监测中的道路目标实时识别，验证了其有效性和独特性。

原则上，现有的高光谱成像系统 (7) 遵循冯·诺依曼架构，其中算术运算和数据移动通过一组共享的通用计算单元进行串行化处理。每次操作都需要明确的指令调度，并且在每个时钟周期进行频繁的配置切换，从而产生相当大的指令开销。中间结果被重复写回片外内存并在随后的指令中重新加载，导致数据流碎片化并降低了内存局部性。这种脱节的调度方式排除了计算与数据传输之间有效的重叠，从而加剧了“内存墙”瓶颈。

其飞行续航时间可达 10 min。集成后，在 $\sim$ 1亿美元 的巡航高度进行了野外实验，期间 Hypervision 设备独立运行，无需从无人机抽取电能。图 4A 清晰地展示了该微系统在无人机上的安装配置，以及起飞和高空巡航状态。图 4B 展示了采集到的原始数据的六帧示例及其对应的合成 RGB 图像。图 4℃ 显示了无人机巡航期间捕捉到的雪地、树木、灌木和地面场景的重建光谱。我们使用 Ocean Optics USB 2000+ 光谱仪获取了雪地、树木、灌木和地面表面的地面真值光谱。与 Hypervision 的重建结果对比显示，平均光谱保真度为 99.629%。该实验充分证明了 Hypervision 微系统在轻量化设计、低功耗和实时处理方面的系统级优势，为航空高光谱遥感提供了一种高效且可靠的解决方案。

B

C

结论与讨论

在这项工作中，我们报告了一种具有硬件-软件协同设计范式的片上高光谱计算框架，实现了在线高光谱成像重建。在硬件层面，我们设计了一个 $D^{2}BA$ 硬件加速器，该加速器首先在 FPGA 上进行了原型设计，随后被制造成为一个名为 HyperN 的高性能 NPU。在软件层面，我们引入了一种 CGT-DO 结构剪枝策略，通过硬件计算逻辑驱动的逆向工程深度优化了网络拓扑，从而产生了一个名为 Lite-SRNet 的轻量级高光谱重建网络。此外，我们将 HyperN 芯片共同嵌入

图 4. Hypervision 用于空对地监测的验证实验。(A) 将 Hypervision 微系统集成到小型自组装无人机平台中进行高空实时高光谱重建的实验。(B) 六组动态帧测量原始数据及其对应的合成 RGB 图像。(C) 巡航期间捕捉到的典型场景（树木、雪地、灌木和地面）的光谱曲线。平均光谱保真度为 99.629%。

因此，计算资源始终处于利用不足的状态，且功耗和延迟随计算需求的增加而线性增长。相比之下，Hypervision 遵循源自数据局部性理论的数据流空间计算原理，在连续算子粒度上调度专用数据流，并通过将计算直接嵌入采集端来实现近传感器计算。具体而言，我们在算子粒度上调度了专用数据路径，有效地将计算图展开到物理空间中。神经网络算子被实现为可配置逻辑块，数据在加载到片上缓冲区后，连续流经空间分布的处理单元，在写回之前完成整个算子链，从而实现了深度的片上数据复用。跨空间、光谱和时间维度的三维数据流调度实现了计算与数据移动的无缝重叠，消除了流水线停顿。这种连续执行使计算单元保持完全饱和，在严格的功耗预算下实现了高吞吐量。这种从控制流时分复用到数据流空间计算的范式转变，使 Hypervision 能够克服重建延迟与实时采集需求之间的不匹配。

目前的实现仍有进一步增强的空间。首先，空间分辨率、光谱通道和帧率之间固有的权衡可以通过先进的工艺节点和基于 Chiplet 的异构封装来进一步缓解，以提高集成密度、吞吐量和能效 (36)。其次，为了进一步提高域偏移重建的泛化能力和鲁棒性，可以使用包含不同场景和不同光照的更多样化数据集来训练模型。还可以引入迁移学习策略（如域泛化）来提高模型处理分布外数据的能力 (37)。总的来说，我们认为这项工作为新一代全合一在线处理相机提供了一种方法，并且我们预见所报道的技术可进一步应用于多个领域，例如生物医学（如术中导航）(38)、微纳空间平台上的遥感 (39) 以及可穿戴传感 (40)。

参考文献与注释

1. L. Bian 等，Nature 635, 73–81 (2024).

2. D. Li, J. Wu, J. Zhao, H. Xu, L. Bian, Nat. Commun. 15, 9459 (2024).

3. D. W. Sun, H. Pu, J. Yu, Nat. Rev. Electr. Eng. 1, 251–263 (2024).

4. J. Yoon 等，. Commun. 10, 1902 (2019).

5. B. G. Ram, P. Oduor, C. Igathinathane, K. Howatt, X. Sun, Comput. Electron. Agric. 222, 109037 (2024).

6. X. Yuan, D. J. Brady, A. K. Katsaggelos, IEEE Signal Process. Mag. 38, 65–88 (2021).

7. Y. Xu, L. Lu, V. Saragadam, K. F. Kelly, . Commun. 15, 1456 (2024).

8. M. Descour, E. Dereniak, Appl. Opt. 34, 4817–4826 (1995).

9. A. Wagadarikar, R. John, R. Willett, D. Brady, Appl. Opt. 47, B44–B51 (2008).

10. F. Yesilkoy 等，. Photonics 13, 390–396 (2019).

11. C.-H. Lin, S.-H. Huang, T.-H. Lin, P. C. Wu, . Commun. 14, 6979 (2023).

12. J. Xiong 等，Optica 9, 461–468 (2022).

13. H. He 等，Adv. Mater. 36, e2313357 (2024).

14. Z. Wang 等，. Commun. 10, 1020 (2019).

15. S. Liu 等，. Photonics 18, 967–974 (2024).

16. M. Yako 等，. Photonics 17, 218–223 (2023).

17. X. He 等，. Electron. 7, 694–704 (2024).

18. D. S. Jeon 等，ACM Trans. Graph. 38, 1–13 (2019).

19. W. Zhang 等，Light Sci. Appl. 10, 108 (2021).

20. X. Du 等，. Electron. 7, 984–990 (2024).

21. T. Wang 等，IEEE Trans. Comput. Aided Des. Integr. Circ. Syst. 41, 4088–4099 (2022).

22. Z. Li 等，载于第32届现场可编程逻辑与应用国际会议论文集 (, 2022), 第 109–116 页.

23. Z. Luo, L. Lu, Y. Jin, L. Jia, Y. Liang, 载于第33届现场可编程逻辑与应用国际会议论文集 (, 2023), 第 242–247 页.

24. W. Ye, X. Zhou, J. Zhou, C. Chen, K. Li, ACM Trans. Embed. Comput. Syst. 22, 1–22 (2023).

25. D. Parikh 等，载于 2024 第32届现场可编程定制计算机器年度国际研讨会 (, 2024), 第 78–89 页.

26. H. You 等，载于 2023 高性能计算机架构国际研讨会 (, 2023), 第 273–286 页.

27. Y. Fu, T. Zhang, L. Wang, H. Huang, Trans. Pattern Anal. Mach. Intell. 44, 3404–3420 (2022).

28. X. Hu 等，载于 2022 / CVF 计算机视觉与模式识别会议论文集 (, 2022), 第 17521–17530 页.

29. R. Sarkar, H. Liang, Z. Fan, Z. Wang, C. Hao, 载于 2023 / ACM 计算机辅助设计国际会议 (, 2023), 第 1–9 页.

30. Z. Zhao 等， Trans. Circuits Syst. II Express Briefs 70, 281–285 (2023).

31. H. Chavan, R. Alghamdi, M. F. Mokbel, 载于 2016 第32届数据工程研讨会国际会议 (, 2016), 第 135–142 页.

32. M. Budiu, G. Venkataramani, T. Chelcea, S. C. Goldstein, 载于第11届编程语言与操作系统架构支持国际会议论文集 (ACM, 2004), 第 14–26 页.

33. J. von Neumann, Ann. Hist. Comput. 15, 27–75 (1993).

34. H. Li, A. Kadav, I. Durdanovic, H. Samet, H. P. Graf, 载于第5届学习表示国际会议论文集 (2017).

35. A. Wang, H. Chen, Z. Lin, J. Han, G. Ding, 载于 / CVF 计算机视觉与模式识别会议论文集 (, 2024), 第 15909–15920 页.

36. W. Tang 等， J. Solid-State Circuits 59, 1235–1245 (2023).

37. K. Zhou, Z. Liu, Y. Qiao, T. Xiang, C. C. Loy, Trans. Pattern Anal. Mach. Intell. 45, 4396–4415 (2023).

38. G. Lu, B. Fei, J. Biomed. Opt. 19, 10901 (2014).

39. A. F. Goetz, G. Vane, J. E. Solomon, B. N. Rock, Science 228, 1147–1153 (1985).

40. Q. Jiang 等，Sci. Adv. 11, eadw7279 (2025).

41. L. Bian, 论文《Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging》中网络的数据集。Science Data Bank (2026); https: / doi.org / 10.57760 / sciencedb.41690.

42. L. Bian, The data underlying the main figures of the paper titled Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging. Science Data Bank (2026); https: / doi.org / 10.57760 / sciencedb.41693.

致谢

我们感谢清华大学自动化系的 Y. Liu 和北京理工大学化学与化工学院的 B. Wang 在修订期间提供的启发性讨论。感谢北京理工大学分析测试中心在材料制备和测试方面提供的帮助。资金支持：本研究得到了国家自然科学基金（61827901, 62322502, 和 62131003）、青年教师科研创新能力支持项目（ZYGXQNJSKYCXNLZCXM- I4）以及北京市自然科学基金（JQ25017）的支持。作者贡献：L.B.、Q.M. 和 Ju.Z. 构思了该想法。L.L. 和 Z.W. 进行了 HyperspecI 传感器的设计与集成。Q.M. 和 X.P. 设计并测试了计算芯片。Q.M. 和 Ji.Z. 完成了重建算法的设计与优化。Z.Y. 完成了计算芯片的流片。Q.M.、Z.W.、J.W.、Y.F. 和 L.L. 实现了相关应用。L.B.、Q.M.、L.L.、X.P.、Z.W. 和 Ji.Z. 在所有作者的参与下准备了图表并撰写了论文。L.B. 和 Ju.Z. 监督了该项目。竞争利益：L.B.、Q.M. 和 Ju.Z. 持有与本工作相关的技术专利（中国专利号 ZL202410781451.7, ZL 202210764166.5, 和 ZL 202210764141.5）并已提交相关专利申请。数据、代码和材料可用性：评估本文结论所需的所有数据均在正文或补充材料中提供。网络数据集以及主图的基础数据可在 Science Data Bank (41,42) 获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会（American Association for the Advancement of Science）。对美国政府原始作品不主张权利。https: / www..org / about / -licenses-journal-article-reuse

补充材料

材料与方法；图 S1 至 S12；表 S1 至 S5；参考文献 (43–100)；视频 S1 至 S3

2026年1月27日提交；2026年5月11日重新提交；2026年7月1日接收

10.1126 / .aef8268

METABOLISM

SGLT2 抑制剂激活人类心脏中的泛酸激酶

Nicholas Forelli $^{1\dagger}$ , Trace Thome $^{1\dagger}$ , Deborah M. Eaton $^{1}$ , Kollin Schultz $^{1}$ , Jiten Patel $^{1}$ , Caitlyn E. Bowman $^{1}$ , Ryo Kawakami $^{1}$ , Jae Woo Jung $^{1}$ , Ivan A. Kuznetsov $^{1}$ , Kristina Li $^{1}$ , Jialiu A. Liang $^{1}$ , Kirsten Branch $^{1}$ , Claire Brady $^{1}$ , Kenneth C. Bedi Jr. $^{1}$ , Yijun Yang $^{1}$ , Kaustubh Koya $^{1}$ , Nesrine Bouhrira $^{1}$ , Emily Megill $^{2}$ , Daniel S. Kantner $^{2}$ , Louis G. Smith $^{3}$ , Cristin F. MacIntosh $^{3}$ , Kushol Gupta $^{3}$ , Gregory R. Bowman $^{3}$ , Nathaniel W. Snyder $^{2}$ , Jonathan Edwards $^{4}$ , Kenneth B. Margulies $^{1}$ , Zoltan Arany $^{1,5*}$

钠-葡萄糖共转运蛋白 2 抑制剂（SGLT2i）可降低心力衰竭的死亡率，但其药理靶点尚不明确。在本研究中，我们证明 SGLT2i 直接激活泛酸激酶 1（PANK1），这是辅酶 A（CoA）合成中的限速酶。通过稳定同位素输注，我们确定 SGLT2i 激活 CoA 合成并广泛刺激人类心脏组织中的燃料利用。我们还证明 SGLT2i 在生理浓度下可与 PANK1 结合，直接诱导构象变化并增加酶活性。计算机模拟（In silico modeling）确定了 SGLT2i 在 PANK1 上的结合位点，并由氨基酸诱变实验证实。最后，我们证明 SGLT2i 介导的 PANK 激活对于增强人类心肌细胞的收缩力是必要且充分的。总之，我们证明了 SGLT2i 对 PANK1 的脱靶激活以及对 CoA 合成的促进作用，这可能解释了其显著的临床获益。

钠-葡萄糖共转运蛋白 2 抑制剂（SGLT2i）是一种口服降糖药，已成为心力衰竭（HF）患者指南指导药物治疗的基础组成部分 (1)。SGLT2i 最初开发用于通过抑制肾近端小管中 SGLT2 介导的葡萄糖重吸收，从而促进 2 型糖尿病（T2DM）患者的尿糖流失。在 T2DM 患者的 3 期临床试验中，SGLT2i 减少了主要心血管不良事件，这在很大程度上是通过对 HF 的强力保护实现的，且与 T2DM 的严重程度无关 (2)。随后的试验显示，无论 患者是否患有糖尿病，使用 SGLT2i 治疗均能同等程度地降低死亡率和 再次住院率 (3–7)。SGLT2i 目前是治疗 的一线药物。然而，SGLT2i 的副作用不可忽视，包括生殖器霉菌感染和尿路感染（UTIs）等靶向副作用、过度利尿以及潜在的酮症酸中毒，所有这些都被认为是由糖尿引起的。此外，当开始胰岛素治疗时，SGLT2i 和其他口服降糖药通常在入院时被停止，从而可能减轻其在 加重住院患者中的心血管获益。

SGLT2i 实现心脏保护的机制仍不清楚。脱靶作用机制极有可能，因为 (i) SGLT2 在心脏中不表达，但多项研究显示 SGLT2i 对分离的心肌细胞或心脏有直接影响；且 (ii) 在小鼠中，SGLT2i 治疗在基因缺失 SGLT2 的动物和对照动物中，均能同等程度地减少缺血再灌注后的梗死面积，并部分改善经主动脉缩窄-心肌梗死后的功能 (8–11)。SGLT2i 这种非 SGLT2 药理靶点的身份仍然难以捉摸。在此，我们证明 SGLT2i 对人类心脏的代谢和收缩功能具有直接影响，并且我们将泛酸激酶（PANK1）鉴定为 SGLT2i 的一个靶点，从而解释了这些获益。

SGLT2i 直接促进人类心脏代谢

关于 SGLT2i 是通过直接影响心脏还是通过全身代谢重编程来使心力衰竭（HF）获益，目前仍存在争议，但缺乏人体数据 (12–14)。因此，我们首先试图测试 SGLT2i 是否直接影响人类心肌的代谢。我们开发了一种离体灌注心脏组织块（平均：7 g）的方法，这些组织块取自移植受者或器官捐献者心脏的室间隔（IVS）（表 S1）。组织块使用含有生理浓度心脏燃料的循环 Krebs-Henseleit 缓冲液进行灌注，其中几种燃料被稳定重同位素标记（[6,6- $^{2}$ H]-葡萄糖、[1- $^{13}$ C]-谷氨酰胺、[3- $^{13}$ C]-乳酸、[U- $^{13}$ C]-缬氨酸和 [U- $^{13}$ C]-3-羟基丁酸），并使用 700 nM 的 SGLT2i 药物恩格列净（EMPA）或溶媒对照进行处理（图 1A）。所选的 EMPA 剂量反映了患者体内达到的血浆浓度 (15–17)。每颗心脏的多个 IVS 组织块进行平行灌注，使每颗心脏都作为其自身的对照。我们首先通过测量循环灌注液中标记营养物质的消失量，来测试 对心脏燃料消耗的影响。在衰竭的人类心肌中， 处理增加了大多数燃料的摄取，表明 广泛激活了代谢活动（图 1B 和图 S1A）。与此一致，在经 处理的心脏组织块中，这些燃料的组织水平有所提高（图 1℃）。在经 处理的 Langendorff 离体大鼠心脏中也观察到了类似的增加（图 S1B）。

灌注液中同位素标记底物的存在使我们接下来能够追踪燃料来源的碳进入三羧酸循环（TCA）的情况，这是燃料氧化的一个间接衡量指标。在经 处理的心脏组织块中，标记 TCA 碳的分数富集显著增加（图 1D），反映了来自乳酸和 3-羟基丁酸的标记碳通过乙酰辅酶 A (AcCoA) 以及来自缬氨酸的标记碳通过丙酰辅酶 A 和琥珀酰辅酶 A 的整合增加。尽管灌注液中不含标记脂肪酸，但 处理的心脏组织块中酰基肉碱水平升高，表明 处理也增加了脂肪酸氧化（图 1E）。在经 灌胃后的完整小鼠体内实验中也观察到了类似结果（图 S1℃）。人类组织块对 产生的这些反应是在关键代谢酶和转运蛋白表达未改变的情况下发生的（图 S1D）。最后，与代谢活动的广泛激活一致， 处理增加了三磷酸腺苷 (ATP) 并减少了单磷酸腺苷，从而增强了这些心脏组织的能量电荷（图 1F）。我们得出结论， 直接且广泛地促进人类心脏的氧化代谢，从而挽救了在衰竭心脏中可见的已知能量缺陷 (18–20)。

SGLT2i 激活 CoA 合成以促进心脏代谢

为了探究 SGLT2i 如何如此广泛地影响心脏代谢，我们对经 处理与溶媒处理的灌注心脏组织块进行了非靶向全局代谢组学分析（图 S2A 和表 S2）。在几种改变的代谢物中，我们注意到 CoA 合的前体泛酸（维生素 B5）减少了两倍以上（图 2, A 和 B）。CoA 是几乎所有途径的必需辅因子

B Perfusate

D

C 组织

E

F

图 1. SGLT2i 直接促进心衰患者的人类心脏代谢。(A) 实验设计。HRMS，高分辨率质谱；LAD，左前降支动脉。(B) 灌注 90 分钟后，从灌注液中摄取的指定底物。(C) 灌注 90 分钟后，指定底物的归一化丰度。(D) 灌注 90 分钟后，指定中间代谢物的 $^{13}\mathrm{C}$ 分数富集度。HIB，羟基异丁酰辅酶 A。(E) 灌注 90 分钟后，组织中酰基肉碱的归一化丰度。(F) 灌注 90 分钟后，组织中能量代谢物的相对水平。ADP，腺苷二磷酸；AMP，腺苷一磷酸。$P$ 值通过配对双侧 Student's t 检验计算。误差线为 $\pm$ SE。

A

B

D

E

G

C

新生大鼠心肌细胞

F

成年大鼠心肌细胞

H

图 2. SGLT2i 激活 CoA 合成以促进心脏代谢。(A) 从泛酸（pantothenate）合成 CoA 的示意图。BCAA，支链氨基酸；KG，α-酮戊二酸；Pi，无机磷酸盐。(B) （左）在接受 EMPA 处理的灌注失效人类心脏组织中，泛酸被耗尽。（右）磷酸泛酸与泛酸的比率增加。(C) （左）灌注的失效人类心脏块对标记泛酸的分数摄取量增加，以及（右）响应 EMPA 处理后，组织 AcCoA 从标记泛酸前体中的标记量增加。(D) 与非失效（NF）供体对照组相比，移植后人类心衰（HF）样本中 物种的丰度降低。(E 和 F) 在使用溶媒、 或 联合 PPCS 抑制剂 HOPA 处理的 NRVMs 中，来自标记泛酸的 AcCoA 分数富集（E）以及来自 $^{13}\mathrm{C}$ 标记混合物的琥珀酰- 分数富集（F）。(G) 通透化 ARVMs 响应 、泛 PANK 激活剂 PZ-2891, 和 HOPA 的耗氧量 $(J_{\mathrm{O_2}})$。CI，复合物；Cyt C，细胞色素 C；OC，辛酰肉碱；PM，丙酮酸和苹果酸；Succ，琥珀酸。(H) 增加了细胞质和线粒体中乙酰- 的浓度，效果与 PZ-2891 相似，且可被 HOPA 抑制。$P$ 值通过配对 [(B) 和 (C)] 或非配对 [(E) 至 (G)] 双侧 Student's $t$ 检验或双向方差分析 (H) 计算得出。误差棒为 $\pm$ SE。

细胞燃料利用，包括碳水化合物、脂肪和氨基酸的降解 (21)。全局代谢组学的通路分析强调， 合成受 处理的影响极大（图 S2A，右面板）。从泛酸合成 的五步过程（图 2A）始于 PANK 对泛酸的限速磷酸化，而 增加了灌注心脏块中磷酸泛酸与泛酸的比率（图 2B，右面板）。在 Langendorff 准备的 处理心脏块和 处理的大鼠心脏中， 合成后续步骤所需的半胱氨酸被耗尽（图 S2B），这与 生物合成的激活一致。为了正式测试泛酸的消耗情况，我们在灌注液中补充了 $\left[{ }^{13} \mathrm{C}_{3}{}^{15} \mathrm{~N}\right]$-泛酸。 处理使人类心脏对泛酸的分数摄取量增加了一倍以上，并显著增加了同位素标记泛酸向乙酰- 的整合（图 2℃）。在 Langendorff 准备的经 处理的大鼠心脏中，泛酸同样被耗尽，且乙酰- 同时增加（图 S2℃）。在完整的小鼠中，灌胃给药 导致几乎所有测试的 物种（包括游离 (CoASH)）的心脏水平升高（图 S2D）。因此，数据表明 可能促进 合成，挽救心衰心脏中 丰度不足的问题，从而解释了 处理所观察到的广泛益处。与这一观点一致，与非失效供体相比，心衰人类心脏中各种酰基-（最重要的是 CoASH）的丰度显著降低（图 2D）。

为了测试 SGLT2i 对 CoA 合成的激活是否介导了 SGLT2i 对 TCA（三羧酸循环）的影响，我们使用了培养的心肌细胞和 hopantenate (HOPA)，后者通过抑制 CoA 合成途径中的第二种酶——磷泛酸半胱氨酸合成酶 (PPCS) 来阻断 CoA 的合成（图 2A）。用 EMPA 处理新生大鼠心室肌细胞 (NRVMs) 增加了同位素标记的泛酸进入 AcCoA 和 CoASH 的量（图 2E），并提高了 AcCoA 和 CoASH 的总水平，这与此前描述的一种同样能增强 CoA 合成的泛 PANK 激活剂 (PZ-2891) 的效果相似（图 S2E），而这一过程被 HOPA 阻断（图 2E）(22)。用 EMPA 处理 NRVMs 促进了燃料来源的碳进入 TCA 循环（图 2F），证明了这些效应是直接的，且独立于血流、血管或其他细胞。加入 HOPA 阻止了 介导的 TCA 标记增加（图 2F）。与 TCA 活性增强一致， 增加了成年大鼠心室肌细胞 (ARVMs) 的线粒体呼吸，PZ-2891 同样具有此作用，且均被 HOPA 抑制（图 2G）。活细胞生物传感器还表明， 处理增加了细胞质和线粒体中（但不在细胞核中）乙酰辅酶 A 的细胞内丰度，PZ-2891 同样如此，且均被 HOPA 抑制（图 2H 和图 S2F）(23)。我们得出结论， 对 CoA 合成的激活是 增强细胞内 CoA 含量、TCA 活性和线粒体呼吸所必需的。

SGLT2i 激活 PANK1

我们接下来试图鉴定 SGLT2i 中介观察到的 CoA 合成增加的酶靶点。如前所述，CoA 的合成始于 PANK 对泛酸（pantothenate）进行的限速磷酸化。有三个基因编码 PANK，其中 PANK1 在心肌细胞中的表达量最高 (21)。在人类衰竭心脏中，PANK1 和 PANK2 的表达受到抑制（图 3A 和图 S3A），而 PANK1 蛋白和泛酸水平没有显著变化（图 3A 和图 S3B）。因此，我们假设 SGLT2i 通过激活 PANK1 来促进 CoA 合成。与这一观点一致，EMPA 增加了灌流心脏块中磷酸泛酸与泛酸的比率（图 2B）。为了直接测试 EMPA 是否能到达并结合 PANK1，我们首先使用了细胞热转移分析（CETSA）(24)。表达 PANK1 的人胚胎肾 293T (HEK293T) 或 HEPG2 细胞分别接受 或溶媒对照处理，并 subjected to 逐步增加的环境温度，随后对 PANK1 进行蛋白质印迹分析。 的加入显著增加了 PANK1 的热稳定性（图 3B 和图 S3℃），与 PZ-2891 达到的效果相似（图 S3D），证明了 能高效进入细胞并诱导配体引起的热稳定化 (22)。为了测试 与 PANK1 的结合，我们将 固定在珠子上，并从 HEK293T 细胞提取物中沉淀相关蛋白。载有 的珠子（而非对照珠子）能高效地从这些提取物中结合 PANK1（图 3℃），证明了结合作用。对结合在珠子上的蛋白质进行的不偏向性蛋白质组学分析鉴定出了其他几种潜在的 结合蛋白（表 S3）。在一种正交方法中，从 HEK293T 细胞中免疫共沉淀 PANK1 可共沉淀 ，这一点已通过质谱检测到（图 3D）。因此，我们得出结论， 与 PANK1 相关联。

接下来，我们寻求 PANK1 与 之间物理相互作用的直接证据。PANK1 通常以同源二聚体形式发挥作用，并受到酰基化 CoA 物种（主要是乙酰-CoA）的产物抑制 (25)。我们使用离子交换色谱法去除从细菌表达中纯化的 PANK1 中的乙酰-CoA（apo-PANK1；图 S3E）。质量光度法和沉降速度分析超速离心法 (SV-AUC) 证实，纯化的 PANK1 在纳摩尔到微摩尔范围内在溶液中以同源二聚体形式存在（图 S3F）。为了探究 PANK1 的结构特性，我们接下来使用了与同步辐射小角 X 射线散射和多角度光散射联用的尺寸排阻色谱 (SEC-SAXS-MALS)，以及带有演化因子分析的奇异值分解 (SVD-EFA)。我们测试了单独的 apo-PANK1，或加入 、乙酰-CoA 或两者兼有；该测试显示寡聚化没有变化，表明 不改变 PANK1 的寡聚状态（图 S3E）。无量纲 Kratky 分析允许对灵活性和无序性进行定性比较：紧凑的蛋白质通常显示出明显的钟形峰，而展开或灵活的蛋白质在较高的 $qR_{g}$ 处显示出较高的强度值，$qR_{g}$ 是一个结合了散射向量幅值 (q) 和蛋白质回转半径 ($R_{g}$) 的无量纲缩放参数，代表蛋白质在溶液中的折叠、紧凑性和灵活性 (26)。在 apo-PANK1 中加入 促进了紧凑化，类似于加入 AcCoA 所达到的效果（图 3E）。使用 DENSS（来自溶液散射的密度）和 CORAL（具有随机环的复合物）进行的结构建模（分别用于生成低分辨率的从头电子密度和执行混合原子建模 (27)）证明了

EMPA 诱导了 PANK1 显著的构象差异（图 S3G）。尽管 apo 酶呈现出一种类似机翼的展开构象，但 EMPA 和乙酰辅酶A（acetyl-CoA）均促进了该结构的紧凑化，且 带来的变化与 AcCoA 不同，它将构象折叠成 V 形（图 3F）。我们得出结论， 直接结合于天然同二聚体状态的 PANK1，并引入了显著的构象变化。

接下来，我们使用纯化的 PANK1 和两种不同的激酶活性分析方法（28, 29），测试了 对 PANK1 酶活性的直接影响。 处理激活 PANK 活性的程度与 PZ-2891（图 3G 和图 S3H）相似。激活的半最大效应浓度 $(\mathrm{EC}_{50})$ 为 $13\mathrm{nM}$（图 3G），远低于人类接受 治疗时达到的血浆浓度（峰值：500 至 $1500\mathrm{nM}$），且与 PZ-2891 达到的浓度相当。另外两种临床使用的 SGLT2i——卡那格列净（canagliflozin）和达格列净（dapagliflozin）同样增加了 PANK1 的活性（图 S4A），且两者均增加了由生物传感器测得的细胞内乙酰辅酶A浓度（图 S4B），这表明 SGLT2i 对 PANK1 的激活是一种类效应（15-17）。我们得出结论，在生理相关浓度下，SGLT2i 能结合并激活 PANK1 的酶活性。

为了探究 SGLT2i 如何激活 PANK1，我们采用了 PopShift（一种计算机模拟建模方法 (30)），分析 和酰基辅酶A（acyl-CoA）的哪些姿态与从 5 ms 累计分子动力学（通过 Folding@home 收集）中采样的 PANK1 构象相兼容。这些姿态预测 结合在 PANK1 的一个变构口袋中，该口袋也可被酰基辅酶A物种占据（图 3H）。当 占据这个变构口袋时，它不会进入酶的活性位点，因此预计不会阻碍酶活性。预测 对 PANK2 和 PANK3 的结合方式类似（图 S4℃）。为了测试该预测模型的准确性，我们识别了 PANK1 中预测会与 相互作用，但不会与乙酰辅酶A或 ATP 相互作用，且不影响酶口袋的氨基酸残基（图 S4D），我们将其中两个残基 T203 和 V244 突变为 K、A 或 D（T 代表苏氨酸 Thr；V 代表缬氨酸 Val；K 代表赖氨酸 Lys；A 代表丙氨酸 Ala；D 代表天冬氨酸 Asp）。在所有六种情况下，基线酶活性均得以保留，PANK1 过表达导致细胞内乙酰辅酶A增加便证明了这一点（图 3I 和图 S4E）。然而，所有三种 T203 变体都对 的刺激不再敏感，证明了在该预测残基处存在功能性相互作用。最后，我们考虑了 激活 PANK1 至少部分是通过置换抑制性酰基辅酶A物种来实现的可能性。与这一观点一致的是，增加乙酰辅酶A的浓度完全抵消了 对 PANK1 的激活作用（图 S5A）。然而，反之则不成立：

A

B

C

D

E

F

G

图 3. SGLT2i 激活 PANK1。(A) 人类衰竭心脏与非衰竭心脏中 PANK1 的 mRNA 表达量（左）和泛酸含量（右）。(B) PANK1 的 CETSA 分析。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。(C) PANK1 与 EMPA 固定珠的结合。(D) EMPA 与 PANK1 的共免疫沉淀 (Co-IP)。AUC，曲线下面积；IgG，免疫球蛋白 G。(E) 根据 SAXS 数据计算的归一化 Kratky 图（左）和形状分布函数（左）。Pr / I₀，由 I₀ 归一化的对距离分布函数，用于直接比较不同样本的颗粒形状。(F) SAXS 数据的 DENSS（上）和 CORAL（下）分析。(G) PANK1 酶活性对递增剂量的 PANK1 激活剂 (PZ-2891) 或 的响应。(H) 计算机模拟显示 结合在 PANK1 内部与乙酰辅酶 A 相同的变构口袋中。（上）PANK1 二聚体的带状模型。（左下）泛酸结合 PANK1 的放大图。（右下）AcCoA 结合的叠加图，显示其延伸至 PANK1 酶口袋中。(I) 在野生型 PANK1 或所示突变体存在的情况下，响应 处理时细胞质中乙酰辅酶 A 浓度的变化。P 值通过非配对双侧 Student's t 检验计算；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001；NS，无显著差异。误差线为 ±SE。NTC，无模板对照。

在存在 1 $\mu$ M 乙酰辅酶 A（足以抑制 60% 的 PANK1 活性）的情况下，增加 浓度并未解除对该酶的抑制（图 S5B）。 同样不影响来自分离的人类线粒体中其他几种受酰基辅酶 A 物种调节的酶的活性，包括丙酮酸脱氢酶、$\alpha$-酮戊二酸脱氢酶和支链 $\alpha$-酮酸脱氢酶（图 S5℃）(31–33)。因此，更复杂的变构机制介导了 对 PANK1 的激活，这与 PZ 化合物激活的复杂模型以及上述观察到的复杂结构变化一致 (22)。

SGLT2i 对 PANK1 的激活是其发挥功能益处所必需的

为了测试 SGLT2i 是否能直接改善人类心肌细胞的功能，我们从衰竭心脏中分离出成年人类心肌细胞，并按照此前描述的方法量化了收缩力和舒张力的指标（图 4A）(34)。在细胞中加入 EMPA 增加了缩短分数（fractional shortening）和收缩峰值高度，这些均是收缩力的标志（图 4, B 和 C）。EMPA 还增加了舒张速度，并缩短了恢复到 90% 基线的时间，这表明舒张功能得到了改善；舒张是一个耗能过程，需要钙离子迅速重新摄入肌质网（图 4, B 和 C，以及图 S6A）。在对 ARVMs 进行处理时观察到了类似但较不明显的效果，这可能反映了其非衰竭状态（图 S6B）。我们得出结论，SGLT2i 能直接改善人类心肌细胞收缩力和舒张力的许多指标，且该作用独立于全身效应、激素环境或来自血管系统的输入。

B

C

D

图 4. SGLT2i 对 PANK1 的激活是其发挥功能益处所必需的。(A) 实验流程图。(B 和 C) 经指示药物处理的单个衰竭人类成年心肌细胞的样本收缩力和舒张曲线 (B) 以及参数量化 (C)。(D) 经 处理后，衰竭人类心脏线粒体呼吸作用的增加。FAO，脂肪酸氧化；LV，左心室；Pyr / Mal，丙酮酸 / 苹果酸。P 值通过配对 t 检验计算。误差线为 ±SE。

接下来，我们测试了 激活 PANK1 在其对心肌细胞收缩功能产生影响中的作用。在人类心肌细胞中加入 PZ-2891 模拟了 对峰值高度、缩短分数和舒张速度的影响（图 4, B 和 C），证明激活 PANK1 足以促进心肌细胞功能。相反，在经 处理的细胞中加入 HOPA 几乎完全逆转了 的有益效果（图 4, B 和 C，以及图 S6A）。同样，在 ARVMs 中观察到了类似但较不明显的效果（图 S6B）。最后，我们测试了 对从衰竭人类心脏中新鲜分离的纯化线粒体的直接影响，发现经 处理的线粒体中，依赖于二磷酸腺苷（ADP）的呼吸作用出现了小幅但高度可重复的增加（图 4D）。我们得出结论，SGLT2i 对 PANK1 的激活对于 SGLT2i 赋予人类心肌细胞的收缩力和舒张力的功能改善既是必要的也是充分的，这可能部分是通过增强线粒体呼吸能力实现的。

讨论

我们在此证明了 SGLT2i 的一个关键脱靶效应：直接激活 PANK1，从而导致 CoA 合成的急性刺激。我们还证明，SGLT2i 对 PANK1 的激活直接促进了人类心脏的代谢和收缩力，且这一过程独立于肾功能、代谢和激素环境以及来自血管系统的输入。这些观察结果为使用 SGLT2i 治疗心力衰竭（HF）患者所取得的显著临床获益提供了一种潜在解释；这种获益不太可能是通过抑制 SGLT2 本身实现的，因为在基因缺失 SGLT2 的啮齿动物中也能观察到这些获益 (8, 9, 11)。SGLT2i 对 PANK1 的激活也可能解释了 SGLT2i 显著迅速的疗效，这种疗效通常在治疗开始后的几天内即可显现。将 PANK1 识别为 SGLT2i 的相关脱靶点，为开发能更强效或更特异性地靶向 PANK1 的药物开启了可能性，这有望在提高疗效的同时，避免 SGLT2i 的在靶副作用，包括正常血糖糖尿病酮症酸中毒、过度利尿和尿路感染（UTIs）。

我们的工作表明 CoA 生物学参与了心力衰竭的病理机制。 合成是氧化代谢的核心，而心脏主要依赖这一过程。我们和其他研究人员在此处及其他研究中表明，人类衰竭心脏中的 物种显著减少，这表明 的丰度可能是限制因素 (35)。我们发现 PANK1 的激活能促进人类心肌细胞的代谢和收缩力，这有力地支持了这一观点。 代谢的改变还可能干扰氧化还原稳态、表观遗传变化以及通过 -化（-lation）进行的蛋白质翻译后修饰。缺乏心脏 PANK1 的小鼠在面对血流动力学挑战时会发展为心肌病，这强调了 PANK1 在心脏功能中的关键作用。同样， 生物合成途径中的第二种酶 PPCS 的纯合或复合杂合突变会导致人类出现扩张型心肌病，证明了 合成在人类心脏功能中的关键作用 (36, 37)。

SGLT2i 的全身性获益可能还反映了其在心脏之外对 PANK1 的作用。PANK1 在肝细胞、肾小管细胞、肠上皮和神经元中均有表达 (38)。SGLT2i 在非酒精性脂肪性肝病和慢性肾脏病中显示出获益，这可能独立于心脏效应 (39, 40)。因此，在这些组织中激活 PANK1 可能在一定程度上解释了 SGLT2i 的临床获益。SGLT2i 还可能调节 PANK 的其他异构体。PANK1 占据了心脏中 PANK 活性的 $>70\%$，但 PANK2 和 PANK3 同样存在，激活这些异构体可能会进一步扩展 SGLT2i 的心脏外获益。

我们的研究存在局限性。对人类心脏组织的研究受限于组织的可用性，且容易产生变异。使用每次采集的配对样本对于解决这一局限性至关重要。遗传模型（例如缺乏心脏 PANK 异构体的小鼠）在未来将具有极大的研究价值，但超出了本工作的范围。最后，SGLT2i 也有可能影响 PANK 之外的其他蛋白质或酶的功能。

总之，我们将 PANK1 识别为 SGLT2i 的直接靶点，并证明 SGLT2i 对 PANK1 和 合成的刺激改善了人类心脏的代谢和收缩活动。这些结果可能解释了 SGLT2i 在心力衰竭患者中的显著获益，并为设计具有潜在更高疗效且 SGLT2 介导的副作用更少的化合物提供了机会。

参考文献与注释

1. P. A. Heidenreich et al., Circulation 145, e895–e1032 (2022).

2. B. Zinman et al., N. Engl. J. Med. 373, 2117–2128 (2015).

3. S. D. Anker et al., N. Engl. J. Med. 385, 1451–1461 (2021).

4. K. B. Margulies, N. . J. . 387, 1138–1140 (2022).

5. M. Packer et al., N. . J. . 383, 1413–1424 (2020).

6. J. J. V. McMurray et al., N. . J. . 381, 1995–2008 (2019).

7. S. D. Solomon et al., N. . J. . 387, 1089–1098 (2022).

8. J. H. Berger et al., bioRxiv 2024.04.29.591665 [Preprint] (2024); https: / doi.org / 10.1101 / 2024.04.29.591665.

9. S. Chen et al., Metabolism 178, 156568 (2026).

10. J. H. Amesz et al., Cardiovasc. Drugs Ther. 38, 659–666 (2024).

11. S. Chen et al., Circulation 147, 276–279 (2023).

12. M. Packer, Nat. Rev. Cardiol. 20, 443–462 (2023).

13. M. J. Hundertmark et al., Circulation 147, 1654–1669 (2023).

14. R. Thirumathyam et al., Cardiovasc. Diabetol. 23, 13 (2024).

15. D. Kim et al., Clin. Transl. Sci. 16, 1469–1478 (2023).

16. A. J. Scheen, Clin. Pharmacokinet. 54, 691–708 (2015).

17. A. J. Scheen, Clin. Pharmacokinet. 53, 213–225 (2014).

18. E. Flam et al., Nat. Cardiovasc. Res. 1, 817–829 (2022).

19. S. Neubauer, N. . J. . 356, 1140–1151 (2007).

20. D. Murashige et al., Science 370, 364–368 (2020).

21. R. Leonardi, Y. M. Zhang, C. O. Rock, S. Jackowski, Prog. Lipid Res. 44, 125–153 (2005).

22. J. J. Smith et al., Cell Chem. Biol. 32, 325–337.e10 (2025).

23. L. K. Sharma et al., Nat. Commun. 9, 4399 (2018).

24. D. Martinez Molina et al., Science 341, 84–87 (2013).

25. C. Subramanian et al., J. Biol. Chem. 291, 22302–22314 (2016).

26. R. P. Rambo, J. A. Tainer, Biopolymers 95, 559–571 (2011).

27. T. D. Grant, Nat. Methods 15, 191–193 (2018).

28. L. K. Sharma et al., J. . Chem. 58, 1563–1568 (2015).

29. M. Kumar, R. G. Lowery, SLAS Discov. 22, 915–922 (2017).

30. L. G. Smith, B. Novak, M. Osato, D. L. Mobley, G. R. Bowman, J. Chem. Theory Comput. 20, 1036–1050 (2024).

31. R. J. Budde, T. K. Fang, D. D. Randall, J. A. Miernyk, Plant Physiol. 95, 131–136 (1991).

32. R. R. Russell III, H. Taegtmeyer, J. Clin. Invest. 89, 968–973 (1992).

33. F. H. Pettit, S. J. Yeaman, L. J. Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 4881–4885 (1978).

34. A. Vite et al., JACC Basic Transl. Sci. 9, 1–15 (2023).

35. K. C. Bedi Jr et al., Circulation 133, 706–716 (2016).

36. A. Iuso et al., Am. J. Hum. Genet. 102, 1018–1030 (2018).

37. T. N. Audam et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 321, H784–H797 (2021).

38. M. Karlsson et al., Sci. Adv. 7, eabh2169 (2021).

39. A. J. Scheen, Diabetes Metab. 45, 213–223 (2019).

40. K. Yau, A. Dharia, I. Alrowiyti, D. Z. I. Cherney, Kidney Int. Rep. 7, 1463–1476 (2022).

致谢

我们感谢约翰逊基金会生物物理与结构生物学核心设施（宾夕法尼亚大学儿童医院，宾夕法尼亚州费城），以及先进光源（ALS）的 SIBYLS 光束线。后者是由劳伦斯伯克利国家实验室代表能源部（DOE）基础能源科学办公室，通过综合衍射分析技术（IDAT）计划运行的国家用户设施，并由 DOE 生物与环境研究办公室提供支持，感谢其在 SV-AUC、多角度光散射尺寸排阻色谱以及质量光度法方面提供的协助。我们还感谢费城的 Gift of Life 捐赠计划以及捐赠者家属，使我们能够从已故器官捐赠者处获取人类心脏。资金支持：本工作部分由宾夕法尼亚心血管研究所和费城儿童医院前沿计划的 DreamTeam 资助。N.F. 由 Sarnoff 基金会资助。Z.A. 由美国国立卫生研究院（NIH）（HL152446）资助。J.E. 由 NIH（K08 HL159311）资助。T.T. 由 (T32HL0078) 资助。D.M.E. 由 (T32 HL007843) 资助。K.G. 由约翰逊研究基金会、一项共享仪器资助（S10-OD018483）以及 ALS-ENABLE 项目（P30 GM124169）资助。人类心脏组织的获取由 (R01 HL149891) 以及 Leducq 基金会对 K.B.M. 的资助实现。作者贡献：N.F. 建立了本研究的假设并启动了工作；领导研究团队；开发了用于追踪研究及随后通过高分辨率质谱分析进行代谢组学分析的人类心肌块灌注方法；开发了针对 PANK1、EMPA-树脂研究和下拉实验的 CETSA；开发了经 EMPA 或 PZ-2891 处理的 PANK1 激酶测定法；进行了 与 PANK1 之间蛋白质-配体相互作用的初步计算机模拟；进行了分离的人心肌细胞收缩性实验；进行了 NRVM 代谢追踪研究；进行了 处理下的小鼠体内代谢组学实验；开发了用于研究 处理心脏中代谢变化的大鼠 Langendorff 方法；并进行了大鼠心肌细胞收缩性实验。T.T. 领导并主要负责修订工作；进行了分离的人类和大鼠线粒体实验；进行了 AcCoA 生物传感器实验，以测试 处理下的细胞内 CoA 浓度；进一步开发了用于测试其他 SGLT2i 的 PANK1 激酶测定法；对 处理后的人类心肌转运蛋白进行了 RNA 测序分析；测试了受 AcCoA 调节的其他激酶；开发并测试了 PANK1 突变体；并进行了 处理下的小鼠体内 CoA 代谢组学实验。D.M.E. 开发了用于追踪研究的人类心肌块灌注方法；协助开发分离的人心肌细胞收缩性实验；开发了用于代谢组学的大鼠 Langendorff 制备；并进行了用于收缩性实验的大鼠心肌细胞分离。K.S. 进行了重组 PANK1 蛋白的分离与纯化，用于激酶

分析。J.P. 协助进行了大鼠 Langendorff 灌流制备；负责小鼠模型的照料与准备；并协助进行了蛋白质分离、蛋白质印迹（Western blot）实验以及高分辨率质谱分析样本的制备。C.E.B. 开发了用于代谢组学的高分辨率质谱方法。R.K. 协助进行了细胞热移位分析（cellular-thermal shift assay）实验和 EMPA-树脂实验。J.W.J. 开发了用于分析丝氨酸、半胱氨酸及相关化合物的高分辨率质谱方法。I.A.K. 协助进行了包括蛋白质印迹在内的分子生物学实验。K.L. 协助进行了包括蛋白质印迹在内的分子生物学实验。J.A.L. 协助制备了 PANK1 突变体。K.B. 协助进行了线粒体分离和氧化还原实验。C.B. 协助从移植患者身上分离人类心脏。K.C.B.

三方遗传冲突系统控制水稻的杂交不育

Xiaodong He $^{1\dagger}$ , Zhigang Zhao $^{1\dagger}$ , Kun Shao $^{1\dagger}$ , Xiaowen Yu $^{1\dagger}$ , Ying Zhu $^{3\dagger}$ , Jintao Tang $^{4\dagger}$ , Jing Li $^{5}$ , Yunhui Zhang $^{1}$ , Keyu Zhao $^{1}$ , Xiaoming Zheng $^{2}$ , Hongru Wang $^{6}$ , Chao Li $^{1}$ , Xiangchao Gan $^{1}$ , Xiaoou Dong $^{1}$ , Yulong Ren $^{2}$ , Yehui Xiong $^{2}$ , Jian Wang $^{2}$ , Yang Hu $^{1}$ , Siqi Cheng $^{1}$ , Bowen Yao $^{1}$ , Yulu Ye $^{6}$ , Song Guo $^{1}$ , Yuantao Zhu $^{1}$ , Ling He $^{1}$ , Tiaofeng Shan $^{1}$ , Chen Xu $^{1}$ , Jinxuan Xu $^{1}$ , Jiayu Lu $^{1}$ , Dekun Lei $^{1}$ , Anqi Jian $^{1}$ , Junwen Gao $^{1}$ , Song Cui $^{1}$ , Gencheng Xu $^{1}$ , Xiuping Guo $^{2}$ , Xi Liu $^{1}$ , Yunlu Tian $^{1}$ , Shijia Liu $^{1}$ , Ling Jiang $^{1}$ , Xianneng Deng $^{5}$ , Jiawu Zhou $^{5}$ , Dayun Tao $^{5}$ , Yonglun Zeng $^{3,7}$ , Letian Chen $^{4}$ , Chuanyin Wu $^{2}$ , Haiyang Wang $^{2}$ , Chaolong Wang $^{1,2}$ , Jianmin Wan $^{1,2*}$

亚非种间杂交水稻可以显著提高产量，但受限于严重的杂交不育。我们鉴定出 RHS3 是控制该性状的主要数量性状位点。RHS3 编码一个由 MAO、DUN 和 JIA 组成的三方毒素-解毒剂系统，其中 MAO 作为毒素，通过破坏线粒体功能导致配子败育，而 DUN 和 JIA 则作为解毒剂中和 MAO 的毒性，从而赋予非洲等位基因传输优势。我们证明，这种解毒作用依赖于通过形成三方 JIA–DUN–MAO 蛋白复合物而实现的选择性自噬。我们推断 RHS3 起源于 AA 基因组水稻谱系，阐明了遗传冲突在物种形成中的作用，并为利用亚非水稻之间的杂种优势提供了策略。

水稻（Oryza sativa）是全球超过一半人口的主食，对全球粮食安全至关重要 (1, 2)。目前仅有两种水稻被驯化：源自亚洲 O. rufipogon 的亚洲水稻 (O. sativa L.)，以及源自西非 O. barthii 的非洲水稻 (O. glaberrima Steud.) (3–6)。亚洲水稻的特点是高产和优质，而非洲水稻则对生物和非生物胁迫具有较强的耐受力 (7, 8)。因此，亚非种间杂交水稻的性能可比传统水稻品种高出 30% 到 60%，在提高水稻生产力方面具有巨大潜力 (9, 10)。然而，严重的合子后生殖隔离，特别是杂交不育，限制了这种种间杂种优势的有效利用 (11)。尽管人们在阐明这两个物种之间杂交不育的遗传基础方面做出了广泛努力，但目前仅克隆了一个位点 S1，且其潜在的分子机制尚未解决 (12, 13)。因此，杂交不育位点如何在水稻物种之间建立生殖隔离在很大程度上仍不清楚，这成为了利用亚非水稻种间杂种优势的主要障碍。

杂交不育通常是由特定位点上不兼容的等位基因相互作用引起的，其中许多位点在多种动植物物种中编码毒素-解毒系统（也称为减数分裂驱动因子或分离扭曲因子）(14–17)。著名的例子包括拟南芥中的 PK3 位点 (18)、水稻中的 S5、qHMS7 和 RHS12 位点 (19–21)、线虫中的 sup-35 / pha-1 元件 (22) 以及小鼠中的 t-complex (23)。在杂交种中，这些位点上不兼容的等位基因相互作用会引发遗传冲突，使携带者等位基因相对于非携带者具有传递优势，从而扭曲孟德尔遗传。这种传递优势可以促进携带者等位基因在自然种群中的扩散，从而有助于物种形成和物种界限的维持 (24–26)。尽管杂交不育位点在不同分类群中普遍存在，但其进化起源和分子机制仍不清楚，这限制了我们对驱动物种形成之力量的理解。

在此，我们鉴定并克隆了 RHS3，这是一个导致亚洲栽培稻与非洲栽培稻之间杂交不育的主要位点。功能和进化分析揭示了一个非典型的三元毒素-解毒系统，并发现了选择性自噬与生殖隔离之间的直接机制联系。这些发现为种间遗传冲突的进化提供了见解，并为克服生殖障碍以及利用亚洲稻与非洲稻之间的种间杂种优势提供了遗传框架。

RHS3 控制种间杂交不育

亚洲栽培稻与非洲栽培稻的杂交种表现出严重的杂交不育，其花粉和颖果的结实率显著降低（图 1A）。在由 DJY1（电晶油1，亚洲栽培稻的一个粳稻品种，基因型为 jj）和 IRGC 102295（一个非洲栽培稻种质，基因型为 gg）衍生出的 $\text{BC}{1} \text{F}{1}$ 群体中进行数量性状位点（QTL）定位，在 3 号和 7, 号染色体上鉴定出两个水稻杂交不育（“RHS”）位点，分别命名为 RHS3 和 RHS7（图 S1A 和数据 S3）。由于 RHS3 与此前报道的与种间杂交不育相关的 S19 / S64 区域共定位（27, 28），我们优先对其进行进一步分析。

在 DJY1 背景下培育了一个在 RHS3 位点携带 IRGC 102295 等位基因的近等基因系（NIL-RHS3）（图 S1B）。DJY1 (RHS3-jj)、NIL-RHS3 (RHS3-gg) 及其 $\mathrm{F_1}$ 杂交种 ($\mathrm{F_1}\text{-RHS3}$, RHS3-gj) 均发育正常，且表现出较高的颖果结实率（图 1A 和图 S1℃）。相比之下，${F_1}\text{-RHS3}$ 植株表现出花粉半不育，而两个亲本系的花粉育率均 $>95\%$（图 1A）。细胞学分析显示，在绒毡层退化或微孢子发育早期没有明显缺陷，但近一半的花粉粒在极性微孢子阶段发育延迟，并停留在双细胞阶段，表现为淀粉积累减少和花粉壁形成缺陷（图 S1, D 和 E）。

反交实验显示，当 ${F_1}\text{-RHS3}$ 作为母本、DJY1 作为父本时，RHS3-gj 和 RHS3-jj 子代以 1:1 的比例分离；而当 ${F_1}\text{-RHS3}$ 作为花粉供体时，仅能回收 RHS3-gj 子代（图 1B），这表明雌性生育力正常，而 RHS3-j 花粉传递失败。与此观察结果一致，${F_1}\text{-RHS3}$ 植株无论在何种细胞质背景下均表现出花粉半不育，且 ${F_2}$ 群体 1:1 分离为育株 (RHS3-gg) 和半不育株 (RHS3-gj)（图 S2）。综上所述，这些结果证明 RHS3 是一个单一的核配子杀手位点，能够选择性地消除 RHS3-j 花粉。

为了鉴定 RHS3 背后的基因，我们对比了 DJY1 和 IRGC 102295 中相应的基因组区间。RHS3 位点在 DJY1 中跨度为 53.8 kb，在 IRGC 102295 中跨度为 142.7 kb，这主要归因于后者中一个 $\sim \$ 94.3\text{-kb}$ 的结构变异（SV）。17 个开放阅读框（ORF）在比对区间内被预测，包括 9 个共有基因、1 个 DJY1 特有基因和 7 个 IRGC 102295 特有基因（图 1℃ 和数据 S4）。

A B

C

图 1. RHS3 的遗传分析与克隆。(A) 亚洲稻 DJY1、非洲稻 IRGC 102295, 近等基因系 NIL-RHS3 及其 ${F_1}$ 杂交种（DJY1 $\times$ IRGC 102295; DJY1 $\times$ NIL-RHS3，命名为 ${F_1}\text{-RHS3}$）的代表性植株形态（上图，颖果结实率见插图）和花粉活力（下图）（n = 5 个独立的小花或圆锥花序）。红色箭头表示败育的花粉粒。比例尺：20 cm（植株），5 cm（圆锥花序），100 $\mu\text{m}$（花粉）。(B) DJY1 与 ${F_1}\text{-RHS3}$ 反交子代中 RHS3-gj 或 RHS3-jj 等位基因的基因型分布。每个杂交方向均显示了百分比和植株总数。星号表示统计学显著差异（$\chi^2$ 检验，***P < 0.001）。(C) RHS3 位点的基因组结构。在定位区间内共注释了 17 个 ORF。ORF4 编码 JIA，gORF10 编码 MAO，gORF16 编码 DUN。

MAO-DUN 编码一种毒素-解毒剂系统

在 $F_{1}$ -RHS3 植物中，RHS3-j 花粉被选择性清除，这表明来自非洲栽培稻的 RHS3-g 区域包含一个毒素-解毒剂系统。在 $F_{1}$ -RHS3 植物中，对该区域内预测的 16 个基因分别进行破坏发现，仅在敲除 gORF10 后花粉活力才得以恢复（图 2A 和数据 S5）。与此一致， $T_{1}$ 子代中 RHS3 的基因型分离恢复到了预期的孟德尔 1:2:1 比例（jj:gj:gg）（图 2B 和图 S3, A 和 B），证明 gORF10 的功能是清除 RHS3-j 花粉的毒素。因此，我们将该基因命名为 MAO，在中文中意为“矛”。

相比之下，多次尝试破坏 $F_{1}$ -RHS3 衍生愈球中的 gORF16 均告失败，这表明它在花粉以及体细胞中均起解毒剂作用。利用绿色荧光蛋白（GFP）作为细胞活力的指标，我们发现 MAO 的表达消除了水稻愈球中的 GFP 信号，而 gORF16 的共表达则恢复了该信号（图 S3, C 和 D）。与此一致，在 MAO 突变体背景下敲除 gORF16 产生了 MAO / gORF16 双突变体，其花粉和小穗生育力正常（图 S3, E 至 G）。此外，将 gORF16 的基因组拷贝导入 $F_{1}$ -RHS3 植物后，$T_{0}$ 转化体的花粉活力增加至约 75%（图 2℃），且 $T_{1}$ 子代中 RHS3 和转基因位点的分离遵循预期的 1:3:2 比例（RHS3, jj:gj:gg；转基因, -:t-:tt）（图 2D 和图 S4, A 至 C）。综上所述，这些发现表明 gORF16 作为解毒剂，恢复了 RHS3-j 花粉的生育力。因此，我们将该基因命名为 DUN，在中文中意为“盾”。

将连锁的 MAO 和 DUN 转基因导入 DJY1 后，重现了 $F_{1}$ -RHS3 表型，导致花粉半不育且不影响小穗生育力（图 S4, D 至 F）。该转基因在 $T_{1}$ 子代中同样以 0:1:1 的比例（ $-:t-:tt$ ）分离（图 S4, G 和 H），表明不含转基因的雄配子被选择性清除。这些结果确立了 MAO 和 DUN 是介导 RHS3 花粉半不育的毒素-解毒剂对。

A B

C

D

E

F

G

H

| |

图 2. MAO 和 DUN 充当介导花粉半不育的毒素-解毒剂系统。(A) 敲除 gORF10 可恢复 F${1}$-RHS3 植物的花粉育性。数据为平均值 ± 标准差 (n = 5 个独立小花)。比例尺，100 μm。(B) 自交 gORF10 敲除 F${1}$-RHS3 植物的后代 (T${1}$) 中 RHS3 基因型的分离遵循 1:2:1 的比例。星号表示具有统计学显著差异 ($\chi^{2}$ 检验, ***P < 0.001)。(C) 引入单拷贝 gORF16 转基因可部分挽救 F${1}$-RHS3 的花粉育性。数据以平均值 ± 标准差显示 (n = 5 个独立小花)。红色箭头表示败育的花粉粒。比例尺，100 μm。(D) 在 F${1}$-RHS3 中插入单拷贝 gORF16 转基因，使 T${1}$ 后代的 RHS3 基因型分离比恢复为 1:3:2 (jj:gj:gg)。星号表示具有统计学显著差异 ($\chi^{2}$ 检验, ***P < 0.001)。(E) MAO–GFP 和 DUN–mCherry 在原生质体中的亚细胞定位。–GFP 和 –mCherry 与线粒体标记物 IDH1-V 共定位；–mCherry 还与叶绿体标记物 AtATPC1 共定位。比例尺，5 μm。(F) 酵母双杂交 (Y2H) 分析显示 与 OsGCD1 之间存在相互作用。MAOΔ 代表缺失线粒体靶向信号的截短版本。(G) 共免疫沉淀 (Co-IP) 分析证实了水稻原生质体中 与 OsGCD1 的相互作用。OsGCD1–FLAG 被 –GFP 共沉淀。(H) Y2H 分析显示 与 之间存在相互作用。DUNΔ 代表缺失线粒体靶向信号的截短版本。(I) Co-IP 分析证实了水稻原生质体中 与 的相互作用。–FLAG 被 –GFP 共沉淀。(J) Co-IP 分析证明 –FLAG 破坏了 –GFP 与 OsGCD1–HA 之间的相互作用。

DUN 与 MAO 结合以保护线粒体

为了研究 MAO–DUN 元件如何调节杂种不育，我们首先检查了 和 的表达模式。这两个基因在营养组织中的表达较弱。 主要在发育中的花药和雌蕊中积累，而 在花药中含量最高（图 S5, A 和 B）。与预测的靶向序列一致， 仅定位于线粒体，而 则同时定位于线粒体和叶绿体（图 2E，以及图 S5, C 和 D）。

酵母双杂交（Y2H）筛选识别出七个候选的 相互作用蛋白（图 S5E），其中 OsGCD1 因其在配子发育中的关键作用而引起特别关注 (29, 30)。与之前的报道一致，未能回收纯合的 Osgcd1 突变体。杂合植株 (OsGCD1-He) 表现出花粉和小穗的半不育，以及胚囊发育缺陷（图 S6, A 至 F）。OsGCD1-He 与野生型 (WT) DJY1 之间的相互杂交仅产生 WT 后代，表明 Osgcd1 通过雄性和雌性配子传递均完全失败（图 S6G）。在共免疫沉淀 (co-IP) 和双分子荧光互补 (BiFC) 实验中，OsGCD1 蛋白发生了自我相互作用，表明其形成了同源寡聚体（图 S6, H 和 I）。如 Y2H、BiFC 和 co-IP 实验所示，OsGCD1 在线粒体中与 共定位并相互作用（图 2, F 和 G，以及图 S7, A 和 B）。 破坏了 OsGCD1 的同源寡聚化（图 S7℃），这表明它通过损害 OsGCD1 的功能来诱导线粒体毒性。

如 Y2H、BiFC 和 co-IP 实验所示， 与 直接相互作用（图 2, H 和 I，以及图 S7D），且这两种蛋白在线粒体中共定位（图 S7E）。尽管 不影响 和 OsGCD1 的线粒体共定位，但它与 OsGCD1 竞争结合 （图 2J 和图 S7E），从而缓解了 对 OsGCD1 功能的抑制。这些发现表明， 通过隔离 并维持 OsGCD1 的功能来中和 的毒性。

JIA 特异性地保护雌配子

目前大多数已表征的水稻杂种不育位点影响的是花粉或胚囊的生育力 (17, 31)。出乎意料的是，在 $F_1$-RHS3 植物中敲除 gORF4 将小穗生育力降低至约 50%，且不影响花粉生育力（图 3, A 和 B，以及图 S8A），这表明其在雌配子传递中发挥作用。由于 RHS3-j 等位基因包含 ORF4（图 1℃），在相同背景下破坏 jORF4 产生的表型与 gORF4 突变体无法区分（图 3, A 和 B，以及图 S8A）。对自交 $T_0$ ORF4 敲除植株产生的 $T_1$ 子代进行基因分型显示，当 jORF4 被敲除时，几乎所有子代仅携带 RHS3-gg 等位基因；而 gORF4 敲除植株的子代几乎全部为杂合子 (RHS3-gj)（图 3℃ 和图 S8, B 和 C），这表明缺乏功能性 jORF4 或 gORF4 的雌配子未能传递。综上所述，这些发现表明 gORF4 和 jORF4 均作为雌配子特异性解毒剂发挥作用。因此，我们将 ORF4 命名为 JIA，在中文中意为“甲胄”。

为了验证 JIA 的解毒功能，我们在 NIL-RHS3 背景下培育了杂合子 gJIA / gjia 和纯合子 / 突变体。 / 和 / 植株分别表现出小穗半不育和近乎完全不育，同时保持正常的花粉生育力（图 3, D 和 E，以及图 S8D）。在开花期， / 植株的成熟胚囊完全没有细胞核，而野生型 (WT) 胚囊则具有典型的八核结构（图 S8E）。在 / 植株自交产生的 $T_1$ 子代中，仅回收到了 / 和 / 基因型，且以约 1:1 的比例分离（图 3F 和图 S8F），表明缺乏功能性 的雌配子未能传递。此外，在 NIL-RHS3 背景下同时敲除 MAO 和 将小穗生育力恢复至接近野生型水平（图 3, E 和 F）。总的来说，这些结果证明 MAO 对花粉和雌配子均产生细胞毒性作用，而 JIA 通过中和 的毒性来保护雌配子。

由于 DUN 能保护花粉免受 毒性的影响，我们进一步研究了它是否也能保护雌配子。在 NIL-RHS3 背景下通过基因编辑产生的杂合子 DUN / 植株在花粉和小穗中均表现出半不育（图 S8, G 至 I，以及数据 S6）。与此一致，约 50% 的胚囊发生败育（图 S8, J 和 K）。在经过基因分型的 $T_1$ 子代中，未检测到 / 纯合子（图 S8, L 和 M），这表明 保护雄性和雌配子免受 毒性影响，而 JIA 则提供了额外的、雌性特异性的保护作用。

JIA 与 DUN 协同作用以清除 MAO 毒性

我们接下来研究了 JIA 如何特异性地保护女性配子。在 $F_{1}$ -RHS3 植物中， 的表达量在发育中的花药中最高，其次是发育中的雌蕊（图 S9A）。gJIA 和 jJIA 等位基因的表达水平相当（图 S9B）。两者编码的蛋白质仅相差 8 个氨基酸替换，且均包含一个预测的叶绿体转运肽和一个花酸磷酸核糖转移酶结构域（图 S10, A 和 B）。gJIA 和 jJIA 均显示出在叶绿体和自噬体中的双重定位（图 4, A 和 B，以及图 S10, C 至 J）。DJY1 根尖细胞的免疫金标记进一步证实了 jJIA 定位于质体和自噬体（图 S11）。这些观察结果表明， 可能通过将 MAO 引导至自噬降解来清除其毒性。

随后，我们进行了相互作用分析，发现 gJIA 和 jJIA 均与 DUN 相互作用，但与 不相互作用（图 S12 和 S13, A 和 B）。然而，-FLAG 和 -FLAG 均能与 -GFP 共同免疫共沉淀（图 S13, C 和 D），这表明形成了 -- 三元复合物。在原生质体中共表达 和 会使 -GFP 从线粒体和叶绿体重新定向至自噬体（图 4℃ 和图 S14, A 和 B）。同样， 与 和 共表达时，-GFP 也会被重新定向至自噬体（图 4D 和图 S14, C 和 D）。这些发现表明， 利用 作为分子桥梁，将 招募到 -- 复合物中，并将其引导至自噬体进行降解。

选择性自噬受体通过 ATG8 相互作用基序（AIMs）与 ATG8 相互作用，从而将货物蛋白招募到自噬体中 (32)。由于水稻基因组编码 7 个 ATG8 异构体 (33)，我们测试了 是否与其中任何一个相互作用。gJIA 和 jJIA 在酵母中均特异性地与 OsATG8e 相互作用，这一结果随后通过共免疫沉淀（co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）实验得到了验证（图 S15）。计算机模拟分析在 中识别出 7 个推测的 AIM（AIM1–7）。为了确定哪个基序介导了 OsATG8e 的结合，我们分别对每个 AIM 进行了突变并重新评估了相互作用。仅破坏 AIM3 即可消除酵母中 –OsATG8e 的相互作用（图 S16, A 和 B）。值得注意的是，这种相互作用的缺失破坏了 在原生质体中的自噬体定位，但保留了其叶绿体定位（图 S16, C 和 D）。

为了测试 AIM3 的体内功能，我们在 NIL-RHS3 背景下对该基序进行了突变。杂合子 AIM3 / aim3 植物显示出正常的花粉育性，但小穗育性约为 50%，且 AIM3 / AIM3 和 AIM3 / aim3 基因型在 $T_{1}$ 代中以 1:1 的比例分离（图 S16, E 至 G），这表明携带 aim3 等位基因的女性配子被选择性地消除了。我们进一步通过将纯化的 MBP- 与幼穗的总蛋白提取物共同孵育，进行了半体内降解实验。携带功能性 gJIA 的 NIL-RHS3 植物提取物能降解 ，而 gJIA 敲除植物的提取物则不能，且这种降解被自噬抑制剂 Bafilomycin A1 阻断（图 4E）。综上所述，这些发现证明 是一种选择性自噬受体，它将 -- 复合物招募到自噬体中进行降解。

RHS3 的进化轨迹

BLAST 分析显示，JIA 仅限于禾本科（Poaceae）的一个子集（图 S17A），而 MAO 和 DUN 则仅限于水稻属（Oryza）。来自多种水稻属物种（包括 AA 基因组和 BB 基因组的野生稻，以及 AA 基因组的栽培稻）的 JIA 蛋白保留了完整的 AIM3 基序，并在酵母中与 OsATG8e 相互作用（图 S17B）。相比之下，来自普通小麦（Triticum aestivum）、高粱（Sorghum bicolor）和玉米（Zea mays）的 JIA 同源蛋白由于保守的 AIM3 Ile 残基被 Val 或 Lys 取代，无法与 OsATG8e 相互作用（图 S17, A 和 B），这表明 JIA 的保护功能仅限于水稻属。

为了研究包含 MAO 和 DUN 的 94.3-kb 结构变异（SV）的起源，我们分析了五个 AA 基因组野生种（O. meridionalis, O. longistaminata, O. glumaepatula, O. barthii, 和 O. rufipogon）、一个 BB 基因组物种（O. punctata）以及两个 CC 基因组物种（O. officinalis 和 O. eichingeri）的染色体级基因组组装。共线性分析显示，MAO 和 DUN 仅存在于 AA 基因组物种中，而在 BB 和 CC 基因组野生稻中缺失（图 4F 和数据 S7），这表明其起源于

A

B

C

D

E F

图 3. JIA 通过解毒 MAO 来保护雌配子。(A) 在 F₁-RHS3 植物中敲除 gORF4 或 jORF4 会导致小穗半不育。红色箭头表示萎缩的谷粒。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示（n = 5 个独立圆锥花序）。比例尺，10 cm。(B) F₁-RHS3、gORF4 敲除系和 jORF4 敲除系中小穗生育力的定量分析。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示（n = 5 个独立圆锥花序）。星号表示具有统计学显著差异（Student's t-test, **P < 0.01）。(C) F₁-RHS3 在 gORF4 和 jORF4 敲除后的 RHS3 基因型分离。gORF4 敲除观察到 0:1:0 (jj:gj:gg) 的比例，jORF4 敲除观察到 0:0:1 (jj:gj:gg) 的比例。(D) 在 NIL-RHS3 背景下敲除 gJIA 几乎完全消除了小穗的生育力，但当 MAO 被敲除时，降低的生育力在很大程度上得到了恢复。红色箭头表示萎缩的谷粒。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示（n = 5 个独立圆锥花序）。比例尺，10 cm。(E) 对照组、杂合子、纯合 gJIA 突变体以及 gJIA / MAO 双敲除系中小穗生育力的定量分析。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示（n = 5 个独立圆锥花序）。星号表示具有统计学显著差异（Student's t-test, **P < 0.01）。(F) 杂合突变体自交后代中 gJIA 的基因型分离显示为 1:1:0 (++:±:--) 的比例。

AA-基因组谱系。利用保守的侧翼基因 ORF9 和 ORF17，我们提取了 ORF9–17 区段进行比较分析。仅有 O. barthii（O. glaberrima 的野生原种）包含一个完整的 94.3-kb SV，而其他野生种要么缺失该片段，要么仅含有部分片段。该 SV 可分解为一个 48.7-kb 的左侧片段（L-；gORF10–13）和一个 45.6-kb 的右侧片段（R-；gORF14–16）。L- 和 R- 分别与 O. glumaepatula 和 O. meridionalis 的相应区域显示出最高同源性（图 4G），这表明 O. barthii 中的 94.3-kb 具有涉及这两个物种的复合起源。O. rufipogon 在该区域包含三种 类型，可能源自多个祖先谱系，包括 O. longistaminata、O. meridionalis 和 O. glumaepatula（图 S17℃）。

为了评估 MAO 和 DUN 的多样性，我们分析了来自非洲和亚洲的 591 份 O. barthii、O. rufipogon 以及栽培稻的样本（数据 S7）。共鉴定出三种 MAO 等位基因类型：功能性 、$^{T / S}$（携带提前终止密码子或被预测在缺失 DUN 时会丧失功能的氨基酸替换的等位基因）以及 $^{U}$（功能未知的等位基因）。 等位基因同样被分为功能性 、$^{T}$（携带提前终止密码子的等位基因）和

图 4. JIA 介导的解毒作用及 RHS3 位点的进化轨迹。(A) gJIA–GFP 在原生质体中的亚细胞定位显示其与叶绿体标记物 AtATPC1 共定位。比例尺，5 $\mu$ m。(B) gJIA–GFP 与自噬小体标记物 mCherry–AtATG8i 共定位。比例尺，5 $\mu$ m。(C) 共表达时， 与 –GFP 在自噬小体中共定位。比例尺，5 $\mu$ m。(D) –CFP 和 –FLAG 的共表达将 –GFP 重新分布至自噬小体。比例尺，5 $\mu$ m。(E) 的半体内降解实验。将纯化的 MBP– 与来自 NIL-RHS3 或 敲除植株幼穗的总蛋白提取物共同孵育。Bafilomycin A1 (BFA) 是自噬流抑制剂。(F) 根据先前报道的全基因组系统发育关系排列的代表性 Oryza 物种 RHS3 位点的共线性分析（相应样本列于下方）。JIA 在 Oryza 属中进化保守，而 和 可能分别在 O. glumaepatula 和 O. meridionalis 中从头起源。(G) 代表性 AA-基因组水稻物种（包括 O. meridionalis、O. glumaepatula 和 O. barthii）中跨越 ORF9 至 ORF17 的 RHS3 位点结构变异。上方彩色方框表示预测的 ORF。彩色片段显示通过重组产生的同源血缘（Identity by Descent）区域。下方面板显示重组断点（由红色虚线标出）的核苷酸序列。每个物种的样本标识符显示在相应物种名称下方。L-， 的左侧片段；R-， 的右侧片段。

A

B

$^{S}$（携带保守氨基酸替换的等位基因）（数据 S8 和 S9）。为了评估 $^{S}$ 的功能性，我们在 F ${1}$-RHS3 植株中引入了一个由原生 $$ 启动子驱动、携带四个保守氨基酸替换的重组 $^{S}$ 等位基因。T ${0}$ 转化体表现出花粉半不育，且在自交后代中 RHS3 基因型（$jj:gj:gg$）以 0:1:1 的比例分离（图 S18, A 和 B），表明 $^{S}$ 不具备功能。基于 $$ 和 $$ 的存在及其功能状态，$-$ 单倍型被分为七类：I 型缺失这两个基因（例如 DJY1），而 VII 型携带功能性 $$ 和 $$（例如 IRGC 102295）。II 型和 III 型分别仅包含非功能性的 $$ 或 $$，而

IV 型包含这两个基因的非功能性等位基因。VI 型携带功能性 $DUN$，而 $MAO$ 的功能状态仍未确定。值得注意的是，V 型携带功能性 $DUN$ 但 $MAO$ 为非功能性（数据 S10），这表明可能存在广泛的兼容性。这一推测得到了遗传分析的验证（图 S18, C 和 D）。

接下来，我们调查了 672 份 AA、BB 和 CC 基因组野生稻品种中的 $MAO–DUN$ 单倍型。所有 9 份 O. longistaminata 品种均携带 I 型。在 32 份 O. meridionalis 品种中，25 份携带 I 型，7 份携带 II 型。在 O. glumaepatula 中，29 份品种中有 11 份携带 I 型，18 份携带 III 型。O. rufipogon 表现出更高的多样性，以 I 型为主（101 / 158 份品种），其次是 II 型（49 / 158）和 III 型（8 / 158）。在 O. barthii 中，检测到四种单倍型：IV 型（37 / 101）、V 型（2 / 101）、VI 型（3 / 101）和 VII 型（59 / 101）（图 S18E）。比较序列和系统发育分析表明，非功能性的 $MAO$ 样和 $DUN$ 样序列分别在 O. glumaepatula 和 O. meridionalis 中从头（de novo）产生，随后通过某个未知中间祖先的渗入或重组结合在一起，形成了一个完整的

但非功能性的 $MAO–DUN$ 元件。在 O. barthii 中，多个编码序列突变使 $MAO$ 和 $DUN$ 均恢复了功能，这一过程伴随着亚洲和非洲稻系之间生殖隔离的出现。所有调查的 O. rufipogon 和亚洲栽培稻品种均携带非功能性 $RHS3$ 单倍型，而功能性 $RHS3$ 出现在 58% 的 O. barthii 和 97% 的非洲栽培稻品种中（图 S18E），这表明 $RHS3$ 是亚洲和非洲稻系之间主要的生殖屏障。

讨论

在这里，我们证明了 RHS3 编码了一个非典型的三元毒素-解毒剂系统。在该系统中，MAO 在孢子体阶段起作用，通过损害 OsGCD1 来杀死雄性和雌性配子；而 DUN 则在配子体阶段起作用，通过破坏 MAO-OsGCD1 的相互作用来拯救携带 DUN 的雄性配子（图 S19）。与此前表征的导致水稻杂交不育的两组分毒素-解毒剂系统 (17, 31) 不同，RHS3 包含第三个组分 JIA，它充当雌性配子特异性的保护因子。从机制上讲，JIA 与 相互作用形成 -- 复合物，并通过其 AIM3 基序结合 ATG8e，从而引导 进行自噬降解（图 S19B）。这些发现将 鉴定为一种植物特有的选择性自噬受体，它介导 的自噬降解，从而揭示了一种此前未被认识的植物生殖隔离机制。

仅在存在 - 元件时才发挥其保护功能，这表明它代表了杂交不育系统中的一个隐匿遗传组分。这一观察结果提出了这样一种可能性：类似的隐藏组分可能广泛存在，但在传统的遗传分析中仍未被检测到，特别是当它们被双亲谱系共同拥有时。 的招募可能也赋予了 RHS3 位点进化优势。通过利用 （一个在 Oryza 属物种中保守的基因），RHS3 可能无需进化出专门的解毒剂。此外，尽管 会损害雄性和雌性配子，但 的保守功能及其雌性配子特异性的保护活性，可能使 RHS3 在不损害小穗生育力的前提下增加其传递率。

为了满足未来的水稻需求，在人口压力增加和气候变化的背景下，需要持续提高生产力 (34, 35)。亚洲栽培稻与非洲栽培稻之间的种间杂种优势（例如成功开发的新非洲稻 NERICA 品种）为进一步提高产量提供了巨大的潜力 (9, 10, 36)。我们鉴定出了 RHS3 的广适型，其携带非功能性的 但具有功能性的解毒组分，在与亚洲或非洲栽培稻杂交时能够恢复生育力。这些变异为克服种间杂交不育和推进亚非杂交水稻育种提供了宝贵的遗传资源。

参考文献与注释

1. H. U. A. Rezvi 等，Food Energy Secur. 12, e430 (2023).

2. K. De Vos 等，Nat. Food 4, 518–527 (2023).

3. D. Guo 等，Nature 642, 662–671 (2025).

4. C. Y. Jing 等，Nat. Plants 9, 1221–1235 (2023).

5. M. Wang 等，Nat. Genet. 46, 982–988 (2014).

6. J. Y. Choi 等，PLOS Genet. 15, e1007414 (2019).

7. D. Zeng 等，Nat. Plants 3, 17031 (2017).

8. P. W. Wambugu, M. N. Ndjiondjop, R. Henry, Plants 8, 376 (2019).

9. M. P. Jones, M. Dingkuhn, G. K. Aluko, M. Semon, Euphytica 92, 237–246 (1997).

10. Y. Sun 等，Crop Sci. 60, 2343–2353 (2020).

11. J. Li 等，Sci. Rep. 13, 23057 (2023).

12. Y. Koide 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E1955–E1962 (2018).

13. Y. Xie 等，Nat. Commun. 10, 2501 (2019).

14. M. A. Bravo Núñez, N. L. Nuckolls, S. E. Zanders, Trends . 34, 424–433 (2018).

15. A. Burga, E. Ben-David, L. Kruglyak, Annu. Rev. . 54, 387–415 (2020).

16. A. L. Sweigart, Y. Brandvain, L. Fishman, Trends . 35, 245–252 (2019).

17. C. Wang, X. Yu, J. Wang, Z. Zhao, J. Wan, J. . Genomics 51, 583–593 (2024).

18. A. Ricou 等，PLOS . 21, e1011451 (2025).

19. J. Yang 等，Science 337, 1336–1340 (2012).

20. X. Yu 等，Science 360, 1130–1132 (2018).

21. C. Wang 等，Cell 186, 3577–3592.e18 (2023).

22. E. Ben-David, A. Burga, L. Kruglyak, Science 356, 1051–1055 (2017).

23. B. G. Herrmann, B. Koschorz, K. Wertz, K. J. McLaughlin, A. Kispert, Nature 402, 141–146 (1999).

24. J. H. Werren, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 10863–10870 (2011).

25. S. Maheshwari, D. A. Barbash, Annu. Rev. . 45, 331–355 (2011).

26. M. E. Frayer, N. V. Robles, M. J. Rodríguez-Barrera, J. M. Coughlan, M. Schumer, Trends . 41, 1068–1095 (2025).

27. Y. Zhang 等，Mol. Breed. 28, 323–334 (2011).

28. Y. Yang 等，Rice (N. Y.) 18, 43 (2025).

29. X. Huang, X. Peng, M. X. Sun, New Phytol. 215, 1039–1058 (2017).

30. J. J. Wu 等，Dev. Cell 23, 1043–1058 (2012).

31. Y. Ouyang, Q. Zhang, Annu. Rev. Plant Biol. 64, 111–135 (2013).

32. V. V. Rogov 等，Autophagy Rep. 2, 2188523 (2023).

33. K. Xia 等，DNA Res. 18, 363–377 (2011).

34. X. Guo, W. Luo, K. Chong, Sci. Bull. 70, 1364–1367 (2025).

35. J. Y. Li, C. Yang, J. Xu, H. P. Lu, J. X. Liu, Plant Cell Environ. 46, 1087–1103 (2023).

36. O. F. Linares, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16360–16365 (2002).

37. K. Zhao, 代码名称：A tripartite genetic conflict system controls hybrid sterility in rice, Zenodo (2026); https: / doi.org / 10.5281 / zenodo.20579119.

致谢

我们感谢 X. Wei, L. Zhang, L. Zhou, X. Yang 和 T. Yu 在水稻田管理和杂交方面提供的帮助；感谢 Q. Yang 和 Y. Cheng 提供野生稻种质资源；感谢 X. Ma 分享水稻地方品种资源；以及感谢 K. Olsen 对手稿的审读和宝贵的讨论。资金支持：本研究得到了青年教师科研创新能力支持项目 (ZYGXQNJSKYCXNLZCXM-A7)、国家重点研发计划 (2022YFD1200801 和 2022YFF1003503)、国家自然科学基金 (32422067)、江苏省自然科学基金 (BK20240089) 以及中山生物育种实验室重点项目 (ZSBBL-KY2023-04 和 ZSBBL-KY2023-07) 的支持。C.Wang 感谢 2024 年达摩院青年学者奖的资助。长江中下游粳稻生物学、遗传学与育种重点实验室以及江苏现代作物生产协同创新中心提供了额外支持。作者贡献：X.H. 和 K.S. 完成了大部分实验并分析了数据。YingZhu 和 Y.Zeng 进行了亚细胞定位和免疫金标记实验。Y.X. 进行了蛋白质纯化实验。JingLi, Y.Zhang, C.L., X. Dong, Y.R., J.Wang, Y.H., S.Cheng, B.Y., T.S., J.X., JiayuLu, D.L., A.J., J.G., S.Cui, G.X., X.L., Y.T., S.L., X. Deng, J.Z., D.T., J.T. 和 L.C. 开发了材料并进行了遗传分析。K.Z., X.Z., Hongru , X. Gan, Y.Y., S.G., YuantaoZhu, L.H. 和 C.X. 进行了进化分析。X. Guo 和 L.J. 进行了遗传转化。J.T., LetianChen 和 X.Y. 对手稿进行了讨论。C., Haiyang , C.Wu, Z.Z. 和 J.Wan 撰写了手稿。J.Wan 构思并监督了该项目。竞争利益：J.Wan, X.H., C., K.S., Z.Z., L.J., X.Y., X.L., S.L., Y.T. 和 Liangming Chen 是与本工作相关的一项中国待批专利 (202410734804.8) 的发明人。其他作者声明没有竞争利益。数据、代码和材料可用性：MAO, DUN, gJIA 和 jJIA 的序列已提交至 GenBank，登录号为 PV833341–PV833344。原始测序数据，包括 IRGC 102295 减数分裂阶段幼穗的转录组数据及其全基因组序列，已提交至 NCBI Sequence Read Archive，BioProject 登录号为 PRJNA1426876。评估本文结论所需的所有其他数据均可在正文、补充材料或数据 S1 至 S11 中获得。原始未裁剪的凝胶印迹图像提供在数据 S1 和 S2 中。用于 RHS3 位点基因组和系统发育分析的自定义代码已提交至 Zenodo (37)。本手稿中产生的所有材料将在签署材料转移协议后，根据请求由 J. Wan 提供。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / content / page / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

.org / doi / 10.1126 / .aec5252

材料与方法；图 S1 至 S19；参考文献 (38–44)；MDAR 可重复性检查清单；数据 S1 至 S11

2025 年 9 月 23 日提交；2026 年 5 月 1 日重新提交；2026 年 7 月 3 日接收

10.1126 / .aec5252

有机化学

铁催化酯与两种卡宾顺序偶联的 [1+1+1] 环丙烷化反应

Lingran Kong $^{1\dagger}$ , Kevin Zong $^{1,2\dagger}$ , Marcus Hopfengärtner $^{3}$ , Brandon J. Orzolek $^{4}$ , Ryan Shenvi $^{1*}$

传统的贵金属催化受益于特征明确的内球初级步骤，其中单个配合物在金属中心结合并统一底物。相比之下，贱金属催化剂近期在交叉偶联转化中展现了能力，通过迭代的外球反应实现，其产物键的形成是通过向配体（而非金属）进行连续加成而发生的。尽管两组分外球反应的多样性正在增加，但类似的多组分外球偶联仍然罕见。在本研究中，我们描述了一种通过两种卡宾与一个酯之间迭代外球反应，由铁催化的环丙醇 [1+1+1] 合成。该反应最初通过一种无痕的定向烯化反应，立体选择性、区域选择性和化学选择性地生成硅基烯醇醚，这种烯化反应可被进一步利用以实现先前方法无法完成的转化。

环丙醇由于其环张力（28 kcal·mol $^{-1}$ ），可作为多功能合成子，这种张力极大地增强了羟基的反应活性，使其能够开环生成反应性中间体，例如金属同烯醇盐、$\beta$-酮自由基和烯丙基阳离子，而这些中间体很难从常规醇类中获得（图 1A）(1–3)。这种张力环也可以通过官能团互变——最显著的是通过脱氧途径——得以保留，从而能够便捷地获得取代环丙烷 (4, 5)。除了合成实用性外，环丙醇亚单元还出现在具有结构多样性的目标化合物中，包括抗微生物药物 valgamicin C (6)、丙型肝炎治疗药物 grazoprevir (7) 以及吗啡类似物 (−)-bremazocine (8)。

几十年来，环丙醇的合成一直由 [2+1] 逆合成范式主导 (9)，在解决官能团兼容性以及立体和区域控制的固有局限性方面几乎没有创新（图 1B）。例如，被广泛应用的 Kulinkovich 反应使羧酸盐与钛环丙烷结合，从而产生 1,2-二取代环丙醇，且主要以反式异构体形式存在 (10)。尽管具有实用性，但由于该反应使用了由化学计量格氏试剂或强还原剂生成的极高反应活性有机钛中间体，导致其官能团耐受性有限 (11)。一种正交方法使用预先形成的硅基烯醇醚作为两碳组分，并以金属卡宾类化合物作为其伙伴，以产生相应的硅氧基环丙醇 (12, 13)。然而，该策略需要选择性地获得硅基烯醇醚，而这类底物的制备通常并非易事，因为伪对称酮的常规烯醇化通常会产生区域异构体和立体异构体的混合物（图 1℃，顶部）(14, 15)。总之，这些局限性制约了现有 [2+1] 方法的模块化程度和选择性。

因此，一种直接从简单构建模块组装环丙醇的多组分策略将代表一项重大进展，尤其是如果能实现催化化（图 1B，底部）。一个模块化的 [1+1+1] 方法将不再依赖于预先形成的两碳组分，从而在扩大底物范围的同时，解决现有方法中固有的化学选择性、区域选择性和立体选择性挑战。该设计的核心是原位生成单一立体异构体和区域异构体的硅基烯醇醚中间体，且理想情况下其条件需与随后的卡宾类环丙烷化兼容 (16)；如果这一转化能够实现，将把一个多步序列简化为单一的催化操作。

我们对这一转化的灵感源自本研究组之前的工作，该工作确定了氧基-钴卡宾是关键中间体，它们在温和的还原条件下能与硫酯发生加成，从而以高化学选择性和立体选择性产生双硅氧基烯烃（图 1℃，底部）(17)。我们推论，羧酸盐与烷基卡宾之间类似的反应可以高选择性地提供所需的硅基烯醇醚产物，从而规避伪对称酮硅烷化的限制（参见图 1B）。这一策略得到了多个研究小组报告的支持，这些报告证明，在类似的还原条件下，使用铁卟啉催化剂可以从易于获取的前体（如醛、重氮酯、$\alpha$-氧基羧酸盐和偕二卤化物）中获得烷基卡宾 (16, 18–25)。

然而，铁卟啉卡宾通常表现为亲电性或金属自由基物种 (26, 27)，这似乎与羧酸盐-卡宾偶联所需的向羰基进行双电子亲核加成相矛盾。为了实现我们的目标，我们通过叶立德转移 (28–31) 逆转了这种天然的亲电性，并利用 2-吡啶基酯来捕获铁卡宾，随后该卡宾与酯羰基发生分子内加成（图 1D，顶部）。值得注意的是，由此产生的 $\alpha$-吡啶酮随后通过铁介导的还原裂解离去，从而立体选择性地生成硅基烯醇醚，有效地将嵌入的吡啶作为一种无痕导向基团。在这一系列事件中，吡啶基酯仅用于使其醛衍生的卡宾配体与铁发生外球反应 (32)，而非与铁中心本身反应。

基于这种反应活性，我们实现了几种多组分序列（图 1D，底部），包括使用单一铁催化剂，由三个简单的单碳组分合成 $[1+1+1]$ 顺式选择性环丙醇。环丙醇的每个组分都很容易获得：(i) 吡啶基酯由羧酸一步合成，(ii) 卡宾前体由相应的醛一步合成，以及 (iii) 二氯甲烷（$CH_{2}Cl_{2}$ 或 $CD_{2}Cl_{2}$），一种常用且廉价的溶剂。本文披露的其他转化则受益于硅基烯醇醚形成时的化学选择性、立体选择性和区域选择性。

优化与范围

研究始于使用芳基羧酸盐和 $\alpha$-苯甲酰溴，这些是 Nagib 及其同事所确定的铁卡宾的高活性前体（图 2A）(33)。尽管简单的酯和硫酯（例如 1 和 2）表现出较低的反应活性，但我们在之前工作中使用的电正性更强的 3,5-双(三氟甲基)苯基硫酯提供了所需的硅基烯醇醚作为初步命中结果，尽管产率极低。随后的添加剂筛选发现，富电子且无位阻的吡啶作为试剂能显著提高这些产率（58%，>20:1 Z:E）。我们提出了三种可能解释吡啶作用的假设：(i) 路易斯碱催化，(ii) 金属配位，或 (iii) 卡宾传递。第一种假设涉及吡啶与硫酯之间潜在的可逆加成，从而加速整体反应。我们能够排除这一选项，因为我们观察到将吡啶以相应的 2-吡啶基酯的形式整合到羧酸盐中会导致高效的偶联，烯醇醚的产率为 56%。为了区分剩下的两种假设——金属配位和卡宾传递——需要进一步研究。此外，四丁基溴化铵 (TBAB) 被确定为一种有益的添加剂，可能通过调节锰粉的还原电位 (34) 或原位产生更具反应性的硅烷化试剂三乙基硅基溴，将产率从 56 提高到 66%。

图 1. 环丙醇合成中的挑战以及模块化铁催化 $[1+1+1]$ 组装的设计。(A) 环丙醇在化学和生物环境中都是普遍存在的基团。(B) 环丙醇的获取受限于苛刻的条件，或需要选择性地获取预组装的中间体（如硅基烯醇醚），这激发了对模块化 $[1+1+1]$ 设计的需求。(C) 从酮出发的传统烯醇醚合成通常会导致非对映异构体和区域异构体的混合物。羧酸盐-卡宾交叉偶联将提供温和的硅基烯醇醚获取途径，但需要亲核性卡宾反应活性。(D) 通过叶立德转移实现的吡啶介导的卡宾极性反转可产生硅基烯醇醚，并能够通过单一铁催化剂获取结构多样的三碳产物。

值得注意的是，当二氯甲烷作为第三个反应组分引入时，可选择性地获得相应的硅氧基环丙醇 7a（图 2B）。基于这些发现，我们开发了一套条件：条件 A，先进行交叉偶联，随后加入二氯甲烷并加热至 $70^{\circ}$ C；条件 B，所有组分同时混合。条件 B 中描述的这种一锅法反应的选择性可能反映了 $\alpha$-苯甲酰溴形成卡宾的速度快于二氯烷烃，从而实现了由单一催化剂顺序生成卡宾。两种条件在操作上都很方便，且能以高顺式选择性（>20:1 非对映异构体比例）提供硅氧基环丙醇，与 Kulinkovich 反应的反式选择性形成互补。

对吡啶酯组分的改变（图 2℃）揭示了广泛的、在电子和空间上具有多样性的芳基羧酸盐均可作为合格的偶联伙伴；富电子、电中性和缺电子取代基均能以中等至良好的产率提供 1,2-二取代硅氧基环丙醇 (7a 至 7i)。烷基酯的表现与芳基羧酸盐一样好，且通常与 Kulinkovich 反应强还原条件不兼容的官能团（例如卤化物、甲酯、腈和酮）具有良好的耐受性 (7j 至 7v)。

图 2. 三组分 $[1+1+1]$ 反应的优化与适用范围。(A) 硅基烯醇醚合成的模型反应，包含底物变化和添加剂筛选。(B) 一锅法硅氧基环丙醇合成。报告的产率均为分离产率。(C) 三组分 $[1+1+1]$ 反应的适用范围。$\dagger$ 除另有说明外，反应均使用条件 A 进行。$\ddagger$ 反应在未添加 TBAB 的情况下进行。$\S$ 反应使用 10 当量 Mn 和 15 当量 $CH_{2}Cl_{2}$ 进行。# 反应使用 10 当量 Mn 和 15 当量 $CH_{2}Cl_{2}$ 且未添加 TBAB 进行。除非另有说明，所有报告的产率均为分离产率。**气相色谱产率。

值得注意的是，该适用范围表明，羰基的亲电性并不影响初始硅基烯醇醚形成的效率，这似乎与吡啶或吡啶酯通过结合金属中心使卡宾具有亲核性的假设作用不相符。该反应可良好地放大至 4 mmol 而产率没有显著下降（参见 7l），且除了使用 $CD_{2}Cl_{2}$ 外，无需更改步骤即可获得 $d_{2}$-环丙醇 (35, 36)，从而提供同位素标记产物 7r' 和 7v'。

接下来，我们考察了可用 $\alpha$-苯甲酰溴的适用范围，发现带有卤化物、张力环、含氮杂环和非吡啶酯的偶联伙伴均具有反应活性 (7w 至 7z)。然而，随着 $\alpha$-苯甲酰溴周围环境的立体位阻增加，观察到硅基烯醇醚向硅氧基环丙醇的转化率较低（更多适用范围条目见补充材料），这表明立体位阻在羧酸盐-卡宾交叉偶联步骤中是可以容忍的，但在随后的环丙烷化步骤中难以适应。综上所述，酯和 $\alpha$-苯甲酰溴的适用范围确立了 $[1 + 1 + 1]$ 环丙烷化是一种广泛适用的方法，可利用简单且易得的起始原料合成 1,2-二取代硅氧基环丙醇。

扩展至二氯甲烷寡聚化

Uyeda及其合作者在关于烯烃催化环丙烷化以及烯酮环寡聚化以通过连续插入产生环戊烷的开创性工作中，证明了二氯甲烷可用作卡宾合成子 (37, 38)。此前尚未有报道关于形成三元环的类似寡聚反应，这激发了我们的研究。值得注意的是，仅通过铁催化无法直接从吡啶酯中实现这种反应性（见补充材料），这可能是由于未取代卡宾二聚化的高背景速率导致产生了不希望看到的乙烯。类比 Uyeda 的条件，我们发现镍配合物能有效促进寡聚化，但仅在存在铁卟啉共催化剂的情况下才有效（图 3）。我们推测，这些条件要么是通过将其螯合到混合有机金属卡宾类化合物中从而抑制了高浓度的铁卡宾 (39)，要么是将吡啶酯引导至羰基插入路径以形成硅基烯醇醚 (40, 41)。一项高通量配体筛选（见补充材料）为 $\mathfrak{sp}^2$ 和 $\mathfrak{sp}^3$ 酯底物确定了不同的最佳前催化剂和配体：$\mathrm{NiBr_2\cdot dme}$ 与 L1 对共轭酯有效，而 $\mathrm{Ni(oct)_2\cdot H_2O}$ 与 L2 则可用于烷基酯。该反应在两类底物中均能以中等至良好的产率提供单取代环丙烷醇，且在化学选择性方面超越了先前的方法。此外，该方法允许使用 ${CD}_2{Cl}_2$ 来简化 ${d}_4$-环丙烷醇的获取，从而无需使用 ${d}_5$-EtMgBr (42) 这种剧烈且非商业化的有机金属试剂。

羧酸盐-卡宾交叉偶联的其他应用

除了环丙烷化，硅基烯醇醚的合成还提供了一个机会，使其极高的区域选择性、立体选择性和化学选择性（即其烯醇盐形成的独特属性）能够被应用于多个额外的反应序列中。传统的碱介导的伪对称酮烯醇化会产生多达四种区域异构体和立体异构体的混合物（图 4A），而此处使用的吡啶酯通过卡宾交叉偶联仅产生单一的硅基烯醇醚异构体。这种选择性实现了 $\alpha$-溴化、$\alpha$-羟基化、Mukaiyama 醛醇反应和氧化偶联，且在每种情况下均能提供单一的区域异构体。这种控制在相应的酮中很难实现，特别是在带有结构相似官能团的底物中。这种选择性的实用价值在合成 14（一种合成抗生素 alaremycin 的构建模块）中得到了证明，由于存在多个可烯醇化的质子，通过传统手段进行选择性烯醇醚形成具有挑战性，这在之前合成该中间体的路线 (43) 中有所体现。相比之下，本工作中报道的铁催化硅基烯醇醚合成直接提供了单一的区域异构中间体，随后 $\mathrm{CuBr_2}$ 介导的溴化反应毫无歧义地进行。

事实证明，化学选择性对于传统碱介导烯醇化无法实现的分子内环化策略同样具有赋能作用（图 4B）。例如，标准烯醇化无法区分 1,4-二羰基底物的四个酸性质子，会产生硅基烯醇醚的混合物，从而使下游反应和纯化复杂化。相比之下，卡宾交叉偶联在存在悬挂酮和 $\alpha, \beta$-不饱和酯的情况下，选择性地仅与吡啶酯反应，将它们保留作为后续环化的手柄。利用这一策略，通过两步反应以良好产率获得了 [3.2.1]- 和 [2.2.1]-桥环双环骨架 (15, 16) 以及功能化的环己烯酮 17 和环己酮 18。烯醇醚合成还提供了便捷的 Diels-Alder 前体获取途径，其中用 $\mathrm{Cu(OTf)_2}$ 和 $\mathrm{Cu_2O}$ 处理所得的三烯促进了形式上的 $[4 + 2]$ 环化，通过两步反应以 $42\%$ 的产率和高非对映选择性得到了三环产物 19。最后，我们探索了卡宾交叉偶联的分子内变体（图 4℃）。由于 $\alpha$-苯甲酰溴的稳定性有限，$\alpha$-二氯

图 3. 酯环寡聚反应的范围。†反应条件：0.1 mmol 芳基和乙烯基吡啶酯，5 当量 Mn，3 当量 TESCI，5 mol % $\mathrm{NiBr_2 \cdot dme}$，8 mol % L1，5 % FeTPPCI，以及 DMA (0.1M)，23℃ 反应 16 小时。‡反应条件：0.1 mmol 烷基吡啶酯，6 当量 Mn，3 当量 TESCI，5 % $\mathrm{Ni(oct)_2 \cdot H_2O}$，8 % L2，5 % FeTPPCI，以及 DMA (0.1M)，60℃ 反应 16 小时（除非另有说明）。§16 小时后，加入 3 当量 Mn 和 6 当量 $\mathrm{CH_2Cl_2}$，并在 60℃ 下继续搅拌 8 小时。

图 4. 选择性烯醇醚合成的应用。(A) 区域选择性获取硅基烯醇醚可实现伪对称酮的选择性官能团化。(B) 化学选择性获取硅基烯醇醚可实现随后与悬挂官能团的分子内环化。(C) 分子内硅基烯醇醚的形成及其在宏环化中的应用。

底物被用作卡宾前体，以 45% 的产率得到了茚酮的硅基烯醇醚 (21)。将此反应活性扩展至长链系底物，得到了元环芳烷 23，该产物可结晶为其甲苯磺酰腙，从而明确证实了其大环结构。尽管产率仍然较低，但这一结果在交付大环酮方面具有重要意义，大环酮代表了一类通过传统手段难以获取的高价值目标类化合物 (44)。通过羧酸盐-卡宾交叉偶联，能够直接从简单的线性前体构建大环酮，这为未来的开发提供了一条极具吸引力的途径。

机理洞察与反应性的扩展

我们已经证明，吡啶氮原子的存在对于有效的催化是必要的，无论它是嵌入在底物中（例如 2-吡啶基酯）还是作为外源添加剂（例如添加 2-甲氧基吡啶）。为此，我们考虑了两种可能的解释：(i) 吡啶配位到铁卟啉的轴向位置，以增加卡宾碳的亲核性（内球机制）(18, 23, 45, 46)；或者 (ii) 添加到铁卡宾碳上，通过形成吡啶鎓叶立德（pyridinium ylide）有效地反转其极性（外球机制）(29–31)。带有额外 C6 甲基的 2-吡啶基酯（例如 27）阻止了产物的形成，这一结果在两种假设中均可预见，因为配位氮原子处的空间拥挤预计将阻碍金属配位和叶立德的形成（图 5A）。为了区分这两个竞争性假设，我们将 2-甲氧基吡啶添加到两种不同的有效 2-吡啶基酯底物中，并观察到两种情况的产率均有所下降（从 56% 降至 27%，以及从 65% 降至 34%）。这些结果与将内球配位作为增强卡宾亲核性手段的观点不一致，因为我们假设更高的吡啶•铁浓度会增加有效路径的速率。相比之下，这些数据与外球吡啶鎓叶立德的形成一致，在这种情况下，对卡宾碳的竞争性加成会阻碍产物的形成。值得注意的是，同样的添加剂对以 2-吡啶基硫酯 28 为底物的反应性没有产生不利影响，这可能是由于其具有更优异的离去基团，使得分子内和分子间的叶立德进攻均能高效进行（参见图 5℃，底部）。与外球机制一致，我们还观察到当

图 5. 机理探究。(A) 离去基团的性质和氮原子的可及性决定了羧酸盐的反应性，且拟议中间体的合成类似物可进行有效的交叉偶联。(B) 卡宾前体和亲电试剂的变化可产生类似的产物骨架。(C) 通过分子内和分子间叶立德转移实现卡宾极性反转的拟议机理。

2-硅氧基吡啶在标准条件下与卡宾前体反应时，叶立德发生了逆-Brook 重排（retro-Brook rearrangement），从而产生化合物 30。然而，该路径并未与正常的产物形成产生有效的竞争（见补充材料），这表明尽管叶立德转移是可行的，但分子内逆-Brook 路径可能会被具有强亲电性的羧酸盐底物所竞争掉。

尽管拟议的外球机制借鉴了源自重氮前体的铑卡宾先例 (31)，但在铁催化反应中尚未报道过类似的反应性。此外，该拟议机理未能解释将产物转化为最终产物所需的异常 $\alpha$-吡啶酮或 $\alpha$-吡啶鎓酮中间体（参见图 5℃）。我们没有发现任何关于铁卟啉介导此类 C–N 键断裂的先例，因此促使我们进行实验来探究吡啶酮 31 和吡啶鎓 33 作为潜在反应中间体的可能性。当独立合成这些杂环并使其处于反应条件下时，我们发现这些杂环实际上被裂解，从而以高产率和高非对映选择性地生成硅基烯醇醚。值得注意的是，仅使用锰和硅烷基氯时反应效率低下（图 S20），这表明铁卟啉本身通过一条额外的外球路径介导了 C–N 键的断裂，从而生成产物。

卡宾前体和亲电试剂的改变不仅为机理假设提供了依据，还指明了开发新反应的机会（图 5B）。用三个当量的相应偕二氯化物取代 $\alpha$-苯甲酰溴，可以获得产率为 $77\%$ 的硅基烯醇醚 6，这证明了叶立德转移机制不仅限于 $\alpha$-溴苯甲酸酯衍生的铁卡宾，尽管这些条件被证明与 $[1 + 1 + 1]$ 环丙烷化不兼容（图 S8）。直接使用醛同样可以获得产率为 $10\%$ 的硅基烯醇醚 36，产率的降低反映了这种非活化前体较低的固有反应活性。最后，用 AcCl 取代 TESCl 可获得产率为 $14\%$ 的烯醇乙酸酯 37，这表明所提出的中间体可以被其他亲电试剂截获，尽管效率有所降低。

对于 2-吡啶基酯底物，这些数据表明其机理为：外球叶立德转移（图 5℃，顶部）、酯加成、还原性 C–N 键断裂以及硅烷化，从而立体选择性、区域选择性和化学选择性地生成硅基烯醇醚。该机理避免了亲核试剂或亲电试剂对的配位和插入步骤，并将反应物在分子内统一，预示着除本研究所述之外的广泛应用。相比之下，当使用外源吡啶试剂结合反应性羧酸盐（如 3,5-双(三氟甲基)苯基硫酯）时，则发生了分子间攻击（图 5℃，底部）。当存在额外的卡宾前体时，这些初始步骤之后会发生进一步的外球反应：烯烃加成到铁卡宾以及分子内 $S_{H}2$ 反应，最终能够利用铁催化剂，由三个简单的单碳构建模块通过 $[1+1+1]$ 多组分组装生成环丙烷醇。硅基烯醇醚形成的独特选择性还可以被利用于多个下游序列，而在这些序列中，传统的碱介导烯醇化无法以相当的控制力提供所需产物。更广泛地说，这项工作证明了贱金属催化剂可以通过内球和外球路径的结合来介导多组分反应，其选择性和官能团耐受性是现有方法难以实现的。在温和的催化条件下，能够从模块化单碳构建模块获得多样化骨架的能力，为多组分反应的设计指明了进一步的机会。

参考文献与注释

1. O. G. Kulinkovich, Chem. Rev. 103, 2597–2632 (2003).

2. T. R. McDonald, L. R. Mills, M. S. West, S. A. L. Rousseaux, Chem. Rev. 121, 3–79 (2021).

3. M. Laktsevich-Iskryk, A. Hurski, M. Ošeka, D. Kananovich, Org. Biomol. Chem. 23, 992–1015 (2025).

4. L. R. Mills, J. J. Monteith, G. Dos Passos Gomes, A. Aspuru-Guzik, S. A. L. Rousseaux, J. Am. Chem. Soc. 142, 13246–13254 (2020).

5. J. J. Monteith, J. W. Pearson, S. A. L. Rousseaux, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202402912 (2024).

6. H. Hashizume et al., J. Antibiot. (Tokyo) 71, 129–134 (2018).

7. S. Harper et al., ACS Med. Chem. Lett. 3, 332–336 (2012).

8. D. Römer et al., Life Sci. 27, 971–978 (1980).

9. Q. Liu, B. You, G. Xie, X. Wang, Org. Biomol. Chem. 18, 191–204 (2020).

10. J. K. Cha, O. G. Kulinkovich, in Organic Reactions, vol. 77 (Wiley, 2012), pp. 1–160.

11. J. Ni, X. Xia, W.-F. Zheng, Z. Wang, J. Am. Chem. Soc. 144, 7889–7900 (2022).

12. J. M. Conia, in Organic Synthesis, A. Bruylants, L. Ghosez, H. G. Viehe, Eds. (Butterworth-Heinemann, 1975), pp. 317–326.

13. J. H. G. Teye-Kau, M. Pauze, S. P. Pitre, JACS Au 6, 3356–3362 (2026).

14. P. L. Hall, J. H. Gilchrist, D. B. Collum, J. Am. Chem. Soc. 113, 9571–9574 (1991).

15. P. Cazeau, F. Duboudin, F. Moulines, O. Babot, J. Dunogues, Tetrahedron 43, 2075–2088 (1987).

16. K. N. M. Nguyen et al., Science 389, 183–189 (2025).

17. L. Kong, K. Zong, J. Guo, R. Shenvi, Nat. Chem. 18, 741–748 (2026).

18. L. K. Baumann, H. M. Mbuvi, G. Du, L. K. Woo, Organometallics 26, 3995–4002 (2007).

19. B. T. Boyle, N. W. Dow, C. B. Kelly, M. C. Bryan, D. W. C. MacMillan, Nature 631, 789–795 (2024).

20. D. T. Ngo, J. J. A. Garwood, D. A. Nagib, J. Am. Chem. Soc. 146, 24009–24015 (2024).

21. R.-B. Liang, C. Yang, W. Xia, L. Guo, J. Am. Chem. Soc. 147, 36781–36792 (2025).

22. E. Ertürk, M. Ulutürk, ACS Catal. 15, 20149–20156 (2025).

23. X. Lin, H. Shen, Z. Wang, ACS Catal. 15, 19030–19039 (2025).

24. Y.-T. Zheng et al., J. Am. Chem. Soc. 147, 43254–43260 (2025).

25. P. S. Pedersen et al., J. Am. Chem. Soc. 148, 18703–18714 (2026).

26. V. F. Batista, D. C. G. A. Pinto, A. M. S. Silva, ACS Catal. 10, 10096–10116 (2020).

27. W.-C. C. Lee, X. P. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202320243 (2024).

28. G. Cheng, G. A. Mirafzal, L. K. Woo, Organometallics 22, 1468–1474 (2003).

29. I. Aviv, Z. Gross, Chemistry 14, 3995–4005 (2008).

30. C.-R. Liu et al., Chem. Commun. 47, 1342–1344 (2011).

31. G. Xu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 58, 1980–1984 (2019).

32. L. Kong, X.-C. Gan, V. A. van der Puyl Lovett, R. A. Shenvi, J. Am. Chem. Soc. 146, 2351–2357 (2024).

33. L. Zhang, B. M. DeMuynck, A. N. Paneque, J. E. Rutherford, D. A. Nagib, Science 377, 649–654 (2022).

34. Z. M. Su, R. Deng, S. S. Stahl, Nat. Chem. 16, 2036–2043 (2024).

35. M. Liu, N. Le, C. Uyeda, Angew. Chem. Int. Ed. 62, e202308913 (2023).

36. I. K. Rana, K. N. M. Nguyen, D. T. Ngo, D. A. Nagib, Org. Lett. 28, 1750–1754 (2026).

37. Y.-Y. Zhou, C. Uyeda, Angew. Chem. Int. Ed. 55, 3171–3175 (2016).

38. C. M. Farley, Y.-Y. Zhou, N. Banka, C. Uyeda, J. Am. Chem. Soc. 140, 12710–12714 (2018).

39. Y.-H. Tee, L. Bachas, D. Bhattacharyya, J. Phys. Chem. C Nanomater. Interfaces 113, 9454–9464 (2009).

40. M. Onaka, Y. Matsuoka, T. Mukaiyama, Chem. Lett. 10, 531–534 (1981).

41. Z. Huang, M. E. Akana, K. M. Sanders, D. J. Weix, Science 385, 1331–1337 (2024).

42. K. Tsukiji, A. Matsumoto, K. Kanemoto, N. Yoshikai, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202412456 (2024).

43. Y.-G. Wang, M. Wachi, Y. Kobayashi, Synlett 2006, 481–483 (2006).

44. J. R. Donald, W. P. Unsworth, Chemistry 23, 8780–8799 (2017).

45. C. E. Castro, G. M. Hathaway, R. Havlin, J. Am. Chem. Soc. 99, 8032–8039 (1977).

46. K. M. Kadish, L. A. Bottomley, Inorg. Chem. 19, 832–836 (1980).

致谢

我们感谢 Q. N. Wong、J. Lee 以及 Scripps 自动化合成设施 (ASF) 提供的分析支持和手套箱；感谢 L. Pasternack 和 G. J. Kroon 在核磁共振 (NMR) 光谱分析方面提供的帮助；感谢 M. Gembicky、S. Yang 以及整个 UCSD 晶体学设施提供的 X 射线晶体学分析；感谢 Baran 和 Yu 实验室提供的气相色谱-火焰离子化检测器和气相色谱-质谱仪；以及感谢 J. Luo 在底物制备和 HTE 筛选方面提供的帮助。资金支持：美国国立卫生研究院 (GM122606)；美国国家科学基金会 (CHE 2400341)；中国博士后科学基金会办公室的博士后交流资助计划 (L.K.)。作者贡献：概念化：L.K., K.Z., R.S.；方法论：L.K., K.Z., B.J.O.；调查：L.K., K.Z., M.H.；可视化：L.K., K.Z., B.J.O.；资金获取：R.S.；项目管理：R.S.；监督：R.S.；初稿撰写：L.K., K.Z.；审阅与编辑：L.K., K.Z., B.J.O., M.H., R.S.。竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：化合物 24 的 X 射线晶体学数据可从剑桥晶体数据中心 (CCDC 2531661) 免费获取。所有其他数据均可在补充材料中获得，包括制备和表征所有报道化合物的实验步骤以及 NMR 光谱副本。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

材料与方法；图 S1 至 S46；表 S1 至 S3；NMR 光谱；参考文献 (47–67) 提交日期：2026年5月19日；接收日期：2026年7月7日

10.1126 / science.aej0194

设备技术

性能超越玻尔兹曼热发射极限的隧道场效应晶体管

Zehan Wu $^{1}$ , Ke Yang $^{1}$ , Wanqing Meng $^{2}$ , Weizhen Wang $^{1}$ , Yifei Zhao $^{1}$ , Fumei Yang $^{1}$ , Ran Ding $^{1}$ , Hui Li $^{3}$ , Yudong Peng $^{1}$ , Zongmeng Yang $^{4,5}$ , Yee Sin Ang $^{5}$ , Songhua Cai $^{1}$ , Ming Yang $^{1}$ , Jiannong Wang $^{3}$ , Lain-Jong Li $^{2}$ , Jianhua Hao $^{1}$

设备与系统国际路线图（IRDS）已将隧道场效应晶体管（TFET）确定为最具前景的下一代逻辑器件，能够实现驱动电压和功耗的可持续下调。证明其具有可接受的亚玻尔兹曼极限开启电流（即 $I_{60}$，指 TFET 切换至每十倍电流电压摆幅为 60 毫伏时的电流水平）和电流开关比一直是一个巨大的挑战。我们报道了一种基于硒化铋 / 硒化铟（Bi / InSe）异质结构的 TFET，其 $I_{60}$ 高达约 10 微安培 / 微米，电流开关比 $>10^{7}$。我们将这种极具前景的 TFET 归功于精确的材料设计、在真空环境下制备的洁净界面，以及基于亚阈值摆幅物理学的能带工程。我们的结果证明了一个高性能的基础构建模块，满足了 IRDS 对下一代集成电路的要求。

互补金属氧化物半导体（CMOS）晶体管的性能提升在一定程度上是由驱动电压和功耗的持续降低所驱动的。CMOS 通道中的玻尔兹曼势垒决定了改变一个数量级输出电流所需的最小栅极电压为 60 mV [即室温下最小亚阈值摆幅（SS）为 60 mV decade $^{-1}$]，这从根本上阻碍了未来晶体管为了实现高效电流控制而进一步降低电压和功耗 (1, 2)。为了克服这一障碍，人们提出了各种“超越 CMOS”的架构。其中，最新的设备与系统国际路线图（IRDS）将隧道场效应晶体管（TFETs）强调为逻辑电路中替代 CMOS 晶体管的最有前景的选择，能够抑制漏电流并降低功耗 (3–5)。

尽管经过多年的开发，TFETs 尚未在主流电子产品中获得广泛采用，因为其器件性能仍逊于金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFETs） (6–10)。具体而言，基于三维（3D）结（例如，硅同质结或 InAs 相关异质结）且研究最广泛的 TFETs 未能表现出可接受的电流开关能力 (10–14)，而基于新兴二维（2D）材料（例如，Si / InSe 混合维度异质结、$SnSe_{2} / WSe_{2}$ 全 2D 异质结或其他全 2D 同质结）的 TFETs 则无法提供令人满意的输出电流 (15–19)。

为了克服这些挑战，研究人员确定了提升 TFET 性能的两个关键方向：(i) 根据 SS 物理学设计材料并实施能带工程，以增加载流子隧穿概率 (20–23)；(ii) 开发可靠的制造工艺以获得高质量的隧穿结 (4, 20, 24)。高性能 TFET 需要同时实现三个关键指标。首先，晶体管必须表现出足够的 $I_{60}$，其定义为 切换到 60 mV decade $^{-1}$ 的实际 SS 水平时所具有的特征电流水平 (5–8)。具体而言，实现 $>1 \mu A \mu m^{-1}$ 的 $I_{60}$ 是 与当前 CMOS 集成电路兼容的最低底线，但在已报道的研究中，实现这一 $I_{60}$ 仍然是一个重大挑战。其次，运行中的晶体管需要在至少四个数量级的开关电流变化范围内，保持远低于玻尔兹曼极限的平均 SS 值（SS ${\sim4dec}$ ≪ 60 mV decade $^{-1}$）(4, 7)，以便在没有过多漏电流的情况下降低驱动电压。第三，低功耗器件和系统（目前 的目标应用领域）要求电流开关比 $>10^{6}$ (3, 4, 10)，这也对 的 $I{60}$ 特性提出了更高要求。尽管如此，任何提高 $I_{60}$ 特性的努力都不应以牺牲 SS $_{\sim4dec}$ 和电流开关比为代价。

我们展示了一种极具前景的 ，它基于由 p 型二维铋 (Bi) 和 n 型二维硒化铟 (InSe) 组成的二维 p-n 异质结，该器件具有洁净的界面、卓越的静电控制、可观的载流子隧穿概率、具有吸引力的电流开关比的陡峭平均 SS 以及高 $I_{60}$。我们表明，由于 2D Bi 具有 $\sim 0.2$ eV 的超窄带隙 ($E_g$) 和电子 $\sim 0.04m_0$ 的超小有效载流子质量 ($m^*$) (图 1A) (25)，它可以成为构建 架构源端的理想二维材料。我们选择 2D InSe 作为沟道材料，是因为它具有有利于抑制关断电流水平的带隙，以及用于高效能带工程的强静电完整性 (26, 27)。此外，我们开发了一种连续的高真空原位沉积工艺，以自下而上地制造厘米级 Bi / InSe 异质结构，从而提供了无界面层的洁净界面。结果表明，Bi / InSe 实现了高达 $\sim 10$ $\mu$ A $\mu$ m $^{-1}$ 的 $I_{60}$（比最低需求高出 10 倍）以及约 $10^7$ 的极具前景的电流开关比，为未来信息产业中晶体管的持续小型化进程奠定了关键基础。

Bi / InSe 隧道结的材料与能带设计

针对新兴隧道结的材料与能带设计，研究人员对 TFETs 的亚阈值摆幅（SS）物理机制进行了深入的理论研究（见补充文本，注 S1）(4, 22)。如前所述，Bi 具有较小的 $m^{}$（图 1A），且 / InSe 隧道结所获得的低有效载流子隧穿质量（ $m_{T}^{}$ ）为 $0.04m_{0}$，这足以实现高隧穿电流（图 S1 及补充文本，注 S2）。分层 的二维特性为范德华（vdW）异质隧道结的设计提供了灵活性，从而实现了具有竞争力的电流开关比 (18, 28, 29)。

我们对所提出的 / 隧道结进行了转移特性模拟，并与此前报道的三种其他架构进行了对比（图 1B 和图 S2）。具体而言，InAs / GaSb 隧道结的 $m_T^$ 较小，为 $0.05m_0$，虽然产生了可接受的开启电流（ON current），但未能提供具有竞争力的关闭电流（ $I_{\text{OFF}}$ ）和电流开关能力。通过应用基于二维材料的隧道结可以优化这些障碍，因为它们在材料和能带设计方面具有更高的自由度 (30)。遗憾的是，目前的发现受限于过高的 $m_T^$（例如，Si / 为 $0.18m_0$，体相到单层黑磷为 $0.15m_0$）。相比之下， / TFETs 能够提供高 $I_{60}$ 以及极具吸引力的电流开关比。

通过密度泛函理论（DFT）计算、非平衡格林函数（NEGF）模拟以及光电子能谱研究，包括 X 射线光电子能谱（XPS）和紫外光电子能谱（UPS）研究（图 S5 和 S6 及补充文本，注 S4）。施加在 侧的栅极电压可以调制窗口的开关，我们通过扫描开尔文探针显微镜（SKPM）测量（图 S7）验证了这一点，从而为高效 TFET 奠定了基础。

E

C

D

图 1. / 隧道结的材料与能带设计。(A) 已报道的 TFET 架构中所使用的各种组成材料的有效载流子质量和能带隙。红星代表本研究中使用的 和 (23–25)。BP，黑磷；BP-ML，单层黑磷。(B) 基于物理模型推导的隧穿电流随调制栅极电压变化的模拟结果，对比了 / 与三种报道的最先进隧道结（InAs / GaSb、单层到体相 BP 以及 Si / ）。(C) 独立 和 的能带结构以及 / 异质结构的投影能带结构。翡翠色和洋红色部分分别代表 层和 层。插图分别显示了 和 组件在接触前后的计算能带边对齐情况。(D 和 E) / 异质结构中的电荷密度差，指示了界面处的电荷转移行为 (D)，从而导致能带弯曲并为载流子开启隧穿窗口 (E)。a.u.，任意单位；$E_{F}$，费米能级。在 (D) 中，异质结构界面中的黄色和天蓝色图案分别代表电子的积累和耗尽。红色曲线展示了沿 z 方向的平面平均电荷密度差。

制造工艺会极大地影响隧道场效应晶体管（TFETs）的性能。以往构建二维异质结构的大多数尝试都局限于转移方法，而这些方法经常受到界面问题的困扰，例如额外的氧化层，这可能会降低隧道电流 (15, 16)。此外，这些制备方法难以控制以实现大规模生产。在本研究中，我们提出了一种顺序脉冲激光沉积（PLD）工艺，用于在厘米级硅晶圆上自下而上地逐层制造连续且超薄的 InSe 和 Bi 薄膜，并确保界面洁净（图 2A；详见材料与方法）。具体而言，InSe 和 Bi 生长温度之间的显著差异确保了每种材料的高质量生长，而超高真空沉积环境通常能产生洁净的界面 (33)。我们利用截面透射电子显微镜（CS-TEM）验证了纵向层间结构（图 2B 和图 S8），并通过能量色散光谱仪验证了纵向元素分布特性（图 S9）。

Bi / InSe 隧道结的构建

旨在确定二维 Bi / InSe 异质结的详细能带特性。通过 DFT 研究获得的投影能带结构（图 1℃）阐明了 和 InSe 的独立晶格以及接触后构建的异质结的电子特性。尽管体相 通常被认为是半金属，但二维 的层状结构导致超薄层中出现能隙，从而形成窄能隙 p 型半导体（图 S3），这一点已通过霍尔效应传输测量得到证实（图 S4 和表 S1）(31, 32)。

关于生长的宏观直接证据是通过 $\theta$-2$\theta$ X 射线衍射 (XRD) 获得的，其中 $\theta$ 为布拉格角。我们可以将所有图谱归于 InSe 或 ，两者均沿 c 轴具有高度择优取向生长，且未发现明显的杂质，如氧化铋或硒化物（图 2℃）(26, 34)。此外，尖锐的

异质结中的能带对齐可以实现有效的带到带载流子隧穿，并允许载流子在外加偏压的驱动和栅极电压的控制下，直接从 价带注入到 InSe 导带（图 1, D 和 E；图 S3；以及补充文本，注 S3）。我们获得了一致的结果，位于 $\sim 21.32^{\circ}$ 和 $\sim 22.36^{\circ}$ 的 X 射线分离峰分别对应于 InSe-(006) 和 -(003) 晶面，表明顶层 层与底层 InSe 层之间具有类 vdW（范德华）的堆叠特性。

生长样品的超薄特性使得 XPS 测量能够验证铋元素的单一性以及界面纯度。 4f 的 XPS 光谱（图 2D）包含两个明显的峰，分别位于 $\ 156.28$ 和 $\ 161.48$ eV，分别对应于单质铋 ( $^{0}$) 4f ${7 / 2}$ 和 4f ${5 / 2}$ 的结合态 (34)。具有低半高全宽 (FWHM) 值的尖锐峰以及可辨识的 $\ 5.2$ eV 自旋-轨道分裂间距表明，不存在铋化合物（如氧化物或硒化物）的结合态 (34)，且已形成洁净界面。此外，可控的 PLD 工艺应允许制备厘米级样品 (33)。额外的表征，包括 XPS 深度剖析、电子 通道材料， 是隧道二极管的源端材料，而重掺杂 Si 作为栅极，通过 $\ 100$ nm 的 $SiO_{2}$ 电介质来调制通道（图 3A，插图）。在 +0.6 V 的漏极电压 ($V_{DS}$) 驱动下， / InSe TFET 在仅 160 mV 的栅极电压 ($V_{g}$) 范围内展示了跨越 7 个数量级以上的有效电流开关特性（图 3B）。作为对比，先进 MOSFET 的 $V_{g}$ 约为 $\ 800$ mV (4, 35)。

B

图 2. Bi / InSe 异质结构的自下而上生长及材料表征。(A) 在 $\mathrm{SiO}_2 / \mathrm{Si}$ 基底上生长 InSe 层，随后通过连续原位 PLD 方法在 平台上生长 Bi 层的自下而上制备工艺示意图。整个过程中生长室保持高真空状态，在很大程度上避免了产生不需要的污染。RT，室温。(B 和 C) 刚生长出的 Bi / 样品的 CS-TEM 图像 (B) 和 XRD 图谱 (C)，分别从局部视角和整体水平证明了其 2D 异质结构的特性。(B) 的插图中可见 2D 结构的层间真空层和层间距。提取了 3 个典型的层间厚度，这些数值与报道的值相似。(D) 在先前生长的 基底之上，$\sim 10$ 层 Bi 薄膜的 XPS 光谱。两个峰的半峰全宽 (FWHM) 值均较低，约为 $\sim 0.8$ eV。

在厘米级硅基底平台上的毫米级 TFET 阵列展现出可靠的亚玻尔兹曼极限 (sub-Boltzmann-limit) 性能。如图 3℃ 所示，Bi / TFET 在六个数量级的电流开关尺度上，其 SS 值始终远低于 $60\mathrm{mV}$ decade $^{-1}$。因此，在相当大的电流开关范围内，晶体管持续在载流子冷电荷注入的主导机制下运行 (4, 6)。当 SS 接近玻尔兹曼极限 ($60\mathrm{mV}$ decade $^{-1}$ ——即在热发射主导的载流子注入发生之前——时，输出电流达到了每微米数微安的理想水平（按隧道区域周长归一化），成功满足了 IRDS 的要求 (3)。我们认为，通过受控且不间断的、无需破真空的 PLD 工艺所获得的洁净异质结构界面，以及 Bi / 异质结系统的设计，对于实现亚玻尔兹曼极限的电学性能至关重要。相比之下，基于 通道（无 Bi 层）的 MOSFET 的电学特性如图 3, B 和 C 所示。

我们在不同温度下对晶体管进行了电学表征（图 3D），以研究热力学条件对器件性能的影响，并进一步理解带到带隧道 (BTBT) 机制在集成载流子注入过程中的作用。随着器件工作温度的降低，晶体管的转移特性曲线出现了轻微变化（图 3E），这表明工作器件中存在热力学势垒 (16, 19, 24)。半导体之间的接触势垒——

为了进一步确认大尺寸 PLD 生长的 Bi / 样品的质量和均匀性，进行了电子背散射衍射 (EBSD) 映射、拉曼鉴定、XRD $2\theta-\omega$ 和面内 $\varphi$ 扫描、原子力显微镜 (AFM) 研究以及平面 TEM 观察（图 S10 至 S13 和表 S2）。

亚玻尔兹曼极限电学性能

我们的自下而上气相沉积工艺在通用硅基平台上实现了大面积、超薄且稳定的 Bi / InSe 异质结构（详见材料与方法及图 S14）。在基于硅晶圆构建的拟议 TFET 中，InSe 是 且电极可能会随温度降低而增加，这将在一定程度上抑制器件的电流水平。然而，该因素对我们 TFET 性能的影响有限。温度降低还导致我们器件的栅极开关电压和 SS 值降低，因为 的导带最小值向相对更接近对齐费米能级的位置移动，使得隧道结更容易被关闭。尽管我们的 在低温下表现更好，但它们在室温下也展现出了高性能。

通过双向扫描转移特性曲线（图 S15）确定的晶体管迟滞响应显示出较小的

图 3. Bi / TFETs 的亚玻尔兹曼极限电学性能。(A) Bi / 的源漏电流与电压 $( / I_{\mathrm{DS}} / - V_{\mathrm{DS}})$ 输出特性。NDR 区域的观察证实了晶体管中的 BTBT 机制。(插图) 基于硅晶圆（带有 $100\text{ nm}$ 氧化层）构建的单个 架构示意图。(B 和 C) 在同一 平台上构建的 Bi / TFETs 和 MOSFETs 的对数刻度转移特性 $(I_{{}} - V_{{g}})$ (B) 以及晶体管开关期间的 SS 变化趋势 $(\text{} - I_{{}})$ (C)。(D) 温度依赖的 $I_{{}} - V_{{g}}$，显示了 高效开启或关闭的电流开关区域。(E) TFETs 在不同温度下的 ${} - I_{{}}$。提取的 ${} \sim 4{ dec}$ 特性显示在 (E) 的插图中。(F) 不同沟道长度的 Bi / TFETs 的 $I_{{}} - V_{{g}}$。(G) 不同沟道长度 TFETs 的 ${} - I_{{}}$。提取的 ${} \sim 4{ dec}$ 和 $I_{60}$ 特性显示在 (G) 的插图中。(H 和 I) 几个 $100{ nm}$ 沟道 TFETs 的 $I_{{}} - V_{{g}}$ (H) 和 ${} - I_{{}}$ (I)，展现出最理想的电学性能。

在室温下，迟滞窗口 ($\Delta V_{g}$) 约为 20 mV。随着温度降低至 60 K，该窗口略有增加。这种迟滞主要源于电介质与沟道界面处的氧化物陷阱 (19, 36)。此外，在不同偏压下，迟滞窗口基本保持不变。总体而言，我们的器件在正向和反向转移特性曲线的宽开关电流区域内，SS 水平始终远低于玻尔兹曼极限，这证实了器件中主导的 BTBT 载流子传输机制。此外，在源-漏电流-电压曲线中观察到了负微分电阻 (NDR) (图 3A) (14, 37)。此外，我们研究了尺寸缩放对器件性能的影响 (图 3, F 和 G，以及图 S16)。沟道较短的晶体管其转移特性显示出向较低栅极开关电压的轻微偏移，同时具有更理想的 SS 特性和 $I_{60}$ 水平。我们将这些现象归因于短沟道中 InSe 更陡峭的能带弯曲斜率，从而增加了隧穿概率 (23, 38)。

尽管进一步激进地缩减器件尺寸可能会使 TFET 受到短沟道效应的负面影响，但我们的架构可以实现更灵活的优化过程 (38, 39)，例如在沟道上开发顶栅结构以抑制漏极诱导势垒降低效应，或使用高介电材料来增强栅极静电控制能力。关于后者，我们进行了一次集成转移工艺，在 $\mathrm{HfO}2$ 电介质平台上重建了 TFET，并观察到了类似的转移特性，且栅极开关电压有所降低 (图 S17A)。这一结果表明，我们的器件具有进一步降低栅极控制电压的潜力。相比之下，由非层状 3D Bi 和 2D InSe 异质结形成的晶体管没有表现出隧穿特性，其转移特性与 InSe MOSFET 相似 (图 S17, B 至 D)。值得注意的是，我们制造了多个沟道长度约为 100 nm 的 ，并获得了理想的高 $I{60}$ 值，最高可达 $\sim 10~\mu \mathrm{A}~\mu \mathrm{m}^{-1}$ (图 3, H 和 I)。总的来说，我们的 架构在实现持续尺寸缩小的同时，能够实现有效的功能缩减。

A

C

图 4. Bi / InSe 的亚玻尔兹曼极限性能与此前报道的架构的基准对比。我们将结果与此前报道的研究进行了对比 (12–16, 19, 23, 40–48)。(A) 本工作中的 InSe / Bi 与此前研究中几种其他代表性 的 SS 特性对比。(B 和 C) $I_{60}$ 与 $I_{60} / I_{OFF}$ 的关系 (B) 以及 $I_{60}$ 与沟道厚度的关系 (C)，将我们的 Bi / InSe 性能与其他典型 系列进行对比，显示本工作中 $I_{60}$ 和 $I_{60} / I_{OFF}$ 均达到了创纪录的高值。这两个面板中用红色标出了实现最佳性能的理想区域。(D) 基于各种结材料和系统的 性能中两个关键指标——SS\~4dec 和 $I_{60}$ ——的对比。本研究报道的 Bi / InSe 符合 IRDS 对实用晶体管亚玻尔兹曼极限性能的要求。

TFETs 的亚玻尔兹曼极限性能基准测试

为了与 MOSFET 竞争，未来的晶体管必须展现出更具吸引力的亚玻尔兹曼极限（sub-Boltzmann-limit）特性；关键参数包括 $I_{60}$、$I_{60} / I_{\mathrm{OFF}}$ 和 SS\~4dec。我们将本研究中的 Bi / InSe TFET 与其他代表性器件进行了对比，如图 4 和表 S3 所示。从每个器件中提取的 SS 随 $I_{\mathrm{DS}}$ 变化的特性曲线如图 4A 所示，上述关键参数在图 4B 至 D 中被进一步提取并对比 (12-16, 19, 23, 40-48)。通常，TFET 可以在低电压下可靠工作，并表现出远低于玻尔兹曼极限的较小 SS 值。尽管如此， 仍需进一步证明其在亚玻尔兹曼极限区域具有足够高的输出电流水平——即 $I_{60}$ 至少达到每微米几个微安培，这是确保低延迟和高扇出性能所必需的。此外，任何逻辑器件面临的一个共同且长期的挑战是同时实现高输出电流和高电流开关比。在 中，这一要求体现为实现 $>10^{6}$ 的 $I_{60} / I_{\mathrm{OFF}}$ 值，或远低于 60 mV decade $^{-1}$ 的 SS\~4dec。

据我们所知，此前报道的所有 尚未能完全满足 IRDS 的要求。传统的全 3D 在器件尺寸为数十纳米时，实现了接近可接受的 $I_{60}$。然而，漏极材料设计受限于 3D 外延的严苛要求，这阻碍了器件实现对于低功耗晶体管至关重要的高开关比。虽然 3D-2D 混合维度异质结提供了一个潜在的新平台，但很难找到能实现性能突破的源极材料。值得注意的是，尽管尺寸缩减可能会进一步增强器件性能，但本研究提出的基于 2D Bi 的高效隧道结，从器件物理的基础角度为高性能 提供了一个极具前景的解决方案。它同时满足了关键因素，包括：具有窄带隙和小 $m^{*}$ 的源极材料、具有增强静电可控性的沟道材料，以及由结构的 2D 特性和成功的原位制备技术所带来的洁净结界面。我们通过 PLD 生长的 / InSe 基 在未来的低功耗信息应用中也展现出了相当的电流开关能力（图 S18）。

结论

我们展示了基于 / InSe 异质结且具有前景的 ，其表现出极具吸引力的亚玻尔兹曼极限电学性能。这包括提升至 10 $\mu$ A $\mu$ m $^{-1}$ 的 $I_{60}$、约 10 $^{7}$ 的显著 $I_{60} / I_{\text{OFF}}$ 比，以及在 6 个数量级开关电流范围内保持的理想小 SS 值。我们基于 SS 物理学实现了材料和能带设计，并确定 2D 是最具前景的源端材料， / InSe 异质结构是构建高性能 的首选隧道结。此外，我们开发了一种具有高可控性和可靠性的原位自下而上沉积方法，用于在常规 $SiO_{2} / Si$ 衬底上系统地制备可扩展的 InSe 和 层。该工艺形成了界面普遍洁净的 2D 异质结构，有利于实现理想的 BTBT 性能。我们的 / InSe 沟道长度可低至 60 nm，明显领先于其他现有 架构，并能够满足实际应用的 IRDS 要求。值得注意的是，PLD 作为一种具有高良率的可控大规模制备方法，有望引领将 2D 材料晶体管集成到传统硅基电路中的发展。

参考文献与注释

1. S. Datta, W. Chakraborty, M. Radosavljevic, Science 378, 733–740 (2022).

2. W. Cao et al., Nature 620, 501–515 (2023).

3. IEEE, IRDS: International Roadmap for Devices and Systems, 2023 Update (2023); https: / irds.ieee.org / irds2023 / .

4. A. M. Ionescu, H. Riel, Nature 479, 329–337 (2011).

5. H. Lu, A. Seabaugh, IEEE J. Electron Devices Soc. 2, 44–49 (2014).

6. X. Li et al., in Beyond-CMOS Technologies for Next Generation Computer Design, R. O. Topaloglu, H.-S. P. Wong, Eds. (Springer, 2019), pp. 195–230.

7. D. E. Nikonov, I. A. Young, Proc. IEEE 101, 2498–2533 (2013).

8. A. Seabaugh et al., "Steep slope transistors: Tunnel FETs and beyond" in 2016 46th European Solid-State Device Research Conference (ESSDERC) (IEEE, 2016), pp. 349–351.

9. W. G. Vandenberghe et al., Appl. Phys. Lett. 102, 013510 (2013).

10. M. Saravanan, E. Parthasarathy, Microelectronics J. 114, 105102 (2021).

11. K. Tomioka, M. Yoshimura, T. Fukui, Steep-slope tunnel field-effect transistors using III–V nanowire / Si heterojunction in 2012 Symposium on VLSI Technology (VLSIT) (IEEE, 2012), pp. 47–48.

12. R. Gandhi, Z. Chen, N. Singh, K. Banerjee, S. Lee, IEEE Electron Device Lett. 32, 437–439 (2011).

13. C. Convertino et al., Nat. Electron. 4, 162–170 (2021).

14. Y. Shao et al., Nat. Electron. 8, 157–167 (2025).

15. D. Sarkar et al., Nature 526, 91–95 (2015).

16. J. Miao et al., Nat. Electron. 5, 744–751 (2022).

17. L. Britnell et al., Science 335, 947–950 (2012).

18. W. Cao et al., "Designing band-to-band tunneling field-effect transistors with 2D semiconductors for next-generation low-power VLSI" in 2015 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM) (IEEE, 2015), pp. 12.3.1–12.3.4.

19. S. Kim et al., Nat. Nanotechnol. 15, 203–206 (2020).

20. K. R. N. Karthik, C. K. Pandey, Silicon 15, 1–23 (2022).

21. A. S. Verhulst, W. G. Vandenberghe, K. Maex, G. Groeseneken, J. Appl. Phys. 104, 064514 (2008).

22. W. Cao, D. Sarkar, Y. Khatami, J. Kang, K. Banerjee, AIP Adv. 4, 067141 (2014).

23. S. Kanungo, G. Ahmad, P. Sahatiya, A. Mukhopadhyay, S. Chattopadhyay, npj 2D Mater. Appl. 6, 83 (2022).

24. G. Fiori et al., Nat. Nanotechnol. 9, 768–779 (2014).

25. A. Szabo et al., IEEE Trans. Electron Dev. 65, 4180–4187 (2018).

26. Z. Yang et al., ACS Nano 11, 4225–4236 (2017).

27. J. Jiang, L. Xu, C. Qiu, L. M. Peng, Nature 616, 470–475 (2023).

28. G. Iannaccone, F. Bonaccorso, L. Colombo, G. Fiori, Nat. Nanotechnol. 13, 183–191 (2018).

29. Z. Wu et al., Nat. Mater. 20, 1203–1209 (2021).

30. A. D. Franklin, Science 349, aab2750 (2015).

31. S. Zhang et al., Chem. Soc. Rev. 47, 982–1021 (2018).

32. C. A. Hoffman et al., Phys. Rev. B 48, 11431–11434 (1993).

33. Y. Liu, Y. Huang, X. Duan, Nature 567, 323–333 (2019).

34. Z. Yang, Z. Wu, Y. Lyu, J. Hao, InfoMat 1, 98–107 (2019).

35. S. Natarajan et al., "A 14nm logic technology featuring $2^{\text{nd}}$ -generation FinFET, air-gapped interconnects, self-aligned double patterning and a $0.0588 \mu \mathrm{m}^2$ SRAM cell size" in 2014 IEEE International Electron Devices Meeting (IEEE, 2014), pp. 3.7.1-3.7.3.

36. F. S. Neves et al., ECS Trans. 66, 179 (2015).

37. Q. Lv et al., Adv. Funct. Mater. 30, 1910713 (2020).

38. L. Liu, D. Mohata, S. Datta, IEEE Trans. Electron Dev. 59, 902–908 (2012).

39. N. D. Chien, C.-H. Shih, Microelectron. Reliab. 55, 31–37 (2015).

40. S. Kamaei et al., Nat. Electron. 6, 658–668 (2023).

41. T. Krishnamohan, D. Kim, S. Raghunathan, K. Saraswat, "Double-Gate Strained-Ge Heterostructure Tunneling FET (TFET) With record high drive currents and $<<60\mathrm{mV / dec}$ subthreshold slope" in 2008 IEEE International Electron Devices Meeting (IEEE, 2008), pp. 1-3.

42. N. Oliva et al., npj 2D Mater. Appl. 4, 5 (2020).

43. S. Kamaei et al., npj 2D Mater. Appl. 5, 76 (2021).

44. N. T. Duong et al., Nano Today 40, 101263 (2021).

45. A. Villalon 等，“具有记录级 $I_{ON}$ 的应变隧道 FET：首次演示具有 SiGe 通道和 RSD 的 ETSOI TFET” 载于 2012 年 VLSI 技术研讨会 (VLSIT) (IEEE, 2012), 第 49–50 页。

46. X. Zhao, A. Vardi, J. A. del Alamo, IEEE Electron Device Lett. 38, 855–858 (2017)。

47. G. Dewey 等，“用于陡峭亚阈值摆幅的 III–V 异质结隧道场效应晶体管 (H-TFET) 的制备、表征与物理特性” 载于 2011 年国际电子器件会议 (IEEE, 2011), 第 33.6.1–33.6.4 页。

48. K. Jeon 等，“具有新型硅化物源极和 46mV / dec 摆幅的硅隧道晶体管” 载于 2010 年 VLSI 技术研讨会 (IEEE, 2010), 第 121–122 页。

49. Z. Wu, 《表现超越玻尔兹曼热发射极限的隧道场效应晶体管》, V1 版本, PolyU 研究数据存储库 (2026)。

致谢

资助：本研究得到了香港研究资助局（GRF 编号 15304224 和 15307124，PolyU SRFS2122-5S02，以及 AoE / P-701 / 20）、香港理工大学项目（RCNN 1-CEOH）、科技部国家重点研发计划（项目编号 2022YFA1203804）、新加坡教育部（项目编号 A-8004854-00-00）以及新加坡国家研究基金会（NRF）教授席位（NRF-P2025-002）的资助。作者贡献：Z.W.、L.-J.L. 和 J.H. 构思了研究并监督了项目。Z.W. 和 Y.Z. 开发了合成技术并制备了样品。K.Y. 和 M.Y. 进行了 DFT 计算，Z.Y. 和 Y.S.A. 进行了 NEGF 模拟。W.W. 和 S.C. 进行了 TEM 和 EDS 实验。Z.W.、W.M. 和 Y.P. 制备了 TFET 器件并研究了其电学性能。Z.W.、F.Y.、R.D.、H.L. 和 J.W. 进行了其他材料表征，包括 XRD、XPS、UPS、扫描电子显微镜、EBSD、AFM、SKPM、拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱以及物理性质测量系统测量。Z.W.、K.Y.、W.M.、Y.S.A.、L.-J.L. 和 J.H. 共同进行了数据分析和讨论。Z.W.、L.-J.L. 和 J.H. 共同撰写了论文，所有作者均对其提出了修改意见。 竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：评估本文结论所需的所有数据以及材料合成的所有细节均在正文或补充材料 (49) 中提供。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

参考文献 (50–69)

材料与方法；补充文本；图 S1 至 S18；表 S1 至 S3；

提交日期 2025 年 3 月 20 日；重新提交日期 2026 年 4 月 26 日；接收日期 2026 年 7 月 8 日

热循环诱导的氮化提高了钛酸盐铁电薄膜的能量存储密度

Jiaojiao Yi $^{1}$ , Kangyu Zhong $^{1,2}$ , Chen Shen $^{3}$ , Yining Zhai $^{1}$ , Lu Sun $^{1}$ , Hongbin Zhang $^{3}$ , Zizheng Song $^{4}$ , Zibin Chen $^{4}$ , Dragan Damjanovic $^{5}$ , Jing-Feng Li $^{6}$ , Shujun Zhang $^{7,8,}$ , Lisha Liu $^{2,}$

提高电介质能量存储密度（$U_{e}$）需要最大化最大极化强度与剩余极化强度之间的差值（$\Delta P$）。提高 $\Delta P$ 仍然是一个根本性的挑战，因为现有的策略很少能同时实现高最大极化强度和低剩余极化强度。我们引入了一种合成后的处理方法——低温热循环，其中液氮渗透进薄膜，然后快速循环至 100℃。通过氧空位介导的氮杂化，该过程显著将氧化物铁电钛酸盐薄膜的 $\Delta P$ 提高至 105 $\mu C / cm^{2}$。利用这种方法，我们将 $U_{e}$ 提高至 261 $J / cm^{3}$，效率接近 80%。该方法广泛适用于厚度跨越纳米至微米级的多种薄膜材料，为克服 $\Delta P$ 和 $U_{e}$ 的关键瓶颈提供了一种简便且具有成本效益的途径。

基于电介质薄膜的静电电容器因其快速的充放电能力、超高功率密度和卓越的可靠性，已成为现代高功率电子设备（尤其是小型化设备）中的核心组件。然而，它们的能量存储密度通常远低于电化学能量存储技术。因此，迫切需要进行改进以克服阻碍其实际应用的局限性。电介质的可恢复能量存储密度 $U_{e}$ 和能量存储效率 $\eta$ 通常由 $U_{e} = \int_{P_{r}}^{P_{m}} EdP$ 和 $\eta = \int_{P_{r}}^{P_{m}} EdP / \int_{0}^{P_{m}} EdP$ 描述，其中 $P_{m}$ 和 $P_{r}$ 分别代表最大极化强度和剩余极化强度，E 是施加在电介质材料上的电场。在给定电场下，通过增强 $P_{m}$ 和抑制 $P_{r}$，即通过获得较大的可逆极化 $\Delta P = P_{m} - P_{r}$，可以实现最优的 $U_{e}$ 和 $\eta$ 性能。

高极化电介质薄膜因其较大的 $P_{m}$ 和较小的 $P_{r}$ 而成为电介质能量存储的有潜力的候选材料。迄今为止，增强这些薄膜的 $\Delta P$ 主要依赖于通过形成固溶体 (1, 2, 3, 4, 5, 6)、元素掺杂 (7, 8) 或增加系统构型熵 (9, 10) 的化学工程手段。通过此类方法实现的目前最先进的 $\Delta P$ 达到了 $\sim 75\ \mu C\ cm^{-2}$（图 1A）。这些增强源于化学异质性的增加，从而诱导局部极化各向异性，并且通常通过将畴尺寸减小至仅包含几个晶胞的极化团簇，导致磁滞现象受到抑制（低 $P_{r}$）。

在大多数情况下，通过化学工程实现的 $\Delta P$ 提升往往伴随着最大极化强度（$P_{m}$）的减弱，这可能是由于畴尺寸的减小降低了极化比例。Pan 等人此前报道，在超顺电的 Sm 掺杂 $BiFeO_{3}-BaTiO_{3}$ 薄膜中，极化纳米区域仅占体积的 15% (3)，这提供了一个代表性模型，解释了化学异质性如何导致 $P_{m}$ 以及随之而来的 $\Delta P$ 的降低。$P_{m}$ 的降低还可能与击穿强度（$E_{b}$）和极化率之间的反比关系有关 [$E_{b} = \varepsilon^{-0.65}$，其中 $\varepsilon$ 是反映极化率的介电常数 (11)]。增加的化学异质性通过增强电子散射提高了 $E_{b}$，但同时也降低了极化率，从而在相同的外加电场下降低了 $P_{m}$。因此，尽管目前已取得进展，但通过化学异质性增强 $\Delta P$ 似乎面临着不可避免的权衡 (12)（图 1A）。

最近，人们尝试通过结构工程来设计高 $\Delta P$，例如构建人工 $\mathrm{MoS}_2 / \mathrm{BaTiO}_3 / {MoS}_2$ 异质结构 (13)、${BiFeO_3 / SrTiO_3}$ 多层膜 (14)、(Ba, Sr) ${TiO_3 / Ba(Zr,Ti)O_3}$ 多层膜 (15) 或 (Hf, Zr) ${O}_2 / {Al}_2{O}_3$ 超晶格 (16)（图 1A）。这种方法可使 $\Delta P$ 高达 $52~\mu {Ccm}^{-2}$。尽管前景广阔，但此类方法涉及复杂的制造工艺，限制了其可扩展性。另一种值得注意的调节极化的方法是通过合成后处理手段，包括机械处理 (17) 和离子轰击 (18, 19)。后者通过离子轰击在 ${Pb(Mg,Nb)O_3 - PbTiO_3}$ 薄膜中引入缺陷，实现了高达 $80~\mu {Ccm}^{-2}$ 的高 $\Delta P$（图 1A）。该方法还被用于增强 (Hf, Zr) ${O}_2$ 薄膜的铁电性 (20)。然而，离子轰击通常效率较低且对表面敏感，给广泛应用带来了挑战。

我们引入了一种不同的策略——低温热循环（cryogenic thermal cycling, CTC），以将电介质薄膜中的 $P_{m}$、$\Delta P$ 和 $U_{e}$ 提升高达 $\sim50\%$。CTC 通过将材料多次循环地浸入液氮（$LN_{2}$）和热液体中，使低温冷却与快速加热交替进行（图 1A 和图 S1）。这种最近开发的方法已被用于调节金属玻璃中的结构异质性和能量状态以提高塑性 (21, 22)。在此，我们将 扩展到氧化物薄膜，其效果与在金属中观察到的效果截然不同。理论与实验相结合的工作表明，增强的 $P_{m}$、$\Delta P$ 和 $U_{e}$ 源于 期间引入的氮与特定 B 位阳离子之间定制的杂化，从而增强了阳离子的离心位移。这一过程特别由氧化物薄膜中预先存在的氧空位（$V_{O}^{\bullet\bullet}$）介导，氧空位充当了氮掺入的活性位点。作为一种具有成本效益且易于实施的方法， 在六种不同的薄膜体系中得到了验证，其厚度跨越纳米级到微米级，生长在包括硅、云母和 $SrTiO_{3}:Nb$ (NSTO) 在内的各种基底上。这些发现将 确立为一种提高极化率和储能性能的通用合成后路径，有可能重塑下一代电介质的设计格局。

通过 CTC 处理增强极化

我们引入了一种 CTC 策略以克服 $\Delta P$ 瓶颈，将其提高至最高 $105~\mu \mathrm{Ccm}^{-2}$（图 1A），超越了通过化学工程 (1-3, 5, 6, 9, 10)、超晶格构建 (13-16)、机械裁剪 (17) 和离子轰击 (18, 19) 所实现的先进数值。这种巨大的 $\Delta P$ 是在厚度约为 220 nm、含 Ti 过量的 $0.7\mathrm{Bi(Mg,Ti)}$ ${O_3 - 0.3(Sr,Bi)TiO_3}$ 薄膜（BMT-SBT-；成分详情见材料与方法）中实现的，该薄膜是通过在 Pt / Si 基底上进行化学溶液沉积 (CSD) 制备的。据报道，处于形态相界（morphotropic phase boundaries）的母体钙钛矿 (Mg,) ${O_3 - SrTiO_3}$ (BMT-ST) 和 (Mg,) ${O_3 - (Sr,)TiO_3}$ (BMT-SBT) 表现出超过 60 $\mu$ C cm $^{-2}$ 的高 $\Delta P$ (1, 23)，使其成为极具前景的 CTC 研究先进体系。

图 1. 用于极化增强的低温热循环 (CTC) 方法。(A) 增强电介质薄膜 $\Delta P$ 的策略，包括此前报道的化学工程、超晶格构建和离子轰击，以及本工作提出的 CTC 方法。BF, BiFeO ${3}$；BT, BaTiO ${3}$；ST, SrTiO ${3}$；BMT, (Mg, )O ${3}$；SBT, (Sr, )TiO ${3}$；HZO, HfO ${2}$ -ZrO ${2}$；BZT, Ba(Zr, )O ${3}$；BST, (Ba, Sr)TiO ${3}$；PZ, PbZrO ${3}$；PZT, Pb(Zr, )O ${3}$；PMN-PT, Pb(Mg, Nb)O ${3}$ -PbTiO ${3}$。所有 $\Delta P$ 值均在其各自的 $E{b}$ 下显示。(B) BMT-SBT- 薄膜在不同 CTC 条件下的 $\Delta P$。循环包括浸入 -196℃ 的液氮 (LN ${2}$)，随后浸入峰值温度为 50°、100°、150° 和 200℃ 的热液体中，而每个峰值温度的停留时间在 5 到 20 s 之间。循环次数固定为 5 次。(C) BMT-SBT- 薄膜的 $P{m}$ 和 $P_{r}$ 随固定条件下 CTC 处理循环次数的变化情况：温度跨度为 -196° 至 100℃，停留时间为 10 s。(D) 原始薄膜、CTC5 和 CTC30 薄膜在各自 $E_{b}$ 下的单极 P-E 滞后回线示例。 “CTC” 后的数字对应于冷却-加热循环次数，温度跨度为 -196° 至 100℃，停留时间为 10 s。CTC30 仅是一个示例，用于演示超过 5 次 CTC 循环后极化的下降，而其他循环次数样品的 P-E 回线可见图 S5。右侧的显微照片显示了原始、CTC5 和 CTC30 薄膜的表面 SEM 图像。绿色圆圈突出了 30 次重复 CTC 循环后产生的微孔。比例尺，500 nm。

在所研究的薄膜中，有意引入过量的 Ti 是为了抑制漏电流并增强 $E_{b}$，这一方法在之前的几项研究中已被采用 (1, 24, 25)。这种提升被归因于在小晶粒内部由密集位错或亚晶界限制而形成的超细畴，这些畴进一步被周围的非晶区域隔离 (1)。这些由于 Ti 过量而产生并适应其分布的微观结构特征，已通过 X 射线衍射 (XRD) 和扫描透射电子显微镜 (STEM) 分析得到确认（图 S2）。这些特征共同抑制了长程电荷载流子的迁移和电流传输，减轻了电场分布的不均匀性，从而增强了 BMT-SBT- 的 $E_{b}$，并在较大的 $E_{b}$ 下提高了 $P_{m}$ (1, 24)。尽管 BMT-SBT- 已经具有成分复杂性，但我们在此的主要关注点是 CTC 相对于原始状态所诱导的微观结构修改，而 过量的作用将在机理讨论中阐明。CTC 方法在增强更简单成分的 $\Delta P$ 和 $P_{m}$ 方面的更广泛适用性将在下文讨论。

我们研究了广泛的 参数（包括温差、循环次数和循环停留时间）对 BMT-SBT- 极化性能的影响。为了排除 诱导的电极处人为电荷积累，样品首先经过 处理，然后制备厚度约为 100-nm 的 Au 圆形顶电极，这些电极使用 100- $\mu$m 掩模制造，并针对每批测量进行了校准（见材料与方法及图 S3）。这种电极尺寸最大限度地降低了寄生电容的可能性，并减少了器件过早失效的风险，有利于研究其固有属性。

针对五次循环的 ，研究了从 $LN_{2}$ ( $-196^{\circ}C$ ) 到不同热液体以及停留时间的变化效果（图 1B 和图 S4）。当使用峰值温度约为 $100^{\circ}C$ 的热水时，$\Delta P$ 的增强最为显著，且最佳停留时间为 10 s（图 1B）。使用硅油可以获得 $>100^{}C$ 的峰值温度，但这种介质导致 $\Delta P$ 的增强程度降低（图 1B）。这可能是由于其高粘度阻碍了随后薄膜与 $LN_{2}$ 的稳定接触，详见机理部分的进一步讨论。在 $-196^{}$ 至 $100^{}C$ 的固定温差和 10 s 停留时间下，评估了循环次数的影响（图 1℃ 和图 S5）。对于 BMT-SBT-，经过 >20 次实验重复验证，$P_{m}$ 值在五次循环时达到最大值。

当 循环次数超过 5 次时，$P_{m}$ 不再进一步增强，反而下降到与原始薄膜相当甚至更低的水平，如图 1℃ 中的红色水平虚线所示。相比之下，$P_{r}$ 虽然也受到影响，但无论循环次数如何都保持在较低水平，从而在五次 循环时产生峰值 $\Delta P$。为了直接可视化极化行为，图 1D 展示了原始薄膜、CTC5（5 次循环）和 CTC30（30 次循环）薄膜的极化-电场 (P-E) 滞后回线的一个象限。此处引入 CTC30 仅作为代表性示例，用以说明超过五次 最佳循环后的极化响应。经过最佳 处理后，在 $E_{b}$ 约为 $6.4\ MV\ cm^{-1}$ 时，$P_{m}$ 从 75 增加到最高约 $115\ \mu C\ cm^{-2}$，而 $P_{r}$ 从 7.5 轻微上升到

$\sim10.1\ \mu C\ cm^{-2}$。这些变化导致 $\Delta P$ 从 68 大幅增加到 $105\ \mu C\ cm^{-2}$。

我们研究了 CTC 条件如何影响极化增强。五个循环之后 $P_{m}$ 的下降可能主要源于重复冷热循环导致的宏观薄膜退化。在 CTC5 中导致极化增强的微观改性在循环次数更高的薄膜中同样存在（以 CTC30 为例，见最后一部分）。具体而言，CTC30 中增加的循环次数产生了更高密度的“呼吸微孔”，这由表面扫描电子显微镜 (SEM) 形貌（图 1D，右）和 STEM 成像（图 S6）所证明。这些微孔略微降低了 CTC30 的击穿强度（图 1D），并且，如频率和温度依赖的介电谱（图 S7）所示，还降低了其介电常数 ($\varepsilon_{r}$)。我们将这些降低归因于重复冷热循环后，呼吸微孔浓度增加对介电常数的贡献。相比之下，CTC5 显著增强的极化能力伴随着 $\varepsilon_{r}$ 的大幅增加。介电谱还证实了 BMT-SBT-Ti 薄膜中极化的无序特性，这与观察到的狭窄 P-E 滞后回线一致，并进一步证明了它们适用于能量存储应用。

A

B

E

G

F

储能性能

在相同的 $E_{\mathrm{b}}$ 下，观察到 CTC5 薄膜的 $P_{\mathrm{m}}$ 和 $\Delta P$ 较薄膜的原始状态均实现了约 50% 的最佳增长，这表明储能性能得到了显著提升。研究人员测量了原始 BMT-ST-Ti 薄膜和 CTC5 BMT-ST-Ti 薄膜在最高至 $E_{{b}}$ 时的电场依赖性 $P - E$ 滞后回线（图 S8）。根据 $P - E$ 回线计算出的 $U_{{e}}$ 和 $\eta$ 随电场变化的关系表明，与未经处理的制备薄膜相比，CTC5 薄膜表现出更好的性能，并在相同的 $E_{{b}} = 6.4{MVcm}^{-1}$ 下实现了 $\sim 261~{Jcm}^{-3}$ 的最大 $U_{{e}}$，较未经处理的原始状态增加了 $53\%$（图 2, A 和 B）。值得注意的是，由于 CTC 处理后 $P - E$ 回线依然保持类似的纤细形状，因此大致保留了较高的效率（ $\sim 79\%$ ）。这些 $U_{{e}}$ 和 $\eta$ 值对应于 CTC 处理薄膜的品质因数 $U_{{F}} = U_{{e}} / (1 - \eta) = 1240$，较原始值的 $\sim 860$ 提升了 $44\%$（图 2, A 和 B）。其 $U_{{e}}$ 以及卓越的 $U_{{F}}$ 和 $P_{{m}}$ 值均超过了已报道的最先进电介质薄膜的值（图 2℃ 和图 S9）(1-4, 9, 10, 13, 16-18, 26, 27)。

值得注意的是，原始薄膜和 CTC5 薄膜的 $E_{b}$ 基本保持一致。为了获得更全面的评估，我们利用 Weibull 分布拟合对 10 批薄膜的 $E_{b}$ 进行了统计分析。原始薄膜和 CTC5 薄膜表现出相当的 Weibull 模数（ $\beta = 40$ 和 42, 图 2D），表明其击穿特性相似。这种相似性归因于它们在最高至 $E = 3$ MV cm $^{-1}$ 的直流电场下具有几乎相同的电阻，量级在 $10^{10}$ Ω（图 2E）。

C

H

图 2. CTC5 BMT-ST-Ti 薄膜相对于其原始状态的卓越储能特性（温度范围 $-196^{\circ}$ 至 $100^{\circ}C$，五个循环，且停留时间为 10 秒）。经其他 处理条件处理的薄膜之 $U_{e}$ 值可见图 S4 和 S5。(A) 这些薄膜的 $U_{e}$ 和 $\eta$ 随施加电场（最高至 $E_{b}$）的变化关系。所测量的薄膜组在 处理前后表现出相同的 $E_{b}$。(B) 未经处理的原始薄膜与 处理薄膜在相同 $E_{b} = 6.4 MV cm^{-1}$ 下的 $P_{m}, U_{e}, U_{F}$ 和 $\eta$ 对比。(C) 处理的 BMT-SBT-Ti 薄膜与最先进薄膜的储能性能对比，包括通过化学改性、超晶格构建、离子轰击和机械处理实现的薄膜。(D) 对 1 个多个样本位置的 $E_{b}$ 进行的两参数 Weibull 分布分析，表明 处理后薄膜的击穿行为在统计上变化极小。(E) 电阻随施加电场的变化关系。(F) 放电能量密度随时间的变化关系，以及在 $10 k\Omega$ 负载电阻下的提取放电速率时间。(G) 所研究薄膜在 $1.8 MV cm^{-1}$ 电场下，储能性能随充放电循环次数的变化关系。原始薄膜可承受 $10^{6}$ 次循环，而 处理的薄膜可承受高达 $10^{7}$ 次循环。(H) 所研究薄膜在 $1.8 MV cm^{-1}$ 电场下随温度变化的储能性能。

我们还使用 10 kΩ 的负载电阻测量了过阻尼放电（图 2F）。在薄膜测量中使用这种中等尺寸的电阻是为了将放电电流限制在毫安范围内，以保护器件免受损坏，并将放电时间常数 ($\tau$) 设置在微秒量级，从而能够对存储能量进行可靠的时间分辨积分 (28)。CTC5 薄膜表现出 $\sim$ $150~J~cm^{-3}$ 的放电能量密度 ($W_{D}$)，这比其原始状态提高了 48%。原始薄膜和 CTC5 薄膜均表现出相似且快速的放电速率 ($\tau_{0.9}$)，约为 $\sim3~\mu s$，揭示了良好的充放电性能，使其成为脉冲功率应用的极具潜力的候选材料。

能量存储性能的可靠性和稳定性还通过在 $ $1.8 \, MV cm^{-1}$ 电场下的加速充放电测试进行了评估，该电场处于实际应用通常相关的范围内。我们观察到，原始薄膜在 $10^{6}$ 次循环后发生击穿，而 CTC5 薄膜则表现出数量级上的提升，可达 $10^{7}$ 次循环（图 2G 和图 S10）。我们还研究了薄膜在 $ $25^{\circ}$ 至 $ $150^{\circ}C$ 温度范围内的热稳定性（图 2H 和图 S11）。CTC5 薄膜在 $U_{e}$ 上的波动约为 $\sim6\%$，在 $\eta$ 上的波动约为 $\sim0.5\%$，明显优于未处理薄膜分别对应的 15% 和 3%。这种卓越的温度稳定性使薄膜即使在高温条件下也能高效运行。这些结果表明，无论使用何种测量方法，CTC5 薄膜始终表现出增强的能量存储密度。

CTC 策略在其他材料中的应用

我们测试了 CTC 方法在有效增强多种铁电薄膜极化强度或能量存储密度方面的广泛适用性，这些薄膜具有不同的厚度（从亚微米到微米量级）和基底类型（Si、云母和 NSTO）。在停留时间固定为 10 s 的情况下，最佳 CTC 循环次数在 3 到 10 之间变化，且取决于材料体系和厚度。首先，通过 CSD 方法制备了具有狭窄 P-E 滞后回线的铁电薄膜，包括 BMT、BMT-SBT、(Bi, La)FeO ${3}$ -PbTiO ${3}$ (BLF-PT) 和 BMT-SBT-Ti。所有体系在经过 CTC 处理后，$U_{e}$ 均有所增强，提升幅度在 37 到 53% 之间（图 3A 和图 S12）。

我们通过在不同基底（包括 Pt / Si、[001] $\mathrm{LaNiO_3 / mica}$ 和 [001] NSTO）上沉积厚度在 150 到 $310~\mathrm{nm}$ 之间的 BMT-SBT-Ti 和 BLF-PT 薄膜，研究了基底约束和热膨胀失配的影响（图 3B 和图 S13 至 S17）。选择云母是因为它可以被减薄至 $10~{\mu\mathrm{m}}$ 作为支撑基底，而 和 Si 的厚度为 $0.5\mathrm{mm}$。选择 是因为与其它典型钙钛矿相比，其热膨胀系数较大，而 Si 和云母的数值较小（详见材料与方法部分及图 S18）。

经过 CTC 处理后，BMT-SBT-Ti 薄膜在 上表现出 38% 的 $U_{e}$ 增强，在 Si 上为 53%，在云母上为 44%（图 3B）。值得注意的是，云母上的基底解钳位或 较大的热膨胀并未进一步提高增强比例，这表明 CTC 机制在很大程度上对这些宏观基底效应不敏感。我们将 CTC 方法扩展到传统的铁电薄膜，包括沉积在 Si 或 [001] LaNiO ${3}$ / mica 基底上的 Pb(Zr,Ti)O ${3}$ (PZT) 和 PT，薄膜厚度增加至 $\sim800$ nm（图 S19）。这些薄膜在 CTC 处理后同样表现出 $P_{m}$ 的增强，提升比例高达 51%（图 S20 和 S21）。然而，正如预期的那样，由于 $P_{r}$ 较大，PZT 和 PT 不适用于能量存储。

机理探讨

这些结果的结合使得能够系统地排除导致性能增强的不太可能的机理。首先，它们排除了化学异质性是导致 CTC 诱导 $P_{m}$ 增强的主导因素。例如，传统的铁电体（如 PT）可以表现出高达 51% 的 $P_{m}$ 增强，尽管其在晶粒尺寸、畴尺寸以及 A 位和 B 位阳离子配置方面与高度可极化的无序 BMT-BT-Ti 薄膜截然不同。虽然增强的幅度在不同材料体系中可能有所不同，但它与成分复杂性之间没有必然的相关性。尽管如此，化学无序抑制了 $P_{r}$，但实现了较大的极化率（即高 $P_{m}$），这有利于能量存储。其次，热应力效应被排除在主要贡献因素之外。在各种基底上，结构和化学性质迥异的体系在性能提升方面观察到的差异极小，尽管在循环热胀冷缩过程中，薄膜内部或薄膜-基底界面可能会产生巨大的原位热应力。这一结论得到了 CTC 处理后 XRD 图谱中峰位置几乎没有变化（图 S22）的进一步支持，这表明残余应力水平可以忽略不计。

此外，在没有与 $LN_{2}$ 和热水直接接触的情况下，单凭 $\Delta T$ 无法解释极化增强。对 BMT-SBT-Ti 薄膜进行 CTC 处理，但用 20-$\mu$m 铂箔或特氟龙胶带包裹以隔离单凭 $\Delta T$ 的影响，结果显示 $P_{m}$ 没有变化（图 3℃），仅存在微小的样本间差异。为了排除由屏障层引入的可能的热滞后效应，我们延长了停留时间，尽管预计热传递延迟仅在微秒量级。$P_{m}$ 保持不变排除了仅由热循环诱导的微观结构修改（如果存在的话）作为主要来源。因此，该机理与 $LN_{2}$ 和热液体的直接接触密切相关。为了进一步确定它们各自的作用，我们进行了 2 项额外的对比研究：(i) 使用 100℃ 的热板代替热水，在 CTC 方案下未能诱导 $P_{m}$ 增强（图 S23）；(ii) 尽管硅油的高粘度导致如前所述的有效性不稳定，但更大规模的测量仍显示，在 $LN_{2}$ 与 100℃ 硅油之间进行 CTC 后，$P_{m}$ 增加了 32% 至 37%，$U_{e}$ 增加了 33% 至 48%（图 S24），这与使用热水取得的结果大致相当。这些结果表明，无论其类型如何，热液体都是不可或缺的；它的主要功能是作为物理屏障，抑制 $N_{2}$ 气体从微孔中逸出，而不是参与任何化学过程。同时，最近的研究表明，氮的掺入可以增强氧化物铁电体（即 $BaTiO_{3-\delta}N_{\delta}$）的极化，其中氮对氧的部分取代 (29) 导致极化增强，这归因于更强的 Ti-N 键合（相对于 Ti-O）以及随之而来的 Ti 位移的增强。这提出了 3 个关键问题：在 CTC 方案下，氮是如何促使极化增加的。

[...OMITTED...]

为了研究氮在 CTC 诱导的极化增强中所起的作用，我们首先检查了薄膜的微观结构，以评估 $\mathrm{LN}{2}$ 和水的渗透情况。在重复 CTC 处理后，在薄膜表面和薄膜内部观察到“呼吸微孔”浓度增加（图 1D 和图 S6），这表明 $\mathrm{LN}{2}$ 和水渗透进了 CSD 沉积的薄膜中。根据二维投影 STEM 图像（图 S6）推断，并如图 S25 所示，渗透路径可能由微孔、微裂纹、非晶区域、晶界或亚晶界、位错以及畴壁组成。我们使用含有重离子的追踪溶液（具体为 ${Pb(NO_{3}){2}}$）验证了液体渗透。图 3D 及其插图显示，在将样品浸入 ${Pb(NO{3}){2}}$ 后，薄膜内部追踪到了 ${Pb}^{2+}$ 离子（详见材料与方法以及图 S26），证实了离子物种可以穿透薄膜。值得注意的是，在低温停留期间，渗透必须在 ${N}{2}$ 分子的摄入中占据主导地位，因为在该温度下的扩散被强烈抑制。对所研究的薄膜（包括 BMT、BMT-SBT、BMT-SBT-Ti、PZT 和 PT）的相对密度 $(\rho_{{r}})$ 进行精确的实验量化具有挑战性，特别是考虑到它们的厚度超过 100 nm 且表面粗糙度在数十纳米以上。尽管如此，在这些不同系统中观察到的极化增强（有时增强程度相同，如上所述）表明，${LN}{2}$ 渗透进这些薄膜是一个稳健且可靠的过程，即使 $\rho{r}$ 可能因（亚）晶界、微裂纹、位错或非晶区域的不同比例而有所不同。支持这一观点的是，最近的一项研究还表明，硫脲溶液可以渗透进 80-nm 的脉冲激光沉积外延 ${BiFeO}{3}$ 薄膜中 (30)，极有可能是通过微裂纹或畴壁。值得注意的是，伴随 CTC 过程的热冲击也可能产生用于溶液渗透的微裂纹。总的来说，这些结果表明，一旦达到某个阈值，溶液渗透就不太可能是 CTC 过程中的限制因素，因为所有材料的 $\rho{r} < 100\%$ 总是意味着存在可进入的渗透路径。

D 低温停留：${LN}_2$ 渗透

B 基底

C 仅 $\Delta T$

E 热液体停留：Ti-N 杂化

G Ti-N 杂化：存在 $V_{0}^{\bullet\bullet}$

F Ti-N 杂化：不存在 $V_{0}^{\bullet\bullet}$

H

图 3. CTC 策略的广泛适用性以及极化增强背后的氮杂化作用。(A) BMT、BMT-SBT、BLF-PT 和 -SBT-Ti 薄膜在 CTC 处理前后的 $U_{\mathrm{e}}$。(B) 在硅、云母和 NSTO 基底上生长的经 处理的 --Ti 薄膜的 $U_{\mathrm{e}}$ 增强情况。(C) -- 薄膜的 $P / P_0$，其中 $P$ 和 $P_0$ 分别表示 处理后的最大极化强度和原始状态的极化强度。 处理采用了 $20 - \mu {m}$ 铂 (Pt) 箔或特氟龙 (Teflon) 胶带屏障。铝 (Al) 箔包裹的不同标记类型表示在相同条件下不同的实验批次。(D) 将薄膜浸入 ${Pb(NO_3)2}$ 追踪溶液后，${Pb}^{2+}$ 渗入原始 -- 薄膜内部的元素分析。绿色表示渗透到整个薄膜体相中的 Pb 信号。(E) 原始 -- 薄膜的 EPR 光谱。（插图）${}^{3+}$ 与 $\mathbf{N}_2$ 通过 $\sigma$ 给电子和 $\pi$ 反馈电子进行配位的示意图。(F 和 G) 在存在和不存在预先存在的 $V_0^{\bullet \bullet}$（作为活性反应位点）的情况下，DFT 计算的 -N 杂化 $E{{a}}$。插图显示了初始状态和最终状态下完全弛豫的 结构。(H) 模拟 晶胞的 $(P - P_0) / P_0$，其中 $P$ 和 $P_0$ 分别是计算出的有和没有 -N 杂化的极化强度。每个彩色点代表 32 种单 -N 或 28 种双 -N 配置中一个独特结构的极化强度（详见材料与方法以及图 S26）。黑色实线和白色虚线分别表示中位数和平均值。红色和蓝色阴影框表示数据的中间 $50\%$。

接下来，我们考虑了渗入物种与薄膜基质之间的化学相互作用。原始薄膜中 ${}^{3+}$ 的存在起到了至关重要的作用，正如之前的研究 (25, 31) 所暗示，这可能与大量的 过量有关。电子顺磁共振 (EPR, 图 3E) 证实了在制备的 -- 薄膜中存在 ${}^{3+}$（具有部分占据的 d 轨道）以及钛酸盐中通常相关的 $V_{O}^{\bullet\bullet}$。具有部分占据 d 轨道的过渡金属中心，如 ${Fe}^{2+}$、${}^{3+}$、${Mn}^{2+}$ 和 ${Mo}^{3+}$，在环境条件下可以通过协同的 $\sigma$ 给电子和 $\pi$ 反馈电子来配位 ${N}\equiv{N}$ (32, 33)。具体而言，${}^{3+}$ 可以通过 ${N}{2}$ 2p 轨道向可用的 ${}^{3+}$ 3d 轨道的 $\sigma$ 给电子，以及从部分占据的 ${}^{3+}$ 3d 向 ${N}{2}$ 反键轨道的 $\pi$ 反馈电子与 ${N}{2}$ 配位（图 3E，插图）。Shima 等人的一项化学研究通过实验证明，三核钛多氢化物配合物中的多 位点可以在环境温度和压力下成功地使 ${N}{2}$ 分离 (34)。因此，我们薄膜内部表面的 ${}^{3+}$ 位点可以作为渗入氮物种的配位中心。这种类催化配位预计将促进 ${N}{2}$ 的活化，从而促进随后的 -N 杂化，这得到了最后一部分所呈现的实验证据的支持。关键在于，热停留步骤对于该化学反应是不可或缺的。一项对比研究显示，将 -- 薄膜浸入 ${LN}{2}$ 长达 2 小时，但随后没有在热水中停留，结果极化强度变化微乎其微（图 S27），这证实了仅靠低温暴露不足以驱动此类化学反应。

进一步采用密度泛函理论 (DFT) 结合爬坡图像微推弹性带 (CI-NEB) 方法，以验证 Ti-N 杂化位点，特别是那些与共存的 $Ti^{3+}$ 和 $V_{O}^{\bullet\bullet}$ 相关的位点。为了简化结构，模拟采用了包含 30 个原子的 R 相 BMT 晶胞，这并未影响结论的有效性。我们在下文中证明，CTC 过程本身并未产生额外的 $V_{O}^{\}$；然而，预先存在的 $V_{O}^{\}$ 在促进模型结构内 -N 杂化方面起到了关键作用。CI-NEB 结果显示，当预先存在的 $V_{O}^{\}$ 作为反应位点时，-N 杂化的活化能 ($E_{a}$) 从 4.60 eV (图 3F) 急剧下降至 1.47 eV (图 3G)。值得注意的是，在无 $V_{O}^{\}$ 的模型中，最终状态的能量高于初始状态，表明在这种条件下 -N 杂化在能量上是不利的 (图 3F)。所有模型结构首先经过能量最小化，然后完全弛豫（见材料与方法），初始氮物种为分子 $N_{2}$。

尽管自由 N≡N 的热力学键离解能可能达到 $\sim 9.75$ eV (35)，但 $N_{2}$ 活化在 CTC 过程中的机制与孤立 $N_{2}$ 的断裂有本质区别。除了 CI-NEB 计算揭示的缺陷辅助路径外，$N_{2}$ 的活化可能还受到上述 $^{3+}-N_{2}$ 配位的进一步促进 (34)，以及与热冲击相关的效应，包括局部 $N_{2}$ 加压和集中在内表面的机械能。在机械球磨形成 $TiO_{0.5}N$ 的过程中，也报道过类似的机械辅助氮活化 (36)。这些类催化配位和热冲击效应通过提供克服活化能所需的能量来促进反应，从而使 -N 杂化能够在 100℃ 下在数十秒内实现。我们进一步考察了其他氮基介质作为低温试剂的可能性，包括 $NH_{3}\cdot H_{2}O$ 和尿素水溶液 (图 S28)。结果未观察到 $P_{m}$ 的有效增强，这可能归因于它们与过渡金属中心的配位特性不同，且由于其各自的冰点分别为 −49℃ 和 −11℃，其热冲击效应要弱得多（详见图 S28）。这些结果进一步支持了以下观点：$-N_{2}$ 配位和强热冲击（包括局部 $N_{2}$ 加压以及热膨胀过程中微孔和通道体积变化产生的机械能）对于在 CTC 过程中激活 -N 杂化同样至关重要。

随后，利用 DFT 计算评估了 -N 杂化对极化的影响。研究人员检查了具有不同相对能量且含有不等价氮 (即 $V_{O}^{\}$) 位点的多种晶体配置（见材料与方法及图 S29）。如图 3H 所示，在 30 个原子的 BMT 晶胞中，由预先存在的 $V_{O}^{\}$ 介导的 2 个 -N 杂化（对应于 $\sim 1.7$ 原子 % (at %) 的理论氮吸收量）导致计算极化值的中位数增加了 $\sim 50\%$。这种增强源于电子局域化中更大的不对称性以及由此产生的局部偶极矩增强 (图 S29)。值得注意的是，将氮杂化量降低到每个晶胞 1 个 -N (薄膜中氮含量为 0.8 at %)，也会导致类似的增加 (图 3H)，这表明即使是少量的 -N 杂化（与典型的 $V_{O}^{\}$ 浓度相当或低于该浓度 (37, 38)），也能有效提高钛酸盐的整体极化。

体相氮杂化证据

为了实验验证氧化物薄膜体相内的氮杂化，我们首先进行了深度分辨 X 射线光电子能谱（XPS）分析（图 4A 插图）。图 4A 中的剖面图显示了 N 1s 从表面向薄膜体相演变的过程，采样步长约为 $ 20$ nm，从而提供了具有表面和体相代表性的信息。为了进行对比，我们对原始薄膜、CTC5 和 CTC30 BMT-SBT-Ti 薄膜进行了测量。在 CTC 处理后观察到了氮化效应，其证据是出现了明显的 N 1s 峰（图 4A）。三个关键观察结果为：(i) 在薄膜表面，中心位于 $\sim$ $ 399.5$ eV 的 N 1s 峰被归属为化学吸附的分子 $\text{N}_2$；(ii) 在表面下方，N 1s 峰移至 $\sim$ $ 397.5$ eV，表明存在化学键合的氮，而 $\sim$ $ 399$ eV 以上可忽略不计的强度表明薄膜内部不存在（或极少存在）化学吸附的 $\text{N}_2$ (29, 39–43)；(iii) CTC5 和 CTC30 薄膜中均有显著的 N 1s 信号，这表明 CTC5 之后极化强度的下降并非由于 Ti-N 反应的差异所致，这与此前显示的宏观结果一致。

利用此前报道的灵敏度因子法 (44)，根据 XPS 数据（图 S30），估计 CTC 处理后薄膜体相内的氮浓度约为 $0.6$ at $\%$。该氮水平大致对应于每个晶胞一个 -N 键，与我们 DFT 计算中验证的结果相当。值得注意的是，一项关于 $\mathrm{BaTiO_{3 - \delta}N_{\delta}}$ 中 O 位被 N 取代的先前研究报道，在 $\sim 7\%$ N 取代时极化强度增加 $167\%$，在 $< 1\%$ N 取代时增加 $\sim 43\%$（根据其报道的 XPS 估算）(29)。低取代区间与我们关于极化增强幅度的发现非常一致。

深度分辨飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）进一步证实了薄膜体相内均匀的 -N 杂化。与原始薄膜（观察到强 $TiO_{x}^{-}$ 信号且 $TiN_{x}^{-}$ 信号可忽略不计）形成鲜明对比的是，在 CTC5 和 CTC30 薄膜的整个体相中均检测到了 $TiO_{x}^{-}$ 和 $TiN_{x}^{-}$ 化学碎片（图 4B）。这一结果明确揭示了氮与钛之间的化学键合。图 4℃ 对比了包含 $TiO_{x}^{-}$、$TiO_{2}^{-}$、$TiN_{x}^{-}$ 和 $TiN_{2}^{-}$ 在内的含钛碎片的归一化强度。CTC5 和 CTC30 薄膜中基于 O 的 碎片与基于 N 的 碎片之间的强度比（$I_{TiO_{x}^{-}} / I_{TiN_{x}^{-}}$）分别为 38 和 32。鉴于六方 BMT-SBT- 晶胞包含 36 个 B-X 键，该比例大约对应于每个晶胞一个 -N 键，与基于 XPS 的定量分析和 DFT 预测高度一致。在任何薄膜中均未观察到 $TiN_{2}^{-}$ 化学碎片（图 4℃），这可能是由于其产率较低。然而，结合 XPS 在薄膜内部未发现 $\sim$ $ 399$ eV N 1s 峰的结果，这些结果表明薄膜内部不存在分子 $\text{N}2$。值得注意的是，另一个 B 位阳离子 Mg 具有 2s 轨道，预计不会与氮发生相互作用，这一点已由微量的 $MgN{x}^{-}$ 信号验证（TOF-SIMS 测量中所有其他化学碎片的归一化强度见图 S31）。

接下来，我们通过实验研究薄膜内部 Ti-N 杂化发生的具体位置，特别强调其与共存的 $Ti^{3+}$ 和 $V_{O}^{\bullet\bullet}$ 之间的相关性，DFT 计算表明这两者至关重要。在原子水平上直接可视化氮和 $V_{O}^{\bullet\bullet}$ 具有挑战性。氮尤其难以通过 STEM 等电子成像技术与氧区分开，且其在样本中预期的非周期性掺入进一步增加了直接识别的难度。因此，我们通过对生长在 NSTO 和 Si 基底上的 BMT-SBT- 横截面薄片进行体敏感 STEM 电子能量损失谱（STEM-EELS）分析来推断该过程（图 4D）。由于 BMT-SBT- 中的 Bi、Sr 和 Mg 的价态基本保持稳定，我们的分析重点在于 （多价态）和阴离子亚晶格。在 $L_{2}$ 和 $L_{3}$ 边，峰值分裂为低能 $t_{2g}$ 和高能 $e_{g}$ 分量，分别对应于 2p 向未占据的 3d_ $t_{2g}$ 和 3d_ $e_{g}$ 态的跃迁（图 4D，左）。携带一个额外 3d $^{1}$ 电子的 $^{3+}$ 优先占据低能 $t_{2g}$ 态，从而抑制了 $t_{2g}$ 的强度。

相应地，CTC 处理后 $t_{2g}$ 峰强度的增加反映了未占据 $t_{2g}$ 态数量的增多，这表明较低的

B

C

D

图 4. BMT-SBT- 氧化物薄膜中氮杂化的实验证据。(A) 深度分辨 XPS 光谱，显示原始薄膜、CTC5 和 CTC30 薄膜中的氮信号。CTC 处理在 $-196^{\circ}$ 至 $100^{\circ}\mathrm{C}$ 的温度范围内进行，5 次和 30 次循环的停留时间均为 10 秒。(B) 深度分辨 TOF-SIMS 光谱，检测原始薄膜、CTC5 和 CTC30 薄膜中的不同化学碎片。(C) TOF-SIMS 光谱中基于 的化学碎片的归一化强度。(D) 生长在 Si 和 NSTO 基底上的原始薄膜、CTC5 和 CTC30 薄膜的钛 L 边和氧 K 边的 STEM-EELS 线扫描图。(E) 钛 $t_{2g} / e_g$ 和氧 $a / b$ 峰强度比的定量分析。(F) 不同合成后处理的 BMT-SBT- 薄膜 EPR 光谱中提取的 $g \sim 2.003$ 峰强度。插图显示相应的 EPR 曲线，颜色代码相同。

薄膜中 $\text{Ti}^{3+}$ 浓度的降低以及平均 Ti 价态向 $\text{}^{4+}$ 的增加（45），如图 4E（顶部）所示。这种向 ${}^{4+}$ 的氧化意味着 周围的八面体配位更加完整，在我们的案例中，这最可能是通过 -N 键合而非氧填充实现的，这与 XPS 和 TOF-SIMS 中观察到的 -N 特征一致。因此我们推断，尺寸与氧相当的氮占据了预先存在的 $V_{O}^{\bullet\bullet}$，且 ${N}_{2}$ 以一种能量有利的方式锚定在这些空位附近。这一发现也解释了这些薄膜中 -N 杂化浓度相对较低（$\sim 0.6{ at \%}$）的原因。尽管如此，这些 -N 杂化增强了 STEM-HAADF（高角环形暗场）图像（图 S32）中观察到的局部 离心位移，这与我们的 DFT 结果一致。

转向氧 K 边，EELS 线扫描分析显示，与原始状态相比，CTC 处理后 $V_{O}^{\}$ 浓度没有可测量的增加，这一结论基于前边峰双峰 a（$\sim 534{ eV}$）和 b（$\sim 538{ eV}$），它们分别对应于 O 1s 向未占据的 O 2p- 3d_ $t_{2g}$ 和 O 2p- 3d_ $e_{g}$ 杂化轨道的跃迁（图 4D，右侧）。根据之前的报道（20, 46, 47），a 峰相对于 b 峰强度的增加将反映 $V_{O}^{\}$ 浓度的降低。然而，我们在每个样本的 5 个以上独立 EELS 线扫描中统计观察到 a / b 比率没有明显变化（图 4E，底部），表明氧状态稳定，CTC 处理引入的额外 $V_{O}^{\}$ 可以忽略不计。这一结果支持了以下结论：我们样本中 $V_{O}^{\}$ 的拓扑消除（与 ${}^{4+}$ 浓度增加相关）并非通过氧填充实现。

这一推论得到了 EPR 光谱的进一步支持，光谱显示原始样本和 CTC 处理样本中 $g \sim 2.003$ 信号的强度相当（图 4F）。值得注意的是，$V_{O}^{\}$ 的形成（$O_{O}^{\times} \rightarrow V_{O}^{\} + 1 / 2{O}{2} + 2e^{\prime}$）和在 $V{O}^{\}$ 位点上的氮掺入（${N}{2} + 2V{O}^{\} + 4e^{\prime} \rightarrow 2{N}'{O} + 2h^{\prime}$）都能产生贡献于相似 EPR 特征的顺磁中心。因此，未改变的 $g \sim 2.003$ 强度支持了这样一个假设，即 CTC 没有显著增加整体 $V{O}^{\}$ 数量，而是氮优先占据了预先存在的空位点。相比之下，在 $\$400^{\circ}{C}$ 下用 ${N}{2}$ 和 ${O}{2}$ 对薄膜退火 20 分钟明显改变了 $g \sim 2.003$ 的强度（图 4F），分别反映了 $V_{O}^{\}$ 浓度的相应增加和减少。随着缺陷通过气氛退火得到调节，还观察到了 2 点。第一，仅由缺陷能级产生的影响对极化作用有限，$P_{m}$ 的变化 $<6\%$（图 S33），证实了 CTC 诱导的增强并非简单地是缺陷操纵的结果，而是源于 -N 杂化的特定形成。第二，对具有调控空位浓度的薄膜进行随后的 CTC 处理导致观察到的极化增强比发生变化（图 S34），证实了 CTC 过程中存在 1 个由氧空位介导的氮化过程。

理论与实验的综合证据共同得出了几个关键结论。首先，有益的化学反应在经过足够次数的 CTC 循环后达到饱和。因此，在 CTC5 时观察到的峰值性能以及随后在更高循环次数下的下降，很可能是由重复的冷却-加热循环导致的宏观薄膜退化所致。其次，CTC 为合成具有高极化的氮取代铁电氧化物（氧氮化物）提供了一条不同于传统方法的途径。尽管早前预测极性氧氮化物将表现出高极化，但此类材料仍然稀缺，因为传统合成通常依赖于退火期间的气氛控制（例如 $N_{2}$ 或 $NH_{3}$）（29, 48–52）：$N_{2}$ 由于其高稳定性通常无效，而 $NH_{3}$ 则可能引入氢并降低铁电性能（48），使得高性能极性氧氮化物难以实现。相比之下，CTC 方法为氧化物氮化提供了一种全新且更直接的替代方案。第三，CTC 诱导的氮杂化是由氧化物中预先存在的 $V_{O}^{\bullet\bullet}$ 浓度介导并受其控制的。因此，这一过程依赖于反应期间对可用 $V_{O}^{\bullet\bullet}$ 的有效利用。尽管如此，它仅涉及极小绝对程度的氮杂化，在本研究中最高达到 $\sim0.6$ at %，但正如先前报告（29）和本研究中所观察到的那样，它可以通过增强阳离子的离心位移，从而产生显著的极化增强。

结论与展望

我们提出了一种合成后处理方法，即 CTC，用以增强极化，从而使介电储能性能相对于原始样本提高高达 $\sim50\%$。具体而言，BMT-SBT-Ti 薄膜实现了 $105\ \mu C\ cm^{-2}$ 的最大 $\Delta P$ 和高达 $261\ J\ cm^{-3}$ 的 $U_{e}$。机理研究将这种增强归因于 CTC 过程中由氧空位介导的氮杂化，这增强了电子局域化不对称性和局部偶极子，从而提升了 $P_{m}$。将氮杂化确定为关键驱动因素，也为有针对性地探索氧氮化物铁电体开辟了路径，从而实现了对极化及相关功能的规模化调控。与使用 $N_{2}$ 或 $NH_{3}$ 的传统高温氮化不同，CTC 为氧化物氮化提供了一种相对温和的途径。

该方法具有几个显著优势：它易于实施且具有成本效益；它具有广泛的适用性，可扩展至多种材料体系，特别是含过渡金属的氧化物；并且与离子辐照等受表面限制的技术不同，它能均匀地修改整个薄膜体积。其广泛的适用性已在多种成分（包括经典铁电体和无序铁电体）、广泛的厚度范围（从纳米级到微米级）以及多种基底（如硅、云母和 NSTO）中得到验证，这使 CTC 成为推进下一代高性能介电薄膜的一个良好范式。为了充分释放该方法的潜力并将其未来的应用扩展到此处探索的材料体系之外，仍需进一步的研究。

参考文献与注释

1. L. Shu et al., Science 385, 204–209 (2024).

2. H. Pan et al., Science 365, 578–582 (2019).

3. H. Pan et al., Science 374, 100–104 (2021).

4. H. Pan et al., Nat. Commun. 9, 1813 (2018).

5. J. Qian et al., Nano Energy 135, 110651 (2025).

6. R. Yuan et al., Nano Lett. 23, 4807–4814 (2023).

7. J. Fu et al., Nat. Commun. 15, 7338 (2024).

8. L. Yang et al., Prog. Mater. Sci. 102, 72–108 (2019).

9. B. Yang et al., Nat. Mater. 21, 1074–1080 (2022).

10. B. Yang et al., Nat. Energy 8, 956–964 (2023).

11. J. W. McPherson, J. Kim, A. Shanware, H. Mogul, J. Rodriguez, IEEE Trans. Electron Dev. 50, 1771–1778 (2003).

12. L. Liu, J. Zhang, Y. Wang, Innov. Mater. 2, 100103 (2024).

13. S. Han et al., Science 384, 312–317 (2024).

14. X. Zhang et al., Nano Energy 121, 109271 (2024).

15. M. D. Nguyen et al., Adv. Mater. 36, e2402070 (2024).

16. S. S. Cheema et al., Nature 629, 803–809 (2024).

17. M. Peddigari et al., Adv. Mater. 35, e2302554 (2023).

18. J. Kim et al., Science 369, 81–84 (2020).

19. Y. Luo et al., Appl. Phys. Rev. 10, 011403 (2023).

20. S. Kang et al., Science 376, 731–738 (2022).

21. S. V. Ketov et al., Nature 524, 200–203 (2015).

22. T. C. Hufnagel, Nat. Mater. 14, 867–868 (2015).

23. C. Bin et al., Chem. Eng. J. 445, 136728 (2022).

24. J. Xie et al., J. Mater. Chem. C Mater. Opt. Electron. Devices 7, 13632–13639 (2019).

25. S. Stemmer, S. K. Streiffer, N. D. Browning, A. I. Kingon, Appl. Phys. Lett. 74, 2432–2434 (1999).

26. Y. Sun et al., Adv. Sci. (Weinh.) 9, e2203926 (2022).

27. Y. Liu et al., Science 388, 211–216 (2025).

28. W. S. Mada Sanjaya, D. Anggraeni, A. Sambas, R. Denya, J. Phys. Conf. Ser. 1090, 012015 (2018).

29. T. Wang et al., Sci. Adv. 11, eads8830 (2025).

30. G. Xi et al., Nat. Commun. 16, 3526 (2025).

31. S. Stemmer et al., Appl. Phys. Lett. 79, 3149–3151 (2001).

32. L. S. Yamout et al., J. Am. Chem. Soc. 143, 9744–9757 (2021).

33. F. Hasanayn, P. L. Holland, A. S. Goldman, A. J. M. Miller, J. Am. Chem. Soc. 145, 4326–4342 (2023).

34. T. Shima et al., Science 340, 1549–1552 (2013).

35. P. Wang, S. Gong, Y. Li, Y. Mo, J. Chem. Phys. 160, 014304 (2024).

36. H. Yang, P. G. McCormick, J. Mater. Sci. 28, 5663–5667 (1993).

37. F. Gunkel, D. V. Christensen, Y. Z. Chen, N. Pryds, Appl. Phys. Lett. 116, 120505 (2020).

38. G. Zhuang, Y. Chen, Z. Zhuang, Y. Yu, J. Yu, Sci. China Mater. 63, 2089–2118 (2020).

39. R. Asahi, T. Morikawa, T. Ohwaki, K. Aoki, Y. Taga, Science 293, 269–271 (2001).

40. C. D. Valentin et al., Chem. Phys. 339, 44–56 (2007).

41. J. M. Polfus, T. Norby, R. Haugsrud, J. Solid State Chem. 198, 65–76 (2013).

42. A. Panepinto et al., J. Phys. Chem. C Nanomater. Interfaces 124, 17401–17412 (2020).

43. S. Shimizu et al., Chem. Sci. 15, 10350–10358 (2024).

44. C. D. Wagner et al., Surf. Interface Anal. 3, 211–225 (1981).

45. G. Z. Zhu, G. Radtke, G. A. Botton, Nature 490, 384–387 (2012).

46. D. Liu et al., Small 21, e07943 (2025).

47. K. Xu, Y. Gu, C. Song, X. Zhong, J. Zhu, Nanoscale 13, 6066–6075 (2021).

48. S. Aggarwal et al., Appl. Phys. Lett. 73, 1973–1975 (1998).

49. S. G. Ebbinghaus et al., Prog. Solid State Chem. 37, 173–205 (2009).

50. I. Marozau et al., Appl. Surf. Sci. 255, 5252–5255 (2009).

51. A. Fuertes, J. Mater. Chem. 22, 3293–3299 (2012).

52. R. Vadapoo et al., Phys. Rev. B 95, 214120 (2017).

53. J. Yi et al., (2026). Thermal-cycling-induced nitriding increases energy storage density in titanate ferroelectric films [Data set], Zenodo; https: / doi.org / 10.5281 / zenodo.20576546.

致谢

我们感谢 J. Daniels（新南威尔士大学悉尼分校）在机理和化学讨论方面提供的宝贵意见，以及在论文修订过程中给予的帮助。资金支持：江苏工业大学中武研究与创新团队项目，202101001 (J.Y.)。中央高校基本科研业务费 30921011217 (L.L.)。香港城市大学启动基金 9380184 (S.Z.)。作者贡献：概念化：J.Y., L.L.。实验：J.Y., K.Z., Y.Z., L.S., Z.S., Z.C.。分析：J.Y., D.D., S.Z., L.L.。DFT 计算：C.S., H.Z.。资金获取：J.Y., L.L.。初稿撰写：J.Y., L.L., S.Z.。审阅与编辑：J.Y., Z.S., Z.C., D.D., J.-F.L., S.Z., LL.。竞争利益：一项涵盖用于增强极化的 CTC 方法的专利申请已于 2026 年 7 月提交审查；发明人为 J.Y. 等。数据、代码和材料可用性：所有数据和材料合成的详细信息均可在正文或补充材料中获得。评估本文结论所需的所有数据和描述均存在于正文、补充文件以及数据集 (53) 中。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。对美国政府原始作品不主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

材料与方法；图 S1 至 S34；参考文献 (54–64)

2025 年 8 月 21 日提交；2026 年 3 月 23 日重新提交；2026 年 7 月 1 日接收

10.1126 / science.aeb5274

利用深度学习从头设计 RNA 假结

Jill Townley $^{1,2\dagger}$ , Wipapat Kladwang $^{3,4\dagger}$ , David Baker $^{5,6}$ , Hamish M. Blair $^{7}$ , Christian A. Choe $^{8}$ , Gina El Nesr $^{9}$ , Andrew Favor $^{5}$ , Eli Fisker $^{1}$ , Daniel B. Haack $^{10,11}$ , Shujun He $^{12}$ , Jason Hingey $^{11}$ , Po-Ssu Huang $^{8,9}$ , Rui Huang $^{3}$ , Chaitanya K. Joshi $^{13}\ddagger$ , Thomas Karagianes $^{1,2,3}$ , Andrew Kubaney $^{5}$ , Pietro Liò $^{13}$ , Adamo Mancino $^{14}$ , Jonathan Romano $^{1,2,4}$ , Boris Rudolfs $^{10}$ , Nicholas Spellmon $^{14}$ , Navtej Toor $^{10}$ , Jigyasa Verma $^{3}$ , Vivian Wu $^{3,4}$ , Zhiheng Yu $^{14}$ , Eterna Participants $^{1\S}$ , Rhiju Das $^{3,4,9*}$

RNA 设计一直受到三维（3D）结构预测精度有限的阻碍。在本研究中，我们证明通过对假结二级结构的精确从头设计，可以使用当前的深度学习工具生成复杂的 结构。在一项涉及 57 个假结的 Eterna 竞赛中，生成式人工智能（AI）方法在解决大多数盲测挑战方面与经验丰富的人类设计者相当，评估手段包括单核苷酸分辨率的化学图谱分析、补偿性突变分析以及冷冻电子显微镜。具有精确二级结构的 AI 生成分子形成了有序的 3D 折叠，并由设计过程中未建模的非规范三级相互作用稳定。成功得益于一个基于先前化学图谱数据训练的 RNet 基础模型，这表明某些困难的 设计任务在无需首先解决 3D 结构预测的情况下可能是可行的。

复杂的 结构是基础生物过程（包括翻译和病毒复制）以及新兴生物技术和药物的基础。在人类专家先驱性的设计工作 (1) 基础上，近年来在设计从 mRNA 疫苗 (2)、核酶 (3, 4) 到复杂的 折纸 (5) 等 结构的能力方面取得了稳步提升，但这些工作仍局限于简单 二级结构的设计、已知 结构的重新设计，或有限的、经过良好表征的三级基序库的组装。基于深度学习的设计已成功设计出结构与先前表征的 相关但序列截然不同的 分子 (6–8)。然而，对于此前未知的结构的从头设计，虽然在蛋白质领域已成为常规 (9, 10)，但在 领域尚未实现。 设计的进展一直受限于 二级和三级结构预测方法的精度不足，特别是对于合成分子 (11–13)，因为这类分子缺乏进化相关的分子序列和结构参考。

假结是一种复杂的二级结构，其中茎环中的核苷酸与茎外的环形成碱基对 (14)。越来越多的天然假结被证明通过形成具有明确茎结构的复杂三维（3D）拓扑结构，发挥核酶、核糖开关和核糖体移码信号的作用 (15, 16)。然而，新型假结仅针对一类特殊的

RNA 折纸分子 (5, 17)，且尚未通过通用三级基序组装实现 (18)。2024 年，Eterna 平台 OpenKnot 挑战赛的人类参与者 (19) 开始实现对新型假结的精确设计；这些设计通过对数百万个 RNA 分子的实验进行了评估和优化，其二级结构是通过引物延伸分析的 2' 羟基选择性酰基化核苷酸逐个反应性（SHAPE）来评估的 (20–22)。与此同时，基于深度学习的从头 RNA 设计算法被提出，但在应用于此前未见的二级和三级结构时，仍未经过实验验证 (23, 24)。这些进展促使 OpenKnot 挑战赛进行扩展，旨在明确对比这些新型 AI 算法与经验丰富的 Eterna 参与者之间的设计性能（表 S1 和 S2）。

将 AI 设计与经验丰富的人类进行基准对比

Round 1 的扩展 OpenKnot 挑战赛邀请了六种 AI 方法提交用于 SHAPE 实验的设计。在 SHAPE 实验中，单链且构象灵活的核苷酸倾向于在其 2'-羟基处被酰基化，而碱基配对的核苷酸通常受到保护并表现出低反应性（图 1, A 至 E）。Round 1 的 17 个二级结构选自 11 个实验 3D 结构已存入蛋白质数据库（PDB）的 RNA，以及 6 个由 Eterna 参与者基于早期部分成功的设计尝试而提出的合成假结（表 S3 至 S4 和图 S1A）。对于 11 个源自 PDB 的目标中的几个，已知其天然序列会形成替代状态。例如，在 Round 1 目标 W03 中，一种在梭菌（Clostridium acetobutylicum）中感知环二鸟苷酸单磷酸的 RNA 长茎 [c-di-GMP-II 核糖开关 (25)]，根据 的评估，在缺乏小分子配体的情况下大部分未形成（图 1D）。因此，即使对于具有天然序列的情况，挑战也在于发现能够使溶液中不含稳定伴侣的 RNA 稳定目标假结的序列。每种 AI 方法以及每位 Eterna 参与者最多可提交 20 个设计；某些需要输入 3D 骨架的方法（表 S2）无法为没有 PDB 结构的 6 个目标进行设计。在整个 OpenKnot 挑战赛中，所有设计均在没有小分子配体的情况下进行探测，以便假结的形成能够反映设计本身而非配体稳定作用；随后的含配体 测量支持了这一选择（图 S2 和补充文本）。

我们观察到了广泛的性能差异，许多 Eterna 设计实现的实验 谱图中，高反应性和低反应性的模式与未配对和配对核苷酸的目标谱图相匹配（图 1, B 和 E）。每个设计的实验 谱图与其目标二级结构的吻合程度使用 OpenKnot 分数进行量化，该分数计算 反应性与预期相匹配的核苷酸百分比（材料与方法）；分数范围从 0 到 100. 一批 Eterna 设计超过了 90% 的成功阈值（图 1, F 和 G；图 S3A；以及数据 S1）；该阈值的设定是基于测量中固有的实验不确定性 (19)，以及 方法在为已知结构的 RNA 分配二级结构时 $\sim$ 10% 的错误率 (26, 27)。负责这些高分设计的 Eterna 参与者

使用了游戏内工具、直觉和多样化设计策略的组合（补充文本）。大多数 AI 方法（Rosetta, Rosetta-LoRes, 3DRNA, gRNAde, MPNN-RFdiff；表 S2）未能通过分数阈值，且在 Round 1 中的表现逊于 Eterna 参与者（图 1, E 至 H，以及补充文本）。一个例外是 MPNN-fixbb，这是一种为固定输入骨架设计序列的消息传递神经网络 [类似于 ProteinMPNN (28, 29)]，它在平均水平上优于 W03 的起始序列（图 1, C 和 G）。许多顶尖的 MPNN-fixbb 设计以及一些高分的 Eterna 设计与起始序列截然不同（序列一致性 $<50\%$；见图 1F）。此外，所有与起始序列一致性 $>90\%$ 的设计得分均低于 $80\%$，这表明脱离天然序列具有重要意义。

B

G | |

[⚠ 低质量翻译，建议复核] 图 1. 17 个起始目标的性能表现。(A 至 D) W03（c-di-GMP-II 核糖开关）的目标二级结构，颜色分别由理想 SHAPE 数据 (A) 以及来自 (B) Eterna 人类参与者、(C) MPNN-fixbb 和 (D) 野生型 RNA（天然 c-di-GMP-II 核糖开关适配体）的最佳设计实验 SHAPE 数据标注。(D) 中的红色标签标记了 P3 茎，其 反应性表明 RNA 骨架具有灵活性，与目标结构不一致。(E) 第 1 轮测试 W03 目标的序列的 反应性，证明了其与理想目标概况（顶部）之间存在广泛的一致性，该一致性由基于 的 OpenKnot 分数（条形图，最右侧）参数化。(F) 与起始序列的序列一致性较低（<50%）的设计实现了与目标 概况的高度一致（OpenKnot 分数 >90）。(G 至 J) 不同设计方法的性能汇总，包括 [(G 和 I)] W03 的 OpenKnot 分数，以及 [(H 和 J)] W01 至 W17 目标中取得成功（此处定义为 OpenKnot 分数 >90）的目标百分比。在 (H) 和 (J) 中，误差线反映了标准误差，实色条和浅色条分别显示了所有 17 个目标以及仅在提交了设计的目标上的成功率。从 [(G 和 H)] 第 1 轮到 [(I 和 J)] 第 2 轮，性能提升明显。

在第 1 轮结束时，观察到基于 100 万 个先前 RNA 的化学图谱训练的神经网络 RNet (21) 所给出的 概况，其模拟分数在很大程度上能重现实验分数，尤其是对于性能较差的设计（图 S4）。这一观察结果表明，RNet 建模可能允许对设计进行前瞻性筛选。随后，在第 2 轮中，这 17 个第 1 轮目标再次提交给所有设计者。Eterna 设计者（在交互界面中获得了 RNet 的访问权限）以及更新后将 RNet 纳入考虑的 AI 设计方法（gRNAde、MPNN-RFdiff、MPNN-fixbb 以及新的 codesign-RFdiff；见材料与方法）在本轮中的表现显著提升，例如在 W03℃-di-GMP-II 核糖开关目标上（图 1I 和图 S3B）。在所有 17 个目标中，所有测试的 AI 方法和 Eterna 人类参与者能够在他们设计的至少 80% 的目标上获得 90 分以上的分数（浅色条，图 1J），且各方法之间没有显著差异。对于第 1 轮和第 2 轮，一种基于 Z-score 的替代评估方法（模拟结构预测关键评估 [CASP] 中使用的程序 (12, 13)）给出了类似的排名（图 S5, A 和 B）。

对此前未见过的假结目标的泛化能力

上述结果表明，AI 设计者和 Eterna 参与者能够从之前的设计探索中学习，从而在同一组 17 个目标上，实现从第一轮到第二轮的提升。为了测试所得方法的泛化能力，我们进行了第三轮实验，选取 20 个新的假结作为目标二级结构（图 2, A 至 C；图 S1℃；以及表 S5）。与第一轮和第二轮相比，从 PDB 中具有实验 3D 结构的 RNA 中抽取的目标数量较少（5 个对比 11 个），以减轻 AI 方法中训练集记忆可能产生的影响。另外 5 个目标二级结构取自 Pseudobase，这是一个由专家策划的天然假结数据库 (30)。其余 10 个则由 Eterna 参与者提出的二级结构策划而成（材料与方法）。作为对通用性的进一步测试，我们在平行的第四轮实验中提出了 20 个长度更长（最高达 240 个核苷酸 [nts]）的额外目标，这些目标同样取自多样化的来源（图 2, D 至 F；图 S1℃；以及表 S5）。为了使所有方法都能针对那些没有关联 PDB 结构的目标进行设计，我们为缺失实验结构的目标提供了建模的 3D 结构（材料与方法及表 S5）。

SHAPE 表征结果有力地支持了 AI 方法和 参与者的表现。每种深度学习设计方法的表现均优于起始序列，而起始序列在第四轮较长目标中的 OpenKnot 分数尤其低。当分组统计时，AI 方法和 方法在第三轮（图 2℃）和第四轮（图 2F；另见图 2, C 和 D）的 19 / 20 个目标中均实现了 90 的 OpenKnot 分数。Z 分数分析也支持这些结论（图 S5, C 和 D）。只有一个目标无法被任何方法或 参与者设计出 OpenKnot 分数 >90 的结果（P16, AK_PK100-3；图 2B 及补充文本）。

除了 P16 目标外，成功案例还包括由 参与者提出的各种复杂的假结（例如，接吻多环 [Kissing Multiloops]，

图 2. 40 个新目标假结的表现。(A 和 B) 和 AI 设计方法（分别为 MPNN-fixbb 和 Struct2SeQ-SHAPE）中 OpenKnot 分数最高的设计：(A) P20 (Kissing Multiloops) 和 (B) P16 (AK_PK100-3)。(B) 中的 Struct2SeQ-SHAPE 设计与另一种替代二级结构更为一致（另见图 S6 和 S7）。(C) 第三轮 20 个目标的性能汇总，长度最高达 100 nt。(D 和 E) 和 AI 设计方法（分别为 gRNAde 和 MPNN-RFdiff）中针对第四轮较大目标的 OpenKnot 分数最高的设计：(D) Q08 (Rous Sarcoma Virus) 和 (E) Q20 (SV_i)。(F) 第四轮 20 个目标的性能汇总，长度在 117 到 240 nt 之间；阴影条标记的方法是在初始第四轮结果发布后，通过实验对其提交内容进行了表征。在 (A)、(B)、(D) 和 (E) 中，二级结构和颜色分别代表目标设计和实验 SHAPE 谱图。在 (C) 和 (F) 中，实色条显示在过滤掉 RNet 预测二级结构不准确的设计后，实现 OpenKnot 分数 >90 的比率；浅色条显示未经过二级结构过滤的比率；误差棒反映标准误差。

图 2A，以及 SV_i，图 2E），以及一个针对 3D 结构未知的天然 RNA（鼠类肉瘤病毒移码信号；图 2D）所提出的假结。设计方法的成功在第 4 轮的长长度目标中尤为显著，对于这些目标，起始序列仅在 20 个目标中的 4 个中取得了成功（图 2F 中的起始序列）。领先的 AI 方法包括一种不采用 3D 输入的图神经网络新变体 gRNAde，以及一种在挑战赛中首次出现的方法 Struct2SeQ，后者是一种纯粹由 RNet 模型 (3I) 训练和引导的深度 Q 强化学习方法（表 S2 及材料与方法）。在第 3 轮和第 4 轮中，MPNN、gRNAde 和 Struct2Seq 这三种最佳方法之间的差异通常并不显著（$P > 0.05$；对不一致对进行精确配对二项分布检验，单侧）。唯一的例外是 Struct2SeQ-SHAPE，它在第 4 轮中显著优于其他 AI 方法；然而，该方法的方案是在初步结果公布后提交的，从而获得了额外的开发时间（材料与方法）。

补偿性突变验证设计碱基对

第 3 轮和第 4 轮的结果表明，经验丰富的人类设计者和 AI 方法均已提高到无需逐步优化即可设计天然和非天然假结的程度。然而，这些设计的评估是基于 OpenKnot 分数 90 这一预设但任意的阈值，以及 SHAPE 测量能准确监测碱基配对状态的假设。关于 SHAPE 解释的注意事项已有描述 (26, 27, 32, 33)，且那些在 SHAPE 保护程度上与目标二级结构一致的核苷酸，有可能实际上形成了替代配对。为了测试这种可能性，我们采用了一种基于比较突变的独立方法，称为高通量测序突变-图谱-救援读出法 (M2R-seq) (33, 34)，图 3 A 至 F 以第 3 轮中 P20（接吻多环）的 gRNAde 设计为例进行了说明。如果两个核苷酸在推定的 RNA 结构中形成碱基对，那么其中任何一个核苷酸的突变都应会破坏该配对，并在突变位点附近产生 SHAPE 扰动（图 3, A 至 C；图 S6 显示了代表性设计的详细数据）；未突变的配对伙伴处也可能出现反应性变化，但并不总是明显，因为未突变的核苷酸可能保持堆叠状态或形成替代相互作用 (33, 35, 36)。然而，如果两个核苷酸同时突变以翻转原始碱基对（例如，C-G 变为 G-C），则 RNA 结构应被“救援”，且 SHAPE 图谱应恢复到未突变 RNA 的状态（对比图 3D 与图 3A，以及图 3E 的底行与顶行）。

图 3. 补偿性突变（突变-图谱-救援，M2R-seq）测试单个碱基对的准确性。(A) 第 3 轮目标 P20（接吻多环）中 OpenKnot 分数最高之 gRNAde 设计的 SHAPE 数据，颜色标注在目标假结二级结构上。(B 至 D) 单突变体 (B) G38℃ 和 (C) C61G 的 SHAPE 图谱显示在突变位点（圈出部分）附近出现扰动，而这些扰动在 (D) 补偿性双突变体中得到了救援，后者将 G38-C61 碱基对恢复为 C38-G61 碱基对。在 (A) 至 (D) 中，为了便于可视化，描绘的二级结构是由 RNet-SS 为这些序列建模的结果。(E) 与 (A) 至 (D) 相同的 SHAPE 图谱，通过堆叠排列以方便直观比较补偿性突变后的图谱恢复情况。(F) (A) 中设计的所有目标碱基对的实验救援因子值。(E) 和 (F) 中的黑色矩形框出了在 (B) 至 (D) 中发生突变的碱基 38、61 以及 38-61 碱基对。(G) 基于 M2R-seq 验证形成至少 80% 目标茎的第 3 轮 20 个目标之比例，汇总所有设计方法的性能。

图 4. AI 设计的假结 RNA 的冷冻电镜（Cryo-EM）结构。(A) 亲吻多环（Round 3 中的目标 P20）的二级结构，按茎（stem）着色。(B) AlphaFold 3 基于 3D 信息的二级结构和预测模型，按茎着色。(C 至 E) 对于经过测试的设计，包括 (C) Struct2SeQ-SHAPE、(D) MPNN-fixbb 和 (E) gRNAde，冷冻电镜衍生的二级结构（上方）在恢复目标假结二级结构 (A) 方面显示出极高的准确性；而冷冻电镜图谱（未锐化）及拟合坐标（下方，按茎着色）则突出了与 AlphaFold 3 预测不同的 3D 拓扑结构以及非规范相互作用 [见 (D) 和 (E) 下方的插图]。

图 3F 总结了该 P20 设计中每个目标碱基对的“救援因子”（rescue factors）(33)。数据为每个茎的形成提供了强有力的证据（相反，图 S7 显示了一个负面示例，目标 P16）。我们获取了 Eterna 的最佳设计以及每种 AI 方法在所有 20 个 Round 3 目标中的 M2R-seq 数据（超过 10,000 个序列，包括单突变和双突变）；并评估了每个茎的恢复情况 [见材料与方法以及 (32, 33)]。在 20 个目标中的 17 个中，至少有一个设计根据我们的 M2R-seq 救援因子标准实现了所有目标茎的 100% 恢复。在 20 个目标中的 19 个中，至少有一个 AI 或 Eterna 设计实现了至少 80% 的 M2R-seq 茎级恢复（数据 S1）。基于这一标准，AI 方法再次展现出与 Eterna 相当的竞争力（图 3G；成功设计的比例分别为 90% 和 75%；差异不显著）。AI 方法之间的差异并不显著，但每种深度学习方法的表现均显著优于 Rosetta (P < 0.05；对不一致对进行单侧精确配对二项分布检验)。总体而言，补偿性突变分析的结果支持了基于 SHAPE 数据的 OpenKnot 评分分析所呈现的情况：与经验丰富的人类 RNA 设计师一样，AI 方法能够以持续的高准确度设计复杂的假结二级结构，包括全新的目标。

冷冻电镜揭示新的 3D 折叠与非规范相互作用

为了了解这些此前未见的假结是否可能对应于新的 3D 结构，我们将几种设计方案进行了冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析。在第三轮的非天然二级结构中，我们优先选择了 Eterna 提出的目标 P20（接吻多环；图 2A；图 3 A 至 F；以及图 4A）的设计，因为其单链连接子长度较短，我们认为这将充分限制 RNA 的 3D 构象，从而使其能够通过冷冻电镜进行结构表征。AlphaFold 3、trRosettaRNA 以及其他 RNA 3D 结构预测算法的建模也表明，P20 设计将形成定义明确的折叠，尽管 3D 建模的置信度较低（图 4B）。为了提高这些设计在冷冻电镜显微照片中的可见度，并打破可能阻碍高分辨率精修的任何伪对称性，我们将顶尖的 P20 设计嵌入到一个最近开发的圆周排列 II 型内含子支架中 (37)。

四种设计（起始序列、Rosetta、Eterna 和 Struct2SeQ）在纯化过程中的尺寸排阻色谱分析显示为聚集或未折叠状态，因此未进行显微镜分析。这些设计在 M2R-seq 茎段恢复率上也表现为 $<80\%$，这表明碱基配对稳定性对于保持样本折叠至关重要。其余四种设计成功成像（图 4℃ 至 E；图 S8 至 S11；表 S6；以及视频 S1 和 S2）。MPNN-RFdiff 设计的 M2R-seq 茎段恢复率为 80%，在冷冻电镜所使用的条件下形成了二聚体（材料与方法）；所有 7 个目标茎段均存在，但 P4 碱基对是在分子之间而非每个分子内部形成的（图 S8 至 S11，视频 S2 以及补充文本）。

另外三种来自 Struct2Seq-SHAPE、MPNN-fixbb 和 gRNAde 的设计，其 M2R-seq 茎段恢复率为 100%。这三种设计在冷冻电镜中均解析为单体，图谱分辨率分别为 5.2, 4.8, 和 3.6 Å，在经过图谱掩模和锐化后，分别提高至 4.8, 4.0, 和 2.9 Å。在所有三幅图谱中，茎段 P1 至 P7 以及相互连接的连接子在锐化前就清晰可见（图 4℃ 至 E）。这些图谱使得所有坐标的建模成为可能，最初是通过对分子序列盲测的无偏手动追踪完成的。坐标构建确认，所有设计均以极高的碱基对级准确度（$F_{1}$ 分别为 0.89, 0.95, 和 0.95）形成了目标二级结构的所有 7 个茎段，且这三种折叠与之前的 RNA 结构不具有同源性，且与 AlphaFold 3 模型不匹配。对分辨率最高的两种设计的详细检查揭示了额外的非规范配对、碱基三联体和三级相互作用（图 4 D 和 E，插图），这些似乎并非由 AI 方法显式设计（补充文本）。

无需 3D 结构预测的 RNA 设计

通过深度学习，现在可以实现复杂 RNA 假结（pseudoknots）的可靠从头设计（de novo design）。在 OpenKnot AI 挑战赛中，自动 AI 方法在不到 1 年的时间里便能与来自 Eterna 的经验丰富的人类设计者相媲美；经由 SHAPE 映射和涉及约 50,000 个序列的补偿性救援实验测试，两种方法在 57 个假结设计目标中的解决率均超过 95%。在类似的蛋白质从头设计问题中，进展主要由精确的 3D 蛋白质结构预测计算方法（9, 10, 38）所驱动，但此类工具在 领域（11–13）仍然缺失。本研究中的 MPNN、gRNAde 和 Struct2Seq 框架并未依赖 3D 结构预测工具，而是利用了一个名为 RNet 的模型，该模型基于先前的 Eterna 化学映射数据进行训练，而这些数据主要对二级结构敏感。除了共同使用 RNet 之外，这三个 AI 框架采用了不同的深度学习变体（表 S2），且我们的结果无法在统计学置信度上区分这些 AI 方法中哪一个优于其他方法。相反，这三个框架可能最适合组合部署，因为序列空间分析显示，AI 方法采样的是紧凑且互不重叠的区域，从而提供了对设计空间的互补覆盖（图 S14）。为了明确哪些框架最适用于当前及未来的 设计任务，还需要对这些方法以及其他新兴方法（7, 39–41）进行进一步的实验测试。

通过冷冻电镜（cryo-EM）探测的 AI 生成分子显示出复杂的非规范三级相互作用，这对于天然 分子中的高级功能至关重要（42–44），但并非先验预测的结果。对此类高分辨率细节进行预测建模和设计，对于设计 催化剂和适配体（aptamers）至关重要，因此仍然是一个重要的挑战。尽管如此，在没有明确设计的情况下出现非规范相互作用表明，其他问题——例如对核糖体和 聚合酶核酶（ribozymes）等机器的重新设计（45, 46），或发现非冗余折叠以扩充 结构数据库（47）——可能会通过基于精确二级结构预测的计算设计立即获得加速，而无需在原子细节上对 3D 相互作用进行高精度的前瞻性建模。

参考文献与注释

1. L. Jaeger, A. Chworos, Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 531–543 (2006).

2. H. Zhang et al., Nature 621, 396–403 (2023).

3. R. Yamagami, M. Kayedkhordeh, D. H. Mathews, P. C. Bevilacqua, Nucleic Acids Res. 47, 29–42 (2019).

4. D. Szokoli, N. E. Nwosu, L. M. Glatt, H. Mutschler, Chembiochem 26, e202500356 (2025).

5. C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen, Nat. Chem. 13, 549–558 (2021).

6. S. Sumi, M. Hamada, H. Saito, Nat. Methods 21, 435–443 (2024).

7. F. Wong et al., Nat. Comput. Sci. 4, 829–839 (2024).

8. A. T. Merchant, S. H. King, E. Nguyen, B. L. Hie, Nature 649, 1–10 (2025).

9. D. Listov, C. A. Goverde, B. E. Correia, S. J. Fleishman, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 25, 639–653 (2024).

10. C. Armer et al., Proteins 93, 2005–2014 (2025).

11. W. Wang et al., Nat. Commun. 14, 7266 (2023).

12. R. Das et al., Proteins 91, 1747–1770 (2023).

13. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 192–217 (2026).

14. E. Westhof, L. Jaeger, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 327–333 (1992).

15. J. Aruda, S. L. Grote, S. Rouskin, Curr. Opin. Struct. Biol. 88, 102912 (2024).

16. Y. Chen et al., Nat. Chem. Biol. 17, 601–607 (2021).

17. E. K. S. McRae et al., Nat. Nanotechnol. 18, 808–817 (2023).

18. J. D. Yesselman et al., Nat. Nanotechnol. 14, 866–873 (2019).

19. J. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 2122–2127 (2014).

20. T. Marinus, A. B. Fessler, C. A. Ogle, D. Incarnato, Nucleic Acids Res. 49, e34 (2021).

21. S. He et al., Ribonanza: deep learning of RNA structure through dual crowdsourcing, bioRxiv 2024.02.24.581671 [Preprint] (2024). https: / doi.org / 10.1101 / 2024.02.24.581671.

22. K. E. Deigan, T. W. Li, D. H. Mathews, K. M. Weeks, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 97–102 (2009).

23. C. K. Joshi et al., gRNAde: Geometric Deep Learning for 3D RNA inverse design (2024); https: / openreview.net / forum?id=lvw3UgeVxS.

24. A. Favor et al., De novo design of RNA and nucleoprotein complexes, bioRxiv 2025.10.01.679929 [Preprint] (2025). https: / doi.org / 10.1101 / 2025.10.01.679929.

25. K. D. Smith, C. A. Shanahan, E. L. Moore, A. C. Simon, S. A. Strobel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7757–7762 (2011).

26. C. W. Leonard et al., Biochemistry 52, 588–595 (2013).

27. W. Kladwang, C. C. VanLang, P. Cordero, R. Das, Biochemistry 50, 8049–8056 (2011).

28. A. Kubaney et al., RNA sequence design and protein-DNA specificity prediction with NA-MPNN, bioRxiv 2025.10.03.679414 [Preprint] (2025). https: / doi.org / 10.1101 / 2025.10.03.679414.

29. J. Dauparas et al., Science 378, 49–56 (2022).

30. F. H. van Batenburg, A. P. Gultyaev, C. W. Pleij, J. Ng, J. Oliehoek, Nucleic Acids Res. 28, 201–204 (2000).

31. S. He, Q. Sun, Struct2SeQ: RNA inverse folding with Deep Q-Learning. bioRxiv 2026.01.16.700031 [Preprint]. (2026). https: / doi.org / 10.64898 / 2026.01.16.700031.

32. E. B. Arnold et al., Nucleic Acids Res. 53, gkaf290 (2025).

33. S. Tian, P. Cordero, W. Kladwang, R. Das, RNA 20, 1815–1826 (2014).

34. S. Tian, W. Kladwang, R. Das, eLife 7, e29602 (2018).

35. W. Kladwang, C. C. VanLang, P. Cordero, R. Das, Nat. Chem. 3, 954–962 (2011).

36. W. Kladwang, P. Cordero, R. Das, RNA 17, 522–534 (2011).

37. D. B. Haack et al., Nat. Commun. 16, 880 (2025).

38. B. Kuhlman et al., Science 302, 1364–1368 (2003).

39. R. Anand et al., arXiv [q-bio.BM] (2025).

40. N. S. C. Merleau, M. Smerlak, BMC Bioinformatics 23, 335 (2022).

41. S. Najeh, K. Zandi, N. Kharma, J. Perreault, RNA 29, 764–776 (2023).

42. Q. Vicens, J. S. Kieft, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119, e2112677119 (2022).

43. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 51–78 (2026).

44. J. H. Cate et al., Science 273, 1678–1685 (1996).

45. Y. Shulgina et al., Nat. Commun. 15, 10627 (2024).

46. C. K. Joshi et al., Generative inverse design of RNA structure and function with gRNAde. bioRxiv 2025.11.29.691298 [Preprint] (2025). https: / doi.org / 10.1101 / 2025.11.29.691298.

47. W. Wang, B. Su, Z. Peng, J. Yang, Nat. Biotechnol. 44, 205–214 (2026).

48. R. Das, eternagame / OpenKnotAIDesignData: v4.5.2 — M2 Single-Mutant SHAPE Data, Zenodo, (2026); https: / doi.org / 10.5281 / zenodo.20101887.

49. A. Favor, OpenKnot RNA Pseudoknots – RFDpoly 3D Structures, version v1, (2026); https: / doi.org / 10.5281 / .18666308.

50. J. Townley et al., OpenKnotAI: Code for RNA library design, SHAPE data processing, OpenKnot scoring, and RNA design methods, version v1, (2026); https: / doi.org / 10.5281 / .20649966.

致谢

我们感谢 C. Geary（海德堡）在设计目标方面提供的建议，感谢 J. Nicol（Eterna）在化学图谱填充设计方面提供的建议，感谢 R. C. Kretsch（斯坦福）在冷冻电镜（cryo-EM）目标选择方面提供的建议，感谢 A. Espeleta 协助开发 3DRNA，感谢 J. Shendure（华盛顿大学）及其实验室分享用于文库制备的引物序列，感谢 G. Meissner（Janelia）在项目协调方面的贡献，感谢 AI@HHMI 计划的支持，以及 Nvidia DGX Cloud 和 NSF NAIRR Pilot（分配号 NAIRR240281）为第 4 轮 Struct2SeQ 提供的工程支持。在修订稿的准备过程中，Claude 被用于文本和图注的编辑协助，以及支持图 S2、S6 和 S14 的计算分析；所有 AI 辅助的输出均由作者审核并验证。资金支持：本工作得到了 NIH 资助 R35GM122579 (R.D.)、NIH 资助 R35GM141706 (N.T.)、 R01AI165433 (S.H.)、 R01GM147893 (P.-S.H.)、 U19AI181881 (A.K.)、霍华德·休斯医学研究所（R.D., D.B.）、NSF 2330652 (R.D.)、NSF 255097 (N.T.)、W. M. Keck 基金会 (N.T.)、新加坡 A*STAR 国家科学奖学金 (C.K.J.)、高通创新奖学金 (C.K.J.)、剑桥大学 Dawn HPC 先驱项目 (C.K.J.)、德克萨斯 A&M X (S.H.) 以及默克研究实验室 (MRL) 科学参与和新兴发现科学 (SEEDS) 计划 (P.-S.H.) 的支持。作者贡献：J.T.、E.F. 和 R.D. 设计了 Eterna OpenKnot 目标；J.T.、J.R. 和 T.K. 协调了 Eterna 上的目标部署、设计收集和评分。C.K.J.、P.L.、A.F.、A.K.、G.E.N.、S.H.、D.B.、P.-S.H.、C.A.C. 以及 Eterna 参与者提交了序列。W.K.、H.M.B.、V.W.、R.H.、J.V. 和 R.D. 设计、收集并分析了 SHAPE 实验。D.B.H.、J.H.、B.R.、N.T.、N.S.、A.M. 和 Z.Y. 设计并执行了冷冻电镜测量和建模。R.D. 在所有作者的参与下起草了手稿。除 J.T.、W.K.、Eterna 参与者和 R.D. 之外的所有作者均按字母顺序排列在署名栏中。竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：第 1-4 轮、M2 和 M2R 实验的 SHAPE 图谱和建模 3D 结构公开可用 (48,49)，并可在 RNA 图谱数据库 (https: / rmdb.stanford.edu) 中通过以下登录 ID 获取：OK45LIB_2A3_0000（第 1 轮）、OK6LIB_2A3_0000（第 2 轮）、OK7ALIB_2A3_0000（第 3 轮）以及 OK7BLIB_2A3_0000 和 OK7BLIB_2A3_0001（第 4 轮）。P20（接吻多环）设计的冷冻电镜结构可在 PDB 中通过以下登录 ID 获取：10ZT（gRNAde 设计，Mol9）、10ZU（MPNN-fixbb 设计，Mol14）、11EH（Struct2Seq-SHAPE，Mol13）和 11AG（MPNN-RFdiff 二聚体，Mol11）。冷冻电镜图谱可在 EMDB 中通过以下登录 ID 获取：EMD-75574（gRNAde 设计，Mol9）、EMD-75575（-fixbb 设计，Mol14）、EMD-75648（Struct2Seq-SHAPE，Mol13）和 EMD-75584（-RFdiff 二聚体，Mol11）。冷冻电镜图像可在 EMPIAR 中通过以下登录 ID 获取：EMPIAR-13759（gRNAde 设计，Mol9）、-13762（-fixbb 设计，Mol14）、-13765（Struct2Seq-SHAPE，Mol13）和 -13766（-RFdiff 二聚体，Mol11）。代码可在 (50) 获取。材料可根据要求提供。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家被许可人为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse。本文受 HHMI 出版物开放获取政策约束。HHMI 实验室负责人此前已在研究文章中向公众授予非排他性 CC BY 4.0 许可，并向 HHMI 授予可转许可的许可。根据这些许可，本文的作者接受稿（AAM）可在发表后立即根据 CC BY 4.0 许可免费提供。

补充材料

材料与方法；补充文本；图 S1 至 S14；表 S1 至 S8；参考文献 (51–58)；视频 S1 和 S2；数据 S1；MDAR 可重复性检查清单

2026年2月23日提交；2026年6月30日接收

二维半导体

用于二维半导体的单晶金属接触直接蒸发法

Ying Zhang $^{1,2\dagger}$ , Chang Liu $^{1,3†}$ , Huiting Wang $^{1,2}$ , Guichen Teng $^{1,2}$ , Yilu Qin $^{4}$ , Wencheng Niu $^{3}$ , Shuimei Ding $^{3}$ , Binmin Wu $^{1}$ , Shuaiqin Wu $^{1,2}$ , Yan Chen $^{4}$ , Ni Yang $^{5}$ , Tie Lin $^{1,2,6}$ , Hong Shen $^{1,2,6}$ , Xiangjian Meng $^{1,2,6}$ , Yuan Liu $^{3}$ , Xuming Zou $^{3}$ , Xudong Wang $^{1,2,6}$ , Lei Liao $^{3}$ , Junhao Chu $^{1,2,4}$ , Lain-Jong Li $^{5}$ , Jianlu Wang $^{1,4,7*}$

金属接触仍然是二维 (2D) 半导体电子器件的关键瓶颈之一。我们开发了一种原子级逐步蒸发法，能够在单层半导体上直接生长具有洁净界面的单晶金属。该方法利用了一个独特的生长动力学窗口，可抑制二次成核并促进横向合并，从而实现了多种金属（包括铋、银、铟、金和钯）在二硫化钼 (MoS $_2$ ) 和二硒化钨 (WSe $_2$ ) 上的范德华外延生长。单晶金属支持超薄导电，提供空间均匀的功函数，并表现出更高的热鲁棒性。作为接触电极，它们显示出极小的费米能级钉扎，接近 Schottky-Mott 极限。使用铋和钯接触电极，单层 MoS $_2$ 和 WSe $_2$ 晶体管分别实现了 36 和 145 欧姆-微米的极低 n 型和 p 型接触电阻，且短沟道电流均在 1.1 毫安每微米以上。

二维 (2D) 半导体因其原子级薄的体层以及在极端器件小型化方面具有的卓越静电特性，被广泛认为是突破硅极限、扩展晶体管缩放规模的有前景的沟道材料 $(1-5)$。然而，由于缺乏可扩展且可靠的接触技术，其实际应用受到了限制。在传统的金属-二维界面上，强烈的费米能级钉扎 (FLP) 会产生巨大的肖特基势垒和高接触电阻 $(6-14)$。转移金属接触可以通过避免沉积诱导的损伤来减轻 FLP $(11, 15-19)$，但由此产生的范德华 (vdW) 间隙会引入隧道势垒，从而阻碍低电阻界面的形成。铋 (Bi) 和锑 (Sb) 等半金属接触通过抑制金属诱导的能隙态，实现了创纪录的低 n 型电阻 $(12, 20)$，但其较差的热稳定性阻碍了它们集成到互补金属氧化物半导体 (CMOS) 工艺中。原子层键合方法——例如金-钼-硫 (Au-Mo-S) 界面重构——提供了更好的热鲁棒性 $(21)$，但涉及相当复杂的工艺，且其对 p 型接触的适用性尚未得到验证。与此同时，可扩展的 p 型接触解决方案仍然滞后 $(5, 22-24)$。因此，开发一种可扩展、低电阻且兼容 CMOS 的接触技术仍然是二维电子器件面临的核心挑战。

原则上，在二维半导体上直接形成单晶金属（sc-metals）为克服这些接触限制提供了一条可行路径。单晶金属没有多晶薄膜固有的晶界、缺陷位点和不受控的表面态，具有更洁净的界面、明确的电子结构以及空间均匀的功函数，这使其成为实现低电阻接触的有前景的平台。其有序结构可进一步支持超薄且导电的金属电极，并可能提高热稳定性。然而，单晶金属接触的进展一直有限，因为现有的晶体生长策略在很大程度上源自于体相 3D 基底上的外延生长，其中晶格匹配决定了成核和取向 (25–29)。这些原则在二维半导体上不易实施，因为二维半导体的脆弱表面容易被高能金属沉积损坏，而其无悬空键的特性为晶体生长提供的晶格注册引导非常有限 (10, 15)。因此，迫切需要开发新的生长机制和策略，以实现一种简单且兼容 CMOS 的方法在二维半导体上制备单晶金属。

在这项工作中，我们报道了通过使用分步蒸发法在单层二维半导体上直接原位生长单晶金属。这种分步蒸发工艺（Step-Eva）由原子级沉积剂量及随后的长时间稳定暂停组成，它抑制了无序的二次成核与生长，促进了横向畴的合并，从而为范德华（vdW）外延创造了一个独特的动力学窗口。该方法广泛适用于在不同二维半导体（包括二硫化钼 (MoS$_2$) 和二硒化钨 (WSe$_2$)）上生长多种单晶金属（包括铋 (Bi)、银 (Ag)、铟 (In)、金 (Au) 和钯 (Pd)），同时保持洁净且低损伤的金属-半导体 (M-S) 界面。由此产生的单晶金属支持超薄导电，提供明确且空间均匀的功函数，并显示出增强的热稳定性。作为二维半导体的接触电极，这些单晶金属表现出强烈的费米能级钉扎（FLP）抑制，并紧密遵循肖特基-莫特（Schottky–Mott）行为。洁净、低损伤的 M-S 界面、受抑制的 FLP 以及空间均匀的金属功函数的结合，显著提升了接触性能。采用单晶铋 (sc-Bi) 接触的 MoS$_2$ 晶体管实现了可忽略不计的肖特基势垒，n 型接触电阻为 36 ohm·μm，高开关比超过 $10^{10}$，短沟道电流为 1.3 mA μm$^{-1}$。采用单晶钯 (sc-Pd) 接触的 WSe$_2$ 晶体管实现了 p 型接触电阻 145 ohm·μm，高开关比超过 $10^{10}$，短沟道电流为 1.1 mA μm$^{-1}$。

原子级分步蒸发

通常，在二维材料上进行金属蒸发是通过连续操作直到达到所需的薄膜厚度。然而，这种连续蒸发法（Cont-Eva）会使腔室内的金属蒸气通量持续增加，导致热量积聚并提高温度和压力（图 1.A 和图 S1A）。不稳定的腔室环境和高原子通量阻碍了稳定的成核与迁移，导致生长出具有大量小晶粒、晶界和缺陷的多晶或纳米晶结构（图 1B）(30)。此外，高能蒸发原子的连续轰击引入了大量能量并导致局部热积累，从而破坏二维晶格，导致金属-半导体（M-S）界面紊乱 (10, 15)。我们使用平面扫描透射电子显微镜（STEM）追踪了 Cont-Eva 铋（Bi）的沉积过程。在 2 到 $20\mathrm{nm}$ 范围内，金属始终表现出紊乱成核、二次成核、不受控制的横向生长以及随机的晶体取向（图 1℃）。选区电子衍射（SAED）进一步证实了沉积金属的多晶特性（图 1D）。

A

B

C E

F

D

G

| | J

K

图 1. 原子级分步蒸发。(A) 显示 Cont- 过程中厚度演变以及温度和压力波动的示意图。(B) 金属在单层二维半导体上通过 Cont- 生长的示意图，其中连续的热冲击和热积累破坏了二维晶格，导致产生多晶金属（pc-metals）和紊乱界面。(C) Cont- 铋（Bi）的平面 STEM 图像，显示从 2 到 $20\mathrm{nm}$ 的动态生长演变，伴有紊乱成核、二次成核、晶粒和间隙。(D) Cont- 铋（）的 SAED 图谱，显示多晶生长。(E) 显示 Step- 过程中厚度演变以及温度和压力松弛的示意图。(F) 金属在单层二维半导体上通过 Step- 生长的示意图。带有暂停的原子级沉积步骤促进了范德华（vdW）外延、横向合并和长程有序。(G) - 铋（）的平面 STEM 图像，显示从 2 到 $20\mathrm{nm}$ 的动态生长演变，具有更均匀的成核、横向外延生长和连续薄膜的形成。(H) - 铋（）的 SAED 图谱，证实了单晶生长。(I) 动力学蒙特卡罗（KMC）模拟显示 4-nm 沉积过程中 Cont- 和 - 铋（）的覆盖率演变。(J) 从 KMC 模拟中提取的成核密度以及 (K) 扩散长度随厚度的变化函数。$P$ 表示压力；$T$ 表示温度；Sec. nuc. 表示二次成核。

为了克服这些局限性，我们开发了一种 Step-Eva 方法，该方法结合了每步 0.5 nm 的原子级沉积剂量和 5 min 的稳定暂停时间，并由范德华（vdW）外延的动力学原理指导（图 1, E 和 F，以及图 S1B）。该方法具有三个关键优势。首先，分步蒸发稳定了腔室的压力和温度，为金属生长提供了稳定的基准环境。其次，原子级的步进厚度和较长的暂停时间能够更精确地控制成核、吸附原子扩散和畴合并，从而抑制无序晶粒的形成并促进 vdW 外延。第三，离散的蒸发-弛豫循环最大限度地减少了热积累和晶格损伤，从而实现了洁净且低损伤的金属-衬底（M-S）界面。原子力显微镜（AFM）测量首先证实，

Step-Eva 在精确控制薄膜厚度和保持表面平整度方面比 Cont- 具有明显优势（图 S2 和 S3）。平面视图 STEM 图像显示，与 Cont- 相比，- Bi 表现出更均匀的成核和增强的横向外延生长（图 1G）。在 7 nm 时，畴已完全合并，且未形成无序晶粒。SAED 图谱显示出尖锐的衍射斑点，具有明确的 Bi–MoS${2}$ 取向关系，进一步证实了 - 的单晶特性及其与 MoS${2}$ 晶格的 vdW 外延匹配（图 1H）。大面积和高分辨率的原子图像进一步验证了单晶 的形成（图 S4）。超大面积平面视图 STEM 图像进一步证明了 - 在广泛空间尺度上的优势（图 S5）。此外，我们发现 - 即使在非晶 SiO$_{2}$ 上也能显著提高 的结晶度。

我们利用动力学蒙特卡罗模拟进一步研究了 - 的生长机制（图 S6）。对于 4 nm 厚的 沉积，- 在沉积过程中和沉积后均产生了均匀且平坦的形貌（图 S7A）。与 Cont- 相比，- 产生了大得多的表面覆盖率 $\sim 0.9$，接近完全覆盖，且与我们的实验观察一致。表面覆盖率在暂停期间继续增加（图 II），而表面粗糙度则继续降低（图 S7B）。这些趋势表明，吸附原子在暂停期间可以继续横向迁移，这有助于抑制二次成核并加速畴合并。此外，模拟进一步显示，- 产生的成核密度较低且扩散长度较长，均优于 Cont-（图 1, J 和 K），这两者均有利于单晶生长。尽管这两个参数主要由金属-衬底相互作用决定，但 - 在生长过程中有效地对其进行了调制。随着薄膜厚度的增加，这种动力学优势变得更加明显，表明 - 在整个沉积过程中调节了生长动力学。这些由模拟得出的量应被视为机制支持，而非成核密度和吸附原子扩散长度的直接实验证明。

从机制上讲，Step-Eva 通过减少二次成核、促进有效的吸附原子扩散、加速畴合并以及抑制无序晶粒的形成，为范德华外延（vdW epitaxy）提供了一个独特的动力学窗口，从而实现了单晶薄膜的形成。所选取的 0.5 nm 阶梯厚度和 5 min 暂停时间是 Step-Eva 的结果导向参数，而非单晶生长的唯一条件。进一步的实验表明，Bi 的单晶形成在每步 <0.6 nm 且暂停时间 >3 min 的工艺窗口内得以维持（图 S8）；在此窗口之外，难以实现高质量生长。此外，实际的薄膜质量可能会根据沉积平台和操作控制而略有不同（图 S9）；尽管如此，通过 Step-Eva 实现的整体提升依然显著。此外，洁净的二维表面对于实现高质量生长也至关重要。

2D 半导体上的单晶金属接触

为了更好地可视化使用 Step-Eva 制备的金属形貌，我们进行了原子分辨率的截面扫描透射电子显微镜（STEM）和成像分析。对于 Cont-Eva Bi（图 2A），金属由小晶粒和含有大量缺陷及晶界的非晶颗粒组成，导致形成了无序的多晶金属（pc-metal）。在 $\text{MoS}_2$ 内部也观察到了严重的缺陷，包括非晶化、断裂、扩散和间隙。

相比之下，Step-Eva 有效地避免了这些问题，在保持 $\text{MoS}_2$ 晶格完整的同时，产生了长程有序的金属。Bi 原子与 ${}_2$ 紧密接触并精确排列，形成了高度有序的界面（图 2B, I 和 II）。额外的明场和暗场原子图像证实了单晶金属（sc-metals）的形成以及干净的界面（图 S10, A 至 C）。从 sc- 中提取的选区快速傅里叶变换（FFT）图谱证实了其结晶度和晶面， 沿 [0001] 方向生长，这与平面选区电子衍射（SAED）分析一致（图 2B, III）。垂直和水平方向的大尺度原子图像证明了 sc- 在 ${}_2$ 上的均匀生长（图 2B, IV 和 V）。大尺度原子图像和 FFT 图谱进一步验证了该单晶的结构完美性（图 S10D）。

在单层 ${}_2$ 的断裂边缘，sc- 无缝生长在相邻的 ${SiO}_2$ 基底上，同时保持与在 ${}_2$ 上相同的原子排列（图 2℃）。这一结果表明，金属外延可以从 ${}_2$ 延伸到非晶 ${SiO}_2$，突显了 Step-Eva 外延生长的鲁棒性。这一特性可能为 2D 半导体实现定义明确的边缘接触提供可能，并为 2D 金属的生长提供见解 (31)。对化学气相沉积（CVD）单层 ${}_2$ 上生长的 进行的大面积电子背散射衍射（EBSD）映射进一步揭示了其单晶

通过 Step-Eva 制备的 sc- A

B

C

D

E

G

图 2. 表征与分析。(A) 通过 Cont-Eva 和接触界面（I 到 IV）获得的多晶铋 (pc-Bi) 原子分辨率图像，其中金属表现出大量的晶界和缺陷，导致 MoS₂ 受损。比例尺：5 nm (I 和 III) 以及 10 nm (II 和 IV)。(B) 单晶铋 (sc-Bi)–MoS₂ 界面 (I 和 II) 的原子分辨率图像，显示出单晶特性和原子级洁净的界面。局部 FFT 图谱 (III) 证实了 的单晶性质，其 [0001] 生长方向垂直于基底。大面积原子分辨率图像 (IV 和 V) 证明了 sc- 在垂直和水平维度上的生长。比例尺：2 (I 和 ) 以及 5 (IV 和 V)。(C) 在 MoS₂ 断裂区域的原子分辨率成像显示 从 MoS₂ 边缘外延生长到 SiO₂ 上。比例尺：2 。(D) MoS₂ 上 sc- 的 EBSD 表征。(I) SiO₂ 上 CVD 生长的单层 MoS₂ 光学图像。() sc- 的反极图 (IPF)–EBSD 图谱，表明整个区域具有高度统一的 [0001] 取向。比例尺：50 μm (I) 和 20 μm ()。(E) 8 薄膜的大尺度 STEM 图像。比例尺：50 。(F) 使用两种方法制备的 MoS₂ 上 8 薄膜的电学测量。Step-Eva sc- 薄膜具有高导电性，而 Cont- pc- 薄膜没有明显的金属导电性。(插图) 器件结构示意图。(G) 8 Step- 薄膜的 XRD 分析。

性质以及在大尺度上高度统一的 [0001] 取向（图 2D）。我们进一步利用具有不同厚度的 Step- 薄膜研究了晶域随厚度的演变，这些薄膜保持相同的晶体学取向，且在 50 时，平均晶域尺寸达到了 $\sim31.8\ \mu m$（图 S11, A 和 B）。结果表明，随着厚度增加，Step- 能够实现稳定的 vdW 外延，且不产生无序晶粒。此外，我们证实了单晶生长与二维材料的厚度无关（图 S11, C 和 D）。单晶金属的一个直接优势是尺寸缩放，包括用于 3D 集成的厚度减小，以及用于减小接触多晶间距的宽度减小。在多晶金属中，由于晶粒尺寸和排列无法控制，减小金属尺寸具有挑战性。为了减小厚度，我们

使用两种蒸发方法在单层 $MoS_{2}$ 上制备了多晶和单晶金属，厚度低至 8 。sc- 薄膜在大面积上保持了极平整且均匀的形貌，而 pc- 薄膜由于晶粒无序而变得不连续（图 2E）。尽管厚度极薄，8 sc- 薄膜承载的电流密度高达 $\sim4\ mA\ \mu m^{-1}$，而 pc- 薄膜没有明显的金属导电性，仅表现出底层 $MoS_{2}$ 通道的电流（图 2F）。为了评估宽度减小，我们制备了相应的 $MoS_{2}$ 晶体管器件，其金属宽度减小至 50 （图 S12）。与使用传统的 500 宽电极的器件相比，该器件的性能没有出现实质性下降。此外，sc- 薄膜的 XRD 在 (0003)、(0006) 和 (0009) 处显示出三个明显的单晶峰，

这与我们的 STEM 结果及之前的研究一致（图 2G）(32–34)。

通用性、功函数与 Schottky–Mott 行为

利用原子分辨率成像，我们进一步证明了 sc-Ag、sc-In、sc-Au 和 sc-Pd 在单层 $MoS_{2}$ 上生长良好且界面洁净（图 3A）。针对每种金属的大量原子分辨率图像、额外的衍射图样和元素分析（图 S13 至 S16），以及 EBSD 映射（图 S17），进一步证实了这一结论。Step-Eva 方法同样兼容其他 2D 材料，例如单层 $WSe_{2}$（图 S18）。原则上，该方法可以扩展到广泛的金属和 2D 材料。然而，不同金属的早期生长行为略有不同，正如我们对 Au 外延生长的详细研究所示（图 S19）。对于这类高熔点金属，由于金属内聚能与吸附能之间的平衡，早期阶段的横向生长较弱，岛状生长更为明显。尽管早期生长存在这些差异，但 Step-Eva 实现的动力学调制在抑制二次成核和促进横向合并方面依然有效。局部 FFT 分析进一步表明，早期的金属岛（如 Au 岛）相对于下方的 $MoS_{2}$ 晶格仍保持一致的单晶特性和外延取向（图 S20）。此外，Step-Eva 的工艺参数，特别是暂停时间，可能会根据金属种类和具体的蒸发系统而有所不同。例如，对于 Au，在每步 <0.6 nm 且暂停时间 >5 min 的工艺窗口内可保持高质量生长（图 S21）。尽管存在这些差异，本研究中使用的条件（即每步 0.5 nm 且暂停时间 5 min）处于此处研究的大多数金属的适用工艺窗口内，因此在本研究中作为通用参数。关于金属的生长取向，由于 Step-Eva 制备的单晶遵循 vdW 外延机制，其生长遵循热力学原理，且无论基底如何，均优先沿最低能量面生长：Bi 沿 (0001) 面生长，而 In，

A B

C

D

E

图 3. 通用性、功函数与 Schottky–Mott 行为。(A) 其他单晶金属（sc-metals）——包括 sc-Ag、-In、-Au 和 -Pd——在单层 MoS${2}$ 上的原子分辨率图像。所有金属均表现出长程有序结构和原子级洁净界面。比例尺：1 nm (I 和 IV) 以及 2 nm (II 和 III)。(B) 通过 Step-Eva 和 Cont-Eva 方法制备的金属（In, Bi, Ag, Au 和 Pd）功函数的统计对比，其中 Step-Eva 制备的单晶金属表现出稳定且接近其体相单晶对应值的功函数，而 Cont-Eva 制备的多晶金属（pc-metals）则表现出较大的离散度和不稳定性。误差棒表示 3 次独立测量的标准差，数据点表示平均值。(C) MoS${2}$ 上 -Bi 和 pc- 薄膜的 KPFM 电势图，显示 - 接触比 pc- 接触具有更均匀的表面电势分布。(D) 不同温度下具有 -Ag 和 -Pd 接触的 MoS${2}$ 晶体管的 I${DS}$-V$_{GS}$ 曲线，其中通过低功函数和高功函数的单晶金属分别实现了 n 型和 p 型转移特性。(E) 提取的 Schottky 势垒高度随单晶金属功函数变化的函数关系。提取的 Schottky 势垒高度随各种单晶金属接触的功函数线性变化，得出钉扎因子 S = 0.92。误差棒表示 5 次独立测量的标准差，数据点表示平均值。

Ag, Au 和 Pd 沿 (111) 面生长。此外，我们还研究了不同超薄单晶金属的最小导电厚度（图 S22）。所有经过检测的单晶金属在 10 nm 以下仍保持导电性，且 和 Pd 在 3 nm 时仍具有导电性，这表明 Step-Eva 在未来的工艺设计和实际应用中具有制造超薄电极的潜力。

这些单晶金属的另一个重要优势是其定义明确且稳定的功函数，这源于其均匀的晶体取向和洁净的表面状态。例如，Step-Eva 制备的 - 表现出 3.98 eV 的功函数，与其体相单晶值一致，而 Cont-Eva 制备的 pc- 则显示出更高的功函数 4.13 eV，且具有 0.1 到 0.2 eV 的较大离散度（图 S23）。我们从 3 次独立测量中提取了两种方法的平均功函数值和标准差，证实 Step-Eva 单晶金属一致地表现出定义明确且稳定的功函数（图 3B）。此外，通过对 进行的空间分辨开尔文探针力显微镜（KPFM）测量（图 3℃ 和图 S24, A 和 B）可见，这些单晶金属有效地抑制了局部电势波动和功函数的不均匀性。在 Au 中也观察到了类似的改善（图 S24℃）。稳定且空间均匀的功函数使得单晶金属接触更具优势且更可靠。

基于上述优势，进一步评估单晶金属（sc-metal）接触的肖特基-莫特（Schottky–Mott）行为具有重要意义，这对于突破接触性能的极限至关重要。通过使用具有不同功函数的单晶金属与 $MoS_{2}$ 接触，我们在本征 $MoS_{2}$ 通道晶体管中实现了 n 型和 p 型传输特性之间的可控切换。在此，低功函数金属 [如铟 (In)、银 (Ag) 和铜 (Cu)] 导致 n 型特性，而高功函数金属（如金 (Au) 和钯 (Pd)）则导致 p 型特性（图 3D 和图 S25）。提取的不同金属的肖特基势垒与功函数之间显示出高度的线性相关性（图 3E）。拟合的钉扎因子为 0.92，表明具有显著的肖特基-莫特行为，而此前人们认为这主要通过转移金属电极才能实现 (15)。单晶金属-2D 半导体接触的界面分析表明，界面处于弱耦合的范德华（vdW）型接触机制内，具有中等界面距离（图 S26）。此类界面在提供足够电子耦合以实现高效载流子注入的同时，抑制了导致费米能级钉扎（FLP）的强杂化，从而实现了肖特基-莫特行为。

二维半导体低电阻 n 型和 p 型接触

单晶金属-二维半导体接触——具有洁净、低损伤的范德华（vdW）界面以及定义明确且空间均匀的金属功函数——有望提高接触性能。我们全面评估了用于 n 型和 p 型二维接触的单晶金属（sc-metals）。对于 n 型接触，单层 $\text{MoS}{2}$ 晶体管采用单晶铋（sc-Bi）接触，在转移特性（$I{DS}-V_{GS}$）中显示出 $>10^{10}$ 的超高开关比（图 4.A），这比多晶铋（pc-Bi）器件高出约两个数量级。该器件还表现出高度线性的输出特性（$I_{DS}-V_{}$）（图 4.B）。随温度变化的测量和分析揭示了明显的金属-绝缘体相变行为以及接近于零的肖特基势垒（$\Phi_{B}$）（图 S27, A 和 B）。我们进一步使用传输线法（TLM）来提取接触电阻（$R_{C}$）（图 S27, C 和 D）。在载流子密度 $n_{2D} = 1.6 \times 10^{13} \, \text{cm}^{-2}$ 时，$2R_{C}$ 值低至 72 $\Omega \cdot \mu{m}$（图 4.C），接近 28 $\Omega \cdot \mu{m}$ 的量子极限，且比报道的多晶铋器件低约 3.5 倍 (12, 20)。短沟道器件进一步证实了超低 $R_{C}$。当沟道长度（$L_{CH}$）缩减至 $\sim 50$ nm 时，器件仍保持 $>10^{8}$ 的开关比（图 S27E），且在 $V_{} = 1.5 \, {V}$ 时最大电流密度达到 1.31 ${mA} \cdot \mu{m}^{-1}$（图 4.D）。对 60 个器件的统计分析进一步证明了单晶铋接触的高重现性和优越性（图 S28）。

A

B

C D

G

E F

H

J 1L-${WSe}_{2}$ p 型接触 K

I 1L-${MoS}_{2}$ n 型接触

图 4. 二维半导体低电阻 n 型和 p 型接触。(A) 采用 sc- 和 pc- 接触的 1L-${MoS}{2}$ 场效应晶体管（FETs）的 $I{\mathrm{}} - V_{\mathrm{GS}}$ 曲线。(B) sc- 器件在不同 $V_{{GS}}$ 下的 $I_{{}} - V_{{}}$ 曲线。(C) 使用 TLM 为 sc- / 1L-${MoS}{2}$ FET 提取的 $R{{C}}$。（插图）TLM 器件的 SEM 图像。比例尺 500 nm。(D) 短沟道 sc- / 1L-${MoS}{2}$ FET（$L{{CH}} \approx 50$ nm）的 $I_{{}} - V_{{}}$ 曲线。（插图）短沟道器件的 SEM 图像。比例尺 200 nm。(E) 采用 sc-Pd 和 pc-Pd 接触的 1L-${WSe}{2}$ FETs 的 $I{{}} - V_{{GS}}$ 曲线。(F) 该器件在不同 $V_{{GS}}$ 下的 $I_{{}} - V_{{}}$ 曲线。(G) $R_{{C}}$

通过对 sc-Pd / 1L-WSe$2$ FET 使用 TLM 法提取得出。(插图) TLM 器件的 SEM 图像。比例尺，500 nm。(H) 短沟道 sc-Pd / 1L-WSe$_2$ FET ($L{{CH}} \approx 50$ nm) 的 $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{DS}}$ 曲线。(插图) 短沟道器件的 SEM 图像。比例尺，200 nm。(I 和 J) 针对 1L-MoS$2$ 和 1L-WSe$_2$ 的前沿接触技术中，(I) n 型和 (J) p 型 $R{{C}}$ 的对比，绘制为 $n_{2{D}}$ 或 $p_{2{D}}$ 的函数。黑色实线表示 $2R_{{C}}$ 的量子极限，根据 $\pi h / (4q^2 k_F) \approx 0.036(n_{2{D}})^{-0.5}$ 千欧·μm，其中 $h$ 为普朗克常数，$q$ 为单位电荷，$k_{{F}}$ 为费米波矢量，$n_{2{D}}$ 和 $p_{2{D}}$ 为 2D 片层载流子密度。(K) 具有 pc-Bi（正方形）和 -Bi（圆形）接触的器件的温度依赖归一化 $I_{{ON}}$。

对于 p 型接触，具有 - 接触的单层 WSe$2$ 晶体管同样显示出 $>10^{10}$ 的超高开关比（图 4E）。在相同的器件几何结构下，- 器件的电流比 pc- 器件高出约一个数量级，这可归因于 pc- 波动金属功函数以及 pc--WSe$_2$ 界面处强烈的费米能级钉扎（FLP）。室温 $I{\text{}} - V_{\text{}}$ 特性显示出高度线性，进一步证明了高质量欧姆接触的形成（图 4F）。低温 $I_{{}} - V_{{}}$ 特性保持高度线性，并伴有明显的金属-绝缘体相变行为（图 S29, A 和 B）。提取出的 - 接触肖特基势垒仅为 16 meV，几乎可以忽略不计（图 S29℃）。在载流子密度 $p_{2{D}} = 7.5 \times 10^{12} { cm}^{-2}$ 时，$R_{{C}}$ 值低至 145 ohm·μm（图 4G 和图 S29, D 和 E）。对于具有 - 接触的短沟道 WSe$2$ 器件 ($L{{CH}} \approx 50 { nm}$)，器件同样维持了 $>10^8$ 的开关比（图 S29F），且在 $V_{{}} = -1.5 { V}$ 时最大电流密度达到 1.1 mA μm$^{-1}$（图 4H）。

我们将 n 型和 p 型接触电阻值与现有的前沿接触技术进行了基准对比。对于单层 ${MoS}_2$ 的 n 型接触，-Bi 接触表现出的 $R_C$ 值在现有接触技术报道的最低值之列（图 4I）(12, 20, 35–41)。尽管半金属接触通常能实现低 $R_C$，但我们的 -Bi 接触仍显示出最具竞争力的接触性能。对于单层 ${WSe}_2$ 的 p 型接触，- 接触在报道的金属接触和掺杂策略中同样显示出极具竞争力的性能（图 4J）(42–47)。最后，我们发现 -金属接触赋予了器件增强的热稳定性。温度升温测量表明，-Bi 器件的最大耐温达到了 $\sim 705$ K，显著高于 pc-Bi 器件 ($\sim 510$ K)（图 4K 和图 S30, A 和 B）。此外，热耐久性测量显示，器件可以在 650 K 下连续运行数小时（图 S30）。这种增强的热稳定性主要归因于 -金属与多晶对应物相比具有高度有序、低缺陷的结构，这抑制了热诱导的快速电失效，从而拓宽了高温工作窗口。

结论

在原子级薄且无悬空键的二维半导体上生长单晶金属接触具有极高挑战性，但对于电子应用的进步至关重要。我们的工作提出了一种简单且通用的分步蒸发技术，实现了在单层二维半导体上直接生长单晶金属。我们证明了这些单晶金属接触具有若干显著优势，包括洁净且低损伤的界面、稳定且空间均匀的功函数以及近乎理想的肖特基-莫特（Schottky-Mott）行为，此外还具有可扩展的金属尺寸和增强的热稳定性等额外优势。这些耦合效应使单晶金属接触能够为 n 型和 p 型二维半导体提供高性能的接触解决方案，标志着从实验室演示向可扩展制造及最终工业化过渡的重要一步。我们进一步预见，这种沉积方法可扩展用于制备各种二维金属、半金属或半导体，有望推动进一步的科学探索和技术创新。最后，我们的发现对于指导下一代金属沉积技术的发展可能具有重要的实际意义。

2. B. Radisavljevic, A. Radenovic, J. Brivio, V. Giacometti, A. Kis, Nat. Nanotechnol. 6, 147–150 (2011).

参考文献与注释

1. M. Chhowalla, D. Jena, H. Zhang, Nat. Rev. Mater. 1, 16052 (2016).

2. D. Akinwande et al., Nature 573, 507–518 (2019).

3. S. Das et al., Nat. Electron. 4, 786–799 (2021).

4. J. Baringhaus et al., Nature 506, 349–354 (2014).

5. K. K. H. Smithe, C. D. English, S. V. Suryavanshi, E. Pop, 2D Mater. 4, 011009 (2017).

6. P. C. Shen et al., Nature 593, 211–217 (2021).

7. Y. Liu et al., Nature 557, 696–700 (2018).

8. Y. Zhang et al., Data from: Direct evaporation of single-crystal metal contacts for 2D semiconductors. Dryad (2026); https: / doi.org / 10.5061 / dryad.xwdbrv1tz.

9. Y. Wang et al., Rep. Prog. Phys. 84, 056501 (2021).

10. L. Liu et al., . Electron. 4, 342–347 (2021).

11. K. P. O'Brien et al., . Commun. 14, 6400 (2023).

12. D. Akinwande, C. Biswas, D. Jena, . Electron. 8, 96–98 (2025).

13. C. M. Went et al., Sci. Adv. 5, eaax6061 (2019).

14. Y. Wang et al., Nature 568, 70–74 (2019).

15. A. Allain, J. Kang, K. Banerjee, A. Kis, . Mater. 14, 1195–1205 (2015).

16. Y. Jung et al., . Electron. 2, 187–194 (2019).

17. C. C. Chiang, H. Y. Lan, C. S. Pang, J. Appenzeller, Z. Chen, IEEE Electron Device Lett. 43, 319–322 (2022).

18. L. Kong et al., . Commun. 14, 1014 (2023).

19. K. S. Kim et al., . Nanotechnol. 19, 895–906 (2024).

20. R. Kappera et al., . Mater. 13, 1128–1134 (2014).

21. G. Kwon et al., . Electron. 5, 241–247 (2022).

22. L. Kumari, J.-H. Lin, Y.-R. Ma, J. Phys. D Appl. Phys. 41, 025405 (2008).

23. W. Li et al., Nature 613, 274–279 (2023).

24. L. Ma, Y. Wang, Y. Liu, Chem. Rev. 124, 2583–2616 (2024).

25. L. Gao et al., Science 390, 813–818 (2025).

26. Y. Liu, P. Stradins, S.-H. Wei, Sci. Adv. 2, e1600069 (2016).

27. Y. Wang, M. Chhowalla, . Rev. Phys. 4, 101–112 (2021).

28. Y. Wang et al., Nature 610, 61–66 (2022).

29. Y.-J. Lu et al., Science 337, 450–453 (2012).

30. C. D. English, G. Shine, V. E. Dorgan, K. C. Saraswat, E. Pop, Nano Lett. 16, 3824–3830 (2016).

31. J.-S. Huang et al., . Commun. 1, 150 (2010).

32. J. Jiang et al., . Commun. 16, 10233 (2025).

33. B.-T. Chou et al., Sci. Rep. 6, 19887 (2016).

34. Y. Wang, S. Sarkar, H. Yan, M. Chhowalla, . Electron. 7, 638–645 (2024).

35. Y. Tolstova, S. T. Omelchenko, A. M. Shing, H. A. Atwater, Sci. Rep. 6, 23232 (2016).

36. S. Chen, Y. Zhang, W. P. King, R. Bashir, A. M. van der Zande, Adv. Electron. Mater. 11, 2400843 (2025).

37. F. Cemin et al., Sci. Rep. 7, 1655 (2017).

38. E. Lotfi et al., Eur. Phys. J. D 66, 207 (2012).

39. J. Zhao et al., Nature 639, 354–359 (2025).

40. A. Kumar et al., "Sub-200 $\Omega$ - $\mu$ m alloyed contacts to synthetic monolayer MoS $_{2}$ " in 2021 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM), 11 to 16 December 2021 (2021), pp. 7.3.1–7.3.4; https: / doi.org / 10.1109 / IEDM19574.2021.9720609.

41. H.-Y. Lan et al., . Commun. 16, 4160 (2025).

42. C. D. English, K. K. H. Smithe, R. L. Xu, E. Pop, "Approaching ballistic transport in monolayer MoS $_{2}$ transistors with self-aligned 10 nm top gates" in 2016 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM), 3 to 7 December 2016 (2016), pp. 5.6.1–5.6.4; https: / doi.org / 10.1109 / IEDM.2016.7838355.

43. J. Xie et al., Nano Lett. 24, 5937–5943 (2024).

44. N. Z. El-Sayed, Vacuum 80, 860–863 (2006).

45. L. Kumari et al., Appl. Surf. Sci. 253, 5931–5938 (2007).

46. H. Y. Lan, R. Tripathi, X. Liu, J. Appenzeller, Z. Chen, “Wafer-scale CVD monolayer WSe $_{2}$ p-FETs with record-high 727 $\mu$ A / $\mu$ m ion and 490 $\mu$ S / $\mu$ m gmax via hybrid charge transfer and molecular doping” in 2023 International Electron Devices Meeting (IEDM), 9 to 13 December 2023 (2023), pp. 1–4; https: / doi.org / 10.1109 / IEDM45741.2023.10413736.

47. X. Shi 等，“通过在 $\text{SiO}2$ 基底上直接生长和制备，实现记录级 $I{\text{ds}} = 425 \mu{A} / \mu{m}$ 且 $G_{{m}} = 100 \mu{S} / \mu{m}$（在 $V_{{ds}} = -1 {V}$ 时）的高性能双层 ${WSe}_2$ pFET”，载于 2022 年国际电子器件会议 (IEDM)，2022 年 12 月 3 日至 7 日 (2022)，第 7.1.1–7.1.4 页；https: / doi.org / 10.1109 / IEDM45625.2022.10019404。

致谢

资金支持：中国国家自然科学基金项目 62588101 (J.C.)；“十四五”国家重点研发计划项目 2021YFA1200700 (J.W.)；中国科学院战略先导研究项目 XDB0580000 (X.W.)；中国国家自然科学基金项目 62535018 (X.W.)；中国国家自然科学基金项目 62334001 (X.W.)；中国国家自然科学基金项目 62431025 (J.W.)；中国国家自然科学基金项目 62561160113 (J.W.)；中国国家自然科学基金项目 62404231 (C.L.)；中国国家自然科学基金项目 62025405 (J.W.)；中国国家自然科学基金项目 U24A20302 (L.L.)；中国国家自然科学基金项目 62134001 (L.L.)；中国国家自然科学基金项目 92577001 (L.L.)；中国国家自然科学基金项目 62575074 (Y.C.)；中国国家自然科学基金项目 62405061 (S.W.)；中国国家自然科学基金项目 62404232 (B.W.)；云南省科学技术厅项目 202402AC080002 (X.M.)；新加坡国家研究基金会教授项目 NRF-P2025-002 (L.-J.L.)；新加坡教育部项目 A-8004854-00-00 (L.-J.L.)；中国教育部复旦大学纳米信息科学创新支持中心项目 (J.W.)；复旦鲲鹏-昇腾培养中心 (J.W.)；111 中心项目 B25033 (C.L.)。作者贡献：概念化：J.W., L.-J.L., L.L., X.W., C.L.；方法论：Y.Z., C.L., X.W., J.W.；调查研究：Y.Z., G.T., H.W., Y.Q., C.L., X.W.；形式分析：Y.Z., C.L., Y.Q., X.W., J.W., L.-J.L.；资金获取：J.C., J.W., X.W., L.-J.L., L.L., C.L., Y.C., S.W., B.W., X.M.；监督指导：J.W., X.W., L.-J.L., L.L., C.L.；初稿撰写：Y.Z., C.L., X.W., Y.Q., J.W., L.-J.L.；审阅与编辑：Y.Z., C.L., H.W., G.T., Y.Q., W.N., S.D., B.W., S.W., Y.C., N.Y., T.L., H.S., X.M., Y.L., X.Z., X.W., L.L., J.C., L.-J.L., J.W.。竞争利益：X.W., C.L., Y.Z., S.W., H.S., T.L., X.M., J.C. 和 J.W. 是中国发明专利 ZL202510983258.6 的发明人，该专利由中国科学院上海技术物理研究所持有，涵盖了与制备 sc-metal 接触相关的某些方法论方面。作者声明没有其他竞争利益。数据、代码和材料可用性：本研究中图表的基础数据可在 Dryad (48) 获取。评估本文结论所需的所有其他数据均在正文或补充材料中提供。本研究未产生新材料。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。对美国政府原始作品不主张权利。https: / www.science.org / about / science-licenses-journal-article-reuse

补充材料

材料与方法；补充文本；图 S1 至 S32；参考文献 (49–53)

提交日期：2025年11月28日；接收日期：2026年6月25日

10.1126 / science.aee3132

SciLine 助力记者在期中选举新闻报道中引入科学证据

卡门·诺贝尔 (CARMEN NOBEL)

在 2026 年期中选举季期间，美国科学促进会 (AAAS) 的 SciLine 项目正提供一系列资源，旨在帮助记者理解并向选民解释，针对全美 50 个州地方选举中所涉及的议题，科学能提供怎样的见解。

科学在今年的选票之上。政治候选人们正在就诸多议题展开辩论，例如如何管理数据中心的能源和用水需求；是否废除财产税；以及如何应对处方药、燃料和住房成本——这些都是社会科学家深入研究过的课题。而且，今年选举的结果还可能影响未来科学研究的资金资助方式。在这样一个年份里，选举故事同样是科学故事。

SciLine 的期中选举项目包括基于证据的指南和规划，旨在实现 SciLine 的唯一使命：增加新闻报道中科学证据的数量并提升其质量。

这一使命从未如此重要。在新闻编辑室大规模裁员的浪潮中，记者必须在海量的政策变动和重大新闻事件中理清头绪；面对关于选举舞弊、疫苗及其他时政议题的虚假主张之海；以及面对一个日益依赖社交媒体获取信息且政治极化严重的选民群体。

“对于记者来说，这次选举带来了一场挑战的‘完美风暴’，”SciLine 主任马特·德里恩佐 (Matt DeRienzo) 表示。“资源短缺一如既往地是个挑战，曾经不具争议的议题现在被政治化了，而且虚假信息的传播速度和复杂程度正随着人工智能 (AI) 而升级。”

通过使用 SciLine 的选举报道工具包以及其提供的免费截稿前服务，记者可以让其报道及其受众立足于科学。阅读这些指南的记者将学习如何跳出竞选活动中政治上的唇枪舌剑，学会利用科学研究结果来解释类似的政策在历史上如何运作、何时运作以及是否有效。他们将从研究这些课题特定方面数十年的科学家那里获得报道灵感。他们将发现包含国家议题地方统计数据的在线数据库。此外，他们还将获得专家建议，学习如何以科学的准确性和细致度来报道极具争议的话题。

该选举报道工具包在 SciLine 网站 (www.sciline.org) 上免费提供，并分发给全国数千名地方记者，它包含两条路径：

一条路径针对地方、州和国家候选人在选举日临近时辩论的政策议题，以及出现在全国各州选票提案中的议题。该路径处理的问题包括 AI 数据中心、住房负担能力、燃料成本和药品价格。SciLine 还在帮助地方记者报道联邦研究资金和监管的未来，近期就拟议的管理和预算办公室 (OMB) 变更及其可能对各州和社区产生的影响制作了一份详尽的报道指南。

另一条路径涵盖选举机制本身的底层科学，重点关注经常成为误导信息和虚假叙事目标的议题。这些指南帮助记——

...SciLine 的唯一使命 [是] 增加新闻报道中科学证据的数量并提升其质量。

者评估关于选举安全的政治主张，例如，探讨科学证据如何揭示邮寄投票舞弊的普遍程度（实际上极其罕见），并阐明关于 2020 年选举中投票机舞弊的重启主张（多项研究已对此类主张进行审查，未发现支持证据）。

除了发布这些报道指南，SciLine 还将通过以下方式支持选举新闻报道：提供如何从科学证据角度报道政治的培训，举办关于选举相关议题的科学家实时简报会，以及提供该组织独特的专家匹配服务。该服务可在截稿期限前将记者与科学家联系起来，就可以通过科学证据和专业知识来丰富内容的具体本地故事进行采访。

重要的是，SciLine 也在这个艰难时期为科学家提供支持。其匹配服务将科学家与讲述其研究工作以及向经过审核的记者分享知识的机会联系起来。SciLine 还提供一系列基于研究的培训计划，帮助科学家在面对媒体讲述自己的工作时建立信心，并引导他们如何讨论那些日益政治化的研究和科学领域。

SciLine 成立于 2017 年，总部设在 AAAS，由慈善资金资助。其工作得益于 Quadrivium 基金会、Eucalyptus 基金会、MAC3 Impact Philanthropies、沃尔顿家族（Walton Family）、西蒙斯（Simons）、Lyda Hill Philanthropies、Daniel Pinkel、Ersen Arseven、Leo Model、Marc Haas 以及个人捐款的支持。

功能包括：

■ 对您的技能、兴趣和价值观进行评估。

■ 预测最适合您的职业路径。

■ 提醒您实现战略目标。

今天就开始规划您的未来吧！

合作伙伴：

终身制教职岗位 休斯顿卫理公会医院 / 莱斯神经系统修复中心

神经系统修复中心现正招聘一名开放职级的教职人员（助理教授、副教授或教授级别），该岗位将在休斯顿卫理公会研究学院、莱斯大学和威尔康奈尔医学院共同任职。强烈鼓励在非侵入性或侵入性人类大脑研究方法（包括但不限于电生理学、成像、超声、经颅磁刺激 [TMS] 和计算方法）方面具有相关培训和经验的优秀候选人申请。理想的候选人应在基础科学方法的发现与应用方面拥有良好记录，且这些方法能够为开发治疗脑功能障碍的创新疗法提供潜在见解。成功的候选人将成为提升我们研究能力的驱动力，致力于与其他研究人员开展创新且具有突破性的研究，并充分利用德克萨斯医学中心的创新研究和转化环境。候选人必须拥有 PhD、MD / PhD 或 MD 学位，完成相关的博士后经历，拥有强大的论文发表记录以及科学发现的历史。

申请请将申请信、个人简历（CV）以及三位推荐人的姓名发送至：hmairecruitment@houstonmethodist.org 和 amchime@houstonmethodist.org

HOUSTON Methodist® 引领医学

正在寻找 科学领域的 工作？ 我们提供 解决方案。

在 ScienceCareers.org 寻找您的下一份工作

ScienceCareers

来自《科学》杂志 AAAS

在照顾他人的同时照顾自己

布里安娜·格里芬 (Breana Griffin)

M

我成为一名心理学家的梦想正变成一场噩梦。在博士就读第二年被诊断出两种慢性疾病后，我陷入了无止境的循环：在医生预约与研究会议之间奔波，在深夜学习与次日上午的崩溃之间切换，在物理治疗与办公时间之间周旋，在医院就诊与实习培训之间往返。我再也无法达到我对一名学术工作者的预期：高效、能干、富有成效。这份职业对我来说是否还可能？这个问题沉重地压在心头。而我的反应则更为沉重：也许是不可能的。我受过专业训练，能够识别自己正在经历的情绪：悲恸。然而，我依然感到迷茫。

我的学术训练一直进展顺利，直到研究生第二年初，我开始感到疲劳、慢性疼痛以及偶尔晕厥。当我的同窗们为了完成第一篇论文而熬夜时，我即便在睡足一整晚后，也仅仅是为了能勉强撑到去上课。冒充者综合征（Imposter syndrome）发作了。由于疼痛，我难以在书桌前长时间停留。当我起身伸展时，心跳加速，头晕目眩。起初只是 15 分钟的休息，有时竟会变成一整天的停工。我错过了截止日期，缺勤次数不断累积。为了给学业节省精力，我放弃了对缓解压力至关重要的社交和休闲活动，这使我陷入了严重的抑郁发作。我越是强迫自己以以往的方式去取得成就，症状就越严重。

经过大量检测，我最终被诊断为体位性心动过速综合征（postural orthostatic tachycardia syndrome）和超关节活动 Ehlers-Danlos 综合征（hypermobile Ehlers-Danlos syndrome）。我不得不面对这样一个事实：如果我过度压榨自己的身心，我终将崩溃。我在大学的残障资源中心注册了，但对于使用其支持系统或探索让工作变得更易管理的方法犹豫不决。相反，我又独自勉强支撑了一年，在感到与大多数同事格格不入的不适感，以及尝试践行自我关怀之间反复摇摆。

随后，在项目的第四年，我开始了一次实习经历——在同一个残障资源中心担任治疗师。我注意到，几乎所有的来访者都面临着与我相同的内心挣扎，他们怀疑自己是否配得上所寻求的便利措施。我发现自己不断重复这样一句话：“仅仅因为你的杯子与众不同，并不意味着你不能从中倾倒。但没有人能从一个空杯中倾倒。”我意识到自己是个多么虚伪的人。我终于承认，我也配得到支持来填满自己的杯子。

我了解到了我可以获得哪些帮助：一些我之前从未考虑过的实用工具和财务支持，例如支持基本生活需求和医疗用品费用的资金，以及与有着相似经历的人建立联系。我开始寻求治疗师的帮助，以管理学业和疾病带来的压力，并且不再让自我关怀在学业面前退居其次。我与项目教师协商，使我的工作空间更具功能性和无障碍性，例如在教学时使用高凳，并在工作区域为我的助行设备留出开放空间。我与导师共同商讨工作时间，确保我在状态较好时工作，在状态较差时休息。

过程并非一帆风顺。当我实习诊所的电梯损坏数月之久时，我的教师们给出的第一个建议不是为我寻找另一种工作方式，而是寻找其他学生来代替我工作。但是，通过与教师们坚持不懈的沟通与协作，我争取到了远程工作的便利措施，并向自己和导师证明，即使我的工作方式与他人略有不同，我依然能产出高质量的工作成果。

通过这段旅程，我发现我并不孤单，而且寻求帮助是一种洞察力，也是对我自身的一种信心，这对我所从事的工作具有不可估量的价值。尽管疾病让我失去了很多，但我获得了发声的能力和自主权，让我能够决定不仅要成为一名心理学家，还要成为我想成为的那种学者：在科学研究、社会服务以及自我管理方面，都能保持同情心、坚定且平衡。

布里安娜·格里芬（Breana Griffin）是伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的博士生。

让 Science Careers 助力您的职业发展。

■ 在 ScienceCareers.org 注册免费在线账户。

■ 搜索数百个职位空缺。

■ 订阅符合您标准的职位提醒。

■ 将您的简历上传至我们的数据库，以便与雇主建立联系。

■ 观看我们关于求职、社交等不同职业主题的众多网络研讨会。

■ 下载我们的职业手册，包括《职业基础》(Career Basics)、《实验室之外的职业》(Careers Beyond the Bench) 以及《技能开发》(Developing Your Skills)。

■ 在“my IDP”完成个性化的职业规划。

- 从我们拥有数千篇文章的库中阅读相关的职业建议文章。

访问 ScienceCareers.org —— 所有资源均免费

陈氏研究所与《科学》杂志 AI 加速研究奖旨在表彰在人工智能与自然科学交叉领域推动跨学科突破的优秀早期职业研究人员。通过认可大胆的构想并提升不同科学领域内的创新工作，该奖项旨在突出在 AI era 驱动发现的下一代思想家。我们邀请全球青年科学家提交一篇 1,000 字的论文，描述其 AI 驱动的项目。

一个独立的评审小组将评选出一名大奖获得者，该获得者将获得 $30,000, 其论文将在《科学》杂志上发表，并获赠该杂志五年的免费订阅。两名入围者将各获得 $10,000, 以及同样的五年订阅权，其论文将在 Science Online 上发表。

立即申请

截止日期：12 月 13

AAAS Science

PSEUDOKNOT RNA

Generative AI rivals human experts at RNA design pp. 859 & 931

27 AUGUST 2026

Receive Prize Money Publish in Science Journals Achieve International Recognition

In partnership with our generous sponsors, Science Awards and Prizes is celebrating the winning essays so far this year from five of our international prize programs, each recognizing exceptional early-career researchers whose pioneering work is advancing knowledge and making a meaningful impact across their respective fields.

Through the Science Awards and Prizes program, more than \$300,000 in prize funding is awarded annually, providing recipients with critical resources to propel their research forward, establish independent laboratories, pursue ambitious new lines of inquiry, and build the foundations for the next stage of their scientific careers.

Grand Prize Winner

Satellite data can help transform food systems Published 5 February 2026

Changing practice and policy for patients with early pregnancy loss Published 1 April 2026

Grand Prize Winner Fábio F. Rosa Turning tumors against themselves Published 2 April 2 2026

Grand Prize Winner Sergey Stavisky Regaining your voice Published 16 July 16 2026

Grand Prize Winner Jan Elaine Soriano Rewiring the paralyzed body's false alarm Published 30 July 2026

854

27 AUGUST 2026 VOLUME 393 | ISSUE 6814

CONTENTS

A view from inside a Varda Space Industries capsule, designed to process drugs in orbit, as it returned home in May 2025.

EDITORIAL

845 The worst energy policy in the world —P. Mahdavi and M. L. Ross

NEWS

846 Coral records suggest global warming is strengthening El Niño Finding bodes greater weather disruptions from the Pacific climate cycle —J. Vaz RESEARCH ARTICLE BY J. COLE ET AL., 10.1126/SCIENCE.ADY2660

848 Deadly tick-borne virus gains ground in Europe Kosovo's surveillance experience could help other countries prepare before human cases appear —R. Stone

849 NASA's Roman telescope readies a sweeping view of the universe

With Hubble's sharp vision and a view 100 times larger, the observatory will rapidly scan the cosmos for distant worlds and clues to dark energy —D. Clery

851 New chief of child health institute has MAHA ties Appointment of John Gaitanis draws concern that politics is driving leadership picks —J. Kaiser

852 Worldwide study of diseases gets historic funding influx Gates Foundation pledges \$540 million to a project often criticized for its opacity —G. Vogel

FEATURES

854 Orbital alchemy Maturing space labs and cheaper launches fuel dreams of manufacturing drugs and tissues in orbit —M. Greshko PODCAST

COMMENTARY

PERSPECTIVES

859 The knotty problem of RNA structure prediction Artificial intelligence enables the design of RNA pseudoknots —A. M. Mustoe and J. Guo RESEARCH ARTICLE p. 931

860 Ordering atoms on weak interaction

Van der Waals interaction guides the growth of single-crystal metals on two-dimensional semiconductors —J.-C. Shin and J. Kim RESEARCH ARTICLE p. 938

862 Rethink the cargo, rethink the carrier New transfer RNA medicines require redesigned lipid nanoparticles for delivery —J. W. Myerson and D. Weissman RESEARCH ARTICLE p. 881

863 Beyond wrinkles Can the skin microbiome shape healthy aging? —S. Jalili and J. Oh

BOOKS ET AL.

866 The history and future of sickle cell disease Promising new gene therapies have arrived, but it is too soon to claim a medical victory —A. Woolfson

LETTERS

867 Deep-sea mining outpaces both science and law —A. Olivera et al.

868 Desert flooding highlights a critical gap in climate change adaptation —J.-X. Gao et al.

868 A plea for public health support for war-torn El Obeid, Sudan —E. E. Siddig

ANALYSIS

POLICY ARTICLE

869 Correcting the logic behind the 2026 US vehicle emissions standard rollback Correction of selective assumptions and inconsistent interpretations of evidence would overturn policy justification —A. M. Bento et al.

RESEARCH

HIGHLIGHTS 872 From Science and other journals

RESEARCH SUMMARIES

875 Cell biology A necroptotic-to-apoptotic signaling axis underlies inflammatory bowel disease —J. Pang et al.

880

876 Neuroscience

Geckos such as the Australian knob-tailed gecko (Nephrurus levis) display remarkable sex chromosome variation.

Hierarchical sensory processing in zebrafish thalamocortical-like circuits —A.-T. Trinh et al.

877 Protein interactions Autism mutations rewire protein interaction networks to drive neurodevelopmental pathology —B. Wang et al.

878 Induced seismicity

375 Induced Seismoty Foreshock productivity and rupture nucleation in injection-induced earthquakes in western Canada —B. Wang et al.

879 Introgression Recovering signatures of archaic hominin introgression using ancestral recombination graphs — Y. Zhang et al.

880 Evolution Genomic predisposition is associated with the direction of sex chromosome evolution —Y. Zhou et al.

881 Gene therapy Nonviral delivery of chemically modified tRNA rescues nonsense mutations in cystic fibrosis —J. Chen et al. PERSPECTIVE p. 862

RESEARCH ARTICLES

882 Optoelectronics High-efficiency, long-lived lead-free perovskite light-emitting diodes —W. Bai et al.

888 Computer engineering Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging —L. Bian et al.

895 Metabolism SGLT2 inhibitors activate pantothenate kinase in the human heart —N. Forelli et al.

903 Plant genetics A tripartite genetic conflict system controls hybrid sterility in rice —X. He et al.

910 Organic chemistry Iron-catalyzed $[1+1+1]$ cyclopropanation by sequential coupling of an ester to two carbenes —L. Kong et al.

917 Device technology Tunnel field-effect transistors exhibiting performance beyond the Boltzmann thermionic limit —Z. Wu et al.

923 Ferroelectrics Thermal cycling–induced nitriding increases energy-storage density in titanate ferroelectric films —J. Yi et al.

931 RNA De novo design of RNA pseudoknots with deep learning —J. Townley et al. PERSPECTIVE p. 859

938 2D semiconductors Direct evaporation of single-crystal metal contacts for 2D semiconductors —Y. Zhang et al. PERSPECTIVE p. 860

ON THE COVER

Each diagram is a designed RNA pseudoknot, a structure in which loops pair with distant parts of the same molecule. On the citizen science platform Eterna, artificial intelligence methods matched expert human players at inventing sequences that fold into these shapes, opening a route to automatically designing RNA therapeutics, sensors, and catalysts from scratch. See pages 859 and 931. Image: J. Townley et al., Science 393, 931 (2026); Adapted by N. Jessup/Science

ON THE PODCAST Making drugs in space, the man who fed India, and what narwhals can teach us about changing seas

WORKING LIFE

946 Caring for myself while caring for others —B. Griffin

944 AAAS News & Notes 945 Science Careers

The worst energy policy in the world

Paasha Mahdavi and Michael L. Ross

The Iran war could serve as a turning point in accelerating the global transition away from fossil fuels: Every additional day that oil and gas prices are high and future supplies are uncertain, wind and solar power—cheaper and more scalable than ever before—grow all the more appealing. But nearly half of the world's countries have adopted emergency subsidies that research shows will make this transition slower, more expensive, and less equitable.

Consumer fuel subsidies are the worst kind of energy policy. They boost the most polluting kind of energy—fossil fuels—with a policy that is wasteful and deceptively hard to reverse. Besides increasing consumption, subsidies worsen air pollution, drain government budgets, discourage renew-

able investment, and disproportionately support wealthy urbanites. They are also staggeringly expensive; according to the International Energy Agency, global subsidies for fossil fuel consumption reached a record \$1 trillion in 2022. But their most alarming quality is their persistence. Once subsidies are in place, they are extraordinarily difficult to remove.

Research has shown that since 2003, there has been little global progress toward ending fuel subsidies, despite widespread

calls for their removal. Since the Paris Agreement in 2015, governments have tried harder than ever to rein in fuel subsidies yet have failed at a startling rate. Of the roughly 130 subsidy reforms attempted in the 21 biggest subsidizers between 2016 and 2023, 70% collapsed within a year. More than 90% were gone within 3 years.

Some reforms were reversed explicitly. This tends to occur after protests, which are common after deliberate price increases. Many episodes of government upheaval around the world have begun, at their core, as a fight over a few cents on a liter of gasoline.

Other reforms died quietly. Rising inflation or a falling currency can erode a reform's value month by month until the subsidy is effectively restored. A government can keep its new pump price in place and, by doing nothing else, let the subsidy reappear as the cost of buying refined fuel rises above the fixed retail price. This kind of silent erosion is now the single largest cause of reform failure.

The boldest reforms are the most fragile. Leaders who

Consumer fuel subsidies are the worst kind of energy policy.

allow domestic prices to rise in tandem with international market-based costs come under the greatest pressure to reverse course. Those who offer a modest tax waiver as a stopgap measure rarely let it expire; the next election, the next oil shock, or the next protest quietly convert temporary relief into permanent policy. A 2009 promise by the Group of 20 to phase out “inefficient fossil fuel subsidies” changed almost nothing. A similar pledge at the 2021 Glasgow climate summit has fared no better.

Why do government efforts keep falling short? For many consumers, the price of gasoline is the single most visible number in an economy. Unlike an electric bill or the price of bread, gas prices confront drivers every day of the week, typically posted in public locations. For politicians, few policy

levers are easier to reach for—and, evidence suggests, few are harder to put back.

There are better ways to cope with volatile fossil fuel prices. In Pakistan, Indonesia, and Egypt, civil servants must work from home at least 1 day a week; bus fares are now reduced or free in Chile, Lithuania, and the Philippines; and Spain is funding energy-saving home renovations and solar energy installations.

The 68 governments that have not used emergency measures to subsidize or regu-

late fuel costs should not start now. Those under pressure to enact temporary fuel tax holidays should recognize what research shows: Most of the benefits go to the wealthy, not the poor, and once enacted, these temporary measures usually become permanent. To help low-income households hurt by high energy prices, governments should adopt the measures that the International Monetary Fund calls “temporary, targeted, timely, and tailored.” These include cash transfers, targeted assistance for low-income households, and subsidies for public transportation. Such tools can help vulnerable citizens without prolonging the very crisis they are seeking to escape.

The Iran war represents a once-in-a-generation opportunity to accelerate the transition away from fossil fuels. But short-term measures that governments are taking—to help their citizens cope with elevated gasoline and diesel prices—will have long-term effects. Making fossil fuels cheaper now will have catastrophic consequences in the future.

CLIMATE SCIENCE

Coral records suggest global warming is strengthening El Niño

Finding bodes greater weather disruptions from the Pacific climate cycle

JULIA VAZ

Researchers use a drill to collect a core from submerged fossil corals in the Galápagos Islands.

The vibrant biodiversity of the Galápagos Islands has helped biologists from Charles Darwin onward unlock the mysteries of evolution. Now, corals growing around the archipelago in the tropical Pacific Ocean are providing clues to another enduring puzzle: whether global warming is changing El Niño, the recurring Pacific climate cycle that drives extreme weather around the world.

Climate models have offered conflicting answers so far. Historical El Niño records are too short to reveal a clear trend. And El Niño's own large natural swings have made it difficult to tease out any human influence.

But a 1000-year archive preserved in fossil corals from the Galápagos offers some of the strongest evidence yet that global warming is already making El Niño stronger. Reporting this week in Science, researchers found that temperature swings recorded in Galápagos corals—a place where the El Niño signal is strong—have intensified by 36% over the past 4 decades, far beyond anything seen in previous centuries. Along with other coral results elsewhere in the Pacific, the findings suggest “there’s something about this important source of climate extremes that has already changed in recent decades,” says Kim Cobb, a climate scientist at Brown University who was not part of the study.

The study doesn't prove climate change is the culprit. But because the intensification coincides with rapid postindustrial warming and exceeds El Niño's natural variability, the authors argue that human-driven warming is the leading explanation. "That's the thing that has changed over that time," says Julia Cole, a paleoclimatologist at the University of Michigan who led the study. “So if I get pushback on that, I would like to know what the alternative is.”

The stakes are enormous, as Cole herself witnessed when she first visited the Galápagos in 1989 and saw the devastation that spiking ocean temperatures during a 1982–83 El Niño inflicted on the islands' coral reefs. Beyond ecological damage, the extreme weather during large El Niño events can cause trillions of dollars of economic losses. As forecasters warn that this year's El Niño could end up the strongest in nearly a century, understanding whether climate change itself is strengthening the events has taken on new urgency.

“This system is the largest source of climate extremes on our planet,” Cobb says. “And if it is in itself becoming more extreme, that has some very serious implications for society, and it’s information that we should be acting on.”

El Niño events develop every 2 to 7 years, when weaker trade winds allow warmer waters from the western Pacific to flow east and pile up near the Galápagos. Through “teleconnections” in the atmosphere, the events have far-flung effects, for example causing flooding in South America and devastating droughts in some parts of Africa.

Diagnosing how the events might be changing has proved difficult. El Niño depends on subtle interactions among winds, ocean currents, and sea-surface temperatures that climate models struggle to reproduce. In many simulations, the eastern tropical Pacific starts out too cold. Those kinds of errors can ripple through the feedbacks that generate El Niño, causing models to disagree on how the phenomenon will respond to greenhouse warming. “Those can create uncertainty,” says Agus Santoso, a climate scientist with the World Climate Research Programme.

Historical records haven't delivered a clear verdict either. El Niño records span little more than a century, and satellite observations of the Pacific, critical to watching the events unfold, extend back only to the 1980s. But in ancient corals scientists can trace the phenomenon over centuries. “Corals are one of the best games in town for El Niño,” says Judson Partin, a geophysicist at the University of Texas at Austin who has been teasing El Niño signals from

corals in Vanuatu, an archipelago in the southwestern Pacific.

Corals build their skeletons from calcium carbonate precipitated from the surrounding water, adding a band of new growth each year. In the Galápagos, Cole and her colleagues drilled cores from corals—both on the beach and underwater. Back in the lab, the researchers measured trace amounts of strontium trapped in each carbonate layer. During El Niño events, when the Galápagos waters warm, the carbonate captures fewer of the large strontium atoms from the water.

The researchers also measured the carbonate's ratio of heavy oxygen, $\mathrm{O}^{18}$ , to ordinary $\mathrm{O}^{16}$ . Warmer water favors the incorporation of lighter oxygen, lowering the ratio. The heavy rains that fall on the Galápagos during

El Niños lower it further because rain is depleted in O $^{18}$ . Together, the signals provided a record of El Niño-driven temperature swings stretching back centuries. The team found those swings grew significantly stronger after global warming took off—far stronger than natural variability could explain.

The new findings echo an analysis of fossil corals from Kirimati in the central Pacific that Cobb and her colleagues reported in 2019, which found a 25% increase in El Niño variability. But the signal is even stronger in the Galápagos, where the warming effects from El Niño are the most extreme.

The study is unlikely to definitively settle the debate. But Santoso says newer climate models also support a link between warming and

El Niño. The latest models, which will inform the next report from the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC), tend to show that El Niño events will become stronger and more frequent as Earth warms, he says. “The fact that three separate analyses—models, paleorecords, and modern observations—are providing the same results is encouraging,” Santoso says.

The last IPCC report, in 2023, refrained from making statements on how global warming might impact El Niño. But Cobb, who helped draft the previous report, says the next report, expected in 2029, is likely to deliver a clearer message. “We are edging close to saying climate change has already had a considerable impact on the strength of El Niño.” □

IN FOCUS

An airborne tool to predict tree death

In the dense forests of Western Australia, a severe drought in 2023 and '24 killed jarrah, wandoo, and karri trees, leaving behind a landscape patchy with brown, brittle, fire-prone stands. The event led researchers to wonder whether they could predict where such die-offs might occur in the future. Now, in a paper published this month in Geophysical Research Letters, the team has unveiled a surprising new tool: gamma rays. Scientists measure the radiation by flying a machine called a gamma ray spectrometer over the forest. The gamma rays, which result from the natural decay of potassium-40 isotopes in soils derived from granite-rich bedrock, act as a proxy for soil depth, which in turn signals how much water a tree can access when rains are lean. The new method could be applied to other areas with similar soils, including Southeast Asia and sub-Saharan Africa, to identify trees that are especially vulnerable to drought. —Hannah Richter

Unlike many ticks, Hyalomma actively pursues potential hosts.

INFECTIOUS DISEASE

Deadly tick-borne virus gains ground in Europe

Kosovo's surveillance experience could help other countries prepare before human cases appear

RICHARD STONE in Pristina, Kosovo

Magnified on a monitor in Kurtesh Sherifi's laboratory, the 6-millimeter-long, armor-plated male

Hyalomma marginatum looked formidable. Even more unnerving, the tick is a hunter, says Sherifi, a veterinary parasitologist at the University of Prishtina. Unlike ticks that wait on vegetation for a passing host, Hyalomma, the principal vector of the virus that causes Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF), can travel hundreds of meters in search of cattle or another animal, Sherifi says. “If we’re in the field, Hyalomma are running after us.”

Kosovo has long been one of Europe's hot spots for CCHF, a human disease that can progress from fever and muscle pain to liver failure, severe bleeding, and death. From 2013 through '16, some three dozen people here were hospitalized and about one-third died. But decades of confronting CCHF have also made Kosovo, Europe's newest country, one of its most experienced in detecting and monitoring the disease.

Now, virologists are advising other European nations to draw on that expertise as the virus gains ground across the continent. “There should be concern, especially because of climate change," says Maryam Keshtkar-Jahromi, an infectious disease specialist at Johns Hopkins University. A review she co-authored, published in June in Virologica Sinica, concluded that CCHF could cause severe outbreaks in previously unaffected areas. Spain has recorded locally acquired CCHF since at least 2013 and continues to see sporadic infections, including three so far this year, one fatal. Portugal confirmed its first case in 2024; the patient died. And in 2023, CCHF virus turned up for the first time in ticks in France, where no locally acquired human case has yet been reported.

"My suspicion is that we will find CCHF in a lot of places we didn't expect it," says Jens Kuhn, an independent virologist who formerly directed virology at the U.S. National Institute of Allergy and Infectious Diseases's Integrated Research Facility.

Hyalomma have been hitching rides into Northern Europe on migrating birds for decades. But until recently, the ticks often encountered conditions too harsh to complete their life cycle. A warming European climate is changing that: Higher temperatures and longer summers now make it more likely that immature ticks will develop into adults and perhaps establish local populations, says Mohammed Parvage, an environmental scientist at the Swedish Veterinary Agency.

A 2025 review found that Hyalomma ticks had been reported at least once in 40 European countries. Finding Hyalomma doesn't necessarily mean the CCHF virus is present. But surveillance for it remains patchy across Europe, leaving an incomplete picture. “Countries that think they don’t have a particular virus typically don’t test for the virus,” Kuhn says.

Scientists also tend to focus on pathogens only after they cause conspicuous illness, Kuhn says, rather than while they circulate quietly in animals and vectors. In parts of Europe, researchers have already found evidence of CCHF virus circulating in ticks or animals without recent human cases. Once CCHF appears on a country's radar, diagnostic panels may expand—and suddenly more cases are detected.

Kosovo has spent decades learning how to look for CCHF. Its national public health laboratory was already performing antibody and polymerase chain reaction testing before the 2013 outbreak, often returning results the same day, says Xhevat Jakupi, a microbiologist at Kosovo's National

Institute of Public Health. Since then, its diagnostic and sequencing capabilities have expanded. Just as important, he says, is accumulated experience: “We know what works well and what doesn’t work.”

Keshtkar-Jahromi says that Kosovo, Albania, and Bulgaria, which have established surveillance systems, could help anchor a regional diagnostic network. This could involve broader surveillance of ticks and the pathogens they carry, Kuhn says, coupled with better tick identification and greater awareness among physicians.

As other countries confront the risk of CCHF, the human disease in Kosovo has dwindled to sporadic cases. Hyalomma remains common and the virus is still turning up in ticks: In a 2024 survey, Sherifi and colleagues found CCHF viral RNA in 16 of 1301 ticks collected around the country. Yet from 2016 through '25, Kosovo recorded a mere five human cases. "We're feeling more relaxed compared to previous years," Jakupi says. "But we're not sure how long this will last."

After the 2013 outbreak, authorities stepped up farmer education, treated livestock with tick-killing acaricides, improved diagnostics, and expanded tick surveillance. Sherifi believes those measures helped drive down cases of human disease. Fewer Kosovars now work small farms by hand, he says, and mechanization means fewer people encounter tick-infested livestock. (Livestock don't appear to get sick from the virus.) Farmers are also more aware of the danger of pulling ticks from animals with bare hands.

Another possibility is that the virus has simply entered a lull—or that it continues to circulate, with many human infections going undetected. A 2012 survey found CCHF antibodies in 4% of 1105 Kosovars without signs of infectious illness, suggesting many infections had gone unrecognized. The unusually high mortality rate among those diagnosed with the disease could reflect an undercounting of people with mild or no symptoms, Keshtkar-Jahromi says. “They don’t come to the hospital,” she says, so confirmed cases may represent “the tip of the iceberg.”

The prospect that infections can remain undetected adds urgency to calls for better surveillance. “The first diagnosed human case may not be the beginning of the story,” Parvage says. “It may simply be the first time we notice it.” □

ASTRONOMY

NASA's Roman telescope readies a sweeping view of the universe

With Hubble's sharp vision and a view 100 times larger, the observatory will rapidly scan the cosmos for distant worlds and clues to dark energy

DANIEL CLERY

In recent years, astronomy has become a big data science, with survey telescopes capturing thousands of objects in a single look. As soon as 30 August, NASA will take that approach into space with the launch of the \$4.3 billion Nancy Grace Roman Space Telescope. With the Hubble Space Telescope's sharp vision but a field of view 100 times larger, Roman will rapidly survey the sky to tackle some of astronomy's biggest questions—from the nature of dark energy to the demographics of planets around other stars.

Arriving 5 years after NASA's giant infrared observatory JWST, the 2.4-meter telescope will find vast numbers of intriguing targets that JWST can scrutinize later in detail. Roman will prostretching across time. Current measurements rely on fewer than 2000 supernovae closer to the Milky Way. “It’s a massive jump,” says Rebekah Hounsell of the University of Maryland, Baltimore County, co-leader of the supernova survey.

More clues will come from the cosmology survey, which will map more than 1 billion galaxies to probe dark energy's effect on galaxy clustering across cosmic time. It will also gauge subtle changes in the shapes of the galaxies caused by the gravitational pull of dark matter, the invisible cosmic ingredient that makes up most of the universe's mass. The shapes will reveal where the dark matter resides and, because it, too, is sensitive to cosmic acceleration, provide a third handle on dark energy.

“It is able to measure the demographics of planets that can’t be measured any other way.”

Scott Gaudi Ohio State University

duce “wonderful science and will provide some great inputs for JWST,” says astrophysicist Garth Illingworth of the University of California (UC), Santa Cruz.

Much of its first 5 years will be spent on three large surveys: one focusing on supernovae, another on cosmology, and the third on exoplanets. The first two projects aim to pin down dark energy, the mysterious driver of the universe's accelerating expansion. The task has taken on greater urgency after a ground-based survey found hints last year that the force may have changed over cosmic history rather than remaining constant, as predicted by cosmology's standard model.

The first survey will help astronomers follow up on those hints by yielding tens of thousands of distant supernovae, which provide reliable distance measures—key to gauging this cosmic

Together with data from two other survey telescopes, Europe's orbiting Euclid telescope and the Vera C. Rubin Observatory in Chile, the measurements should provide the sharpest constraints yet on dark energy. “It’s a pretty hard signal to measure,” says Olivier Doré of NASA’s Jet Propulsion Laboratory (JPL), who leads the cosmology survey. “We’re really pushing the limit in terms of the observational analysis.”

Probing dark energy will require years of data gathering, but the exoplanet census should generate more immediate results. Most of the roughly 6000 known exoplanets have been detected when they transit, or pass in front of their host star, temporarily dimming the starlight. Roman is expected to find 100,000 new transiting exoplanets, but this technique is biased: It's most sensitive to large planets in tight orbits, leaving large parts of the exoplanet population unexplored.

To go after those undiscovered planets, Roman will stare for months at the crowded center of the Milky Way, monitoring 100 million stars for brief brightenings caused by an effect known as gravitational microlensing. This occurs when a foreground star passes in front of a distant background star and the nearer star's gravity acts as a lens, briefly magnifying the more distant star's light. If the foreground star hosts a planet, it, too, can act as a lens, producing a characteristic

The Nancy Grace Roman Space Telescope's 2.4-meter mirror was donated by a U.S. spy agency.

double blip in the brightening. This little-used technique could reveal about 2500 planets that would otherwise be invisible, including ones smaller than Mars and farther from their stars. “It is able to measure the demographics of planets that can’t be measured any other way,” says Ohio State University astronomer Scott Gaudi, who leads the micro-lensing survey.

The observatory will also carry an experimental coronagraph, an instrument that uses specially shaped masks that block starlight to reveal the light of planets. Coronagraph-

equipped telescopes have already imaged a handful of large planets that are young and hot, producing their own infrared glow. But researchers hope Roman's more advanced coronagraph—aided by deformable mirrors that correct beam irregularities and ultrasensitive detectors that count individual photons—will be able to capture reflected light from older, cooler Jupiter-size exoplanets. "Roman is our first chance to see reflected light from a mature planet like Jupiter," says Bruce Macintosh, director of the UC Observatories and a member of the coronagraph team.

The images might even reveal the presence of clouds.

Roman itself has evolved considerably since a 2010 survey of the astrophysics community recommended NASA pursue what was then called the Wide-Field Infrared Survey Telescope. A large mirror originally intended for a spy satellite, donated by the National Reconnaissance Office, transformed the mission into a much more capable observatory, although later cost-cutting scaled back its coronagraph. Renamed in 2020 for Nancy Grace Roman, NASA's first chief astronomer, the mission has since remained largely on schedule.

Like other modern survey telescopes, Roman is designed to catch the unexpected. Whenever it revisits a patch of sky, software will automatically look for anything that has changed and rapidly alert astronomers worldwide—a scheme similar to one on Rubin. Alerts team leader Mansi Kasliwal of the California Institute of Technology hopes it will uncover everything from merging binary stars to pair-instability supernovae, a kind of stellar explosion thought to happen only to the universe's earliest stars. “Roman is going to kill it with its large field and depth,” she says.

Because the telescope will serve so many areas of astronomy, tensions developed over time allocations, but Roman's deputy project scientist, Jason Rhodes of JPL, says mission managers will be flexible. "We're going to adapt [the surveys] to what we feel the needs are," he says. And because every observation will immediately enter a public archive, astronomers everywhere will be able to mine Roman's immense data sets for discoveries no one has yet imagined.

BY THE NUMBERS

18,943

Antibody validation images from 15 companies that a scientific sleuth found had been manipulated. The images are supposed to show the commercial research antibodies work as intended.

New chief of child health institute has MAHA ties

Appointment of John Gaitanis draws concern that politics is driving leadership picks JOCELYN KAISER

The U.S. National Institutes of Health (NIH) last week named a pediatric neurologist with controversial views on autism to helm the agency's child health institute. The pick is stoking worries that NIH Director Jay Bhattacharya is choosing—or being forced to choose by his boss, Secretary of Health and Human Services (HHS) Robert F. Kennedy Jr.—leaders with fringe scientific views and no experience with NIH research funding.

Another new official at the child health institute who worked under Kennedy at HHS has already blocked grants that had been recommended by staff for funding or approved by the institute's previous interim leader.

John Gaitanis, who until July 2025 was at Brown University's Hasbro Children's Hospital, became director of the \$1.7 billion Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) on 23 August. Gaitanis earned an M.D. from Brown and trained at Harvard University-affiliated hospitals. He has headed pediatric neurology divisions at Brown and Tufts University and published research on epilepsy and autism.

But NIH's Reporter database offers no evidence he has ever received funding from NIH, and sources at the agency could not find him listed among researchers who served as outside peer reviewers on NIH grants. Several NIH staffers told Science they were alarmed at Gaitanis's appointment.

A former colleague of Gaitanis also expressed “surprise” he was chosen to lead a major government research institute. “He was sought after by patients who were seeking alternative therapies, and he was polarizing as to his views and his beliefs about vaccines and his investment in unconventional approaches,” says Brown physician-scientist Phyllis Dennery, Hasbro’s medical director. “His strengths were clinical and not really research as he had no NIH funding, nor had he worked on research projects in a way that resulted in publications.”

Gaitanis is affiliated with several autism organizations that hold views outside of the mainstream. For example, he serves on the board of the

Medical Academy of Pediatrics and Special Needs, which has promoted alternative medicine treatments for autism such as hyperbaric oxygen and leucovorin, a vitamin derivative that Trump administration officials last year promoted based on limited evidence. In April, Gaitanis co-founded a telehealth company offering leucovorin treatments. He has also served as a paid expert witness in a federal court for families claiming neurological harm from childhood vaccines.

Gaitanis has seemingly embraced Kennedy's controversial Make America Healthy Again agenda. In September 2025, he appeared at an autism event held by the MAHA Institute, a group that promotes the movement.

Also last year, Gaitanis was on a shortlist for the Centers for Disease Control and Prevention's Advisory Committee on Immunization Practices as part of an overhaul by Kennedy that brought in members who share his skepticism of vaccine safety. Gaitanis declined citing “prior professional obligations,” The Washington Post reported. He also told the Post, “I unequivocally support vaccination.”

Still, these and other ties to Kennedy's positions “are concerning,” says David Mandell, an autism researcher at the University of Pennsylvania. “Now he is going to oversee 1100 employees and a \$1.7 billion budget for an institute with which he has absolutely no experience.”

Gaitanis's appointment comes 2 weeks after another physician connected to Kennedy, endocrinologist Dorothy Fink, became deputy director and acting director of NICHD. After Trump took office in January 2025, Fink served as acting HHS secretary, where she oversaw moves such as a communications pause across the department that caused dozens of NIH grant-review meetings to be canceled and the closure of HHS offices overseeing diversity, equity, and inclusion efforts.

According to documents viewed by Science, Fink last week rejected several “paylists” of research proposals that her staff had recommended for funding. She also paused 11 pending awards that had cleared final approval by her predecessor as acting director. The topics of the paused awards range from child nutrition to violence prevention and the impact of policy changes on women's reproductive health. Policy-related research is undergoing new scrutiny under Bhattacharya, as Nature recently reported.

The suspended awards include several at public universities that NIH staff are supposed to leave alone because the schools are protected by ongoing litigation.

Because of the time needed to process grant paperwork, the disruptions could jeopardize NICHD's ability to spend its full 2026 budget by the end of the fiscal year on 30 September. “This is too late in the fiscal year to stop an approved paylist,” says Elizabeth Ginexi, a former NIH program director who has criticized policy changes under Trump.

Bhattacharya has begun to fill the top slots at 15 NIH institutes, most of which became vacant last year after multiple directors were fired or pushed out. He reassigned another director, the chief of NIH's environmental health institute, and replaced him with a friend of Vice President JD Vance. Aside from Gaitanis, Bhattacharya's six picks so far this year—some from within NIH, others outside—have been conventional choices.

Politico reported recently that NIH will soon name biotech executive Steven Quay as director of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). According to Politico, Quay was not recommended for an interview by NIH staff considering applicants but won Kennedy's backing. Quay is a proponent of the disputed theory shared by many within the Trump administration that NIAID virology funding contributed to a lab leak in China that caused the COVID-19 pandemic. Like Gaitanis, Quay apparently has never held NIH funding.

Both men show “no evidence of even a rudimentary understanding of how NIH works (at least in the past) and clear evidence consistent with selection based on his political views,” says Jeremy Berg, former director of NIH’s basic research institute (and former editor-in-chief of Science). “I have been worried that this would happen.” □

GLOBAL HEALTH

Worldwide study of diseases gets historic funding influx

Gates Foundation pledges \$540 million to a project often criticized for its opacity GRETCHEN VOGEL

Dust storms like this one in Dakar, Senegal, contribute to air pollution, one of many health risks tracked by the Global Burden of Disease study.

A key effort to track health around the world is getting a massive boost from the Gates Foundation. This month, the charity pledged more than half a billion dollars to the Institute for Health Metrics and Evaluation (IHME), which publishes the Global Burden of Disease (GBD) study, the world's most expansive data set on diseases and health risks. But the 10 August announcement is also bringing fresh attention to criticisms of IHME, whose conclusions are based on computer models unavailable to outsiders that extrapolate from often very sparse data.

Based at the University of Washington (UW) and long funded by Gates, IHME says it will use the 10-year, \$540 million grant—the largest in the university's history—to boost the precision of the GBD study, increasing the number of locations it evaluates from just over 900 to nearly 5000. It will also expand its global health forecasting project, which helps predict the impact of health policy decisions, and its tracking of global health financing.

The gift is “a good use of Gates money,” says Lincoln Chen, a global health expert and former member of IHME’s board, because the GBD study “is the only truly comprehensive picture of global health that we get on a regular basis.” The most recent report, published in 2025, covers the impacts of 375 diseases and injuries in 204 countries and territories. Because the data help guide health investments, “This sort of investment has disproportionate returns,” says global health expert Tim Evans of Concordia University.

But others in the global health community caution that IHME's computer models can't replace efforts to collect information about populations' health. For many estimates, “they rely on data skewed toward high-income countries and model the heck out of it,” says Ramanan Laxminarayan, president of the One Health Trust. “And their models are opaque and neither easily verifiable nor replicable.”

That has led to some striking errors, notes Prabhat Jha, an epidemiologist at the University of Oxford. The 2015 GBD study, for example, cited cholera as the leading cause of diarrheal deaths in Canada, where that disease is extremely rare and only affects travelers from endemic countries. IHME corrected the report without explaining the error. “We still don’t know how it happened,” Jha says. “What was the underlying problem that led to that misdiagnosis?”

To produce its reports, IHME collects data from millions of sources around the world, including wealthy countries' health system records, published research papers, and, in poorer countries where health systems are sparse or absent, surveys that attempt to track disease symptoms and mortality. It then uses these data to build models that estimate disability-adjusted life years, a unit that allows researchers to compare the impacts of different diseases in a given region. To avoid errors like the one with cholera, IHME has increased its coopera-

tion with local experts and health authorities who provide checks on its estimates.

The first GBD report was commissioned by the World Health Organization (WHO) in the 1990s. In 2007, the Gates Foundation funded health economist Christopher Murray, who had worked at WHO on the early reports, to launch IHME and expand the study. The biennial GBD reports—each of which is published as a series of papers in The Lancet—have stirred controversy several times. The first one, published in 2013, found that malaria deaths were more than twice as high as WHO estimates, causing serious friction between IHME and WHO. During the COVID-19 pandemic, IHME's forecasts of infections and deaths were often far too high.

Their models are opaque and neither easily verifiable nor replicable.

Ramanan Laxminarayan One Health Trust

Yet the institute has thrived, thanks largely to the largesse of the Gates Foundation, which has so far spent more than \$385 million on IHME's work and currently supplies 60% of its roughly \$90 million annual budget. Murray, whose \$855,000 salary makes him the best-paid professor at UW, is close to Bill Gates.

Murray says the new grant will allow IHME to produce more fine-grained data, giving estimates of disease burdens for smaller geographical regions—states, provinces, or even local health authorities instead of countries as a whole. “Governments are very, very interested in the geographic breakdown of their countries,” he says, because it can reveal health disparities and help allocate funding where it is most needed.

That idea in itself is “critically important,” says Lucia D’Ambruoso, an expert on health policy systems at the University of Aberdeen, “but that does not abolish that underlying data problem.” Only about 40% of deaths globally have a medically certified

cause recorded, she notes, and in low-income countries that falls to below 10%—which is why the global health community relies so heavily on modeling. D'Ambruoso hopes the new money will allow IHME to help lower income countries “not only to generate these data, but to interpret them and use them.”

Jha cautions IHME's reports convey a false precision that can make such investments seem unnecessary. "Where they give the sense to policymakers that we actually have data when what they have is guesses, it might well distract from building the kind of essential data systems" that provide more accurate information. Jha would like IHME to shift toward an open-source approach, serving more as a library than as a publisher of results and making both primary data and modeling strategies truly transparent. "It would be an amazing global resource," he says. "But that's probably wishful thinking."

Murray acknowledges that efforts to build up even basic birth and death registries in lower income countries have struggled. But, he says, simple, low-cost information systems are making inroads in some of the poorest countries, and many middle-income countries have instituted electronic health records, which provide more accessible data on conditions for which people seek care.

IHME will also use the new funding to expand models that forecast the impacts of health policies, such as stricter tobacco control or the introduction of a new vaccine, in hopes of “giving a little bit more guidance on what are the 20 leading opportunities to change the arc of health in the future,” Murray says.

A third focus will be the institute's efforts to monitor global health spending. So far, it has primarily tracked money flowing from high- to low- and middle-income countries, but given recent steep cuts in global health aid, “we need to do a much better job tracking what governments put in of their own money” and how much patients and their families contribute, Murray says.

Evans applauds the expansion of IHME's work, “especially when more and more countries seem to think it’s more important to invest in war than in health. ... Our health is a global public good, and we really need to understand how to do better.”

IN OTHER NEWS

SPACE TELESCOPE RESCUE MISSION FAILS A daring mission to save the Neil Gehrels Swift Observatory, a 22-year-old space telescope whose orbit is decaying, has ended in failure. A rescue craft, developed and launched in record time, spun out of control, NASA announced last week. Swift, a telescope designed to study gamma ray bursts and other fast-developing high-energy cosmic events, was launched in 2004 on a 2-year mission. But recent solar activity caused Earth's atmosphere to swell, slowing Swift's orbit. Last year, NASA commissioned Katalyst Space to build a rescue craft, which it completed in about 8 months. But soon after its 3 July launch, the craft began to spin wildly. After weeks trying to regain control with thrusters, NASA and Katalyst admitted defeat. Swift is expected to burn up re-entering the atmosphere before the end of the year. —Daniel Clery

THE FIRST INSECTS HAD WAY MORE THAN SIX LEGS Today, all insects have six legs, but the first ones had many more. That's the conclusion paleontologists reached after re-examining four crustaceanlike fossils found in Texas, Illinois, and Scotland dating back 405 million years. The researchers report this week in Nature that the many-legged critters represent evolutionary links between modern winged insects and their predecessors. An analysis of the specimens, which represent three new species, revealed these early insects had legs on their rear ends as well as six legs in their midsection. The extra legs, with paddlelike ends, may have enabled an amphibious existence. —Elizabeth Pennisi

SHINGLES VACCINE LINKED TO HEALTHIER HEARTS Vaccines provide protection against shingles, the painful condition caused by reactivation of the chickenpox virus later in life. But vaccinating against the disease may also reduce the risk of heart disease, according to a study published this week in Nature Medicine. People who received Shingrix—a recombinant vaccine containing chickenpox virus protein and other ingredients—were less likely to suffer heart problems over the next 7 years than people who received an older, less effective vaccine containing the live virus, researchers found. The team suggests Shingrix’s ingredients could trigger temporary changes to the immune system that protect heart health. A clinical trial is now underway in Denmark to more deeply investigate the link. —Catherine Offord

ORBITAL ALCHEMY

Maturing space labs and cheaper launches fuel dreams of manufacturing drugs and tissues in orbit

MICHAEL GRESHKO, in El Segundo, California or nearly a century, this coastal Los Angeles suburb has been the beating heart of the U.S. aerospace industry. During World War II, factories here cranked out bombers for the Pacific theater. Later came generations of air- and spacecraft built by giants such as Hughes and Northrop. Today, dozens of aerospace and techno-

logy startups share the neighborhood with SpaceX, just down the road in Hawthorne.

At a pizza-and-beer lunch joint, conversations buzz with talk of supply chains for spacecraft components. When the fog rolls in, the low-slung warehouses seem to dissolve into the clouds—as if the neighborhood itself were preparing for launch.

On a Monday night in May, in a non-descript building along El Segundo's eastern edge, about 50 engineers with Varda Space Industries gathered to witness not a launch, but a homecoming. They ate cold pizza and played Settlers of Catan as they watched a livestream, waiting for word on a spacecraft's status. Inside a smaller mission control room, eight desks faced a wall of TV screens streaming information from the spacecraft, which was plummeting to Earth half a world away above the Australian outback. The robotic capsule, roughly the size of a washing machine, was preparing for a fiery plunge through the atmosphere before a planned parachute landing in the desert.

Nicholas Cialdella, Varda's chief technology officer, adjusted his Apple Watch, knowing his pulse would quicken. At 10:59 p.m., the show began. Screaming toward Earth at about 31,000 kilometers per hour, the capsule awoke and separated from the satellite that had shepherded it through orbit, an update it passed along via GPS and radio pings. Cheers went up 17 minutes later, when the capsule's first parachute deployed exactly on time. But then the telemetry stream from the capsule slowed to a trickle. "Give me another data point," one cursing engineer muttered.

The room looks much like mission control centers run by NASA and other aerospace companies for human missions, scientific probes, and communications satellites. But it serves a different goal: laying the ground for a new space industry, focused on biomedicine.

Varda was founded in 2021. In just 5 years, it has designed, built, and launched six capsules into orbit. This one, for the U.S. Air Force Research Laboratory, was meant to test heat-shield materials, but others have carried miniature laboratories that autonomously melt, dissolve, cool, and recrystallize pharmaceutical compounds. On Earth, those processes are disrupted by gravity, which drives bubbling convection in liquids and causes crystals and particles to settle. But in space—where there's no up or down—warm fluids do not rise, dense particles do not sink, and crystals can assemble under far calmer conditions.

As a result, Varda says, microgravity can make protein and drug crystals purer or more uniform—or nurture ones that won't form on Earth. Cialdella hopes those advantages will translate into medicines that are easier to make, store, and administer. If so, space won't merely be a venue for research. It will become a factory floor.

Varda is only one expression of a much broader bet. Across academia and industry, researchers are trying to transform decades of biomedical experiments aboard the International Space Station (ISS) into a new kind of manufacturing enterprise. They think microgravity can improve not just the manufacturing of pharmaceuticals, but also the growth of stem cells, implants, miniature organs,

and other living materials. That vision is not new, but increasingly sophisticated orbital laboratories and cheaper rocket launches are reviving hopes that microgravity might finally become an industrial tool rather than merely a scientific curiosity.

"The biggest revolution over the past couple decades has been the decline in launch costs," says Matthew Weinzierl, an economist at Harvard Business School who studies the space economy. "When more companies like Varda produce autonomous manufacturing and research facilities, we're going to have, I think, a similar revolution."

hundreds of kilometers above Earth. If its use cases show promise, the industry has the potential to be transformative, Weinzierl says. But today, “uncertain’ is one word I would use,” he adds. “Nascent’ is another.”

Yet the field still faces the question that has shadowed space manufacturing for decades: whether remarkable science can overcome the stubborn economics of doing business

FOR AS LONG AS HUMANS have been journeying into orbit and beyond, space agencies have banged the drum on the benefits reaped back on Earth. (Tang! Velcro!) Call it black-sky thinking.

In May, Varda Space Industries's sixth capsule returned from orbit, landing in the Australian outback.

For decades, however, turning that promise into reality has been stymied by spaceflight's unforgiving physical and financial constraints. Back when the ISS was being built throughout the 2000s, “if you sent straw into space and turned it into gold, it wouldn't be cost-effective,” says Columbia University neuroendocrinologist Rae Silver, who in 2002 co-chaired a NASA task force that helped shape ISS research priorities.

Even after experiments reached orbit, researchers had to learn how to adapt lab

techniques developed with gravity in mind. Before she joined the NASA astronaut corps in 2009, Kate Rubins worked as a principal investigator at the Whitehead Institute, studying viral and immune system genomics. As a newly minted astronaut, she was struck by how many familiar tools, such as pipettes, had not been taken up by space researchers—unnecessarily, she suspected. “I’m like, explain to me the physics,” she recalls.

When Rubins went to the ISS in 2016, she used most of her 5 kilograms of personal cargo to bring up pipettes and other lab gear to test herself. As it turns out, pipettes work just fine, as do the ubiquitous 96-well plates that are used like miniature test tubes to prepare and store samples. Rubins's insistence instantly expanded how bioscience could be done on the ISS. “Some of this,” she says with a grin, “is just me being obnoxious.”

NASA astronaut Kate Rubins examines stem-cell derived heart cells aboard the International Space Station in 2016.

Those years of dogged work are finally paying off. The ISS has become a sophisticated orbital laboratory, complete with automated microscopes, standardized workflows, and a growing understanding of how cells and molecules behave in microgravity. For certain applications, microgravity “could be a useful new variable,” says Rubins, now director of the University of Pittsburgh’s Trivedi Institute for Space and Global Biomedicine.

Meanwhile, falling launch costs, driven by SpaceX's reusable Falcon 9 rockets, have made it cheaper to access space and follow up on ideas. According to an analysis published in PNAS Nexus in July, the inflation-adjusted cost of launching 1 kilogram of material into space has dropped from more than \$15,000 in 2000—when habitation of the ISS began—to less than \$4000 in 2025. If these trends continue, the study projects, costs per kilogram might drop another 50% between now and 2030.

“We’ve reached a maturity of understanding and accumulation of knowledge,” says Michael Roberts, chief scientific officer of the ISS National Laboratory. “That can lead to accelerated cures and outcomes here on Earth.”

Roberts points to a key milestone from pharmaceutical company Merck, which flew ISS experiments on its

blockbuster cancer drug Keytruda (pembrolizumab), a monoclonal antibody that unleashes the immune system so it can attack tumor cells. In a 2019 study, Merck researchers reported that in microgravity, the antibody proteins form smaller, more uniform crystals than conventional manufacturing could produce, opening the way to formulating the drug as an injection rather than a lengthy intravenous infusion. Although Merck ultimately commercialized the injection with a different (Earth-based) approach, the experiment highlighted the advantages of microgravity.

The Merck study motivated the founding of Varda. On its first mission in 2023, the company melted the HIV antiviral ritonavir and recrystallized it as the drug's least stable structural variant. The demonstration showed drugs could be autonomously processed in orbit, withstand months in space, and survive the searing heat of atmospheric re-entry.

By hitching rides on frequent SpaceX Falcon 9 launches, the company now aims to speed up what was once an agonizingly slow experimental process so it can support commercial research. “When you have something where you get a data point once a year, every other year, every 3 years, it’s hard to do that in a business context,” says Adrian Radocea, Varda’s chief scientific officer.

Varda is hardly alone. In 2025, longtime ISS payload developer Redwire Space announced a deal with the startup ExesaLibero Pharma to grow ultrapure crystals of an experimental bone drug in space to seed larger crystals back on Earth. In May, the U.K.-based startup BioOrbit launched a payload to the ISS that, like Varda's capsules, is designed to autonomously crystallize drugs in microgravity. Around the same time, Varda announced a partnership with United Therapeutics to screen its drugs for formulations that might benefit from orbital processing.

According to Michael Reilly, Varda's chief strategy officer, in the next couple of years, one of the company's capsules will be able to process enough drugs for a clinical trial with hundreds of patients. "Our focus is really getting a space drug—in this case, one that we've manufactured in microgravity—into people," he says.

THE PROMISE of microgravity extends well beyond individual proteins and small molecule drugs. For LambdaVision, a startup spun out of the University of Connecticut, the goal is to make artificial retinas from thin films of an unusual light-harvesting protein known as bacteriorhodopsin.

When exposed to light, bacterio-rhodopsin pumps protons across a membrane. In the organisms that naturally produce it, the resulting ion gradient provides energy. By stacking up to 200 carefully aligned layers of the protein, LambdaVision hopes to create implants that could stimulate healthy cells that remain in otherwise degraded retinas, restoring some vision to patients with macular degeneration.

When Nicole Wagner, now Lambda-Vision's CEO, helped found the company in 2009, she hadn't considered microgravity. But after flying nine experiments to the ISS, the company found the absence of sedimentation and convection allowed it to build more uniform protein films with far less waste. On Earth, Wagner says, roughly $60\%$ of its films end up too thick or too thin.

The protein films remain stable after at least 6 months in orbit, allaying concerns about damage from space radiation. “Everybody else is sending stuff to change it,” Wagner says. “We don’t want the protein to change.” LambdaVision has five additional ISS flights planned through 2028, as well as its first flight outside of the ISS: a joint mission to test orbital manufacturing methods aboard a device built by startup Helogen.

For Catriona Jamieson, director of the Sanford Stem Cell Institute at the University of California, San Diego, the appeal of microgravity is not preventing biological change, but accelerating it. In space, cancer cells more readily organize into 3D structures and rapidly activate pathways associated with metastasis. Jamieson believes that acceleration could dramatically speed the search for new cancer therapies. In 2024, she flew breast cancer cells to the ISS to test the effectiveness of rebecsinib, an experimental cancer drug developed by Aspera Biomedicines, which Jamieson co-founded. “We see all of that in the space of 10 days,” she says, “where it could take 10 years on the ground.”

Other kinds of cells behave in new and unusual ways when released from the bonds of gravity, Jamieson says. Stem cells, the protean cells that give rise to all other cell types, proliferate and age rapidly, activating stress responses in their “dark genomes”—stretches of usually silent DNA—that can take far longer to emerge on Earth. “Microgravity unleashes stress biology and accelerates it,” she says.

Over the past 2 decades, researchers have learned to reprogram ordinary skin or blood cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs), which provide the versatility of ordinary stem cells. Arun Sharma, a cardiobiologist at Cedars-Sinai Medical

Center in Los Angeles, has spent a decade investigating how iPSCs behave in microgravity—and the kinds of advantages it might present for growing them.

Sharma has looked toward the heavens ever since he was a child growing up in Huntsville, Alabama, alongside the children of scientists and engineers at NASA's Marshall Space Flight Center. As a graduate student, he worked with Rubins to culture human heart cells derived from iPSCs aboard the ISS. Now, as director of Cedars-Sinai's Center for Space Medicine Research, Sharma focuses on space from a star-studded setting on Earth: in a sprawling hospital within West Hollywood.

He hopes microgravity will help coax iPSCs to form organoids, lab-grown clumps of cells that mimic many of the properties of real organs, making them useful for testing drugs and other therapies and even replacing living tissue. In Sharma's lab, his colleagues pulled up images comparing organoids grown on Earth with counterparts cultured aboard the ISS. The terrestrial organoids looked ragged: uneven in size, fused together, strewn with dead cells and debris. The space-grown versions were more abundant and pristine. "Way more uniform in shape, and less cell death," graduate student Madelyn Arzt said, holding up a screenshot from the lab's group chat.

The results fit a simple physical explanation. On Earth, organoids are grown in bioreactors that suspend

cells within a constantly circulating fluid to prevent them from settling. That flow can fuse clusters together or tear the fragile structures apart just as they're starting to form. In microgravity, Sharma says, the organoids remain suspended without any need for circulation. "It just kind of makes sense, right?" he says. "They're supposed to float."

The findings have yet to be published, but they were compelling enough—“kind of a ‘holy shit’ moment,” Sharma says—that NASA approved \$1.5 million in funding to replicate the ISS experiment. That payload will be launching aboard a SpaceX resupply mission later this year.

If the effect holds up, it could spawn another line of space biomanufacturing—of replacement tissues grown from iPSCs. Already, clinical trials are evaluating whether surgically implanted neurons derived from iPSCs could help relieve symptoms of Parkinson's disease, or whether iPSC-derived cardiac cell implants could mitigate heart failure. Orbital bioreactors might make high-quality organoids like the ones in Sharma's experiment at far higher yields than can be produced on the ground.

On its first mission in 2023, Varda Space Industries showed it could melt and recrystallize the HIV antiviral ritonavir in orbit.

SUCH POSSIBILITIES are already influencing plans for post-ISS space facilities. After 25 years in orbit, the station—literally leaking and groaning under the weight of fraught international partnerships—is approaching retirement, and commercial successors are taking shape. Sharma and I drove across Los Angeles to visit one of them. In an office park in Long Beach, Vast Space is racing to finish Haven-1, a commercial station that Cedars-Sinai plans to use for biomedical experiments as early as next year.

LambdaVision's artificial retinas are made of thin films of a light-harvesting protein. The films grow more uniformly in space, and with less waste.

Inside the company's clean room sat the station itself: an intricately milled aluminum barrel nearly as long as a bus. Technicians in white bunny suits leaned in and out of an open hatch, each taking their turn with some presumably fiddly bit of assembly.

Haven-1 will host only a few astronauts on brief, 2-week missions. Its larger purpose is to test a different model for research in orbit: one in which increasingly automated experiments run while scientists fly up only occasionally to tend to them. “We absolutely want to move towards automation,” says Vast’s principal scientist Meghan Everett, formerly the deputy chief scientist of NASA’s ISS program. But in “areas where we’re still learning and we’re still in the infancy, we really benefit from having a crew member be in space.”

Watching technicians put the finishing touches on Haven-1, Sharma couldn't help imagining himself aboard. He has applied to NASA's astronaut corps a couple times, and he credits researchers such as Rubins with showing how much it helps to have astronauts with biomedical expertise. Would he go to space to tend to his experiments himself? "Selfishly, yes—I would love to," he says.

Whether stations like Haven-I can support a thriving biomanufacturing industry, however, depends on a more prosaic question: the economics. In 2020, Cedars-Sinai opened a large biomanufacturing facility that currently makes 1500 different cell lines for disease models and clinical trials of cell therapies. Dhruv Sareen, the center's director, says it would currently cost more than \$2 million and take at least 8 months to build a personalized cell line from iPSCs and culture billions of cells to, say, restore a diabetic patient's insulin-producing cells. Doing all that in orbit would be costlier still, says Sareen, who has flown three stem cell-related payloads to the ISS. "We may cure diseases, but if you can't reach it, what's the point?" he says.

Some products, however, may be valuable enough to justify the trip. LambdaVision, together with the ISS payload developer Space Tango, makes its protein films within an automated, 10-kilogram device the size of a shoebox. Currently, it costs roughly \$600,000 to fly that payload to and from the ISS, Wagner says. Already, she says, electronic retinal implants cost upward of \$150,000 per eye. At those prices, it would take just four artificial retinas per mission to cover launch costs—assuming clinical trials showed promise and the implants were eventually approved by regulators.

The commercial space station companies will need other sources of revenue, however. Vast and its competitors are premised on an orbital economy in which paying customers of all kinds—tourists, researchers, astronauts—work and play in droves hundreds of kilometers above our heads. “It’s possible that in the future we may be able to close the business case on space manufacturing,” Roberts says. But, he adds, he is “not a person who believes that immediately when we deorbit [the ISS], there are going to be commercial factories operating in space, turning out organs.”

For now, much of that hoped-for economy depends on NASA's largesse. Yet earlier this year, the agency said it could only afford to support one commercial space station. “Though we have seen investor interest, there’s no independently verifiable market research indicating the economic viability of a commercial station that is only partially funded by NASA,” the agency’s ISS program manager, Dana Weigel, said in a March presentation.

Regardless of what NASA does after the retirement of the ISS, “I don’t think the [low-Earth orbit] economy is entirely going to go away,” Sharma later said as we stood in Vast’s parking lot. “So many people are trying to get into the game now.” After speaking with a veteran’s earned authority, the 36-year-old biologist hopped into his white Tesla and peeled out.

IF COMMERCIAL SPACE STATIONS falter, robotic capsules like Varda's could conceivably pick up the slack—and even offer advantages. In addition to being more expensive, crewed stations impose strict safety requirements, limiting the procedures and reagents astronauts can use.

Back in El Segundo, engineers at the company's mission control were feeling upbeat. Varda's capsule had parachuted into the South Australian outback, safe and sound. Jordan Croom, Varda's vice president of payloads, likened the feeling to waiting to get punched in the stomach—only for nothing to happen. For Cialdella, the mission previewed a future routine: flying the company's capsule and satellite bus, all built in-house, and bringing the capsule back safely.

The company wants to repeat the feat again and again. Varda has seven flights scheduled for 2027 and 10 more for 2028. “We’ve got to not just do demonstrations, but do science-grade and then production-grade processing of these chemicals in orbit—but then we also have to do it at a scale and cadence that nobody has even come close to before,” Croom says. “It’s invigorating, it’s a little bit scary.”

Long after dark, the engineers gathered at the company's home-spun tiki bar, saluting a safely fallen capsule half a world away. But tomorrow, they would get back to work. Spools of felt, impregnated with resin, would get formed into heat shields. Thruster tests in a building next to the company parking lot would require employees to move their cars. Part by part, future space factories would be assembled.

In another era, all of this would have been a once-a-decade event. The Varda team hopes it will become just another day on the job: as technically impressive, and as taken for granted, as manufacturing pharmaceuticals on Earth. “Our greatest hope,” Croom says, “is that it will continue to be boring.” □

BIOPHYSICS

The knotty problem of RNA structure prediction

Artificial intelligence enables the design of RNA pseudoknots

Anthony M. Mustoe $^{1,2}$ and Junzhe Guo $^{1}$

RNA molecules perform remarkably diverse roles in biology, from serving as messengers that encode instructions on how to make proteins, to functioning as ligand-responsive regulatory switches that control gene expres-

sion and catalyzing biochemical reactions (1). These functions typically depend on the specific fold, or ensemble of

RNA-based technologies and therapies have been constrained by the limited accuracy of computer design and modeling tools.

folds, that each RNA adopts, including both its secondary and higher-order three-dimensional (3D) structure (2). Accurately predicting RNA structure from sequence promises to accelerate understanding of RNA mechanisms and the design of synthetic RNA medicines and devices. However, RNA structure prediction has proven to be a formidable problem. On page 931 of this issue, Townley et al. (3) report an important assessment of state-of-the-art deep learning methods developed toward this goal. This and other recently published (4–6) and unpublished (7,8) studies indicate that exciting progress is being made, but that robust RNA structure prediction remains a major challenge.

Deep learning models that predict protein structure such as AlphaFold have revolutionized protein structural biology (9) but have remained unreliable for RNA (10). Why has the RNA problem proven more difficult? RNA sequences are composed of only four chemically similar nucleotides and therefore provide a less information-rich alphabet than the 20 amino acid building blocks of proteins. A given RNA sequence can usually fold into multiple, nearly isoenergetic structures, making it difficult to identify the biologically relevant conformation(s). Protein structure prediction methods also rely heavily on evolutionary covariation information learned from comprehensive sequence alignments across species. However, for most RNAs, fewer homologs have been identified and consequently, alignments are less informative. Likely most important, the number and diversity of experimentally determined RNA structures are orders of magnitude smaller than they are for proteins, limiting the data available for training models.

Over the past 4 years, a variety of deep learning methods have been developed to address these challenges. Townley et al. sought to test the real-world performance of these models in de novo RNA design—that is, creating RNA molecules that fold into desired structures without a pre-existing natural sequence template. This is a particularly demanding application that requires both efficient generation of candidate sequences and accurate prediction of whether these sequences will adopt the desired fold. The authors made this test even more difficult by soliciting designs for pseudoknots, a class of specialized RNA motifs that contain interlocked base-paired regions. Pseudoknots are among the hardest RNA motifs to predict owing to their topological complexity and poorly understood folding rules, and they are outside the

scope of most traditional design algorithms. Given that pseudoknots are recurrent features of functional RNAs—including comprising the catalytic centers of ribozymes and specific binding pockets for ligand sensors—predicting and designing pseudoknots are essential for understanding and engineering RNA biology.

Townley et al. found that the latest generation of deep learning (artificial intelligence, or AI) systems could design properly folding sequences for 55 of the 57 different tested pseudoknot architectures. This performance was comparable to that of experienced humans, who also submitted designs for the same set of pseudoknot structures. Several of the successfully designed pseudoknots had architectures that were not previously reported in the literature, emphasizing the difficulty of the design challenge and indicating that existing structural databases likely only contain a small subset of possible RNA folds.

A key finding by Townley et al. is that design success improved substantially when both AI systems and humans were given access to a specialized deep learning model trained to predict RNA secondary structure from sequence. This model, called RNet, was previously trained by the authors using a large corpus of nucleotide-resolution measurements of RNA folding patterns obtained from chemical probing experiments (11). RNet enabled both humans and AI systems to discriminate sequence designs likely to adopt the desired pseudoknot secondary structures versus those likely to misfold. Notably, with RNet, all design strategies performed comparably, consistent with RNet providing decisive information. Because the tested sequences are new and some of the target structures were likely absent from the RNet training set, the results suggest that RNet has learned transferable folding patterns that can be applied to all RNA molecules.

Although successfully designing pseudoknots is an impressive achievement, it is important to note that success is low when evaluated on a per-sequence basis. Only $\sim 40\%$ of designs assessed by chemical prob ing folded into the desired secondary structures. When a subset of designs was evaluated more rigorously by mutagenesis experiments, only \~70% of the sequences convincingly displayed the target pseudoknot structure. And when analyzed at high resolution by cryo-electron microscopy (EM), only three out of seven designs showed the intended conformation. Even the designs confirmed by cryo-EM exhibited unexpected features, including breaking of expected base pairs that instead formed unpredicted tertiary interactions. Extrapolated, these results suggest that even with RNet, prediction accuracy for pseudoknot secondary structures is <20%, and substantially lower for 3D structures. Thus, continued improvements in accuracy are needed to enable reliable, large-scale structure prediction in biological RNAs.

It is also unclear whether advances in synthetic RNA design will generalize to improved structure prediction of biological RNAs, which are typically much longer and are shaped by evolutionary constraints beyond optimization for a single, well-defined structure. Indeed, other studies have found that deep learning methods often underperform at predicting structures of long biological RNAs compared to traditional thermodynamic models (4). Further, RNA function frequently depends on structural dynamics, and RNA folding in cells is often context dependent. For example, processes such as cotranscriptional folding, chemical modifications, and protein binding continually shift the thermodynamics of RNA folding (12). Fully understanding RNA biological mechanisms and designing RNAs with complex functions require going beyond predicting single structures to modeling complete structural ensembles, their relative energies, and their contextual dependencies (13).

A recurrent lesson in molecular biology is that RNA plays by its own rules and requires different solutions than proteins. For example, Townley et al. and other recent studies (5, 6) reinforce classic understanding (14) that RNA secondary structure can be modeled largely independently of 3D structure, whereas accurate 3D modeling depends on accurate secondary structure. More fully incorporating this and other RNA-specific folding rules into deep learning models may improve model performance. RNA is also differentiated from proteins by the ease at which RNA structure can be measured at moderate resolution through chemical probing experiments. Better leveraging this rich data source, including using probing data as restraints during modeling and not just for pretraining, represents another path for increasing model performance and utility. Given the accelerating pace of discovery in RNA biology and the expanding applications of RNA in biotechnology, solving the RNA folding problem has never been more vital.

REFERENCES AND NOTES

1. T. R. Cech, J. A. Steitz, Cell 157, 77 (2014).

2. X. Cao, Y. Zhang, Y. Ding, Y. Wan, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 25, 784 (2024).

3. J. Townley et al., Science 393, 931 (2026).

4. A.A. de Lajarte et al., Sci. Adv. 12, eadz4967 (2026).

5. S. Tarafder, D. Bhattacharya, Nat. Methods 23, 1349 (2026).

6. W. Wang, Z. Peng, J. Yang, Nat. Mach. Intell. 8, 722 (2026).

7. S. He, Q. Sun, bioRxiv 10.64898/2026.01.16.700031 (2026).

8. A. Favor et al., bioRxiv 10.1101/2025.10.01.679929 (2025).

9. J. Jumper et al., Nature 596, 583 (2021).

10. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 192 (2026).

11. S. He et al., bioRxiv 10.1101/2024.02.24.581671 (2024).

12. R. Bose, I. Saleem, A. M. Mustoe, Cell Chem. Biol. 31, 17 (2024).

13. L. R. Ganser, M. L. Kelly, D. Herschlag, H. M. Al-Hashimi, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 474 (2019).

14. P. Brion, E. Westhof, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 113 (1997).

ACKNOWLEDGMENTS

A.M.M. acknowledges support from the National Institutes of Health (R35 GM147010) and the Arnold and Mabel Beckman Foundation. A.M.M. is an adviser to and owns equity in RNAConnect, Inc.

10.1126/science.aek4499

ELECTRONIC DEVICES

Ordering atoms on weak interaction

Van der Waals interaction guides the growth of single-crystal metals on two-dimensional semiconductors

June-Chul Shin $^{1}$ and Jeehwan Kim $^{1,2,3,4}$

Next-generation computer logic and memory technologies require high-speed data processing and low power consumption to handle massive data loads and perform real-time artificial intelligence tasks. Meeting these demands involves

packing more transistors into a limited chip area while maintaining efficient control of electrical current. However, continued miniaturization of conventional silicon transistors becomes difficult as their dimensions approach the nanometer scale. Two-dimensional (2D) semiconductors—atomically thin materials that bridge conductors and insulators—are promising materials for future transistors (1). They can efficiently transport charge carriers, such as electrons and holes (the counterpart of electrons), and regulate current flow at atomic dimensions. Realizing this potential requires atomically controlled metal contacts that connect 2D semiconductors to external circuits. On page 938 of this issue, Zhang et al. (2) report a stepwise process that grows single-crystal metal contacts on 2D semiconductors. This offers a route to integrate a range of single-crystal materials into devices.

As device dimensions continue to shrink toward the scale of individual crystal grains, grain boundaries where two grains with different atomic orientations meet can affect device performance and reliability. These boundaries scatter or trap electrons and holes, reducing charge transport and electrical conductivity. Single-crystal metals that are free of grain boundaries preserve uniform and large electrical properties across spatial dimensions. A method of forming single-crystal materials is epitaxy in which a crystalline film grows with a well-defined atomic orientation guided by an underlying crystalline substrate. In conventional epitaxy, strong covalent or ionic bonding between the deposited atoms and the substrate helps establish the crystallographic alignment. However, 2D semiconductors lack out-of-plane dangling bonds, which serve as anchors to guide incoming metal atoms. In addition, conventional metal deposition techniques can damage the atomically thin 2D semiconductor lattice through energetic atomic bombardment and localized thermal accumulation. The resulting strong interactions between metal and semiconductors can also generate unintended electronic states that increase resistance to electric current flow at the interface and deteriorate device stability.

Different strategies solved this bottleneck in an n-type 2D semiconductor [e.g., molybdenum disulfide (MoS $_2$ )] in which electrons are the major charge carriers. Contacts made of a semimetal instead of a metal, substitutional doping (replacing atoms in a crystal lattice with an impurity), and atomic-layer bonding, which creates strong bonds between 2D semiconductor and metal layers, have substantially reduced contact resistance, approaching performance

Taking steady steps for atomic ordering

Alternating atomic-scale deposition increments with pauses stabilizes the pressure and temperature of the reaction chamber, providing a steady environment for metal growth. This suppresses formation of new crystal nuclei on already existing crystal domains and localized thermal accumulation that could create defects. The stepwise approach promotes surface diffusion of metal atoms and lateral coalescence of small crystal domains, producing a long-range crystalline order.

comparable to that of conventional silicon technology (3–5). However, achieving stable charge carrier movement into a p-type 2D semiconductor [e.g., tungsten diselenide (WSe $_{2}$ )], where holes are the major carriers, remains more difficult because hole transport is highly sensitive to defects, interfaces, and surrounding environments. This leaves an imbalance between the development of advanced n- and p-type transistors.

Zhang et al. performed a stepwise process in which metal atoms are deposited on a 2D semiconductor layer in increments with stabilization intervals between deposition steps. The approach suppressed the formation of new crystal nuclei on already existing domains, thereby reducing formation of misoriented crystal domains. It also minimized localized heat accumulations in the semiconductor layer that can cause variation in metal film thickness and structural defects. During the stabilization intervals, adsorbed metal atoms diffused across the 2D surface, and smaller domains laterally merged into larger ones (see the figure). These effects promoted smooth, layer-by-layer propagation of the crystal lattice.

The approach of Zhang et al. enabled epitaxy of diverse metals, including bismuth, silver, indium, gold, and palladium, on both n-type $\left(\mathrm{MoS}{2}\right)$ and p-type $\left(\mathrm{WSe}{2}\right)$ 2D semiconductors through weak van der Waals interaction instead of strong covalent or ionic bonding at the interface. The resulting single-crystal metal contacts provide spatially uniform metal work functions (the minimum energy needed to remove an electron from its surface), preventing local variations in electrical barriers. Consequently, detrimental and unintended electronic states (such as Fermi-level pinning) were suppressed. The metal-semiconductor interface behaved close to the Schottky–Mott limit, an ideal theoretical rule in which the energy barrier is determined primarily by the metal work function and the semiconductor's energy levels. This makes the metal contact's behavior more predictable, allowing the control of charge injection through the choice of metal.

The study of Zhang et al. could redefine a major process bottleneck—dangling bond-free surface of 2D semiconductors—as a template for epitaxial growth of a broad range of single-crystal materials. Conventional semiconductors, such as silicon, readily form native oxides on the surface or contain out-of-plane reactive dangling bonds that can complicate the epitaxial integration of materials with different lattice structures. By contrast, the atomically flat, dangling bond-free surfaces of 2D semiconductors can guide crystal growth without requiring strict lattice matching between depositing and substrate materials. These properties broaden the role of 2D semiconductors as epitaxial templates for integrating diverse single-crystal materials for different circuit components (6–8). For example, single-crystal metals could preserve spatial continuity of electrical properties for thin electrodes (9), and single-crystal insulators could suppress current leakage and device breakdown pathways associated with grain boundaries (10).

Translating the approach of Zhang et al. into manufacturing will require further development. Although stepwise deposition of metal atoms on 2D semiconductors enables high-quality single-crystal film growth, the repeated stabilization intervals could increase the overall processing time relative to conventional continuous techniques, creating a substantial throughput challenge. In addition, advanced 3D device architectures in which circuit compo-

nents are integrated by stacking them vertically instead of planar assembly require deposition processes that can grow materials conformally over different layers of the device at low temperature. This is to ensure that each material covers flat surfaces, sidewalls, and complex geometries uniformly without damaging previously fabricated device layers. Atomic layer deposition and chemical vapor deposition techniques, which use gas-phase chemical reactions, are well suited for conformally depositing materials on substrates with complex geometries. Recent studies demonstrated using these approaches for directly growing crystalline materials on 2D surfaces at low temperatures (11–13). However, these approaches have not yet simultaneously achieved uniform single-crystal growth across entire devices, compatibility with industrial processing, and coherent integration over complex geometries. Van der Waals epitaxy demonstrated by Zhang et al. could contribute to establishing 2D semiconductor surfaces as templates for the growth of diverse single-crystal materials. Further combining this capability with low-temperature and conformal deposition techniques could provide a route for integrating single-crystal materials over advanced 3D device architectures. □

REFERENCES AND NOTES

1. K. S. Kim et al., Nat. Nanotechnol. 19, 895 (2024).

2. Y.Zhanget al., Science 393, 938 (2026).

3. W. Liet al., Nature 613, 274 (2023).

4. J. Jiang et al., Nat. Electron. 7, 545 (2024).

5. L. Gao et al., Science 390, 813 (2025).

6. Y. Cui et al., Science 383, 212 (2024).

7. Z.Zhang et al., Nat. Electron. 9, 367 (2026).

8. B.Zhao et al., Science 388, 1183 (2025).

9. S.J. Kim et al., Nature 603, 434 (2022).

10. D. Zeng et al., Nature 632, 788 (2024).

11. J. Patouillard et al., J. Tech. Sci. Technol. A 42, 050401 (2024).

12. H. Ryu et al., paper presented at the 2026 IEEE/JSAP Symposium on VLSI Technology and Circuits, Honolulu, HI, 14 to 18 June 2026.

13. M.Yue et al., Nat. Commun. 16, 4018 (2025).

ACKNOWLEDGMENTS

The authors acknowledge support from the Ministry of Trade, Industry and Energy (MOTIE), Republic of Korea, through the Industrial Technology Innovation Program (P0028488); the Air Force Office of Scientific Research under award FA9550-22-1-0024; and the Semiconductor Research Corporation (SRC) and DARPA.

10.1126/science.aek4631

$^{1}$ Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. $^{2}$ Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. $^{3}$ Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. $^{4}$ Microsystems Technology Laboratories, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Email: jeehwan@mit.edu

RNA THERAPEUTICS

Rethink the cargo, rethink the carrier

New transfer RNA medicines require redesigned lipid nanoparticles for delivery

Jacob W. Myerson and Drew Weissman

In the current world of RNA therapeutics, transfer RNA (tRNA) occupies a relatively small niche. Yet the medical potential of tRNA has been acknowledged for decades $(1)$ . These RNAs facilitate protein synthesis by translating mRNA sequences into amino acid sequences. One aim of tRNA-based therapy is correcting genetic mutations that disrupt protein production. Engineered suppressor tRNAs can translate a premature stop codon in mRNA into a desired amino acid instead, restoring its normal translation into a full-length protein. For the $\sim$ 10% of genetic diseases driven by such aberrant termination codons, suppressor tRNAs are a potential medical solution. On page 881 of this issue, Chen et al. $(2)$ report reengineering tRNAs and tailoring lipid nanoparticles (LNPs) for the delivery of tRNA to enhance suppressor tRNA efficacy in animal and organoid models of cystic fibrosis. The findings

Optimizing delivery of tRNA versus mRNA

Distinct modifications and sequence characteristics define the preparation of transfer RNA (tRNA) versus mRNA for therapeutic use. Then, distinct lipid nanoparticle (LNP) properties are needed for delivery of the two RNA types to target cells.

are a promising step toward tRNA medicines for genetic diseases.

Chen et al. build on advances in engineering tRNA to correct nonsense mutations—genetic changes that turn amino acid codes in mRNA into signals to stop protein production (3, 4). They focused on an approach of adding nucleoside modifications to tRNA, inspired in part by the modifications that enable mRNA medicines (5). Although engineered tRNA therapeutics face immune system barriers different from those faced by mRNA medicines, they may follow the same chemical modification-driven roadmap to become successful drugs. The authors screened nucleoside methylations and pseudouridine substitutions. Adenosine methylation in the T-loop of tRNA, a conserved sequence that binds to the ribosome, emerged as a potential modification strategy.

Cystic fibrosis is a genetic disease characterized by the accumulation of mucus in organs, including the lungs. Nonsense mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) present a clinically meaningful application for suppressor tRNA. Although mRNA and gene editing strategies are also being considered for cystic fibrosis treatment (6), premature termination codons in mRNA encoding CFTR are a frequent cause of the disease and have been targeted in prior proof-of-principle suppressor tRNA work. Previous studies of CFTR correction with tRNA have reported successes in adapting LNP carriers for tRNA or the use of viral vectors to deliver DNA that encodes tRNA (3, 7). However, prior work did not systematically engineer targeted tRNA delivery to lung epithelial cells, the most important cell type for cystic fibrosis health outcomes. Chen et al. report data to address this gap.

LNPs have been refined for carrying mRNA to the lungs, both intravenously and through inhalation (8–10). For inhaled delivery, one mRNA-LNP formulation is now in phase 1 clinical trials for cystic fibrosis (6). These promising lung-targeted LNPs may seem ideal for delivering tRNA to the lungs. However, strategies for targeting LNPs to specific cells and tissues face complications. The wide array of LNP formulations derived from chemical library screening has yet to yield lasting clinical success in targeting nonhepatic cells (11). This has triggered interest in revisiting the older approach of conjugating LNPs to target-seeking ligands (12).

In screening approaches, candidate targeted LNPs are selected from libraries of formulations on the basis of how well they deliver a reporter or tracer cargo, such as mRNA encoding luciferase or barcoded DNA $(13)$ . When targeted LNPs are identified this way, the results do not typically reveal why the candidate formulations successfully deliver to their target cells. This approach intrinsically provides no information on side effects of the LNPs, nor does it indicate whether seemingly small changes to a formulation might have effects on targeted delivery. Along these lines, in studying tRNA delivery to lung epithelial cells, Chen et al. addressed an important question for this approach: Could the type of RNA cargo that the LNPs carry a factor in delivery success?

Chen et al. adhered to a standard reporter-based screening tack to find LNPs that deliver tRNA to cultured human bronchial epithelial cells. They used a library of LNPs designed to carry suppressor tRNA that restores the activity of a luciferase reporter bearing a premature termination codon. However, they introduced a nonstandard variable to the screen by repeating their experiments with a reporter mRNA in lieu of tRNA (see the figure). The result is a critical finding for the LNP engineering field. The authors found that encapsulating mRNA or tRNA—molecules with different morphologies and functions—yields different results for reporter activity in target cells. They observed that mRNA performance does not predict suppressor tRNA performance in the same LNP formulations. The study focused mainly on comparing ionizable lipids, the components of LNPs thought to facilitate RNA transport to the cytosol after the nanoparticles enter cells via endosomal compartments (14). But reporter activity was also profiled as a function of other LNP formulation characteristics, including ratios of the different LNP components. Again, the optimal LNP features for mRNA delivery did not correlate with tRNA delivery.

Effective delivery of reporter mRNA is generally treated as predicting delivery of therapeutic mRNA. This thinking is motivated by a model where LNPs can deliver a wide variety of RNAs to the cytosol of a target cell, with subsequent function of the RNA in the cell being irrelevant to delivery $(14)$ . The findings of Chen et al. dispute this idea. Indeed, the ionizable lipid dilinoleyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA) proved optimal for delivering a small interfering RNA to hepatocytes in the first clinically approved RNA-LNPs $(15)$ , but it is less effective in LNPs used for mRNA vaccines. By contrast, screening, as used by Chen et al., may be specifically suited to suppressor tRNAs. A suppressor tRNA that overcomes premature termination codons in reporter genes in screening studies is the same one that will target premature termination codons in genetic diseases. Chen et al. also show how advanced LNP screening methods can consider multiple variables, including RNA sequence, size, morphology, and function, when identifying the best delivery vehicle—call it a more “cargo-aware” approach.

The results of Chen et al. have implications for thousands of cystic fibrosis patients. The authors report that their LNP formulation and tRNA design had positive effects on CFTR expression and function in cultured cells, mice with CFTR nonsense mutations, and human organoids developed from a cystic fibrosis patient. Translating these effects to the amelioration of respiratory function in cystic fibrosis patients will require further work, including characterization of side effects, especially given dose-dependent inflammation noted both by Chen et al. in mice and in prior animal studies of inhaled LNP delivery (8, 9). Moreover, a likely therapeutic regimen could include both tRNA to rescue aberrant CFTR expression and drugs to enhance normal CFTR function, a combination that might have an additional side effect profile. Navigating the therapeutic potential of the tRNA, drugs, and LNPs may still be a matter of rethinking both the cargo and the carrier.

REFERENCES AND NOTES

1. T. Anastassiadis, C. Köhrer, J. Biol. Chem. 299, 105246 (2023).

2. J. Chen et al., Science 393, eaeb0054 (2026).

3. S. Albers et al., Nature 618, 842 (2023).

4. S. Albers et al., Nat. Commun. 12, 3850 (2021).

5. K. Karikó et al., Mol. Ther. 16, 1833 (2008).

6. X. Liu et al., Mol. Ther. 34, 2044 (2026).

7. J. Wang et al., Nature 604, 343 (2022).

8. S. Omo-Lamai et al., Nat. Nanotechnol. 20, 1285 (2025).

9. S. Omo-Lamai et al., Nat. Rev. Bioeng. 3, 775 (2025).

10. A. Y. Jiang et al., Nat. Nanotechnol. 19, 364 (2024).

11. T. Anchordoquy et al., ACS Nano 18, 13983 (2024).

12. H. C. Geisler et al., Nat. Protoc. 10.1038/s41596-025-01330-w (2026).

13. S. Yoo, M. J. Yan Ang, A. M. Murray, M. J. Mitchell, Mater. Today 93, 103176 (2026).

14. S. Chatterjee, E. Kon, P. Sharma, D. Peer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 121, e2307800120 (2024).

15. A. Akinc et al., Nat. Nanotechnol. 14, 1084 (2019).

10.1126/science.aek3835

MICROBIOLOGY

Beyond wrinkles

Can the skin microbiome shape healthy aging?

Sasan Jalili $^{1,2}$ and Julia Oh $^{3,4,5}$

Aging skin is often described in structural terms: a thinning epidermis, declining sebum production, reduced elasticity, slower repair, and increased susceptibility to irritation, infection, and chronic inflammation. However, skin is not only

a tissue that ages but also an ecosystem that ages. The skin hosts a diverse community of bacteria, fungi, viruses, and mites whose composition and activities are shaped by intrinsic characteristics of their microenvironment, such as sebum, moisture, pH, anatomy, and host genetics, and by extrinsic factors such as ultraviolet radiation, pollution, and lifestyle (1). Distinguishing aging-associated microbial changes that reflect the altered habitat of the aging skin from those that actively shape skin-barrier resilience, immunity, and tissue repair is challenging. However, identifying microbial functions that influence these processes opens the possibility of modulating them to promote healthy aging.

The skin microbiome changes markedly in older adults. Aging is characterized by loss of Cutibacterium acnes, a microbe that contributes to skin-surface acidification, production of antimicrobial peptides, and lipid metabolism; reduced stability and increased heterogeneity of the skin microbial community, which may decrease its resilience; and an increased presence of microbes that can become harmful in certain conditions or pave the way for more virulent species (2). For example, hospital-acquired strains of Staphylococcus epidermidis can act as reservoirs for resistance genes for the more dangerous S. aureus. Notably, these changes are less correlated with the chronological age of individuals than with “frail aging,” the accumulation of physical and cognitive deficits that better reflects their biological age. Without functional data, however, such microbial patterns are best read as biomarkers of biological age rather than causal factors that drive the aging process.

Although studies in aged human cohorts primarily identify associations between microbial features and aging, experiments in younger or diseased skin, animal models, and in vitro systems have provided corroborating mechanistic evidence that skin microbes regulate processes that deteriorate with age (see the figure). These include epidermal differentiation, lipid homeostasis, skin-barrier repair, training of immune cells to respond appropriately to microbes, and resolution of inflammation. Therefore, skin aging may be shaped by a continuous cross-talk between barrier decline, immune remodeling, and changes in the composition and function of the skin microbiome.

Several bacteria and fungi reinforce the skin barrier in humans and mice, either directly through the production of supporting lipids or indirectly through the modulation of cellular signaling pathways. For example, S. epidermidis strains produce sphingomyelinase enzymes that increase the amount of protective ceramides in mice, thereby reducing water loss across the epidermis in damaged skin (3). Furthermore, C. acnes produces short-chain fatty acids that stimulate the synthesis of epidermal lipids through peroxisome proliferator-activated receptor alpha signaling in hu

Skin aging

The functional role of skin as a protective barrier weakens with aging, as its outer layer becomes drier, loses ceramides, and acquires a neutral, rather than acidic, pH. This changed environment affects skin architecture and decreases the dominance of beneficial microbes, such as Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acnes, which are involved in the synthesis of lipids such as ceramides and sebaceous lipids. It also increases the likelihood of infection with pathogens such as S. aureus and hospital-acquired microbial strains. Deeper in the dermal layer of younger skin, regulatory T ( $T_{reg}$ ) cells promote immune tolerance and mucosal-associated invariant T (MAIT) cells support tissue repair. However, in aging skin, senescent fibroblasts can recruit inflammatory monocytes that suppress local antigen-specific T cell activity. This reshaping of immune function contributes to chronic inflammation and reduces tissue repair and antimicrobial defense.

man skin cells (keratinocytes) in culture and mouse models of skin barrier function (4). Notably, in mice and in three-dimensional (3D) reconstructed human skin, certain bacteria and Malassezia fungi reinforce the skin barrier through production of metabolites derived from the amino acid tryptophan, which bind to the aryl hydrocarbon receptor and stimulate downstream signaling (5). Furthermore, sebaceous lipids, whose quantity and quality decline in aged skin, are nutritive substrates for microbes and can be metabolized by C. acnes and Malassezia into oxylipins and other lipid-derived molecules. Although they may support skin homeostasis in a healthy skin barrier environment, studies in natural and reconstructed human skin showed that these lipids also promote the production of inflammatory signals such as interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 (6). More generally, age-related shifts in the composition and abundance of sebum and barrier lipids in skin may not simply lead to a different microbial community; they may create new metabolic interactions between microbes and host cells that influence inflammation. This metabolic rewiring may be especially relevant in older skin, which is characterized by altered lipid composition, reduced lipid abundance, barrier dryness, and low-grade inflammation. Therefore, the functional outputs of microbial activity, such as lipid metabolites, immune mediators, or repair responses, may be more informative indicators of microbiome-linked aging compared with microbial composition alone.

Exposure to commensal microbes can have a long-term effect on skin immunity, particularly early in life. S. epidermidis, for example, activates skin immune signaling pathways and shapes innate defense and adaptive tolerance mechanisms (7). Furthermore, the production of riboflavin by commensal bacteria drives the accumulation of mucosal-associated invariant T cells in the skin of neonatal mice, and these cells support tissue repair later in adulthood (8). These microbes can also activate dendritic cells, promote recruitment of IL-17A-producing T cells and CD8+ T cells, and contribute to host tolerance to their presence through activation of regulatory T cells (8). Fungi and bacteria can also influence the speed of skin immune responses to injury or infection.

For example, Malassezia can activate the IL-23 and IL-17 pathway in mouse skin and stimulate the production of Malassezia-specific CCR6 $^{+}$ memory T helper 17 cells in human skin (9). Importantly, microbial programming of skin immunity has mostly been documented in early life or nonaged skin. However, surveys of immune cell subsets and inflammatory mediators in aging skin showed increased immune-cell exhaustion and senescence, inflammation, and impaired immune responses. Even mild cutaneous injury in aging human skin can trigger a strong immune response in which senescent fibroblasts recruit inflammatory monocytes that, through prostaglandin E2 production, suppress local antigen-specific T cell activity (10). Differences in the frequency and function of dermal dendritic cells, increased T cell exhaustion and senescence, reduced responsiveness of regulatory T cells, and reduced absolute numbers of Langerhans cells have also been observed in aging mouse and human skin compared with younger skin (10, 11). These findings support a model in which altered microbial exposure and function interact with age-associated immune remodeling to turn skin away from repair and tolerance processes toward chronic inflammation, although a causal link remains to be demonstrated in human skin and evidence of temporal associations is not enough to establish causality.

Several technical limitations hamper the performance of aging skin microbiome studies. Skin models that account for host aging and the diversity of age-associated microbial changes are lacking. Aged animal models provide whole-organism context. However, mouse skin differs from human skin in architecture, structure and distribution of hair follicles and sebaceous and sweat glands, abundance and composition of sebum, resident microbes, and composition and spatial distribution of immune cells, especially in aging individuals. Furthermore, systematic testing of multiple microbial combinations in mouse models is difficult because each combination requires separate animal cohorts and longitudinal monitoring. Human-relevant in vitro systems are therefore essential. 2D models enable testing of many microbial interactions at the same time but lack the spatial organization of biological skin. 3D skin models, such as reconstructed human epidermis, skin organoids, and organs-on-chip, could make it possible to study microbial survival, skin-barrier physiology, immune interactions, and aging-associated host states in the same platform. However, existing models must be improved to better capture skin-barrier, stromal, and immune biology and to replicate skin microbiota and nutritional microenvironments akin to those in biological skin. Moreover, human skin models are imperfect surrogates for aged tissue because donor cells are often derived from nonaged skin, and many are generated under high-humidity culture conditions that may not reproduce the dry, lipid-altered, pH-shifted, and barrier-impaired habitat of older skin. Notably, a model that mimics the stratum corneum, the nutrient-poor outermost layer of the skin, using cross-linked hydrogels and nonviable epidermal cells supported stable colonization by human skin microbiota and difficult-to-grow organisms such as C. acnes (12).

Sampling issues can also temper the interpretation of research findings in this area. Although skin swabs, a common technique, are useful for longitudinal profiling, bacterial DNA recovered from the skin surface may not represent the organisms that live in follicles, cutaneous invaginations, sebaceous and sweat glands, and other deep microniches $(13)$ . Biopsies, which can capture the whole skin microbiome, are invasive and difficult to perform repeatedly in older adults. Minimally invasive platforms that recover interstitial fluid, cytokines, and immune cells are needed to define the temporal sequence of microbial and immune shifts and identify early changes in skin decline or resilience. Sampling of aged skin, which has lower sebum and moisture content than younger skin, may also be especially susceptible to contamination with extraneous microbial material or DNA from dead or nonviable native skin microbes or be confounded by hygiene practices, use of topical products and medications, and exposure to specific microbial strains associated with long-term care or hospital environments. Ethnic and population-level differences in skin aging must also be considered, as should the influence of viruses that are more commonly carried by older adult skin. Furthermore, many host responses elicited by organisms such as S. epidermidis, C. acnes, or Malassezia are distinctly strain or species specific $(7-9)$ . S. epidermidis commensal variants and those associated with health care settings, for example, can differ markedly in their barrier-protective, proinflammatory, or antimicrobial-resistance potential. Therefore, hospital-acquired lineages might be both biomarkers and potential risk factors for frail aging. Overall, progress in aging-skin microbiome research requires rigorous negative controls; assessment of microbial load and viability; expanded sampling across human populations; functional multiomic profiling, including metatranscriptomics to identify active microbial programs, metabolomics to measure microbial and host-derived metabolites, and spatial profiling to localize these activities within specific skin niches; and models that better reproduce the aged-skin ecosystem.

Epigenetic regulation, which controls age-associated gene expression programs across tissues, including skin, contributes to cellular senescence, chronic inflammation, and metabolic imbalance. Analysis of antibiotic-treated and germ-free mice showed deep remodeling of the chromatin landscape of gut epithelial cells (14). Furthermore, microbial products such as short-chain fatty acids have been linked to histone acetylation and altered differentiation and function of regulatory T cells, macrophages, CD8 $^{+}$ cytotoxic T lymphocytes, and B cells (15). If similar microbiome-dependent processes are found in skin, the relative ease of manipulating the skin microbiome and epigenome compared with those in other organs could render them attractive therapeutic targets for improving skin resilience during aging.

Aging skin is characterized by the accumulation of cells that undergo cell-cycle arrest and transition to a senescence-associated secretory phenotype that promotes chronic inflammation and tissue dysfunction. Although cellular senescence has typically been viewed as a cell-intrinsic process, microbes can modulate the gut epithelium directly through metabolites such as propionate and butyrate that affect cellular signaling and chromatin state and indirectly through inflammation and metabolic stress $(14, 15)$ . In aging skin, the accumulation of senescent keratinocytes, fibroblasts, and immune cells contributes to changes in DNA damage responses, epigenetic remodeling, chronic inflammation, and a reduced ability of epidermal stem and progenitor cells to repopulate the skin after damage. These processes change the skin environment, affecting its microbial composition and host-microbe interactions $(10, 11)$ . Understanding this bidirectional interplay requires models that incorporate age-associated cellular states, such as cells from older individuals or defined mixtures of normal and senescent skin cells, while allowing exposure to selected microbes or microbial products.

Skin aging involves the reorganization of a dynamic ecosystem, where host-driven changes reshape the composition of microbial communities and microbial functions influence tissue decline. Can this understanding guide interventions that improve skin resilience with age? Such interventions could include microbe-centered approaches—such as application of probiotics, engineered microbes, or defined microbial strains or multispecies communities—or habitat-centered ones that target the repair of skin-barrier lipids and inflammation (1). The most effective strategies would plausibly combine both approaches, because an exogenous microbial strain will not engraft unless supported by the appropriate nutrients, pH, barrier state, or physical niche of the skin environment and because improving the skin habitat could also facilitate the recovery of beneficial microbial populations. Clinical translation of such strategies must overcome several barriers: The microbiome is highly personalized and body-site specific, the production of live biotherapeutic products faces complex regulatory and manufacturing challenges, and the topical products or delivery vehicles used for microbiome disruption may have harmful effects. The success of such interventions must be judged against functional improvement in aging-related features, such as reduced susceptibility to infection and skin disease, decreased itching or dry skin, improved skin repair responses, restored barrier function at the molecular level, and reduced concentrations of inflammatory mediators.

REFERENCES AND NOTES

1. J. Oh, A. Y. Voigt, Nat. Rev. Microbiol. 23, 771 (2025).

2. P.J. Larson et al., Nat. Aging 2, 941 (2022).

3. Y. Zheng et al., Cell Host Microbe 30, 301 (2022).

4. S. Almoughrabie et al., Sci. Adv. 9, 33 (2023).

5. E. Gushiken-Ibañez et al., Nat. Microbiol. 11, 1934 (2026).

6. M. P. Pagac et al., npj Biofilms Microbiomes 11, 13 (2025).

7. S. Naik et al., Nature 520, 104 (2015).

8. M. G. Constantinides et al., Science 366, eaax6624 (2022).

9. F. Sparber et al., Cell Host Microbe 25, 389 (2019).

10. E. S. Chambers et al., Nat. Aging 1, 101 (2021).

11. S. M. Pilkington et al., Immunology 153, 60 (2018).

12. P. Wang et al., Nat. Commun. 16, 3085 (2025).

13. E. M. Acosta et al., eLife 12, e87192 (2023).

14. L.A. Gates et al., Nat. Metab. 6, 697 (2024).

15. K.A. Krautkramer et al., Mol. Cell 64, 982 (2016).

ACKNOWLEDGMENTS

The authors acknowledge support from the National Institutes of Health (grants U01-AG084765-02, P30AG067988, R56AG060745, DP2GM12689, 7R01AR083742, and 1R21AR084297-01A1).

10.1126/science.aeh4348

MEDICINE

The history and future of sickle cell disease

Promising new gene therapies have arrived, but it is too soon to claim a medical victory

Adrian Woolfson

Kevin Davies Belknap Press, 2026. 352 pp.

CURVED AIR | In 1874, the West African physician James Africanus Beale Horton described patients with fever, recurrent pain crises that worsened during the rainy season, and blood abnormalities that today would be recognized as consistent with sickle cell disease (SCD). His observations initiated a journey that moved this disease from clinical description to molecular explanation and, ultimately, genomic intervention.

The distorted red blood cells present in those with SCD clog small blood vessels, reducing oxygen delivery to tissues and precipitating excruciatingly painful

vaso-occlusive crises. Oxygen starvation generates a cascade of pathologies, ranging from pneumonia, anemia, and jaundice to avascular necrosis, blindness, strokes, cognitive impairment, end-stage organ damage, and premature death. SCD is more common in certain ethnic groups, including people of African descent. Life expectancy is between 5 years and 50, depending on the availability of medical care.

In his powerful and compelling book Curved Air, geneticist Kevin Davies takes readers on a whirlwind, and at times heart-wrenching, tour of the history and nature of SCD, which the American chemist Linus Pauling referred to as “the first molecular disease.” Davies uses SCD to illustrate the remarkable successes and limitations of molecular genetic medicine, while providing a rigorous critique of the deeply ingrained prejudices, denial, indifference, stereotyping, ignorance, injustice, and inequality of the American health care system.

In 1949, Pauling and his colleagues transformed SCD from a blood disorder into the first disease understood at the molecular level, tracing its origin to an abnormal $\beta$ -globin subunit in the oxygen-carrying molecule hemoglobin. The British biochemist Vernon Ingram showed in 1956 that this resulted from a mutation that changes a negatively charged glutamic acid residue into an uncharged valine. This makes sickle hemoglobin polymerize under deoxygenated conditions, distorting red blood cells into their characteristic shape and coaxing them to self-assemble into rodlike fibers.

The book interweaves patient narratives with epidemiology, pathology, genetics, and physiology. Among these are accounts of two young African American women with SCD: Victoria Gray, the first patient to be treated with the CRISPR-Cas9 gene-edited cell therapy Casgevy, and Brittany Hightower, who died from complications of the disease that may, at least partially, have resulted from medical neglect. Their stories are told alongside tales of the US's shameful history of slavery, eugenics, and unethical medical experimentation on African Americans. The ideologies underlying this mistreatment remain endemic, readers learn, and continue to inform and perpetuate institutionalized medical racism throughout the country.

Davies also touches on the social history of SCD, including the interventions made by Black Panther cofounder Bobby Seale and US President Richard Nixon, whose actions increased disease awareness, helped to establish dedicated community clinics, and facilitated home testing. His analyses are contextualized with the psychological traumas, social pathology, and personal tragedies that accompany this complex, relentless, and devastating disease.

Despite their remarkable efficacy, the approved SCD therapies Casgevy, which uses CRISPR-Cas9 to reactivate fetal hemoglobin production, and Lyfgenia, a gene addition therapy that introduces an anti-sickling $\beta$ -globin variant, are unlikely to be received by more than a small fraction of eligible patients because of their eye-watering price tags (2.2 million and 3.1 million, respectively). Many SCD patients in the US face poverty, unstable employment, inadequate medical insurance, and barriers to accessing care. In Africa, even the mainstay drug hydroxyurea is barely affordable to many patients.

Curved Air succeeds because it refuses to equate molecular mastery with medical victory. The story of SCD reminds us that scientific breakthroughs alone cannot transform global health care without affordability and social systems to deliver them. □

10.1126/science.aej0154

The reviewer is the CEO and cofounder of Genyro Inc., San Diego, CA, USA, and the author of On the Future of Species (MIT Press, 2026). Email: adrianwoolfson@yahoo.com

Swaminathan led efforts to transform Indian agriculture.
SCIENTIST AS SUBJECT
M. S. Swaminathan is best known for spearheading India's green revolution, which drastically increased the country's food production capacity during the 20th century. This week on the Science podcast, Priyambada Jayakumar, author of M. S. Swaminathan: The Man Who Fed India, offers listeners an insider's perspective on the renowned geneticist. 10.1126/science.ael0871

https://scim.ag/swaminathan

Polymetallic nodules serve as substrates for deep sea species, such as the Parapagurus crab. Nodule-mining threatens to disrupt little understood ecosystems.

Deep-sea mining outpaces both science and law

The International Seabed Authority's (ISA's) 36-member Council met in July 2026 to consider whether the international regulatory regime is ready for commercial deep-sea mining and closed without adopting exploitation regulations. Even unfinished, this multilateral process stands in stark contrast with the actions currently being taken by the United States, which is advancing a unilateral domestic pathway for exploration licenses and commercial recovery permits in areas beyond national jurisdiction. This unilateral approach would weaken the common-heritage regime, which prohibits claims of national sovereignty and requires peaceful use and the sharing of economic benefits, just as new scientific evidence is revealing the ecological importance of the Clarion-Clipperton Zone (CCZ), the world's largest polymetallic-nodule exploration region, in the eastern and central Pacific Ocean.

The CCZ is not a vacant or barren mineral province, as it has been portrayed by mining enthusiasts. Its nodules provide the scarce hard substrate required by sponges, corals, anemones, echinoderms, crustaceans and many other benthic organisms. Thousands of metazoan species have already been recorded there, most of them still undescribed (1), and removing polymetallic nodules would eliminate or severely damage one of Earth's least understood ecosystems. Because these habitats develop over geological timescales, recovery is expected to be extremely slow, if it is possible at all.

Recent studies have sharpened the risk calculus. Industrial disturbance and long-term test tracks show that nodule-mining impacts can persist for decades, with incomplete biological recovery (2). Plumes, discharge, pollutants, and noise may also affect benthic and midwater food webs (3, 4), disturbing ecological processes that connect abyssal habitats with pelagic species (5) and the migratory routes of whale sharks (6) and marine mammals (7, 8), and may even affect larval connectivity between the central and eastern Pacific Ocean (9, 10). Moreover, deep-sea mining may disturb the oceanographic conditions in adjacent marine protected areas near Mexico and France's Clipperton atoll and could even have an impact on nearby coastal-state conservation interests.

Current knowledge gaps about the deep sea mean that policy-makers lack the information needed to grasp the full scale of potential harm—and the possible disruptions for which governments could be held responsible—if they allow mining to begin. The ISA Council should treat unilateral licensing as both a governance failure and a biodiversity threat (11). Its decision in July 2026 to extend a CCZ exploration contract held by a subsidiary of a company simultaneously seeking unilateral permits, while an inquiry into that contractor's compliance remains open, illustrates how far the Authority remains from doing so (12). No mining code, exploitation contract, or commercial recovery permit should proceed until independent evidence shows that serious harm can be prevented, that thresholds and halt rules are enforceable, and that environmental data are publicly available.

A mining moratorium, now supported by 43 states (13), is not a political maneuver; it is the only precautionary position consistent with the scale of scientific uncertainty and the fragility of the ecosystems at stake.

Alejandro Olivera $^{1}$ , Erick Morales-Montes de Oca $^{2}$ , Viridiana Lázaro $^{3}$ , María Fernanda Méndez-Martínez $^{2}$ , Héctor Reyes-Bonilla $^{2}$

$^{1}$ Center for Biological Diversity, Tucson, AZ, USA. $^{2}$ Departamento Académico de Ciencias Marinas y Costeras, Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz, Baja California Sur, México. $^{3}$ Greenpeace México, Mexico City, México. Email: erick4220@gmail.com

REFERENCES AND NOTES

1. M. Rabone et al., Curr. Biol. 33, 2383 (2023).

2. D.O.B. Jones et al., Nature 642, 112 (2025).

3. M. H. Dowd et al., Nat. Commun. 16, 9575 (2025).

4. A. G. Glover et al., Curr. Biol. 36, R400 (2026).

5. L. Macheriotou et al., Front. Mar. Sci. 12, 1547803 (2025).

6. H. M. Guzman et al., Mar. Biodivers. Rec. 11, 8 (2018).

7. H. Bailey et al., Endang. Spec. Res. 10, 93 (2010).

8. J. D. Darling et al., Biol. Lett. 18, 20210547 (2022).

9. M. Romero-Torres et al., Sci. Rep. 8, 9354 (2018).

10. P.W. Glynn et al., Eds., Coral Reefs of the Eastern Tropical Pacific, Coral Reefs of the World series (Springer, 2017).

11. ISA, "Statement on the U.S. Executive Order Unleashing America's Offshore Critical Minerals and Resources" (30 April 2025).

12. ISA, "Draft decision relating to a application for extension of the contract for exploration for polymetallic nodules with Nauru Ocean Resources Inc." (10 July 2026).

13. Statements in the Assembly of the International Seabed Authority, 31st session, Kingston, Jamaica (27 to 31 July 2026).

Desert flooding highlights a critical gap in climate change adaptation

In June 2026, the southern margin of the Taklamakan Desert experienced an unprecedented extreme precipitation event, triggering sudden and severe flooding (1). The phenomenon of desert flooding challenges the conventional understanding of hydrological processes in hyperarid regions, where flooding events have traditionally been considered rare. However, this perception is increasingly challenged by observational evidence.

Studies have shown a substantial expansion of extreme flooding in the Taklamakan Desert since 1960, correlating with the intensification of extreme precipitation (2–4). Globally, flood disasters in arid and semiarid regions have also risen rapidly (5–7).

Under the Global Goal on Adaptation (GGA) of the Paris Agreement, priority remains largely given to established climate risks such as heat waves, sea-level rise, long-term droughts, and coastal flooding, whereas emerging risks such as flash floods in hyperarid regions have received insufficient attention. This mismatch between governance priorities and evolving hydrological realities further amplifies the vulnerability of socioecological systems in these regions. More importantly, it exposes a fundamental issue of spatial inequity in global climate governance: Drylands, which are typically characterized by water scarcity and ecological fragility and are not major greenhouse gas emission sources, are nevertheless experiencing intensified climate extremes driven by global warming (8). This asymmetry between low emissions and high exposure makes drylands one of the most prominent zones of climate risk spillover (9).

To address this adaptation gap, it is necessary to refine the conceptual framework of climate risk in dryland regions. The traditional perception of oasis systems as non-flood-prone areas should be revised, recognizing them instead as ecosystems characterized by high hydroclimatic variability, with key features that include the coexistence of drought and flood extremes as well as compound hazards driven by the coupling of glacier melt and extreme precipitation. An integrated monitoring and early-warning system should be established across mountainous cryospheric zones, river basins, and downstream oasis systems to detect and monitor the full evolution of compound flood risks. Last, flood hazards in drylands should be explicitly incorporated into global adaptation targets and climate finance mechanisms, including the GGA and the loss-and-damage framework.

Ji-Xi Gao $^{1}$ , Hai-Dong Li $^{2}$ , Li-Jun Zhao $^{2,3}$ , Dilinuer Tuoliewubieke $^{4,5}$ , Ying-Kui Li $^{6}$ , Ya-Mei Shao $^{3}$

$^{1}$ Satellite Application Center for Ecology and Environment, Ministry of Ecology and Environment, Beijing, China. $^{2}$ College of Forestry and Grassland and College of Soil and Water Conservation, Nanjing Forestry University, Nanjing, China. $^{3}$ Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing, China. $^{4}$ Institute of Desert Meteorology, China Meteorological Administration, Urumqi, China. $^{5}$ Key Laboratory of Tree-ring Physical and Chemical Research, China Meteorological Administration, Urumqi, China. $^{6}$ Department of Geography and Sustainability, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA. Email: shaoyamei@nies.org

REFERENCES AND NOTES

1. “China warns of risk of ‘extreme floods’ in desert regions,” Reuters, 11 June 2026; https://www.reuters.com/business/environment/china-warns-risk-extreme-floods-desert-regions-2026-06-12.

2. W. Dong et al., Nat. Commun. 15, 4379 (2024).

3. Y. Suet al., J. Earth Sci. 36, 1351 (2025).

4. S. Tang, T. Zhou, L. Zhang, Weather Clim. Extrem. 46, 100739 (2024).

5. J. Yin et al., Nature 615, 212 (2023).

6. J. Feng et al., Int. J. Appl. Earth Obs. Geoinf. 139, 104511 (2025).

7. Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC), "Sixth Assessment Report (AR6)" (IPCC, 2021–2023)

8. S. Schöngart et al. Nat. Clim. Chang. 15, 627 (2025).

9. H. Li et al., Assessment of Climate Change and the Effectiveness of Ecological Protection and Restoration in Vulnerable Regions (China Environment Publishing Group, 2019).

A plea for public health support for war-torn El Obeid, Sudan

An ongoing public health crisis is unfolding in El Obeid, the capital of Sudan's North Kordofan, where a protracted proxy war between the Sudanese Armed Forces (SAF) and the paramilitary Rapid Support Forces (RSF) has led to civilian casualties, infrastructure collapse, and mass displacement, leading to overcrowding in sites of refuge that increases the risk of infectious disease outbreaks. This health crisis will not follow the path of a traditional disease outbreak because it is complicated by the severe humanitarian and human rights violations unfolding concurrently (1).

Like many cities in Sudan, El Obeid had been under immense strain. Hospitals and clinics are working with limited staff, medicine shortages, and damaged infrastructure (1, 2). Basic services such as maternal care, pediatric treatment, and chronic disease management have become difficult to access. Clean water and sanitation issues have increased the risk of preventable illnesses such as cholera, diarrheal diseases, dengue, malaria, and respiratory tract infections (3).

Local doctors, nurses, and community workers continue treating patients with whatever resources they have, often travelling long distances to reach families in rural areas. Community groups such as Sudan Red Crescent Society, Sudanese American Physicians Association, and Emergency Response Rooms have stepped up too, organizing health awareness campaigns and supporting vulnerable families.

Multinational entities including the United Nations (UN), the World Health Organization, and Médecins Sans Frontières are delivering critical assistance to the city, but military blockades, crumbling infrastructure, and funding shortfalls imperil efforts to stem the disaster. What El Obeid needs most right now is a reliable source of medical supplies, safe water, and specialized training for local health workers, particularly with regard to improving primary health care, which keeps small problems from becoming emergencies. These resources should be delivered through coordinated partnerships: The Sudanese Ministry of Health and North Kordofan state health authorities must lead planning and oversight; UN agencies and nongovernmental organizations should work to negotiate humanitarian access to goods and funds through neutral coordination platforms; private-sector logistics partners and pharmaceutical suppliers should focus on supply-chain procurement and warehousing; and community health committees and local training institutions must continue community outreach and workforce training efforts.

El Obeid has always been resilient. With the right support, its health system can recover and ensure that the Sudanese people have access to adequate care delivered with dignity.

Emmanuel Edwar Siddig

University of Khartoum, Khartoum, Sudan. Email: emanwelleds389@gmail.com

REFERENCES AND NOTES

1. United Nations, "Sudan: Security Council warns of mass atrocity risk in El Obeid," UN News 20 June 2026; https://news.un.org/en/story/2026/06/1167773 (accessed 22 June 2026).

2. Plan International, “Raising alarm over threat of attack on El Obeid, Sudan,” Reliefweb 19 June 2026; https://reliefweb.int/report/sudan/raising-alarm-over-threat-attack-el-obeid-sudan (accessed 22 June 2026).

3. Al Jazeera staff and Reuters, "At least 29 countries raise alarm about atrocities in Sudan's el-Obeid," Al Jazeera 18 June 2026; https://www.aljazeera.com/news/2026/6/18/dozens-of-countries-warn-of-atrocities-amid-escalation-in-sudans-el-obeid (accessed 22 June 2026).

REGULATORY IMPACT

Correcting the logic behind the 2026 US vehicle emissions standard rollback

Correction of selective assumptions and inconsistent interpretations of evidence would overturn policy justification

Antonio M. Bento $^{1,2}$ , Kenneth T. Gillingham $^{3,2}$ , Mark R. Jacobsen $^{4,2}$ , Christopher R. Knittel $^{5,2}$ , Benjamin Leard $^{6,7}$ , Joshua Linn $^{7,8}$ , David S. Rapson $^{9}$ , James M. Sallee $^{10,2}$ , Arthur A. van Benthem $^{11,2}$ , Kate S. Whitefoot $^{12}$

Vehicle emission and fuel economy standards—the sector's most important policies—have swung wildly in the US since 2000. Modest tightening of standards under the Bush administration was accelerated under Obama, partially rolled back under the first Trump administration, then reinstated

and tightened under Biden. Yet the current Trump administration has gone further, with a complete elimination of the US Environmental Protection Agency (EPA) greenhouse gas (GHG) standards for vehicles. These regulatory swings each claim support from formal cost-benefit analysis, as required by executive orders. Yet the contradictory conclusions stem not from evolving evidence, but from selective assumptions and inconsistent interpretation of key evidence. We discuss how to interpret and apply the existing evidence correctly and demonstrate that correcting errors would overturn the justification for the elimination of the EPA GHG standards.

Light-duty vehicles account for over half of US transportation GHG emissions and 16% of total emissions (1). EPA regulations, our focus, regulate GHG emissions, but the US Department of Transportation (DOT) separately regulates fuel economy. The current administration zeroed out penalties for the DOT regulation and has proposed a weak version that is unlikely to be binding on industry, which de facto leaves the market with no effective regulation. The recent rollback of EPA standards under the second Trump administration took effect in April 2026 and will surely be disputed in court, where errors in analysis could create legal vulnerabilities if they undermine the agency's stated justification for the rescission.

There are two crucial changes in the recent cost-benefit analysis. One is the decision by EPA to ignore environmental benefits of the GHG standards, eliminating what was \$1.8 trillion in benefits from reducing GHGs and copollutants according to the analysis of the 2024 standard. This change is transparent and has been extensively critiqued. But there is a second key change that is on the same order of magnitude as the first but is less transparent and more difficult to assess. This change relates to the treatment of how consumers value fuel savings and vehicle attributes. Both the elimination of environmental benefits and the change in valuation are alone enough to reverse whether the rollback has positive net benefits. We focus on the valuation change because of its large magnitude and the fact it has received relatively little attention, but we recognize the importance of both.

The core of the valuation issue is that research consistently shows that new car buyers are willing to pay less than \$1 extra for the car in exchange for \$1 in discounted fuel savings (2–8) [see supplementary materials (SM) A]. This finding admits multiple interpretations, such as reflecting behavioral biases that imply the low valuation is a mistake, or hidden costs that occur if vehicle efficiency is improved at the expense of other vehicle attributes. The cost-benefit analysis hinges on the relative importance of these different mechanisms. In the case of hidden costs from worsened attributes, we show how the losses to consumers will also be mirrored in technology cost savings for producers. Past administrations have toggled between extremes on how to treat the issues around valuation, sometimes without clear explanation. When an agency makes a strategic choice on this issue, it can swing analysis substantially. We show how the most recent change strips many billions of dollars in benefits from regulating vehicle GHG emissions.

We provide a framework that maps empirical research on consumer valuation into cost-benefit analysis consistently and transparently (see SM B). We apply this framework to the EPA's 2026 Regulatory Impact Analysis (RIA), which puts emphasis on a scenario that takes an extreme position and credits only \$0.22 out of every \$1 of fuel savings as a benefit (9). We show that both this position and the approach taken by EPA under the Biden administration are premised on a misreading of the evidence.

Consumer valuation deserves focus for several reasons. It is pivotal: Proper treatment would overturn the current administration's analysis. By contrast, it would have only modestly affected the Biden-era 2024 analysis. It is also mishandled: Multiple recent administrations have made modeling errors or misapplied the available empirical evidence, enabling policy swings that paralyze long-term industry investment. Finally, it is opaque: Unlike transparent parameters like gasoline prices or cost per ton of carbon emissions, the treatment of fuel savings valuation remains buried in analytical confusion. Our framework brings needed clarity. The framework is also relevant to energy efficiency standards promulgated by the Department of Energy, where the same valuation issues arise.

A FRAMEWORK FOR HOW CONSUMERS VALUE FUEL SAVINGS AND VEHICLE ATTRIBUTES

The starting point to understand valuation is the question: How much more are consumers willing to pay, relative to a benchmark vehicle, for a vehicle that saves \$1 in fuel costs (applying a discount rate to express future costs in present dollars)? Consumers may be willing to pay less than \$1 for two reasons. First, consumers may systematically undervalue fuel savings owing to inattention, misperceptions about future fuel use or price, a bias in favor of the present relative to the future, other cognitive biases, or credit constraints. Second, there may be attribute trade-offs: To reduce vehicle cost, manufacturers may choose designs that save fuel but compromise other attributes (weight, performance, comfort, etc.). Our framework (see SM B) shows how every dollar of fuel savings can be decomposed into three components that must sum to one: (i) willingness to pay for the fuel-efficient vehicle; (ii) inattention or other behavioral biases leading to undervaluation of fuel savings; and (iii) attribute trade-offs reducing consumer utility (“hidden costs”).

In one edge case, suppose that automakers respond to regulation by deploying a fuel-saving technology that changes no other attribute of a car, and that consumers are fully attentive to fuel costs and have no biases. In that case, consumers will value \$1 of savings at \$1. In reality, many fuel-efficiency improvements affect other vehicle attributes, negatively or positively depending on the specific technology (10). Economic evidence also shows that many buyers imperfectly value future savings (2–8). Thus, in reality we expect consumers to be willing to pay less than \$1 per \$1 in fuel savings and that the gap will be a mix of inattention (or other biases) and hidden costs. But logically, the components sum to one. Past regulatory analyses have made inconsistent, and often implicit, assumptions about these components. Using an explicit decomposition—with each component justified by credible evidence and constrained to sum to one—would greatly improve analytical transparency.

VALUATION IN THE 2026 EPA ANALYSIS

The EPA's 2026 RIA concludes that eliminating vehicle greenhouse-gas standards would increase US welfare by \$600 to \$790 billion (9). This conclusion rests on a problematic approach to valuation and the associated technology costs. We map both the earlier 2024 EPA analysis, which supported stricter standards, and the 2026 analysis, into our valuation framework (10, 11). We reveal implicit assumptions of both analyses that run counter to empirical evidence.

Both recent EPA analyses assume car buyers require a 2.5-year payback period, and thus include only the first 2.5 years of fuel savings in benefit calculations. This implies a willingness to pay for \$1 in fuel savings of \$0.21 to \$0.25 (see SM A.1). The 2026 RIA introduces a scenario with no undervaluation of future fuel savings. Consequently the remainder—\$0.75 to \$0.79—is assumed by EPA to represent the hidden attribute trade-offs. These assumptions contradict the preponderance of available evidence, as discussed below. Likewise, although industry convention cites similar 2.5-year payback periods, automakers typically associate the remainder with undervaluation rather than attribute trade-offs—contrary to the 2026 RIA's assumption. By contrast, the 2024 analysis assumes no hidden attribute trade-offs, assigning the full remainder to inattention.

The assumptions about valuation in the present cost-benefit analysis also create an internal logical inconsistency: Both the 2024 and the 2026 RIA estimate technology costs using established methodologies that assume fuel-saving technologies hold other attributes (weight, performance, comfort, etc.) constant. Yet the 2026 RIA simultaneously assumes large attribute trade-offs that produce hidden costs. If automakers achieved fuel economy by sacrificing performance or weight rather than deploying new technology, costs would be substantially lower than the 2026 RIA estimates (SM A.3).

AVAILABLE EMPIRICAL ESTIMATES

The assumption that consumers value only 2.5 years of savings lacks empirical grounding (see SM A.1). The academic literature estimates either undervaluation or attribute trade-offs and uses these to infer willingness to pay. We know of no credible studies directly estimating willingness to pay in regulatory contexts involving trade-offs. Nevertheless, absent direct estimates, we accept the RIA's implied willingness to pay of \$0.21 to \$0.25 as our starting point.

The 2026 RIA's assumption of no undervaluation of future fuel savings is inconsistent with a literature review of recent high-quality studies finding substantial undervaluation (2–8). The analysis fur-

Monetized impacts of rescinding standards

Values are calculated in billions of 2024 dollars. Columns 2 to 4 reflect adjustments to the US Environmental Protection Agency (EPA) values in column 1. The combined change in net benefits after all adjustments equals \$1.46 trillion at a 3% discount rate. Pollution benefits of the standards are not included.

	2026 EPA scenario (A3) (1)	Adjustment: rebound (2)	Adjustment: fuel-savings split (3)	Adjustment: technology costs (4)
3% DISCOUNT RATE
Savings	1290	1290	1290	748
Costs	500	734	1418	1418
Net savings	790	556	-128	-670
7% DISCOUNT RATE
Savings	850	850	850	493
Costs	240	365	732	732
Net savings	600	485	118	-239

ther distorts results by applying high discount rates to future payoffs and ignoring an approximation bias present in some studies. Our literature summary (see SM A.1 and table S2) addresses these issues and indicates inattention (or other behavioral biases) between \$0.54 and \$0.62.

Regarding attribute trade-offs, the RIA emphasizes the gasoline-to-electric transition as an important burden to consumers, yet available empirical evidence suggests they face much smaller costs. A recent study estimates attribute trade-offs of fully electric vehicles (EVs) compared to their conventional gasoline vehicle counterparts at between \$0.17 and \$0.31 per dollar of the EV's fuel cost savings, declining over time as EV range improves (12). Further, these are upper bounds: Consumers need not choose the fully electric version of the vehicle they would have purchased absent regulations and will only switch to other technologies (e.g., hybrids) or other vehicles if they value them more.

Taken together, our suggested ranges for the three components—willingness to pay, inattention or other biases, and attribute trade-offs—are 21 to 25%, 54 to 62%, and 17 to 31%, respectively. Although determined separately, the midpoints of these ranges sum up to 100% almost exactly. For the current year, we propose that the EPA use \$0.22, \$0.55, and \$0.23 for consumer valuation, inattention or other biases, and attribute trade-offs, respectively. The value for attribute trade-offs should decline over time. Both the 2024 and 2026 estimates attributed \$0.22 to willingness to pay, as does our estimate. However, the 2024 estimate attributed \$0.78 to inattention and \$0 to trade-offs, whereas the 2026 estimate attributed \$0 to inattention and \$0.78 to trade-offs. In stark contrast to those earlier EPA analyses, our estimate attributes \$0.23 to trade-offs and \$0.55 to inattention (fig S1) (10, 11).

FUEL PRICES, DRIVING CHANGES, AND ELECTRIC VEHICLES

We have additional substantive concerns with the regulatory analyses beyond valuation. The 2026 Rule makes asymmetric assumptions about fuel prices, presenting the central fuel price forecasts from the 2025 Annual Energy Outlook alongside a low-price case, without presenting the corresponding high-price scenario—all of this in a current gasoline price environment that well exceeds the central case. Assuming low gasoline prices will mechanically and unrealistically lower the benefit of fuel economy improvements (SM A.2).

The 2026 RIA analysis also makes an accounting error associated with reductions in driving when cars become more expensive to operate (a reverse of what is often called the “rebound effect”) (13). Specifically, the analysis says that consumers are better off when driving is more expensive because the higher cost leads consumers to drive less, creating large savings in fuel, maintenance, and repair costs from reduced trips, which EPA estimates at around \$250 billion. By basic economic logic, however, consumers valued those lost trips by at least as much as they would have paid to take them, and so the foregone value of those trips must also be included as a cost of rescission (SM A.4). The magnitude of the change in driving itself, which EPA estimates at about 1.4 trillion miles lost over the analysis period, is debated in the literature (13), so we do not examine it here. However, regardless of the estimated change in driving, the cost-benefit analysis must be consistent with the logic of why consumers choose to drive.

We also note that both the 2024 and 2026 analyses ignore potential electricity distribution costs that could be triggered by increased EV penetration. The EV transition could also potentially deliver benefits by smoothing demand on the electric grid. These costs and benefits are prospective, and therefore harder to estimate, but we believe they could be substantial. Analyses of standards that involve EV adoption should be expanded to include any notable system costs associated with vehicle electrification, as well as any gasoline-related infrastructure costs that occur as a result of eliminating the standards.

OVERALL IMPLICATIONS FOR COST-BENEFIT ESTIMATES

Applying the accounting correction for driving changes, our proposed undervaluation estimates, and the associated changes in technology cost leads to a substantially different conclusion than that in the 2026 RIA. Starting from the EPA's full-valuation scenario A3 (see the Table, column 1), we first estimate that correcting for driving changes leads to a \$234 billion increase in the costs of rescinding the EPA GHG standards (see the Table, column 2 versus 1). Next, we apply our proposed division of fuel savings: The costs of rescission increase further by \$684 billion (see the Table, column 3 versus 2). Thus, if we simply apply EPA's own modeling and adjust for these corrections, we find that the conclusion of the 2026 EPA analysis is reversed.

Finally, there is a logical inconsistency in the 2026 RIA of measuring technology costs assuming manufacturers use fuel-saving technologies that hold other attributes constant, while at the same time including large hidden costs of attribute trade-offs in valuation. This inconsistency overstates technology costs in the 2026 RIA; automakers will choose technologies with hidden costs only if they reduce compliance costs. Estimates from the literature imply that this inconsistency could inflate the savings from rescinding the standards by 42% or \$542 billion (see the Table, column 4 versus 3). Added together, we conclude that these three corrections alone reduce the net benefit of rescinding the standards by \$1.5 trillion.

The elimination of environmental benefits is also deeply problematic from an economics perspective, and this is valued at \$1.8 trillion in the 2024 analysis. Taken together, we conclude that a more careful and complete analysis would almost certainly come to a different conclusion than in the 2026 RIA.

ALTERNATIVE POLICIES FOR VEHICLES

Analyses of regulation typically give only perfunctory consideration to policy alternatives. A serious consideration of alternatives, which could identify policies to reduce GHG emissions at lower cost, would be a positive outcome of the current debate and policy whiplash.

New vehicle taxes based on fuel consumption or emissions factors offer one alternative to corporate average fuel economy (CAFE). Whether structured as differentiated taxes or as “feebates” (combining taxes on less efficient vehicles with rebates for more efficient vehicles), these instruments make compliance costs transparent—unlike CAFE, where costs are hidden in design and pricing choices. Opacity may be advantageous for political reasons, but it creates confusion by enabling stakeholders to exaggerate or understate costs. Fuel consumption-based taxes eliminate this ambiguity, address known limitations of performance standards regarding market size, and can raise revenue if desired. Dozens of countries already implement such systems successfully.

Fuel or mileage taxes provide another alternative with considerable advantages. Unlike CAFE, fuel pricing (as would be the case with a carbon tax) affects both vehicle choice and driving behavior, encourages retirement of older vehicles, and immediately affects the entire fleet when adjusted. CAFE standards, by contrast, take decades to permeate the vehicle stock. The main limitation is that if consumers ignore fuel prices when purchasing vehicles, they may underinvest in efficiency without standards $14$ . When undervaluation of future fuel savings is substantial, as our review suggests, a hybrid approach combining fuel taxes with standards may be preferable.

The 2026 rollback rests on several fundamental errors. Correcting the issues in how the valuation of future fuel savings is treated would alone negate the economic justification for EPA's decision to rescind the standards. When applying further corrections for other problematic assumptions, most notably the omission of environmental damages from the analysis, the case for removing the standards in the 2026 EPA analysis is even more clearly unjustified. Policy volatility hamstrings automakers' long-term investments. Although political power drives these swings, rigorous and transparent cost-benefit analysis—consistently applied—could moderate them. Application of our framework to deal with valuation could correct errors from multiple administrations, providing analytical consistency that could help improve and stabilize policy.

REFERENCES AND NOTES

1. US Environmental Protection Agency, Sources of Transportation Emissions (2022); https://www.epa.gov/ghgemissions/transportation-sector-emissions.

2. H. Allcott, N. Wozny, Rev. Econ. Stat. 96, 779 (2014).

3. M. R. Busse, C. R. Knittel, F. Zettelmeyer, Am. Econ. Rev. 103, 220 (2013).

4. K. T. Gillingham, S. Houde, A. A. van Benthem, Am. Econ. J. Econ. Policy 13, 207 (2021).

5. L. Grigolon, M. Reynaert, F. Verboven, Am. Econ. J. Econ. Policy 10, 193 (2018).

6. B. Leard, J. Linn, Y. C. Zhou, Rev. Econ. Stat. 105, 158 (2023).

7. B. Leard, J. Linn, K. Springel, J. Polit. Econ. Microecon. 10.1086/738879 (2025).

8. J. M. Sallee, S. E. West, W. Fan, J. Public Econ. 135, 61 (2016).

9. US Environmental Protection Agency, Rescission of the Greenhouse Gas Endangerment Finding and Motor Vehicle Greenhouse Gas Emission Standards Under the Clean Air Act. Regulatory Impact Analysis (2026); https://nepis.epa.gov/Exe/ZyPDF.cgi?Dockey=P101HV06.pdf.

10. K. S. Whitefoot, M. L. Fowlie, S. J. Skerlos, Environ. Sci. Technol. 51, 10307 (2017).

11. Fed. Reg. 89, 27842 (18 April 2024)

12. C. R. Forsythe, K. T. Gillingham, J. J. Michalek, K. S. Whitefoot, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120, e2219396120 (2023).

13. K. Gillingham et al., Rev. Environ. Econ. Policy 10, 68 (2016).

14. A. M. Bento et al., Science 362, 1119 (2018).

ACKNOWLEDGMENTS

K.T.G. has served as an expert witness for the California Air Resources Board on fuel efficiency regulation-related issues. K.T.G. has also consulted for the Toyota Research Institute and the Center for Applied Environmental Law and Policy. D.S.R. has served as a compensated expert witness in energy-related matters through an economic consulting firm; the entities involved did not sponsor this research, and the expert-witness activities had no role in the analysis or conclusions. All other authors declare that they have no competing interests.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aef0464

10.1126/science.aef0464

$^{1}$ USC Price School of Public Policy, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA. $^{2}$ National Bureau of Economic Research, Cambridge, MA, USA. $^{3}$ Yale School of the Environment, Yale University, New Haven, CT, USA. $^{4}$ Department of Economics, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. $^{5}$ Sloan School of Management, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. $^{6}$ Department of Economics, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA. $^{7}$ Resources for the Future, Washington, DC, USA. $^{8}$ Department of Agricultural and Resource Economics, University of Maryland, College Park, MD, USA. $^{9}$ Department of Economics, University of California, Davis, Davis, CA, USA. $^{10}$ Haas School of Business, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. $^{11}$ The Wharton School, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. $^{12}$ Department of Engineering and Public Policy, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, USA. Email: kenneth.gillingham@yale.edu

RESEARCH

IN SCIENCE JOURNALS

Edited by Michael Funk

OCEANOGRAPHY Narwhals as ocean sensors

The rate of melting of ice-sheet margins in contact with the ocean is highly sensitive to ocean temperature, with an increase in melting causing ice-margin retreat and sea-level rise. However, accessing these polar regions to measure ocean temperature is logistically challenging and expensive. Seals equipped with ocean sensors have been used to monitor water mass properties around the Antarctic ice-sheet margin, greatly increasing our understanding of oceanographic changes there. Addressing similar needs along the ice-covered East Greenland coast, Heide-Jørgensen et al. instrumented six narwhals to collect more than 2000 temperature measurements over a 3-year period. They found that warmer intermediate waters now penetrate deep into the East Greenland fjord system, enhancing submarine melt and iceberg discharge from the Greenland Ice Sheet. —Peter U. Clark Sci. Adv. (2026) 10.1126/sciadv.adr1424

Researchers equip a narwhal with equipment for measuring temperatures in inaccessible areas around Greenland.

OPTOELECTRONICS Stabilizing tin perovskite emitters

Lattice stabilization enabled the fabrication of highly efficient and stable near-infrared light-emitting LEDs based on $CsSnI_{3}$ . Bai et al. used for-mamidine doping to suppress the phase transition to $Cs_{2}SnI_{6}$ and added triphenylphosphine oxide to balance electron-hole transport and improve optical properties. These lead-free devices had an external quantum efficiency of 21.2% at 963 nanometers and operating half-lifetimes of 920 hours at 7.1 Watts per steradian per square meter. —Phil Szuromi Science p. 882, 10.1126/science.aeg8955

METABOLISM

Powering up failing hearts

Empagliflozin and other inhibitors of sodium glucose cotransporter-2 (SGLT2) are drugs that were developed to reduce blood glucose in patients with diabetes by promoting the elimination of excess glucose in the urine. It eventually became clear that these drugs also improved cardiac function and

protected patients from heart failure regardless of whether those patients also had diabetes or high blood glucose. Moreover, SGLT2 itself is not expressed in the heart, so the beneficial cardiac effects were not attributable to either diabetes control or on-target action in the heart. Forelli et al. now demonstrate that in addition to their canonical activity, SGLT2 inhibitors activate pantothenate kinase 1, a key enzyme for cardiac metabolism, thereby promoting more efficient fuel use and improved contractility in the heart. —Yevgeniya Nusinovich

PLANT GENETICS Resolving an ancient rice conflict

Asian and African rice are the only two domesticated rice species. Asian-African hybrid rice offers a path to higher yield and resilience but faces hybrid sterility barriers. Using genome-wide linkage analysis, He et al. identified RHS3 as the quantitative trait locus underlying this incompatibility. RHS3 consists of three genes, MAO, DUN, and JIA. MAO functions as a toxin affecting both male and female gametes. In pollens,

DUN functions as an antidote competitively inhibiting MAO's toxicity, whereas in female gametes, JIA and DUN together target MAO for detoxification through autophagy. The researchers found rice lines with functional antidote DUN but nonfunctional toxin MAO, providing a potential resource for Asian-African hybrid rice breeding. —Unnati Sonawala and Madeleine Seale

Science p. 903, 10.1126/science.aec5252

ORGANIC CHEMISTRY Cyclopropanes from three separate parts

Despite the strain inherent in forcing three carbons into a triangular ring, cyclopropane groups are sufficiently stable to appear in numerous natural products and pharmaceuticals. The most common methods to synthesize them involve the addition of a single activated carbon fragment to a two-carbon olefin. Kong et al. now report an alternative iron-catalyzed reaction that brings together three separate carbon fragments, an ester and two carbenes, for greater versatility in the assembly of cyclopropyl alcohols. Both coupling steps appear to proceed through outer sphere additions to iron-coordinated ligands. —Jake S. Yeston

Science p. 910, 10.1126/science.aej0194

PREGNANCY

Understanding UTIs

Urinary tract infections (UTIs) during pregnancy have been linked to a higher risk of preterm birth, but the mechanisms linking these two processes are not understood. Ottinger et al. developed a mouse model of maternal UTI to show that T cell activation and inflammatory cytokine production were associated with induction of early labor, a phenotype that could be ameliorated by exogenous interleukin-10 administration to the dam or pharmacologic inhibition of T cell egress. To translate these findings, the

authors looked at urinary cytokines in pregnant individuals and associated them with birth outcomes and urine culture positivity, discovering that cytokines associated with T cell immunity were likewise linked with preterm birth. Together, these findings provide both a model with which to delve deeper into the link between UTI and preterm birth and potential biomarkers of and therapeutic targets for preterm birth in humans. —Courtney Malo

Sci. Transl. Med. (2026) 10.1126/scitranslmed.aea1228

COMPUTER ENGINEERING Real-time hyperspectral video

Unlike most hyperspectral systems, which provide detailed spectral signatures and rely on bulky, high-power computing systems and offline processing, Hypervision is a standalone visible-near-infrared hyperspectral microsystem. Introduced by Bian et al. and built around the HyperN neural processing unit, this system integrates hardware acceleration, algorithm architecture, and topology-aware network pruning in a closed-loop co-optimization strategy. Paired with the Hyperspecl sensor, Hypervision achieved real-time reconstruction across 61 spectral channels at 512 × 512 pixels (32.9 frames per second), weighing about 950 grams and consuming about 25.3 Watts, an order of magnitude below its graphics processing unit-based counterparts. Validated in intelligent driving, smoke monitoring, and uncrewed aerial vehicle-based imaging, Hypervision demonstrated robust performance in complex, dynamic scenes, reflecting a growing expectation for deployable, power-efficient hyperspectral computing in applications requiring timely decision-making. —Yury Suleymanov

Science p. 888, 10.1126/science.aef8268

PLANT GENOMICS A tale of two ferns

Fern genomes can reach more than 100 gigabase pairs long and encompass hundreds of chromosomes, with whole-genome duplications (WGDs) proposed as a reason. However, ferns of the order Salviniales tend to have smaller genomes, thought to be due to differing reproductive modes. To examine the role of polyploidy and ancient WGDs, Rizzieri et al. sequenced the genomes of Salvinia molesta and S. cucullata. Despite its having the smallest known genome of a fern, the authors found that S. cucullata had 34 chromosome pairs and that S. molesta was an obligately clonal diploid despite earlier belief that it was a pentaploid. Neither showed a history of WGDs, suggesting that repeated chromosome rearrangements may explain Salviniales' genomic plasticity. —Corinne Simonti Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2026)10.1073/pnas.2602084123

Chromosomal rearrangements may underlie the genomic plasticity seen in ferns such as Salvinia molesta.

SIGNAL TRANSDUCTION Lysosomes signal kidney disease

Evidence continues to accumulate that lysosomes are critical hubs of signaling that coordinate metabolism and other biological functions. Nguyen et al. found that in a form of human kidney disease, lysosomes showed increased accumulation of asymmetric dimethyl-arginine, a by-product of proteolysis in lysosomes.

This failure to release dimethylarginine led to abnormal lipid accumulation and toxicity that could lead to cell death. This could be alleviated in a cell culture model by adding back the lysosomal metabolite. Thus, beyond their roles in cellular recycling, lysosomes are proving to participate in interorganellar signaling and may thus offer previously unrecognized targets for therapeutics. —L. Bryan Ray

Nat. Cell Biol. (2026) 10.1038/s41556-026-01970-4

COMPARATIVE BEHAVIOR

Roots of our love for animals?

Throughout human history, human animals have connected with nonhuman animals in nonfood contexts, and today more than half of human homes are estimated to have a pet. Although the explanations for this have often called upon utilitarian uses, what might be called “friendly” interactions across animal species have been anecdotally observed for decades. Nonhuman primates are also known to engage in social interactions with other species. Grueter et al. looked across recorded cases of such interactions in the literature and found patterns of positive affiliation across multiple primate groups, both with other primates and with nonprimate species, including other mammals, birds, and reptiles. These widely distributed cross-species connections may indicate deep roots for our own desire to connect with species other than our own. —Sacha Vignieri Primates (2026) 10.1007/s10329-026-01281-0

Many nonhuman primates display friendly interactions with other species.

and determined their size distributions. They found that the highest crater density is on the side facing Mars, whereas theory predicts that it should be on the side facing the direction of orbit. This observed distribution could be explained by a reorientation of Deimos, preferential erasure of some craters by dust, or a combination of both effects. —Keith T. Smith

OPTOELECTRONICS Slow light for faster communications

The rapid increase in artificial intelligence engines, processing of data in the cloud, and digital communication networks requires efficient, fast and low-power interconnects that can handle the vast amounts of data. Traditional Mach-Zender modulators lie at the heart of existing technologies but can be relatively big and limited in scalability. Jia et al. present a silicon-photonics approach based on the slow light properties of a structured photonic crystal. Through careful design of the photonic crystal structure, the authors could achieve modulation rates of 400 gigabits per second per wavelength with a power consumption of just 15 femtojoules per bit. Such a large-scale manufacturable platform is promising to address the need for energy-efficient and compact high-speed optical interconnects. —Ian S. Osborne

Optica (2026) 10.1364/OPTICA.603434

SPECTROSCOPY Electron motion at the ultimate limit

The convergence of ultrafast optics and atomic-scale imaging over the past two decades promises direct visualization of atomic and electronic motion by simultaneously resolving structure and dynamics, although the underlying fundamental space-time limit remains poorly understood. Maier et al. developed subfemtosecond scanning tunneling microscopy to directly visualize the quantum motion of individual electrons at this space-time limit as they tunneled through an energy barrier. Modulating the barrier with the carrier field of near-infrared waveforms produced isolated

sub-1-femtosecond electronic wave packets, the spatial extent of which depended on a complex interplay between multiphoton and field-driven dynamics. By balancing quantum path interference, the authors minimized the wave function's space-time volume down to the attosecond-angstrom scale. —Yury Suleymanov

Nat. Photon. (2026) 10.1038/s41566-026-01932-0

MARS MOONS

Deimos has more craters on its Mars side

Mars has two small moons, Phobos and Deimos, which are tidally locked to the planet and are of uncertain origin. In 2023, the Emirates Mars Mission spacecraft imaged parts of Deimos that were previously poorly observed. Shimizu et al. identified impact craters across the entire surface of Deimos

Geophys. Res. Lett (2026) 10.1029/2025GL117346

MEMORY Hippocampus-free consolidation

During sleep, consolidation of all types of memories is thought to be initiated by hippocampal replay of spatiotemporal context. However, whether the hippocampus is the driver of, and needed for, memory consolidation in all conditions remains a matter of debate. Thompson et al. showed that the consolidation of procedural memory occurs in the striatum, without the involvement of the hippocampus. Bilateral hippocampal lesions did not affect memory consolidation, suggesting that the hippocampus is not necessary for triggering procedural memory consolidation. —Mattia Maroso

Nat. Neurosci. (2026) 10.1038/s41593-026-02362-5

CELL BIOLOGY Cell death changes in IBD

Inflammatory bowel disease (IBD) affects millions worldwide and causes recurrent intestinal inflammation and debilitating symptoms. Although current therapies can suppress inflammation, many patients still experience unpredictable disease relapse, highlighting major gaps in our understanding of what drives IBD. Pang et al. found that intestinal cells in IBD patients are more prone to cell death signaling than usual, even when disease appears to be well controlled. This shift toward exaggerated cell death pathway activity represents an early warning sign of impending relapse in patients who are in remission and on advanced therapies and presents a possibility for intervention with therapeutics targeting cell death pathways. —Stella M. Hurtley

Science p. 875, 10.1126/science.aeh7112

NEUROSCIENCE Zebrafish sensation

Thalamocortical projections, a major source of sensory processing, have been extensively studied in mammals. By contrast, little is known about the thalamocortical-like system in nonmammalian vertebrates. Trinh et al. used zebrafish to determine how sensory information is processed in the pallium, the homolog of the cerebral cortex. The researchers isolated a structure called the preglomerular complex (PG) that is primarily responsible for conveying sensory (vibrational and visual) information to the pallium. Further analysis led to the identification of spatially segregated subpopulations of PG neurons with preferential

Edited by Michael Funk

responses to light or vibration stimuli and of light-exclusive, vibration-exclusive, multisensory, and integrative neuronal subpopulations in the pallium. This study thus identifies a conserved feature of structural and functional organization of the vertebrate brain. —Mattia Maroso

Science p. 876, 10.1126/science.aec2171

PROTEIN INTERACTIONS Interacting proteins in ASD

A large number of genomic and transcriptomic datasets have revealed valuable insights into the biology of autism spectrum disorder (ASD). Wang et al. produced a complementary resource by mapping 100 high-confidence ASD genes and producing a large protein-protein-interaction (PPI) network, identifying more than 1800 interactions, most of which (87%) have never been reported previously. By integrating affinity purification–mass spectrometry data with AlphaFold-based structural predictions and by validating key interactions in human induced pluripotent stem cell-derived organoids and Xenopus embryos, the authors showed that disease-associated variants selectively weakened or strengthened specific PPIs, producing convergent neurodevelopmental phenotypes even when the variants reside in different genes. This study provides a valuable resource for understanding the biology of ASD.—Mattia Maroso

Science p. 877, 10.1126/science.ady4523

INDUCED SEISMICITY What's behind foreshocks

Earthquakes are regularly induced by injection activities during energy or disposal operations. Their increasing frequency and sometimes damaging magnitudes have led to mitigation strategies based on foreshock detection, although their link to main-shock behavior is uncertain. Wang et al. studied 10 years of continuous waveform data in the Western Canada Sedimentary Basin and found that more than 90% main-shocks of local magnitude 3 or greater were preceded by foreshocks. However, the foreshock-mainshock relationship varied depending on regional and local parameters. These results support risk mitigation approaches that are spatially conditioned, rather than fixed, and based on combined seismic and geodetic monitoring. —Angela Hessler

Science p. 878, 10.1126/science.aed9893

INTROGRESSION Not so deserted after all

Since the sequencing of Neanderthal and Denisovan genomes, extensive gene flow between archaic hominins and humans has become increasingly apparent. However, early episodes of gene flow can obfuscate later signals, and introgression is still difficult to detect without a reference genome. Zhang et al. developed TRACE, a method that uses ancestral recombination graphs to identify introgression in humans without archaic reference genomes. They found introgressed regions from a ghost lineage of hominins in all modern human populations that surprisingly overlapped regions previously identified as lacking Neanderthal and Denisovan introgression, called “deserts.” This work also supported previous evidence of superarchaic ancestry within Denisovan introgressed regions. —Corinne Simonti

Science p. 938, 10.1126/science.aef8874

EVOLUTION Are there set paths to XY and ZW?

Despite their importance in reproduction, sex chromosomes have often shown signs of rapid evolution. Zhou et al. sequenced the genomes and examined the sex chromosomes of 19 gecko species, which have evolved temperature-dependent as well as XY and ZW genetic sex determination systems across lineages. Although some ancestral chromosomes evolved into sex chromosomes in multiple species, these often did not stem from homologous regions. When the authors examined the gene content of these regions, they found gene clusters with sex-biased gene expression, even in species with different sex determination systems. Given the prevalence of recombination suppression locking genes together on sex chromosomes, such properties may tip evolution toward XY or ZW systems. —Corinne Simonti

Science p. 880, 10.1126/science.aec3449

GENE THERAPY

No more nonsense

Nonsense mutations cause many genetic diseases by inserting premature stop codons (PTCs) that prevent full-length proteins from being made. Suppressor transfer RNAs (tRNAs) can bypass these faulty stop signals, but their current therapeutic use has been limited by inefficient PTC readthrough, immunogenicity, and delivery challenges. Chen et al. improved suppressor tRNAs through chemical modifications that enhanced therapeutic efficacy and persistence while reducing innate immune activation (see the Perspective by Myerson and Weissman). They also developed nonviral lipid

nanoparticles tailored for pulmonary tRNA delivery. In models of cystic fibrosis ranging from cells to mice to patient-derived organoids, this nonviral approach restored the missing CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) protein production and function. Thus, nonviral-delivered suppressor tRNAs represent a promising therapeutic platform for treating diseases caused by nonsense mutations. —Stella M. Hurtley

Science p. 881, 10.1126/science.aeb0054; see also p. 862, 10.1126/science.aek3835

RNA

Designing pseudoknots using AI

RNA molecules can fold into intricate three-dimensional shapes that drive much of their biology, but designing new structured RNAs from scratch has remained out of reach. Townley et al. show that complex RNA structures called pseudoknots can now be designed reliably using artificial intelligence (AI). In a year-long competition on the citizen science platform Eterna, AI methods solved more than 95% of 57 design challenges, matching the performance of expert human players (see the Perspective by Mustoe and Guo). Cryo–electron microscopy revealed that the molecules folded into entirely new three-dimensional architectures, sometimes featuring intricate interactions that the AI had not been instructed to build. RNA design has thus entered the deep-learning era. —Di Jiang

Science p. 931, 10.1126/science.aeg6829; see also p. 859, 10.1126/science.aek4499

2D SEMICONDUCTORS High-quality contacts for 2D materials

Integrating reliable metal contacts with two-dimensional (2D) semiconductors is a key challenge for the practical application of such devices due to persistent issues such as high contact resistance and low thermal stability. Zhang et al. introduced an in situ atomic layer-by-layer evaporation process to directly deposit single-crystal metals onto 2D semiconductors, creating atomically clean interfaces with minimal Fermi-level pinning (see the Perspective by Shin and Kim). The resulting contacts delivered ideal Schottky-Mott behavior, ultralow n- and p-type contact resistances (both approaching the quantum limit), and exceptional thermal robustness across various metals and 2D materials. The presented results overcome long-standing limitations and may represent a paradigm shift, greatly accelerating the integration of 2D semiconductors into future electronic technologies. —Yury Suleymanov

Science p. 938, 10.1126/science.aee3132; see also p. 860, 10.1126/science.aek4631

DEVICE TECHNOLOGY Tunneling transistors based on bismuth

A field-effect transistor (FET) based on tunneling between two-dimensional layers of p-type bismuth and n-type indium selenide can lower driving voltage and power consumption. Wu et al. showed that the favorable band effects in their Bi/InSe tunnel FETs allowed operation that is not limited by the Boltzmann thermionic emission but is based on cold carrier injection. The devices, grown on a silicon platform, maintained efficient current switching over more than seven orders of magnitude at a gate voltage of only 160 millivolts, versus about 800 millivolts in state-of-the-art FETs. —Phil Szuromi

Science p. 917, 10.1126/science.adx6059

FERROELECTRICS Increasing energy storage by nitriding

Postsynthetic processing of ferroelectric titanate films introduced titanium-nitrogen bonds and resulted in up to a 50% enhancement in dielectric energy storage density. Yi et al. showed that alternately immersing the films in liquid nitrogen and heat baths doped the films with nitrogen and avoided the introduction of hydrogen, which accelerates degradation. By maximizing polarization and minimizing remnant polarization, the researchers achieved storage densities as high as 286 Joules per cubic centimeter in relaxor ferroelectric films. —Phil Szuromi

Science p. 923, 10.1126/science.aeb5274

PAIN

BRAF boosts pain at the spinal cord

Increased activity of glutamate receptors called NMDARs in sensory neurons drives chronic neuropathic pain. Jin et al. found that this phenomenon after nerve injury can be blocked by BRAF inhibitors. The intensity and duration of neuropathic pain after spinal nerve injury in rodents were driven by the translocation of the kinase BRAF from sensory nerve cell bodies to their central terminals at spinal cord neurons, where BRAF-activated signaling increased the activation and abundance of pre- and postsynaptic NMDARs. BRAF inhibitors that are approved to treat cancer reduced the animals' hypersensitivity to various stimuli, suggesting that BRAF inhibitors might be repurposed to treat pain. —Leslie Ferrarelli

Sci. Signal. (2026) 10.1126/scisignal.aeh6852 androgens during development protected the animals from allergen-induced pulmonary inflammation. They found that androgens promoted the innervation of sympathetic nerves in the lungs of male mice, which in turn suppressed type 2 inflammation through norepinephrine. In addition to their direct effects on immune cells, androgens may therefore also dampen allergic responses in the lung through an endocrine–neuroimmune signaling axis. —Seth Thomas Scanlon

Sci. Immunol. (2026) 10.1126/sciimmunol.aed0186

ASTHMA Warding off asthma takes a lot of nerve

During puberty, the prevalence of asthma and other allergic diseases shifts from men to women. A growing body of evidence suggests that sex hormones help drive this phenomenon. Studying mice, Tu et al. reported that

A necroptotic-to-apoptotic signaling axis underlies inflammatory bowel disease

Jiyi Pang†, Aysha H. Al-Ani†, et al.

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aeh7112

INTRODUCTION: Each day, billions of human cells are eliminated through tightly regulated death programs that preserve tissue integrity without provoking inflammation. In the intestine, disruption of these pathways can have profound consequences. For example, rare inherited defects in cell death regulation cause severe, early-onset inflammatory bowel disease (IBD) in children. These monogenic disorders have led to the broader hypothesis that intestinal cell death is a causal force behind the more prevalent multifactorial forms of IBD. This idea has motivated therapeutic trials, yet direct evidence that aberrant cell death drives prevalent human disease has been lacking.

RATIONALE: We undertook a prospective clinical cohort study to determine whether intestinal cell death is merely a consequence of inflammation or if it is a mechanistically defined feature of human IBD. We profiled intestinal biopsies for transcriptional and post-translational signatures of cell death signaling, functionally dissected these mechanisms in patient-derived intestinal organoids, and correlated these signatures with the patients' inflammatory state and longitudinal clinical outcomes. This integrated approach allowed us to determine when cell death programs emerge during lesion development, how they are regulated in human intestinal epithelium, and whether they have prognostic value.

RESULTS: Intestinal biopsies from adults with IBD showed increased signaling through two cell death pathways: necroptosis and apoptosis. However, these pathways did not conform to canonical models of cell death activation. Instead, necroptotic and apoptotic

Cell death is tightly controlled in the human gut and dysregulated in IBD. FICTURE-rendered image of xenium spatial transcriptomic data showing that distinct intestinal cell types differentially express cell death-related genes. These spatial patterns of cell death pathway expression are altered in patients with IBD in a manner that precedes and predicts impending gut damage.

signaling arose through noncanonical mechanisms linked to inflammation-induced transcriptional remodeling in discrete epithelial subpopulations. These epithelial states were largely absent from healthy intestinal tissue, indicating that inflammation creates cell populations newly susceptible to aberrant death signaling. Functional studies in patient-derived intestinal organoids supported this model and helped to define the epithelial mechanisms through which inflammatory cues promote cell death pathway activation. Unexpectedly, aberrant cell death signaling was detectable at the earliest stages of mucosal lesion formation. These signals appeared in nascent lesions even among patients with clinically mild disease and those receiving advanced therapies, suggesting that current treatments may suppress inflammation without fully eliminating epithelial death programs. Longitudinal follow-up further showed that patients with increased intestinal cell death signaling had higher rates of disease relapse over 2 to 3 years. Thus, epithelial death signaling is not only a molecular feature of active disease, it is also a marker of future clinical flares.

CONCLUSION: Epithelial cell death signaling emerges early in IBD lesions and persists despite advanced therapies and predicts disease relapse. □

Corresponding authors: Edwin Hawkins (hawkins.e@wehi.edu.au), Britt Christensen (britt.christensen@mh.org.au), Andre Samson (samson.a@wehi.edu.au), James Vince (vince@wehi.edu.au), James Murphy (jamesm@wehi.edu.au) †These authors contributed equally to this work. Cite this article as J. Pang et al., Science 393, eaeh7112 (2026). DOI: 10.1126/science.aeh7112

A necroptotic-to-apoptotic signaling axis underlies inflammatory bowel disease

Jiyi Pang $^{1,2,\dagger}$ , Aysha H. Al-Ani $^{1,2,3,4,\ddagger}$ , Komal M. Patel $^{1}$ , Yunzhuo Zhou $^{1}$ , Samuel N. Young $^{1}$ , Jinjin Chen $^{1,2}$ , Isabella Kong $^{5}$ , Marilou Barrios $^{1,2}$ , James A. Rickard $^{1,3}$ , Siqi Chen $^{1,2,6}$ , Xiuquan Ma $^{1,2}$ , Farzaneh Shojaee $^{1,2}$ , Seong-Beom Kim $^{7}$ , Siavash Foroughi $^{1,2}$ , Wayne Cawthorne $^{1,2}$ , Annette V. Jacobsen $^{1,2}$ , Asha Jois $^{1,2,8}$ , Ashley L. Weir $^{1,2}$ , Lachlan W. Whitehead $^{1,2}$ , Pradeep Rajasekhar $^{1,2}$ , Christopher R. Horne $^{1,2,9}$ , Ruqian Lyu $^{1,2}$ , Lucy J. Mather $^{1}$ , Raymond K. H. Yip $^{1}$ , Ellen Tsui $^{1}$ , Imadh Azeez $^{1,2}$ , Tao Tan $^{1,2}$ , Weiwei Liang $^{10,11}$ , Suresh Sivanesan $^{3,4}$ , Andrew Metz $^{3,4}$ , Ash Patwardhan $^{3,4}$ , Natalie Shea $^{3,4}$ , Guru Iyngkaran $^{3,4}$ , Daniel Schneider $^{3,4}$ , Alexander T. Elford $^{3,4}$ , William Beattie $^{3,4}$ , Finlay Macrae $^{3,4}$ , Gianmaria Liccardi $^{12,13,14}$ , Henning Walczak $^{12,15}$ , Yuxia Zhang $^{10,11}$ , Oliver M. Sieber $^{1,2}$ , Tim Spelman $^{1}$ , Lisa Giulino-Roth $^{5}$ , Michael Christie $^{1,3}$ , Yunshun Chen $^{1}$ , Kelly L. Rogers $^{1,2}$ , Rory Bowden $^{1,2}$ , Sandra E. Nicholson $^{1,2}$ , Kate E. Lawlor $^{1,16,17}$ , Edwin D. Hawkins $^{1,2,\ddagger}$ , Britt Christensen $^{1,2,3,4,\ddagger}$ , Andre L. Samson $^{1,2,\ddagger}$ , James E. Vince $^{1,2,\ddagger}$ , James M. Murphy $^{1,2,9,*\ddagger}$

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic condition caused by altered cytokine signaling, maladaptive immunity, dysbiosis, and intestinal barrier dysfunction. Although current therapies aim to correct these imbalances to induce remission, most patients ultimately relapse, suggesting that key pathogenic mechanisms persist. Here, we identified aberrant epithelial cell death signaling as an underlying feature of IBD that arises in patients in remission and on advanced therapy. Mechanistically, nascent inflammation skewed epithelial cells into an M1-macrophage–like transcriptional state that promoted RIPK1-independent necroptotic signaling. This signaling then triggered inducible nitric oxide synthase-assisted mitochondrial apoptosis of absorptive epithelial cells and PUMA-mediated intestinal stem cell death. Thus, aberrant epithelial cell death signaling represents a hallmark of IBD that occurs early in mucosal lesion development, persists despite current therapeutic strategies, and predicts clinical relapse.

Inflammatory bowel disease (IBD), encompassing Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC), is a chronic disorder of the gastrointestinal tract characterized by relapsing mucosal inflammation. By 2030, up to 1% of people in Western countries will be affected by IBD, with incidence rising in other industrialized nations (1). Because the causes of IBD are multifactorial (2), current therapies are not curative but instead dampen inflammation through long-term immunosuppression (3–5). Even when they are on advanced therapies such as tumor necrosis factor (TNF) inhibitors, most patients experience flares that necessitate an escalation in treatment, with only 13 to 34% of patients achieving deep remission, as evidenced by the absence of histological inflammation (6, 7). This clinical pattern suggests that pathological drivers of IBD persist even when inflammation has seemingly resolved.

Apoptotic cell death mediates the orderly removal or recycling of tissue matter and is essential for many physiological processes, including infection control and cancer prevention (8). Intrinsic apoptosis requires BAX-/BAK-dependent mitochondrial permeabilization, whereas extrinsic apoptosis relies on the initiator caspase, caspase-8 (8). Both types of apoptosis culminate in activation of effector caspases, caspase-3, -6, and -7, which cleave substrates to disassemble the cell (8). Necroptosis is another form of cell death typically activated when apoptosis is impaired (9–14). Necroptotic signaling causes Receptor interacting serine/threonine kinase (RIPK)-1, RIPK3, Z-nucleic acid binding protein 1 (ZBP1), and/or Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter molecule 1 (TRIF) to form an intracellular scaffold called the necrosome. The necrosome activates RIPK3 and Mixed lineage kinase domain-like (MLKL) to trigger necroptosis (15–20). Unlike apoptosis, where intracellular constituents are degraded to limit immunoreactivity, necroptosis involves overt plasma membrane lysis that promotes the proinflammatory release of cell contents (21).

Cytokines central to IBD pathogenesis, including TNF and interferons (IFNs), are also potent cell death triggers $(22–27)$ . Accordingly, increased cell death has long been linked to IBD, and cell death inhibitors are being explored as therapies for UC $(24, 25, 28–37)$ . Despite this, few studies have used definitive markers to detect apoptosis $(38–41)$ or necroptosis in IBD tissue $(30–32, 42–44)$ , and no studies have examined patients on advanced therapies or profiled multiple cell death modalities. To address these gaps, we defined the prevalence and mechanisms of apoptosis and necroptosis in adults with IBD within the context of advanced therapies.

Results

To clarify the relationship between cell death and mucosal lesions in IBD, biopsies of noninflamed, marginally inflamed, and inflamed intestinal tissue were collected from patients with CD or UC (Fig. 1A and table S1). In patients without endoscopic inflammation, biopsies were taken from sites historically classified as noninflamed, marginally inflamed, or inflamed during prior examinations. As a non-IBD comparator, intestinal biopsies were collected from adults undergoing colonoscopy for noninflammatory conditions or to exclude malignancy. More than 900 biopsies were collected from 80 patients, with even sampling of sites from the ileum to the rectum (Fig. 1B). Most patients had quiescent or mildly active disease by clinical, endoscopic, and histologic criteria (Fig. 1C and fig. S1, A to C). The cohort was representative of IBD populations in Australia (45) and other Western countries, except that a high proportion (62%) were receiving biologic or small-molecule therapies (Fig. 1D), hereafter referred to as “advanced therapies.” Accordingly, the molecular events studied here represented changes that arise during quiescent IBD and despite advanced therapy.

We integrated histology, immunoblotting, bulk and spatial transcriptomics, and epithelial organoid assays with demographic and clinical metadata (Fig. 1A and table S1). We verified that mucosal markers of IBD (46), including S100A8 and S100A9, were expressed in an inflammation-dependent manner in our samples (Fig. 1E) and that histopathology scores correlated with endoscopic inflammation (fig. S1C). We next performed gene set enrichment analysis to identify biological pathways that may be perturbed in IBD. Despite many patients being on advanced therapies, TNF- and IFN-related genes were dysregulated in our cohort of IBD samples (Fig. 1F and fig. S1D). Apoptosis-related genes were also dysregulated in IBD samples, whereas necroptosis and ferroptosis signatures were not (Fig. 1F and fig. S1D). The dysregulation of the apoptotic pathway was incongruent with the fact that polymorphisms in canonical apoptosis genes are not linked to adult-onset IBD (47). Indeed, although apoptosis is frequently observed in graft-versus-host disease (48), histopathological assessment failed to detect appreciable levels of apoptotic cells in IBD tissue (fig. S1E). We thus reasoned that if cell death is dysregulated in IBD, then it involves overlooked mechanisms.

Elevated cell death signaling is a feature of IBD

To ascertain whether cell death signaling is dysregulated in IBD, we analyzed the expression and activation of the apoptotic pathway using immunoblotting. Signals from tissue were quantified relative to well-defined signals from human HT29 cell culture (Fig. 2, A to C). The necroptotic pathway was also profiled because antinecroptotics are prospective IBD therapies (35–37). In total, 41 markers of cell death signaling were measured (average of n = 23 patients/marker; Fig. 2B and fig. S2). Increased necroptotic signaling [defined by phosphorylated RIPK3 (pRIPK3)] and apoptotic signaling (defined by cleaved caspase-3) were prevalent features of IBD (Fig. 2, A to C). Activation of both pathways correlated with intestinal inflammation in patients with UC and CD irrespective of treatment class (Fig. 2, A to C, and fig. S2).

Necroptotic signaling was elevated in noninflamed IBD biopsies collected far from mucosal inflammation (16 of 31 noninflamed IBD samples and 54 of 89 IBD samples had pRIPK3 levels above the non-IBD mean; e.g., NM058; Fig. 2A). This suggests that necroptotic activation is an early event in lesion development. Although conventional models of RIPK3 activation (49) involve RIPK1 coactivation and suppression of negative regulators (e.g. caspase-8, cFLIP $_{L}$ , HOIP, FADD, OTULIN, and IAPs), RIPK3 activation in IBD did not follow this pattern (Fig. 2, B and C, and fig. S2, A and B). Instead, RIPK3 activation was more closely followed by increased ZBP1 expression (Fig. 2C). Additionally, there was a subset of patients in whom increased RIPK3 activation culminated in MLKL activation (21 of 89 IBD samples had both pRIPK3 and pMLKL levels above the non-IBD mean; e.g., NM058; Fig. 2A). Another subset of patients demonstrated RIPK3 and RIPK1 coactivation (20 of 79 IBD samples had pRIPK1 and pRIPK3 levels above the non-IBD mean; e.g., NM058; Fig. 2A), indicating that patient stratification may be important for RIPK1 inhibitor trials (35–37). The disconnect among RIPK1, RIPK3, and MLKL activation may reflect immunoblot limitations, stochasticity in RIPK signaling, or noncanonical RIPK3 signaling.

The relationship between intestinal inflammation and apoptosis was distinct. Increased apoptotic signaling was observed in histologically inflamed IBD tissue (16 of 30 inflamed IBD samples and 38 of 93 IBD samples had cleaved caspase-3 levels above the non-IBD mean; e.g., NM028 and NM036; Fig. 2A), suggesting that apoptosis plays a more downstream role in lesion development. Mechanistically, cleavage of the initiator caspase, caspase-10, and decreased levels of cell death inhibitors (HOIP, cFLIP $_{L}$ , and XIAP) coincided with active caspase-3 (fig. S2, A to C). Increased levels of active full-length RIPK3 were often detected in IBD tissue that had no appreciable cleaved caspase-3 (30 of 93 samples), whereas cleaved forms of both pRIPK3 and caspase-3 were codetected in many inflamed IBD samples (20 of 30 samples; fig. S2D). These findings suggest that inflammation-associated necroptotic-to-apoptotic signaling occurred in the same cells, although in situ detection of apoptotic and necroptotic markers is required to formally address this possibility. Overall, 74 of 93 IBD samples had pRIPK3 and/or cleaved caspase-3 levels above the non-IBD mean, showing that elevated intestinal cell death signaling is prominent in IBD even when patients are on advanced therapies.

Inflammation-induced transcription rewires epithelial cell death signaling

Bulk RNA sequencing of biopsies was performed to explore how inflammation alters cell death signaling. From a predefined list of 164 genes covering the necroptotic and apoptotic pathways (table S1), only six were significantly up-regulated in an inflammation-dependent manner: NOS2, MLKL, PDK1, ZBP1, BCL2A1, and NFKB2 (Fig. 3A and fig. S3, A and B). BCL2L10 was the only significantly down-regulated gene (Fig. 3A and fig. S3, A and B), with caspase-6 being decreased in inflamed IBD tissue (figs. S2A and S3A). Meta-analysis of prior studies confirmed that intestinal expression of NOS2, MLKL, PDK1, ZBP1, BCL2A1, and NFKB2 were elevated in IBD (50). These data suggest that changing expression of a few genes can profoundly affect cell death signaling and/or that cell death is driven by posttranslational mechanisms.

We then performed unsupervised hierarchical clustering to identify coregulated gene modules. Of the modules identified, “cluster B” was notable because it contained several genes of interest, including NOS2, MLKL, and ZBP1 (Fig. 3B). To gain insight into their upstream regulation, we performed transcription factor enrichment analysis and digital cytometry on clusters A to E. These analyses suggested that cluster B was governed by transcription factors and genes linked to M1-macrophages (fig. S3, C and D), leading to the theory that increased cluster B expression was due to infiltration of M1-macrophages into IBD tissue. Contrary to this hypothesis, digital cytometry indicated that M1-macrophages were not enriched in our IBD samples (fig. S3, E and F, and table S1), presumably because most patients had well-controlled disease. We therefore queried whether increased cluster B expression in IBD tissue was due to a non-immune–resident cell type. Consistent with this logic, publicly available single-cell RNA-sequencing data suggested that cluster B genes were primarily up-regulated in absorptive intestinal epithelial cells in patients with UC (fig. S3G) (51). Immunohistochemistry further suggested that intraepithelial necroptotic signals [defined by caspase-8 clusters (44)] were present in noninflamed IBD tissue, whereas intraepithelial apoptotic signals (defined by cleaved caspase-3) were associated with histologically inflamed IBD tissue (fig. S3H). Cluster B gene expression was mirrored by markers of epithelial inflammation [defined by increased LCN2 and DUOX2 (52)] and was apparent in patients receiving different classes of therapy (fig. S3I). Collectively, these observations led us to hypothesize that unknown inflammatory cues increase cluster B gene expression in intestinal epithelial cells, driving necroptotic signaling in nascent IBD lesions and promoting apoptotic signaling in more advanced lesions. We further hypothesized that inflamed epithelia in IBD phenocopy the transcriptional response of M1-macrophages to inflammation (53–55).

An immune niche with nearby expansion of inflamed epithelia skews cell death

We used spatial transcriptomics to define mechanistically how epithelial cell death is altered in IBD. Fifty-one intestinal biopsies with high RNA integrity were chosen to encompass different degrees of inflammation, intestinal sites, IBD subtypes, and treatment classes (fig. S4A and table S1). The expression of 160 cell death-related genes, 90 genes from IBD susceptibility loci, and 230 cell-type markers were mapped (table S1). Approximately 1.7 million cells, including the major epithelial and immune cell types of the human gut, were detected across all biopsies (Fig. 3C). As expected, the cellular composition of noninflamed IBD and non-IBD biopsies were similar (fig. S4, C and D). Even in inflamed IBD samples, plasma cells were the only significantly expanded population (fig. S4, C and D). These similarities between non-IBD and IBD samples confirmed that most patients in our cohort had well-controlled disease. Despite this, a graded and inflammation-dependent increase in

Fig. 1. Prospective study to define the role of cell death in IBD. (A) Study design. (B) Anatomical origin of the biopsies used in this study. (C) Disease activity of the cohort at recruitment. Each dot represents one patient with IBD. Clinical activity measured by the Harvey-Bradshaw Index (for CD) or the Simple Clinical Colitis Activity Index (for UC).

Endoscopic activity measured by the Simple Endoscopic Score (for CD) or the Mayo subscore (for UC). Histopathologic activity measured by the Robarts Histopathology Index (RHI; for all cases). (D) Demographic or clinical features of cohort at recruitment: Primary sclerosing cholangitis (PSC), thiopurines or methotrexate (IMM), mesalamine (5-ASA), exclusive enteral nutrition (EEN), no therapy (None), infliximab or adalimumab (anti-TNF; $\alpha$ -TNF), ustekinumab (anti-IL12/23), vedolizumab (anti- $\alpha_{4}\beta_{7}$ ), tofacitinib (JAKi), and corticosteroid (Steroids) (table S1). (E) Heatmap showing the mean expression of selected genes in intestinal biopsies from patients with IBD (n = 26 noninflamed, n = 24 margin, and n = 25 inflamed biopsies) relative to non-IBD patients (n = 23). The genes selected were S100A8 and S100A9 (encoding for Calprotectin) and the top 50 and bottom 50 inflammation-associated mucosal markers from patients with IBD (46). (F) Gene set enrichment analysis of bulk RNA-sequencing data from the same biopsies as in (E). Normalized enrichment score (NES) and the nominal P value are shown.

cluster B expression was observed (Fig. 3D and fig. S5A). The transcriptional up-regulation of cluster B was largely confined to a subpopulation of differentiated absorptive epithelia herein referred to as colonocyte #2 cells (Fig. 3D and fig. S5A). Consistent with findings presented earlier (Figs. 2 and 3A), up-regulation of cluster B in colonocyte #2 cells was detected in noninflamed IBD tissue and thus represents an early step in lesion development (Fig. 3D and fig. S5A). Trajectory inference analysis confirmed that cluster B expression increased during the end stages of colonocyte differentiation in patients with IBD (fig. S5, B and C). No major changes in XIAP, FADD, or RIPK1 expression were noted between the IBD and non-IBD samples (fig. S5A). The up-regulation of cluster B genes in colonocyte #2 cells was accompanied by expansion of the cluster $\mathrm{B^{+}}$ colonocyte #2 subpopulation (Fig. 3, E to G). Cluster $\mathrm{B^{+}}$ colonocyte #2 cells were rare in the non-IBD gut, with this subpopulation rising to $\sim 30\%$ of epithelial cells in highly inflamed IBD tissue (Fig. 3, F and G). By contrast, cluster $\mathrm{B^{+}}$ stem cells remained rare in IBD tissue, dominated by NOS2 expression, and were transcriptionally less reactive to inflammation (fig. S5, D to F). Thus, colonocyte #2 cells mount a qualitatively and quantitatively distinct response to inflammation.

To investigate the impact of nascent inflammation on the crypt top, we performed differential expression analysis between cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells and their cluster B $^{-}$ counterparts in noninflamed IBD samples (Fig. 3, H to K). Many IBD susceptibility genes, including ICAM1, SOCS1, TNFAIP3, ESRRA, and ITPKA, were differentially expressed by cluster B $^{+}$ colonocytes. Moreover, many positive regulators of inflammation and immunity, including TNF, NFKB2, RELB, CXCL1, and CCL23, were increased in cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells. This divergence between cluster B $^{+}$ and cluster B $^{-}$ colonocyte #2 cells was evident at the subpopulation level (Fig. 3H) and spatially between adjacent epithelial regions (see landmarks 1 to 4 in Fig. 3I). These observations suggest that inflamed colonocyte #2 cells modulate IBD risk and mucosal immunity. To advance this hypothesis, we compared the gene expression and cellular composition of the lamina propria underneath cluster B $^{+}$ or cluster B $^{-}$ colonocyte #2 cells (Fig. 3, J and K, and fig. S5, H to J). Positive regulators of mucosal immunity, including TNF, IFNG, OSM, CCL3, S1PR5, ITGAX, and CD137, were up-regulated in the lamina propria underlying cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells (Fig. 3J). These proinflammatory changes coincided with enrichment of IFNG-expressing CD4 $^{+}$ T cells in the lamina propria proximal to cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells (Fig. 3K and figs. S5, A and G to J). The exclusion of plasmablasts from the niche underlying cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells (fig. S5J) may relate to the skewing of plasmablast responses in IBD (56). Altogether, an inflammatory niche arises in IBD characterized by: (i) a concentration of CD4 $^{+}$ T cells in the lamina propria near the crypt top, (ii) increased expression of inflammatory triggers such as IFNG and TNF, (iii) increased cluster B gene expression in crypt top colonocytes, and (iv) expansion of these inflamed cluster B $^{+}$ colonocytes. We propose that this niche is an early and disease-modifying event that promotes intestinal cell death signaling in IBD.

IFN $\gamma$ and TNF cooperatively kill intestinal epithelial organoids

Cell death-, TNF-, and IFN $\gamma$ -related pathways are dysregulated in IBD (Figs. 1 to 3). We therefore studied whether inflammatory cytokines trigger epithelial death. Intestinal stem cell organoids derived from IBD and non-IBD tissue were maintained in IntestiCult Organoid Growth Medium (OGM) and differentiated into colonocyte organoids using IntestiCult Organoid Differentiation Medium supplemented with the Wnt inhibitor IWP2 (Fig. 4A). Organoid identity was confirmed by morphology, quantitative polymerase chain reaction (PCR), immunohistochemistry, and bulk RNA sequencing (Fig. 4, A and B, and fig. S6, A to C). Next, we quantified organoid death after treatment with IBD-associated cytokines or microbial Toll-like receptor (TLR) ligands (fig. S6D). TNF did not cause substantial colonocyte death, IFNγ induced \~40% colonocyte death, and TNF and IFNγ cotreatment killed up to 80% of colonocytes (Fig. 4, C and D, and fig. S6, E and F). Stem cell organoids exhibited similar, albeit less pronounced, death responses to these stimuli (Fig. 4, C and D, and fig. S6E). Comparable responses were observed in organoids derived from IBD and non-IBD tissue (Fig. 4C and fig. S6E). Type I or III interferons, alone or with TNF, failed to induce epithelial death within 24 hours despite all triggering canonical transcriptional responses (fig. S6, G and H). Combining IFNγ with TRAIL, FasL, or TLR ligands also did not enhance cytotoxicity (fig. S6, I and J). Notably, of the tested stimuli, only IFNγ induced robust NOS2 expression, suggesting that it is a key inducer of cluster B in colonocytes (fig. S6H). These data show that the combination of IFNγ and TNF is a strong driver of intestinal epithelial death (movie S1).

IFNγ transcriptionally alters intestinal epithelial cells to promote cell death signaling

Bulk RNA sequencing showed that the transcriptome of IFNγ- and TNF-treated organoids resembled that of the IBD intestine (fig. S7, A and B). Similar to IBD biopsies (fig. S3D), digital cytometry showed that IFNγ- and TNF-treated epithelial organoids transcriptionally mimicked an M1-macrophage signature [fig. S6K; using LM22 matrix designed for immune cells (57)]. IFNγ- and TNF-treated organoids also up-regulated cluster B genes (CASP8, CASP10, ZBP1, MLKL, and NOS2; Fig. 4E) akin to the transcriptional changes in our IBD cohort (Fig. 3A) and a larger IBD cohort (Fig. 4E). Other key regulators of apoptosis and necroptosis were up-regulated in IFNγ- and TNF-treated organoids (Fig. 4F and fig. S7C). Immunoblotting of intestinal organoids confirmed that IFNγ increased caspase-8, caspase-10, ZBP1, and MLKL levels, and IFNγ and TNF cotreatment caused extrinsic (caspase-8/-10), intrinsic (caspase-9), and effector (caspase-3) caspase processing together with RIPK3 and MLKL activation and cleavage (Fig. 4G). These inflammation-induced apoptotic and necroptotic signals were more prevalent in colonocytes compared with stem cells (Fig. 4G), consistent with their heightened sensitivity to cytokine-induced death (Fig. 4C). Because gasdermins control mucosal repair (24, 58) and because many pyroptotic genes were up-regulated in IBD tissue (fig. S7D), we also measured pyroptotic signaling in inflamed organoids. Although no proteolytic activation of GSDMC was observed, IFNγ and TNF treatment of colonocytes caused apoptotic caspase-3-driven GSDMD inactivation and GSDME activation (defined by GSDMD p43 and GSDME p30; fig. S7E). Thus, treating intestinal organoids with IFNγ and TNF recapitulated the transcriptional and posttranslational cell death-signaling features of inflamed IBD patient biopsies and colonocyte #2 cells.

C

Fig. 2. Necroptotic and apoptotic signaling is increased in IBD. (A) Immunoblot of lysates from HT29 cells (gray text; left) and intestinal biopsies from patients (black text; right). Apoptotic signaling induced by TNF and Smac mimetic (TS). Necroptotic signaling induced by TS and IDN-6556 (TSI). The fifth lane of each gel contained lysates from

TSI-treated $RIPK3^{-/-}$ or TSI-treated $MLKL^{-/-}$ cells (see source data for details). The study number (NM), IBD subtype (UC/CD), and treatment for each patient is stipulated. The histopathological score (RHI) of each biopsy site is shown: Thiopurines or methotrexate (IMM), mesalamine (5-ASA), no therapy (Tx free), or infliximab or adalimumab (anti-TNF; $\alpha$ -TNF). (B) Heatmap showing the expression levels of the indicated proteins or posttranslation modifications in biopsies from patients with IBD relative to non-IBD patients. Data are shown as median values (from an average of n = 23 biopsies/target/endoscopic grade). *P < 0.05 by one-way ANOVA with Geisser-Greenhouse correction. (C) Graphs show relative expression levels of the indicated proteins or posttranslational modifications in HT29 cells and biopsies. Each dot represents one biopsy. Bars indicate mean values. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by one-way ANOVA with Geisser-Greenhouse correction.

IFN $\gamma$ and TNF cause intestinal organoid mitochondrial apoptosis

To define the mechanism of inflammation-induced epithelial death, we used inhibitors of necroptosis (Nec1s, GSK872, and TC13172), pyroptosis (MCC950 and VX765), ferroptosis (liproxstatin-1 and ferrostatin-1), death ligands (FASL and TRAIL neutralizing antibodies), and apoptotic caspases (Q-VD-OPh and IDN-6556) (Fig. 4, H and I, and fig. S7, F to N). Despite their ability to limit cell death in control assays (fig. S7, F, G, and J to N), none of these inhibitors prevented IFNγ- and TNF-induced organoid killing (Fig. 4, H and I, and fig. S7, H and I). Even pan-caspase inhibition with Q-VD-OPh only delayed death of IFNγ- and TNF-treated organoids without additional protection conferred by coinhibiting necroptosis or pyroptosis (Fig. 4I and fig. S7I). However, as expected, more potent inhibition of the caspase-8/cFLIP heterodimer with IDN-6556 (59) invoked IFNγ- and TNF-induced necroptotic organoid death (fig. S7I). Because no single inhibitor could substantially protect intestinal organoids from IFNγ- and TNF-induced death, we considered whether organoids were dying by mitochondrial apoptosis, in which BAX/BAK-mediated mitochondrial membrane permeabilization is sufficient to cause cell death (60–62). This hypothesis stemmed from experiments in which BH3-mimetics, which promote BAX/BAK activation (63, 64), triggered organoid death in the presence of QVD-OPh (control experiments confirmed that QVD-OPh blocked caspase activity; fig. S7, J and M). Accordingly, we engineered organoids to overexpress BCL-2 (Fig. 5, A to C, and fig. S8, A and B), an inhibitor of BAX/BAK-driven mitochondrial apoptosis (65), and confirmed that this prevented BH3-mimetic-induced organoid death (Fig. 5, A to C). BCL-2 overexpression also prevented IFNγ- and TNF-induced death and caspase processing, and, as anticipated, this was reversed by the BCL-2 antagonist ABT199 (Fig. 5, A to C, and fig. S8B) (66). Moreover, IFNγ and TNF treatment induced BAX/BAK oligomerization (Fig. 5D), whereas BAX deletion reduced IFNγ and TNF-induced organoid death (fig. S8, C and D, and Fig. 5E). Thus, mitochondrial apoptosis represents the main mechanism of IFNγ- and TNF-induced intestinal stem cell and colonocyte death.

Necroptotic signaling does not cause IFNγ- and TNF-induced organoid death

We next examined apoptotic, necroptotic, and pyroptotic cross-talk. Blocking necroptosis neither reduced caspase-3 activation nor altered caspase-mediated cleavage of RIPK3 in IFN $\gamma$ - and TNF-treated colonocytes (fig. S9A). Blocking mitochondrial apoptosis did not prevent RIPK3 and MLKL phosphorylation but did reduce RIPK3 cleavage and abolish gasdermin E cleavage in inflamed organoids (Fig. 5F and fig. S9B). Thus, despite having a shared transcriptional response to inflammation, necroptotic and apoptotic signaling can operate independently, whereas gasdermin E-mediated signaling was elicited downstream of apoptosis in inflamed colonocytes.

Neither RIPK1 inhibition nor deletion of ZBP1 prevented RIPK3 activation in inflamed colonocytes (fig. S9, A to D). Deletion of ZBP1 in organoids also did not alter IFNγ- and TNF-triggered death or caspase-3 cleavage (fig. S9, C and D), whereas RIPK1-independent RIPK3 activation still occurred in inflamed BCL-2-overexpressing colonocytes (fig. S10, A and B). To examine nonlethal necroptotic signaling in inflamed colonocytes, we performed bulk RNA sequencing on IFNγ- and TNF-treated BCL2-overexpressing organoids in the presence or absence of RIPK3 or MLKL inhibition (Fig. 5G and fig. S10A). This approach showed that RIPK3 and MLKL signaling in IFNγ- and

TNF-treated colonocytes up-regulated a small number of genes, including NUPR1 (Fig. 5H). NUPR1 is a stress-inducible transcriptional regulator that is increased in inflamed colonocytes (fig. S10C) and also in IBD tissue (fig. S10D). The importance of NUPR1 induction by RIPK3 and MLKL signaling is unknown. Thus, IFNγ and TNF treatment promotes nonlethal necroptotic signaling and lethal apoptotic signaling in colonocytes.

PUMA drives intestinal stem cell apoptosis

To investigate the mechanisms of mitochondrial apoptosis in organoids, we profiled transcript levels of the BCL-2 family, which are master regulators of mitochondrial apoptosis (Fig. 6, A and B, and fig. S11A). Relative to stem cells, colonocytes expressed higher levels of pro-apoptotic BCL-2 family members under basal conditions, with IFNγ and TNF treatment accentuating this prodeath state (Fig. 6B and fig. S11A). Analysis of publicly available single-cell RNA-sequencing data confirmed that colonocytes adopted a pro-apoptotic state more than undifferentiated epithelial cells in patients with IBD (fig. S11B) (51). These expression changes across the BCL-2 family were consistent with the capacity of IFNγ and TNF to kill organoids, and with the heightened vulnerability of colonocytes to this insult (Fig. 4C).

To identify proteins critical for restraining epithelial apoptosis, we treated organoids with inhibitors of BCL-2, BCL-XL and MCL-1, factors that negate BAX and BAK activation. This analysis showed that BCL-XL, but not BCL-2, was essential for preventing stem cell and colonocyte death, with colonocytes also relying on MCL-1 for survival (Fig. 6C). Notably, the pro-apoptotic protein PUMA, which antagonizes BCL-XL and MCL-1, was up-regulated in inflamed organoids, particularly in stem cells (Fig. 6, B and D). We therefore speculated that PUMA was important for IFNγ- and TNF-induced intestinal cell death. To address this hypothesis, we deleted the PUMA-encoding gene BBC3 from organoids. BBC3 deletion protected stem cells, but not colonocytes, from IFNγ- and TNF-induced caspase-3 processing and death (Fig. 6, E to J). This illustrates that inflammation damages intestinal stem cells by increasing PUMA expression. Supporting this concept, and consistent with prior studies (67), a subset of IBD patients (four of 11 patients tested) displayed elevated PUMA levels upstream of caspase-3 cleavage (Fig. 6K and fig. S11C), consistent with PUMA itself being a caspase substrate (68) and implicating PUMA as an initiator of apoptosis in these cases.

Inducible nitric oxide synthase is up-regulated in IBD and high levels promote colonocyte death

The mechanism of inflammation-induced colonocyte apoptosis is unknown. We hypothesized that inducible nitric oxide synthase (iNOS) was responsible because it can license mitochondrial apoptosis in macrophages $(53)$ and because the iNOS-encoding gene NOS2 was up-regulated in IBD tissue, in inflamed colonocyte #2 cells, and in inflamed colonocyte organoids (Figs. 3, A and H to I, and 7, A and B). Immunohistochemistry confirmed that iNOS levels were increased in IBD tissue, particularly within inflamed epithelia (Fig. 7, C to F, and fig. S12, A to C). Similarly, IFNγ and TNF treatment induced iNOS and nitrite, a marker of nitric oxide production, in colonocytes and, to a lesser extent, in stem cells (Fig. 7, G and H). To test our hypothesis formally, we deleted NOS2 from organoids. Deletion of NOS2 in colonocyte organoids reduced IFNγ- and TNF-induced nitrite production, apoptotic caspase activation, and cell death (Fig. 7, I to L,

A
B

C

D

F

G

H

J

Fig. 3. Cell death signaling in IBD coincides with inflamed colonocyte expansion next to an immune niche. (A) Bulk RNA-sequencing data. Plot shows mean expression of necroptotic and apoptotic genes in IBD biopsies ( $n = 26$ noninflamed, $n = 24$ margin, and $n = 25$ inflamed) relative to non-IBD tissues ( $n = 23$ ). Log $_{2}$ -fold change $>1$ or $<-1$ and $P < 0.05$ by multiple testing Benjamini–Hochberg are asterisked. Dendrogram of unsupervised hierarchical clustering ordered by expression similarities. (B) Main transcription

factor families predicted to regulate clusters A-E (fig. S3C). (C) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) of all cells in spatial transcriptomic (ST) data (fig. S4A). N = 1,732,121 cells (downsampled to $1.5 \times 10^{5}$ cells; each dot represents one cell). IBD biopsies are grouped by absence (IBD noninflamed; IBD RHI 0) or presence (IBD inflamed; IBD RHI 1+) of inflammation (fig. S4B). (D) ST expression values (counts) of pseudobulked cell types. UMAPs show differential expression of the cluster B gene set between biopsy groups. Log $_{2}$ -fold changes >0.5 and **P < 0.01 or ****P < 0.0001 by edgeR's quasi-likelihood F test are shown. (E) UMAP of epithelial cells. N = 675,867 cells (downsampled to $1.5 \times 10^{5}$ cells; each dot represents one cell). (F) Proportion of cluster B $^{+/-}$ epithelial subtypes. ****P < 0.001 by 2-way ANOVA Benjamini-Krieger-Yekutieli. (G) Number of cluster B $^{+}$ colonocyte #2 cells/biopsy. Each dot represents one biopsy. Bar is group mean. **P < 0.01 and ****P < 0.0001 by 1-way ANOVA Kruskal-Wallis. (H) Differential gene expression between cluster B $^{+}$ (N = 6126 cells) and cluster B $^{-}$ colonocyte #2 cells (N = 101,823 cells) in the IBD noninflamed group. Each dot represents one gene. False discovery rate (FDR) was by edgeR's Benjamini–Hochberg. (I) Density maps of ST data from an IBD noninflamed sample. Top three rows show relative expression of select genes. Bottom left micrograph shows 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained nuclei with line-of-interest (LOI) and landmarks (1, 2, 3, and 4). Bottom right plots show relative expression of select genes along the LOI. Scale bar, 1 mm. (J) Cells within 35 $\mu$ m of cluster B $^{+/-}$ colonocyte #2 subsets were pseudobulked (fig. S4H). Plot shows differential expression between cluster B $^{+}$ and cluster B $^{-}$ neighborhoods. Each dot represents one gene. (K) FICTURE (130) depiction.

and fig. S12D). Targeting NOS2 also limited iNOS and nitrite levels in stem cell organoids but did not alter IFNγ- and TNF-induced killing (Fig. 7, M to P), likely because inflamed stem cells produce less iNOS and nitric oxide (Fig. 7, G and H). These data suggest that IFNγ and TNF increase iNOS to levels that can promote mitochondrial apoptosis of colonocytes.

Epithelial cell death signaling predicts relapse

Inflammation rewires the intestinal epithelia to promote necroptotic and apoptotic signaling (Fig. 8A). Being an early and graded event in mucosal lesions, we reasoned that increased intestinal cell death signaling may predict disease progression. To address this hypothesis, we followed our cohort of patients with IBD for 24 to 36 months after recruitment. Of the 52 patients enrolled, 22 were lost to follow-up, 14 patients had stable disease with unaltered therapy (nonrelapse), and 16 patients experienced at least one inflammatory flare requiring corticosteroids, an escalation or switch in therapy (relapse; Fig. 8B). Consistent with disease activity being well controlled across the cohort, most patients at recruitment had normal serum albumin and C-reactive protein (CRP) levels (Fig. 8, C and D). No differences in CRP levels were detected at baseline between the nonrelapse and relapse groups (Fig. 8D), whereas patients who later relapsed had slightly but significantly lower serum albumin levels (Fig. 8C). Increased signs of histological inflammation were detected in biopsies from patients who subsequently relapsed (Fig. 8E), indicating the presence of low-grade mucosal inflammation not captured by routine clinical biomarkers. Consistent with this notion, levels of the necroptotic marker pRIPK3 were higher in patients who later relapsed relative to non-IBD controls (Fig. 8F). A nonsignificant increase in the apoptotic marker cleaved caspase-3 was also observed in patients with IBD who subsequently relapsed (Fig. 8G). Thus, subtle increases in inflammation, typically at or below the detection limit of clinical assays, are inextricably coupled to unconventional mechanisms of colonocyte death and are of prognostic value.

Discussion

Dysregulated cell death has long been implicated in IBD, most definitively through rare early-onset cases caused by inborn errors in the cell death regulators XIAP, RIPK1, and CASP8 (69-72). Whether these monogenic mechanisms extend to adult-onset IBD was unclear. Here, we found that necroptotic and apoptotic signaling in adults with IBD does not rely upon loss of XIAP, RIPK1, CASP8, or other forms of cell death disinhibition. Instead, nascent inflammation induced the expression of select genes, including ZBP1 and MLKL, and promoted the activation of RIPK3. Notably, because RIPK3 activation preceded caspase activation during mucosal lesion development, necroptotic signaling may represent a frontline response to intestinal inflammation rather than a secondary response to impaired apoptosis. As an in vitro precedent, it is known that apoptosis can be funneled toward a necroptotic outcome simply by changing the expression of a few pathway components (73, 74). We also found that inflammation induces the expression of PUMA and iNOS to promote mitochondrial apoptosis of stem cells and colonocytes. Although apoptosis is generally considered an immunologically silent process, our data indicate that it has the potential to cause pyroptotic gasdermin E activation. Whether gasdermin E activation amplifies inflammation in IBD remains unknown. Our findings likely explain why coadministration of IFNγ and TNF causes intestinal crypt death in mice (54), and attribute function to the expansion of $NOS2^{+}$ intestinal epithelial cells in patients with IBD (52). Together, these results highlight inflammation as a potent inducer of epithelial plasticity and cell death signaling in IBD.

Chronic intestinal inflammation increases the risk of colorectal cancer (75, 76). Whether the cell death signals observed in IBD tissue influence the risk of inflammation-associated colorectal cancer remains unknown. Polymorphisms in the cell death-related genes BBC3, RIPK3, ZBP1, and MLKL are not enriched in colitis-associated neoplastic samples (75, 76). Moreover, deletion of Ripk3 or Mlkl does not alter the progression of inflammation-associated colorectal cancer in mice (77), suggesting that these effectors do not modulate inflammation-driven malignancy. By comparison, mutations in NOS2 are enriched in patients with colitis-associated neoplasia, suggesting that iNOS may sensitize inflamed epithelia to apoptosis to guard against malignancy (75, 76). Given its antineoplastic potential, the precise mechanism by which iNOS promotes colonocyte apoptosis and its role in other epithelial models such as air-liquid interface intestinal organoids warrant further investigation.

Durable remission in patients with IBD will likely only be achieved when underlying disease drivers are corrected $(78)$ . Noncanonical epithelial cell death signaling is an early, graded feature of mucosal lesions that arises in histologically normal IBD tissue and predicts relapse. The discovery of a histologically inconspicuous niche in the lamina propria that skews epithelial function may also have prognostic value. Because dysregulated cell death signaling persists across various treatment regimens and during remission, we propose that it is refractory or inefficiently targeted by current therapies. Ultimately, imbalanced epithelial cell death signaling is an early warning sign in IBD. Correcting this necroptotic-to-apoptotic signaling axis may help to achieve “molecular healing” of IBD.

Materials and methods Antibodies

All primary antibodies used in this study are listed in table S1. For Fig. 2 and fig. S2, the primary antibodies for immunoblotting were: pMLKL (Ab187091, Abcam), MLKL (3H1, in-house $(18)$ ; available from Sigma-Aldrich as MABC604), RIPK1 (BD 38/RIP, BD Biosciences), ZBP1 (5H15L56, Invitrogen), CYLD (D6O5O, Cell Signaling Technology), cFLIP (D5J1E, Cell Signaling Technology), TRADD (7G8, Cell Signaling Technology), caspase-8 (D35G2, Cell Signaling Technology), pRIPK3 (D6W2T, Cell Signaling Technology), RIPK3 (1H2, in-house $(79)$ ; available from Merck as MABC1640), GAPDH (MAB374, Millipore), pRIPK1 (D813A, Cell Signaling Technology), HOIP (E6M5B, Cell Signaling Technology), Sharpin (D4P5B, Cell Signaling Technology), RIPK3 (E1Z1D, Cell Signaling

1
A

B

C

D

E Log $_{2}$ fold change to non-IBD

F
G

H

Fig. 4. IFN $\gamma$ synergizes with TNF to trigger intestinal organoid death. (A) Intestinal organoid differentiation procedure with representative micrographs. Scale bars, 100 $\mu$ m. (B) Expression of stem (LGR5), goblet (MUC2), and colonocyte (ALPI, FABP1) cell markers by quantitative PCR (qPCR) (n = 4 donors). Two-way ANOVA with a Sidak's multiple

comparisons test. (C and D) Organoids from non-IBD tissue were treated with IFNγ and/or TNF. (C) Percentage death was measured using lncuCyte imaging (fig. S4D) from n = 5 donors. Data are the mean ± SEM of five experiments. Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test (versus untreated; final three time points) was used. (D) Representative micrographs from (C) after 21 hours. Scale bars, 550 μm. (E) Heatmaps of selected genes from intestinal biopsies from patients with UC or CD, relative to non-IBD patients from (50) (top) or organoids treated with IFNγ/TNF for 3.5 hours (bottom). (F) Differential gene expression analyses of individual replicates of organoids in (E). All entries with an adjusted P < 0.05; empirical Bayes moderated t statistic and Benjamini-Hochberg multiple test correction. (G) Immunoblots of organoids treated with IFNγ and/or TNF (one of three experiments). (H) Intestinal organoids were pretreated (0.5 hours) with vehicle [dimethylsulfoxide (DMSO), −], inhibitors of RIPK3 (GSK872, abbreviated as G872), RIPK1 (Nec1s), MLKL (TC13172, abbreviated as TC172), Caspase-1 (VX-765), NLRP3 (MCC950, abbreviated as MCC), ferrostatin-1 (Fer-1), liproxstatin-1 (Lipr-1), or pan-caspase Q-VD-OPh (QVD) inhibitors, followed by IFNγ/TNF (n = 7 experiments using five donor organoids, mean ± SEM). Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test (versus IFNγ/TNF/DMSO) was used. (I) Intestinal organoids were pretreated for 0.5 hours with the indicated cell death inhibitors followed by IFNγ/TNF treatment (n = 3 experiments using five donor organoids, mean ± SEM). Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test (versus IFNγ/TNF/Q-VD-OPh group). For all analyses, P > 0.05 (ns), *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.

Technology), ABIN-1 (4664S, Cell Signaling Technology), cIAP1 (D5G9, Cell Signaling Technology), cIAP2 (15C8, in-house), caspase-8 (B.925.8, Invitrogen), RIPK1 (D94C12, Cell Signaling Technology), caspase-3 (9662S, Cell Signaling Technology), caspase-10 (M059-3, MBL), FADD (2782S, Cell Signaling Technology), ADAR1 (E6X9R, Cell Signaling Technology), TAK1 (D94D7, Cell Signaling Technology), OTULIN (EPR1984I, Abcam), MLKL (Rat, 7G2, in-house (19); available from Merck as MABC1636), A20 (D13H3, Cell Signaling Technology), caspase-10 (EPR10890, Abcam), XIAP (EPR22189, Abcam), iNOS (MAB950, R&D Systems), PUMA (98672, Cell Signaling Technology), caspase-6 (9762, Cell Signaling Technology). For Figs. 4 to 7 and figs. S6 to S12, the primary antibodies for immunoblotting were: caspase-3 (9662, Cell Signaling Technology), caspase-8 (9746, Cell Signaling Technology), caspase-9 (9508, Cell Signaling Technology), caspase-10 (M059-3, MBL), pMLKL (Ab187091, Abcam), MLKL (3H1, in-house (18); available from Sigma-Aldrich as MABC604), ZBP1 (5H15L56, Invitrogen), pRIPK3 (D6W2T, Cell Signaling Technology), RIPK3 (1H2, in-house (79); available from Merck as MABC1640), BCL-XL (2764, Cell Signaling Technology), MCL-1 (5453, Cell Signaling Technology), PUMA (98672, Cell Signaling Technology), β-actin (A-1798, Sigma), GAPDH (MAB374, Millipore), iNOS (MAB9502, R&D), BCL2 (clone Bcl-2-100, WEHI), BAK (4B5, WEHI (80)), GSDME (84005S, Cell Signaling Technology), GSDMD (69469, Cell Signaling Technology), GSDMC (HPA026317, Sigma), BAX (49F9, in-house from Prof. David Huang, WEHI).

The secondary antibodies (1:10,000 working concentration) for immunoblot were horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rat immunoglobulin (Ig) (3010-05, Southern BioTech), HRP-conjugated goat anti-rabbit Ig (4010-05, Southern BioTech), and HRP-conjugated goat anti-mouse Ig (1010-05, Southern BioTech Cat).

The primary antibodies for immunohistochemistry were caspase-8 (MA5-15226, clone B.925.8; RRID:AB_10978471; 0.619 g/L Thermo Fisher Scientific), cleaved-caspase-3 (9661, Cell Signaling Technology) and iNOS (MAB9502, R&D, 1:200), LGR5 (TA503316, OTI2A2, Thermo Fisher Scientific, 1:300) and Intestinal Alkaline Phosphatase Polyclonal Antibody (PA5-22210, Thermo Fisher Scientific, 1:200).

Research ethics

Ethical approval for intestinal tissue collection from participants undergoing endoscopy procedures through the Gastroenterology Department at the Royal Melbourne Hospital (RMH) was attained from the Human Research Ethics Committee (HREC): HREC 2021.074. This was in accordance with the National Health and Medical Research Council (NHMRC) National Statement on Ethical Conduct in Human Research (2007) and the Note for Guidance on Good Clinical Practice (CPMP/ICH-135/95). Site-specific governance was sought for the participating site, WEHI. Collaboration amongst the involved institutions: RMH, WEHI, and the University of Melbourne was officiated through the Melbourne Academic Centre for Health Research Collaboration Agreement (Non-Commercial). The human research in this study was performed in accordance with the principles expressed in the World Medical Association Declaration of Helsinki and conforms to the principles set out in the United States Department of Health and Human

Services Belmont Report. The human materials used in this study were obtained with signed informed consent from all subjects.

Intestinal biopsy collection

Adults with or without IBD scheduled for endoscopic evaluation of the lower gastrointestinal tract (flexible sigmoidoscopy or colonoscopy) by the Gastroenterology Department at RMH were screened for eligibility. Patients were ineligible for recruitment if they had: active infection, active malignancy, simultaneously or currently received anti-neoplastic therapy, nonsteroidal anti-inflammatory drug use in the past month, hereditary or familial polyposis syndromes, non-IBD forms of colitis (e.g. microscopic colitis, ischemic colitis, diversion colitis, or diverticulitis). Eligible patients were recruited and consented with a signed form. In total, 80 patients were recruited from 30 August 2021 to 21 April 2023 (table S1). One recruited patient was excluded from this study due to a finding of probable colorectal cancer during endoscopy. For patients with IBD, intestinal biopsies were retrieved endoscopically from relatively noninflamed, marginally inflamed, and inflamed areas of intestine. On six occasions, biopsies were also collected from a strictured region of the intestine (table S1). Where there were no signs of endoscopic inflammation, biopsy collection was instead tailored to the individual's prior sites of disease activity (e.g. if a patient with ileal CD was found to have a SES-CD of 0, then the ileum was deemed to be the historically "inflamed" region with distal parts of the bowel deemed to be the "margin" and "noninflamed" sites). Patients without IBD (non-IBD controls) had biopsies retrieved endoscopically from only noninflamed segments of the intestine, with comparable segments sampled in each patient. Boston Scientific Radial Jaw biopsy forceps and Olympus EVIS EXERA III endoscopes were used for biopsy collection. Upon retrieval, matched biopsies were immediately placed into the following ice-cold media: 1) $10\%$ v/v neutral buffered formalin, 2) dPBS (Thermo Fisher Scientific catalog no.14190144) supplemented with protease inhibitors (ThermoFisher Scientific catalog no. A32955) and phosphatase inhibitors (ThermoFisher Scientific; catalog no.A32957), 3) RNAlater (ThermoFisher Scientific; catalog no.AM7021), and 4) DMEM/F-12 with $15~\mathrm{mM}$ HEPES (DMEM/F-12, STEMCELL Technologies, 36254) and $1\%$ w/v Bovine Serum Albumin (BSA, Sigma-Aldrich, A4612). Two biopsies were collected per site/patient/media.

Sixteen independent intestinal organoid lines were used in this study. Five organoid lines were prepared from the healthy margin of resected intestinal tissue from n = 5 colorectal cancer patients. Seven organoid lines were prepared from the intestinal biopsies of n = 7 non-IBD patients in Fig. 1. Four organoid lines were prepared from the intestinal biopsies of n = 4 patients with IBD in Fig. 1. All patients provided written informed consent, and the study was approved by the Human Research Ethics Committee at all sites (HREC 2016.249, HREC 2021.074).

Clinical scoring of disease activity

Patients were interviewed on the day of endoscopy for contemporaneous clinical symptomology. Patients with CD were scored using the

A

B

C

D

F

G

H

Fig. 5. IFN $\gamma$ /TNF-induced intestinal organoid death proceeds through mitochondrial apoptosis. (A and B) Wild-type control and BCL2-overexpressing organoids were treated with IFN $\gamma$ /TNF and cell death was assessed (n = 3 donors, mean ± SEM of three experiments). The BCL-XL inhibitor A-1331852 (BCL-XLi) was used as a mitochondrial apoptosis control. (B) The BCL-2 inhibitor ABT199 (BCLi) was added to BCL2-overexpressing organoids 0.5 hours before IFN $\gamma$ /TNF treatment and cell death was assessed (n = 3 donors, mean ± SEM of three experiments). Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test between the two groups. (C) Immunoblot of dox-inducible BCL2 expressing colonocyte organoids pretreated with doxycycline (+DOX) or doxycycline with ABT199 (+DOX+BCL2i) overnight, followed by IFN $\gamma$ /TNF or A-1331852 (BCLXLi) and S63845 (MCL1i), as indicated (one of three experiments). (D) Blue native PAGE analysis of the membrane fraction extracted from organoids stimulated with IFN $\gamma$ /TNF (one of three

experiments). A-1331852 (BCL-XLi) and S63845 (MCL1i) were added for 4 hours as a mitochondrial apoptosis control. (E) CRISPR/Cas9 targeted BAX (BAX $^{sgRNA}$ ) and control (Scramble $^{sgRNA}$ ) organoids were treated with IFNγ/TNF and cell death was assessed (n = 3 different donors, mean ± SEM of three experiments). Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test between BAX $^{sgRNA}$ and Scramble $^{sgRNA}$ groups (final three time points). (F) Immunoblot analysis of doxycycline-inducible BCL2 expressing colonocyte organoids treated with IFNγ/TNF (one of three experiments). GSK'872 was added 0.5 hours before IFNγ/TNF as a necroptosis inhibitor control. (G and H) Dox-inducible BCL2 expressing colonocyte organoids (n = 3 donors) were pretreated with doxycycline overnight followed by GSK'872, TC13172, or DMSO for 0.5 hours. Organoids were then treated with IFNγ/TNF for 8 hours and harvested for bulk RNA sequencing. (G) Schematic of the experiment. (H) Volcano plots showing the down-regulation of NUPR1 in all necroptosis inhibitor groups compared with the DMSO control. For all statistical analyses, P > 0.05 (ns), *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.

Harvey Bradshaw Index (HBI): remission 0-5; mild 5-7; moderate 8-16; severe >16 (81). Patients with UC were scored using the Simple Clinical Colitis Activity Index (SCCAI): remission $< / = 2$ ; mild 3-5; moderate 6-11; >12 severe (82).

Endoscopic scoring of intestinal inflammation

The Simple Endoscopic Score for Crohn's Disease (SES-CD) was used for patients with CD: 0-2 (remission), 2-6 (mild); 6-15 (moderate), >15 (severe) (83). The Mayo Endoscopic Score was used for patients with UC: 0 (normal/inactive), 1 (mild), 2 (moderate), 3 (severe) (84).

Clinical biomarker assessment for IBD

In line with standard guideline-based monitoring of IBD (85), patients underwent venesection to measure key blood biomarkers, including C-reactive protein (CRP) and albumin: CRP < 5 mg/L was normal; albumin < 35 g/L was reduced. Patients were also required to provide stool samples to measure fecal calprotectin with levels >50 $\mu$ g/g considered elevated due to intestinal inflammation. Results were included where these tests were performed within six weeks of endoscopy biopsy collection and clinical assessment.

Clinical outcome follow-up

Electronic medical records were examined for up to 24-36 months after recruitment of the last patient. Disease relapse was defined based on documented evidence of: recurrence of clinical symptoms, biochemical relapse (elevated CRP or calprotectin), endoscopic or histologic disease activity or IBD-related hospitalization with a need for use of corticosteroids; therapeutic escalation or switch in medical therapy; and IBD-related surgery. Patients were considered lost to follow up if they had relocated with care transferred to an external organization or if they failed to attend subsequent appointments.

Organoid generation and differentiation

Fresh human intestinal samples were collected and kept in DMEM/F-12 with 15 mM HEPES (DMEM/F-12, STEMCELL Technologies, 36254) containing 100 $\mu$ g/ml Primocin (Invivogen, ant-pm-05) and 1% w/v Bovine Serum Albumin (BSA, Sigma-Aldrich, A4612) until further processing. Samples were washed 3 times with 5 ml of phosphate-buffered saline (PBS) containing 100 $\mu$ g/ml Primocin and 20 $\mu$ g/ml Gentamicin (Thermo Fisher Scientific, 15710064), then were digested in 3 mM EDTA chelation buffer (Sigma-Aldrich, E5134) containing 100 $\mu$ M dithiothreitol (Merck, 10197777001) at room temperature for $\sim$ 30 min, with periodic shaking to facilitate crypt release. Crypts were collected through brief centrifugation and resuspended in DMEM/F-12 containing 1% w/v BSA.

Organoids were then generated and cultured using Low-viscosity matrix suspension culture methods described in $(86)$ . Briefly, 1 ml of IntestiCult $^{™}$ Organoid Growth Medium (Human) (OGM, STEMCELL Technologies, 06010) containing 5% Matrigel matrix (Bio-strategy, BDAA354234), 100 U/ml penicillin-streptomycin (Life Technologies, 15140122), 10 $\mu$ M Rho-kinase inhibitor Y27632 (Stemcell Technologies, 72308) and 20 $\mu$ g/ml Gentamicin was used to resuspend and plate crypts in sterile 24-well nontreated tissue culture plates (Falcon, 351147). Plates were incubated at 37°C with 5% CO $_{2}$ . The medium was refreshed every two days by adding 200 $\mu$ L of fresh OGM into each well. Mature organoids were obtained within 7 to 14 days.

For passaging, organoids were collected through centrifugation at 300 xg for 3 min at 4°C. The pellets were washed once with ice-cold PBS and then incubated with TrypLE Express enzyme (Thermo Fisher Scientific, 12604021) at 37°C for 10 min for cell dissociation. Cells were centrifuged at 10,000 xg for 30 seconds, and digestion was terminated by adding 1 ml DMEM/F-12 containing 1% BSA. Then cell pellets were mechanically dissociated into single cells using a 26 G needle, and were replated into sterile, nontreated 24-well plates at a density of $1 \times 10^{5}$ cells per well in a final volume of 1 ml OGM supplemented with 5% Matrigel matrix and 10 $\mu$ M Rho-kinase inhibitor Y27632. The plates were incubated at 37°C with 5% CO $_{2}$ and medium was refreshed every two days by adding 200 $\mu$ L of fresh OGM into each well. Mature organoids were obtained within 7 days.

To obtain colonocyte organoids, undifferentiated organoids at day 4-6 were collected, washed twice with ice-cold PBS and resuspended in IntestiCult™ Organoid Differentiation Medium (Human) (ODM, STEMCELL Technologies, 100-0214) supplemented with or without $10~\mu \mathrm{M}$ IWP-2 (STEMCELL Technologies, #72122) and $5\%$ Matrigel matrix. The resuspended organoids were then replated and incubated at $37^{\circ}\mathrm{C}$ with $5\%$ $\mathrm{CO}_{2}$ . After 4 days of differentiation, organoids were used for experiments.

Cell lines and culturing

HT29 (ATCC, HTB-38), HEK293T (ATCC, CRL-3216), MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26) and HepG2 (ATCC, HB-8065) cells were originally sourced from the American Type Culture Collection. The $RIPK1^{-/-}$ , $RIPK3^{-/-}$ , $MLKL^{-/-}$ HT29 cells have been previously reported (87–89). For doxycycline (dox)-inducible-NOS2 HEK293T cells, pLIX403-hNOS2 (90) (a gift from Edward Morgan, Addgene plasmid #110800) was transiently transfected into HEK293T cells alongside pMDL (packaging), RSV-REV (packaging) and VSVg (envelope) using Lipofectamine 2000 diluted in OptiMEM (Thermo Fisher Scientific) to generate lentiviral particles in DMEM. The cell culture supernatant was collected 48 h later and filtered through a 0.45 $\mu$ m filter before cell transduction. Lentiviral transduction was performed by replacing normal cell culture medium with DMEM containing lentivirus particles for 24 h. Transduced positive cells were selected by puromycin (2 $\mu$ g/ml) for 3 days.

The origin of cell lines was not further verified, although their morphologies and responses to cell death stimuli were consistent with their stated origins. Cell lines were monitored through polymerase chain reaction every $\sim$ 6 months to confirm they were mycoplasma-free. Human cell lines were maintained in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Life Technologies) supplemented with 8-10% v/v Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma-Aldrich), L-glutamate and 50 U/ml penicillin, 50 $\mu$ g/ml streptomycin in a humidified incubator at 37°C and 10% CO $_{2}$ .

Mouse macrophage generation

Bone marrow-derived macrophages were derived as described $(53)$ . Bone marrow cells were harvested from femoral and tibial bones and cultured for 6 days in DMEM containing 10% FBS, 50 U/ml penicillin, 50 $\mu$ g/ml streptomycin, and 15-20% L929 cell-conditioned medium, with an additional 10 ml of 20% (v/v) L929 cell-conditioned medium added on day 3. At day 6 post-harvest, differentiated BMDMs were replated at $5 \times 10^{5}$ cells per well in 24-well plates with 500 $\mu$ L DMEM/FCS and 20% L929 conditioned medium and were used for experiments on day 7.

A

Fig. 6. Efficient IFN $\gamma$ /TNF-induced stem cell organoid death requires PUMA. (A) Schematic showing interactions between BCL-2 prosurvival family members and prodeath members. (B) Sum of normalized transcript counts of pro-apoptotic genes (left) or prosurvival genes (right) from untreated and IFN $\gamma$ /TNF-treated organoids from 3' mRNA sequencing (n = 3 donors). (C) Stem cell organoids (n = 4 donors, symbols) or colonocyte organoids (n = 3 donors, symbols) were treated with BH3-mimetics for 24 hours:

|ABT-199 (BCL2i), A-1331852 BCL-XLi), or S63845 (MCL1i) and cell death was assessed (mean ± SEM of four experiments). One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test (versus the untreated group). (D) Immunoblot analysis of organoids treated with IFNγ/TNF (one of three experiments). (E and F) CRISPR/Cas9-targeted BBC3 (BBC3 $^{sgRNA}$ ) and control (Scramble $^{sgRNA}$ ) stem cell organoids were treated with IFNγ/TNF and cell death was assessed (n = 3 donors, mean ± SEM of three experiments). Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test was used. Comparisons between Scramble $^{sgRNA}$ and BBC3 $^{sgRNA}$ organoids were conducted for each treatment (final three time points). (F) Representative IncuCyte images of stem cell organoids after 21 hours of IFNγ/TNF treatment. Scale bars, 400 μm (left); 200 μm (right). (G) Immunoblot of BBC3 $^{sgRNA}$ and Scramble $^{sgRNA}$ stem cell organoids treated with IFNγ/TNF for 24 hours (one of three experiments). (H to J) Colonocyte organoids were treated and analyzed as indicated in (E), (F), and (G). (K) Representative immunoblots showing levels of PUMA and cleaved caspase-3 in intestinal biopsies from patients. The patient designation (NM), IBD subtype (UC/CD), and treatment for each patient and histopathological score (RHI) of each biopsy site is shown. Blue arrowheads indicate activated forms of caspase-3. Gray arrowheads indicate the full-length form of each protein. For all statistical analyses, P > 0.05 (ns), *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.

Organoid stimulation

Organoids were maintained in noncoated 24-well tissue culture plates with OGM until day 7, then were collected through centrifugation at 300g for 3 min. The pellets were washed once with ice-cold PBS and resuspended in either OGM with 5% Matrigel matrix for stem cell organoids, or ODM supplemented with 10 $\mu$ M IWP-2 and 5% Matrigel matrix for colonocyte organoids. 300-500 organoids were then plated per well in triplicate in nontreated 96-well tissue culture plates (Falcon, 351172) with 50 $\mu$ L of media. The surrounding wells were filled with PBS, and the plate incubated at 37 °C in a 5% CO $_{2}$ incubator until treatment.

Unless otherwise stated in figure legends, organoids were treated with IFNγ (50 ng/ml, R&D, 285-IF-100), IFNα (100 U/ml, PBL assay science, 11101-2), IFNβ (100 U/ml, Rebif 44, Merck Serono), IFNλ1 (100 ng/ml, R&D, 1598-IL-025), IFNλ3 (100 ng/ml, R&D, 5259-IL-025), Human Fc-TNF (50 ng/ml, in-house (91)), LPS (50 ng/ml, InvivoGen; tlrl-3pelps), Pam-3-CSK4 (500 ng/ml, InvivoGen; tlrl-pms), PolyI:C (10 μg/ml, InvivoGen; tlrl-picw), FAS ligand (10 ng/ml, Peprotech, 310-03H), TRAIL (5 ng/ml, in-house). Where multiple time points were used, stimulations were performed in a reverse time-course fashion so that all organoids were harvested at the same time. Necrostatin-1s (10 μM, nec1s, Merck, 504297), GSK'872 (10 μM, SynKinase, SYN-5481), TC13172 (5 μM, MedChemExpress #HY-101524), GSK'481 (1 μM, Sapphire Bioscience, #13-20309), VX-765 (40 μM, Selleck, S2228), MCC950 (10 μM, kindly provided by A. Roberson and M. Cooper, University of Queensland, Australia), Ferrostatin-1 (20 μM, Fer-1), liproxstatin-1 (40 μM, Lipr-1), Q-VD-OPh (40 μM, QVD, MedChemExpress, HY-12305), IDN-6556 (20 μM, provided by Idun Pharmaceuticals), Human Fas Ligand/TNFSF6 Antibody (10 μg/ml, R&D, MAB126), Human TRAIL/TNFSF10 Antibody (10 μg/ml, R&D, MAB375), RAS-selective lethal 3 (RSL3, 20 μM), ABT-737 (1 μM, Active Biochem; A-6044), cycloheximide (10 μg/ml, Sigma; C7698), TNF (50 ng/ml), Smac mimetic (1 μM, Compound A, TetraLogic Pharmaceuticals), Q-VD-OPh (20 μM), ABT-199 (1 μM, BCL2 inhibitor, Active Biochem; A-1231), S63845 (10 μM, MCL1 inhibitor, Active Biochem; A-6044) and A-1331852 (2 μM BCL-XL inhibitor; AbbVie, provided by Guillaume Lessene, WEHI).

Cell line treatment

MDA-MB-231 and HepG2 cells were plated at $2 \times 10^{4}$ cells per well in 96-well plates with 100 $\mu$ L DMEM containing 10% FCS. After cells had adhered to the plate, MDA-MB-231 cells were primed with recombinant human IFN $\gamma$ (50 ng/ml) overnight, followed by TRAIL (50 ng/ml) treatment for 48 hours. TRAIL neutralizing antibody (10 $\mu$ g/ml) was added 30 min before TRAIL treatment. HepG2 cells were treated with Actinomycin D, Streptomyces sp (0.5 $\mu$ g/ml, Sigma-Aldrich, 114666) and FAS ligand (100 ng/ml) for 48 hours, Human Fas ligand/TNFSF6 Antibody (10 $\mu$ g/ml) was added 30 min before FAS ligand treatment. BMDMs were primed with LPS (100 ng/ml) for 3 hours followed by Nigericin (10 $\mu$ M, Sigma; N7143) treatment. Dox-inducible-NOS2 HEK293T cells were plated at $1 \times 10^{6}$ cells per ml in 10-cm dishes, then treated with doxycycline (1 $\mu$ g/ml, Sigma-Aldrich) overnight.

To make cell culture standards for immunoblotting, HT29 cells were treated in DMEM containing 8% v/v FCS. Media for treatment was supplemented with: 100 ng/ml recombinant human TNF- $\alpha$ -Fc (produced in-house as in (91)), 500 nM Smac mimetic (provided by Tetralogic

Pharmaceuticals) and 5 $\mu$ M IDN-6556 (provided by Idun Pharmaceuticals). HT29 cells were treated for 7.5 hours.

CRISPR gene editing of organoids through ribonucleoprotein and electroporation

Human NOS2 and BAX knockout intestinal organoids were generated using the Alt-R™ CRISPR-Cas9 system from Integrated DNA Technologies (IDT) and a published protocol (92). The Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNAs (2 nM) were designed using IDT's online software (https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN). The crRNA sequences are listed in table S1. To form gRNA, both crRNA and Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550 (5 nM, IDT, 1075927) was resuspended to 100 μM and mixed to a final concentration of 50 μM, heated to 95°C for 5 min, then cooled to room temperature. To form the ribonucleoprotein (RNP) complex, Alt-R™ S.p. Cas9-GFP V3 (100 μg, IDT, 10008100) was diluted to 5 μg/μL and mixed with gRNA (50 μM) at a 1:2.5 molar ratio (3 μl sgRNA + 2.3 μl Cas9). The mixture was incubated at room temperature for 20 min.

Mature organoids (day 7) were harvested and digested into a single-cell suspension, with $1 \times 10^{6}$ cells used for each electroporation reaction. Cells were centrifuged at 300 g for 5 min at 4°C, washed twice with PBS, and resuspended in 20 $\mu$ L of P3 primary nucleofection solution (Lonza, V4XP-3032). The nucleofection mix consisted of 5.3 $\mu$ L RNP complex, 1.2 $\mu$ L IDT electroporation enhancer (1075915), and 20 $\mu$ L cell/P3 nucleofection solution, for a total volume of 30 $\mu$ L. The mixture was added to the supplied Nucleocuvette Strip and transfected using the 4D-Nucleofector Core Unit (Lonza, AAF-1003B) and 4D-NucleofectorTM X Unit (20 $\mu$ L format) (Lonza, AAF-1003X) on program code DS-138.

Immediately after electroporation, cells were transferred to Eppendorf tubes, washed with ice-cold PBS, and resuspended in 500 $\mu$ L fluorescence-activated cell sorting (FACS) buffer containing DAPI (Thermo Fisher Scientific, 00-4959-52) for viability staining. The cell suspension was passed through a 40 $\mu$ m filter and sorted by FACS to isolate single live cells that were DAPI-negative and positive for both ATTO 550 and GFP. Sorted cells were collected in Eppendorf tubes containing DMEM/F-12 with 1% BSA and 10 $\mu$ M Y27632. Collected cells were washed and resuspended in fresh OGM with 5% matrix gel and 10 $\mu$ M Y27632 before being returned to nontreated 24-well plates for expansion. Organoids were cultured for 7-10 days before harvesting for assessment of genome editing efficiency by immunoblot, as detailed in relevant figures and figure legends.

Genetic modification of organoids using viral transduction

BBC3 sgRNAs or scramble sgRNAs were designed and cloned into the lentiCRISPR v2 Cas9 backbone (a kind gift from F. Zhang, http://n2t.net/addgene:52961; RRID:Addgene_52961) (93). The sgRNAs (listed in table S1) were introduced into intestinal organoids using lentiviral transduction. Lentiviral particles were generated based on a CRISPR/Cas9 protocol described previously (94). Briefly, HEK293T cells were plated at a density of $1 \times 10^{6}$ cells per well in a 6-well plate. $1.48\mu \mathrm{g}$ of plasmid DNA and lentiviral packaging vectors ( $0.74\mu \mathrm{g}$ pMDL, $0.37\mu \mathrm{g}$ RSV-REV, $0.44\mu \mathrm{g}$ VSVg) were mixed with Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher, 11668027) and OptiMEM and added to cells according to the manufacturer's protocol. The mixture was incubated overnight then

B

C

E

F

G

1

J

K

M

N

0

P

Fig. 7. Increased iNOS is detected in IBD tissue and can promote IFN $\gamma$ /TNF-induced colonocyte organoid killing. (A) Increased NOS2 in patients with IBD relative to control patients. Data are combined from 26 studies (50). (B) Volcano plot showing DEGs and NOS2 levels in IFN $\gamma$ /TNF-treated colonocyte organoids compared with untreated organoids. (C and D) Representative immunoblots and corresponding quantification of iNOS levels in intestinal biopsies from patients with IBD and non-IBD controls (D) (mean ± SEM, n=7 per group). See fig. S12 for additional immunoblots. The patient study number (NM), IBD subtype (UC/CD), treatment and histopathological score (RHI) of each biopsy site are shown. (E and F) Representative iNOS immunohistochemistry (E) and quantification (F) in IBD intestinal biopsies (mean ± SEM, n=5 patients with IBD and

$n = 4$ non-IBD control patients). See fig. S12 for additional example of iNOS staining. Scale bars, $200\mu \mathrm{m}$ (top); $20\mu \mathrm{m}$ (bottom). (G and H) Stem cell and colonocyte organoids were treated with IFN $\gamma$ and/or TNF and (G) iNOS expression measured by immunoblot (one of three independent experiments) or (H) nitrite ( $\mathrm{NO}_2^-$ ) production after 24 hours quantified ( $n = 4$ donors [symbols], mean $\pm$ SEM of four independent experiments). (I to K) The indicated colonocyte organoids were treated with IFN $\gamma$ and TNF and cell death was assessed (I) ( $n = 3$ donors mean $\pm$ SEM of three independent experiments). Statistical analysis was performed using two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. Comparisons between Control $^{\mathrm{sgRNA}}$ group and the corresponding NOS2 $^{\mathrm{sgRNA}}$ group were conducted. For clarity the statistical analysis from the last three time points is presented. Representative IFN $\gamma$ /TNF-treated intestinal organoid images are shown in (J). Scale bars, $400\mu \mathrm{m}$ (left); $200\mu \mathrm{m}$ (right). Nitrite ( $\mathrm{NO}_2^-$ ) production was measured after 24 hours (K) ( $n = 3$ donors mean $\pm$ SEM of three independent experiments). (L) Immunoblot analysis of colonocyte organoids treated with IFN $\gamma$ and TNF for 24 hours. One of three independent experiments is shown. See fig. S12D for additional repeats. (M to P) Stem cell organoids were treated and analyzed as in (I), (J), (K), and (L).

A

B

C

D

E

F

G

Fig. 8. Increased epithelial cell death signaling predicts disease relapse. (A) Proposed mechanism of noncanonical necroptotic-to-apoptotic epithelial signaling that arises in patients with IBD irrespective of disease subtype or therapy choice. (B) Patients with IBD were monitored from recruitment (baseline), with patients either lost to follow-up (LTFU), maintained on the same therapy regime (nonrelapse), or requiring an escalation/change in therapy (relapse) for the ensuing 3 years (table S1). (C and D) Serum albumin levels and serum CRP in patients with IBD at baseline. **P < 0.01 by unpaired t test. Each dot represents one patient. The normal ranges of serum albumin (34 to 50 g/liter) and CRP (0 to 5 mg/liter) are indicated. (E to G) Histopathology scores for the most inflamed biopsy collected per patient (E), the levels of pRIPK3 (F), or cleaved caspase-3 (G) at baseline. Each dot represents one biopsy. **P < 0.01 by 1-way ANOVA with Dunnett's correction for (E) and by 1-way ANOVA with Tukey's correction for panels (F) and (G).

was replaced with DMEM containing 10% FCS the following day. Viral supernatants were collected after 48 hours, filtered through a 0.45 $\mu$ m filter, and concentrated 20 times using a Lenti-X Concentrator (Takara Bio, 631232) according to the manufacturer's directions. The lentiviral particles were resuspended in OGM and aliquots stored at -80 °C. Transfected HEK293T cells were refreshed with DMEM containing 10% FCS medium, and the same procedure repeated 72 hours post-transfection.

Organoids cultured for seven days were digested into single cells for lentivirus transduction. Cells were resuspended in 250 $\mu$ L OGM and seeded into nontreated 24-well plates at $2 \times 10^{5}$ cells per well, then mixed with 250 $\mu$ L of concentrated lentiviral particles supplemented with 8 $\mu$ g/ml Polybrene (Sigma-Aldrich, TR-1003) and 10 $\mu$ M Y27632. Four wells were used for each gene targeting experiment. The plate was centrifuged at 600 g for one hour at 32 °C, followed by incubation at 37°C with 5% CO $_{2}$ for 6 hours. After incubation, the cells were collected, washed, and resuspended in fresh OGM with 5% matrix gel and 10 $\mu$ M Y27632 before being returned to nontreated 24-well plates to allow organoids to grow. For puromycin selection, gene-modified organoids were digested into single cells and co-cultured with puromycin (2 $\mu$ g/ml) in OGM with 5% matrix gel and 10 $\mu$ M Y27632 for 3 days. The surviving organoids were collected, washed, and resuspended in fresh OGM with 5% matrix gel and 10 $\mu$ M Y27632 before being returned to nontreated 24-well plate to continue growth. Lentiviral particles containing doxycycline-inducible human BCL2 (cloned into pFTRE3G PGK puro (18)) were generated in the same manner.

Human ZBP1 knockout intestinal organoids were generated using a two-step CRISPR strategy. First, stable Cas9-expressing organoids were established by lentiviral transduction. A Cas9-mCherry construct (a kind gift from the Marco Herold laboratory) was packaged into lentiviral particles as described above. After transduction, organoids were expanded for 7 days and mCherry-positive cells were isolated by FACS to generate Cas9-expressing organoid lines. After 1-2 passages to allow recovery and expansion, Cas9-expressing organoids were dissociated into single cells and electroporated with synthetic gRNAs targeting ZBP1 or nontargeting scrambled control gRNAs (sequences listed in table S1). For each electroporation reaction, $1 \times 10^{6}$ cells were resuspended in P3 primary nucleofection solution and electroporated using the 4D-Nucleofector system (Lonza) with program DS-138. Immediately after electroporation, cells were washed and resuspended in OGM supplemented with $5\%$ matrix gel and $10~\mu \mathrm{M}$ Y27632 and plated in nontreated 24-well plates for recovery and expansion.

For constitutive overexpression of human BCL2, a retroviral pMIG BCL2 FLAG IRES GFP plasmid (gifted by the laboratory of John Silke) was used to generate retroviral particles by Lipofectamine 2000 cotransfection of HEK293T cells with retroviral packaging vectors (VSVg and gagpol), using 4 $\mu$ g and 6 $\mu$ g per well of a 10-cm plate. Virus supernatants were collected, filtered, and concentrated 20 times using Retro-X $^{™}$ Concentrator (Takara Bio, 631455) according to the manufacturer's directions and organoids infected with virus particles following the same procedure as for lentiviral transduction (see above). Cell sorting for GFP $^{+}$ cells was used to enrich for organoids overexpressing BCL2. Briefly, infected organoids were digested into single cells and resuspended in FACS buffer (1% FCS in PBS) supplemented with propidium iodide (PI, 10 $\mu$ g/ml) and 10 $\mu$ M Y27632. Using fluorescence-activated cell sorting, single live cells (PI negative) positive for GFP were sorted into Eppendorf tubes containing DMEM/F-12 with 1% BSA and 10 $\mu$ M Y27632. Collected cells were washed and resuspended in fresh OGM with 5% matrix gel and 10 $\mu$ M Y27632 before being returned to nontreated 24-well plate for expansion.

Histology and immunohistochemistry

For cell pellets: Trypsinized cells were centrifuged at $670 \times g$ for 3 min at room temperature. The supernatant was discarded, cell pellets resuspended in 10% (v/v) neutral buffered formalin, incubated for 15 min at room temperature, and centrifuged at $670 \times g$ for 3 min at room temperature. Cell pellets were resuspended in 50 -70 $\mu$ L of HistoGel (Epredia catalog no.HG-4000-012) pre-warmed to 56 °C and then pipetted onto ice-cold glass coverslips to set. Set pellets were stored in 70% (v/v) ethanol until sample processing and paraffin-embedding (Tissue-Tek VIP 6 AI).

For tissue samples: biopsies were fixed in 10% v/v Neutral Buffered Formalin for 24–72 h, paraffin embedded, and sectioned for immunohistochemistry as described (44). Staining for caspase-8 and cleaved caspase-3 was performed as described (44). For staining iNOS, sections were treated with low pH Retrieval buffer (DAKO, K800521-2) at 97 °C for 30 min and stained with iNOS (R&D MAB9502, 1:200) on a Dako Omnis platform for 1 h and secondary antibody for 30 min followed by substrate chromogen (DAB) (DAKO, GV82511-2) treatment for 10 min and counterstaining with hematoxylin. Stained slides were scanned on an Olympus VS200 (objective: 20x, numerical aperture 0.8, media dry; software: Olympus VS200). Where higher resolution was required, slides were scanned on the Olympus VS200 using the 60x objective (numerical aperture 1.42, media oil). Downstream analyses used QuPath Software (v0.4.3) (95).

For organoids: organoids were harvested from 2-3 wells of a 96-well plate and transferred into Eppendorf tubes. After centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute, the organoid pellet was gently resuspended in 1 ml PBS. To ensure removal of residual Matrigel, the organoid samples were kept on ice for 1 hour, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute. The pellet was resuspended in pre-heated HistoGel at 55-60°C, pipetted gently, and placed onto a pre-cooled cover slip. After solidification at 4°C for 15 min, the gel domes were fixed in 10% formalin at 4°C overnight. The fixed domes were then transferred to cryomolds, ready for paraffin embedding. Subsequent histological or immunohistochemical analyses were performed on sectioned paraffin-embedded organoids with antibodies against LGR5 (clone OTI2A2, Thermo Fisher Scientific, TA503316, 1:300, described in (86)). For Intestinal Alkaline Phosphatase Polyclonal Antibody (ALPI) staining, sections were treated with low pH Retrieval buffer (DAKO, K800521-2) at 97 °C for 30 min and stained with ALPI (Catalog # PA5-22210, 1:200) on a Dako Omnis platform for 1 h and secondary antibody for 30 min followed by substrate chromogen (DAB) (DAKO, GV82511-2) treatment for 10 min and counterstaining with hematoxylin. Slides were scanned on the Olympus VS200 using the 60x objective (numerical aperture 1.42, media oil). The displayed immunohistochemistry images of intestinal tissues and organoids were processed using ImageJ (96), with brightness and contrast adjusted to a range of 0-235 and gamma set to 1.5.

Histopathological scoring of intestinal inflammation

The Robarts Histopathology Index (RHI) was used to measure IBD activity within biopsies $(97)$ . Scoring was performed by one anatomical pathologist with gastrointestinal expertise based on haemtoxylin and eosin-stained slides sliced from formalin-fixed paraffin-embedded biopsies. Slides were de-identified as to disease state (control or IBD) and inflammatory state (non-inflamed, margin or inflamed), however the anatomical location of the biopsy was known. When a sample could not be scored due to high levels of inflammation and tissue abnormalities (e.g. the tissue was largely composed of inflammatory neutrophilic exudate) a pseudo-score of 15 that likely underrepresents the extent of disease activity was assigned.

Immunohistochemical quantitation of iNOS expression

Images were analyzed using QuPath (v0.4.3) (95). A region of interest was manually defined to cover the whole section. The brown DAB signal was then thresholded to isolate the iNOS-positive areas. The iNOS-positive area as a percentage of the whole section was then measured.

Cell and tissue protein lysates

For human tissue lysates: biopsies were transferred from ice-cold dPBS into 0.4 ml of ice-cold RIPA buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 0.5% v/v Triton X-100, 0.1% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, and 90 mM NaCl) supplemented with 1x Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (Cell Signaling Technology catalog no.5872) and 100 U/ml Benzonase (Sigma-Aldrich catalog no.E1014) and then homogenized with a stainless steel ball bearing in a Qiagen TissueLyzer II (30 Hz, 1 minute). For organoid lysates: \~1000-2000 organoids were collected, washed twice with ice-cold PBS, and lysed in 60-120 μL of ice-cold RIPA buffer supplemented with cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Biochemicals, 11697498001), phosphatase inhibitors (Merck, 4906837001) and 100 U/ml Benzonase (Sigma-Aldrich catalog no.E1014). HT29 or HEK293T cells were lysed in RIPA buffer supplemented with cOmplete Protease Inhibitor Cocktail, phosphatase inhibitors, and 100 U/ml Benzonase.

Immunoblot

The protein concentration of lysates was measured using Pierce™ BCA Protein Assay Kits (Thermo Fisher Scientific, 23225) according to the manufacturer's directions. For Fig. 2 and fig. S2, $20\mu \mathrm{g}$ of HT29 cell lysate and $40 - 50~\mu \mathrm{g}$ tissue lysates were boiled for 10 min in Laemmli sample buffer (126 mM Tris-HCl, pH 8, $20\%$ v/v glycerol, $4\%$ w/v SDS, $0.02\%$ w/v bromophenol blue, $5\%$ v/v 2-mercaptoethanol) and fractionated by $4 - 12\%$ Bis-Tris gel (Thermo Fisher Scientific catalog no.NP0335BOX) using MES running buffer (Thermo Fisher Scientific catalog no.NP000202). Note, patient lysates were always run alongside HT29 cell standards to allow the quantitative comparison of immunoblot data across this study. After transfer onto polyvinylidene fluoride (Merck catalog no. IPVH00010), gels were Coomassie-stained as per manufacturer's instructions (Thermo Fisher Scientific catalog no.LC6060) and membranes were blocked in $5\%$ w/v cow's skim milk powder in TBS containing $0.1\%$ Tween 20 (TBS+T) and then probed with primary antibodies (1:2000 dilution for rat primary antibodies or 1:1000 for other primary antibodies in blocking buffer supplemented with $0.01\%$ w/v sodium azide; see Antibodies section for details) overnight at $4^{\circ}\mathrm{C}$ , washed twice in TBS + T, probed with an appropriate HRP-conjugated secondary antibody (see Antibodies section for details), washed four times in TBS + T and signals revealed by enhanced chemiluminescence (Merck catalog no.WBLUF0100) on a ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad). Between probing with primary antibodies from the same species, membranes were incubated in stripping buffer (200 mM glycine pH 2.9, $1\%$ w/v SDS, $0.5\mathrm{mM}$ TCEP) for 30 min at room temperature and then re-blocked.

For all other immunoblot figures, protein concentration was adjusted into 1 mg/ml. Lysates were subsequently mixed with SDS-PAGE sample buffer. Proteins from lysates were separated using 4%-12% gradient gels (Invitrogen) and then transferred onto either nitrocellulose membranes (Amersham) or Immobilon-P polyvinylidene fluoride membranes (Merck Millipore; IEVH85R). To ensure accurate protein loading of organoid lysates, Ponceau staining was routinely performed. The membranes were blocked for 30 min with 5% skim milk (Devondale) in (TBS+T) at room temperature. After blocking, the membranes were incubated with primary antibodies overnight at 4°C. The primary antibodies were diluted in 5% BSA TBS+T with 0.04% sodium azide, typically at a dilution of 1:1000 unless otherwise specified. Between probing with primary antibodies from the same species, membranes were incubated in stripping buffer (200 mM glycine pH 2.9, 1% w/v SDS, 0.5 mM TCEP) for 30 min at room temperature and then re-blocked. See Antibodies section for details. Appropriate HRP-conjugated secondary antibodies (see Antibodies section for details) were diluted 1:5000-10,000 in 5% skim milk in TBS+T and applied to the membranes for 1 hour at room temperature. The membranes were washed three times for 5 min each in TBS+T between antibody incubations, and four times for 5 min each after the secondary antibody incubation. The membranes were developed using ECL (Millipore,

Bio-Rad) and visualized with the ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad) using Image Lab v6.1 (Bio-Rad).

For BN-PAGE immunoblot, organoids were permeabilized with 0.025% (w/v) digitonin for 10 min on ice, and cytosol and heavy membrane fractions were separated by centrifugation at 13,000 g for 5 min at 4°C. Membrane fractions were then resuspended in lysis buffer [20 mM tris (pH 7.4), 135 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, and 10% (v/v) glycerol, supplemented with 1% (v/v) digitonin and complete protease inhibitor (0.5 μg/ml; Sigma-Aldrich)] for 30 min on ice. After lysis, samples were centrifuged at 13,000 g at 4°C for 10 min and supernatants were collected. Samples were run in NativePAGE™ Bis-Tris Mini Protein Gels, 3 to 12%, 1.0 mm (Invitrogen). Gels were transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane, and nonspecific binding was blocked with 5% (w/v) nonfat milk in TBS+T for 1 hour at room temperature. Membranes were incubated with the primary antibody overnight at 4°C. The membranes were washed three times for 5 min each in TBS+T between antibody incubations, and four times for 5 min each after the secondary antibody incubation. The membranes were developed using ECL (Millipore, Bio-Rad) and visualized with the ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad) using Image Lab v6.1 (Bio-Rad) software.

Immunoblot quantitation

For Figs. 2 and 8 and fig. S2, densitometric analysis of the raw full-resolution .scn Chemidoc files was performed using Image Lab v6.1 (Bio-Rad). For phosphorylation or cleavage events, their densitometric signals were expressed relative to their parent protein (e.g. phosphorylated RIPK3 values were expressed relative to nonphosphorylated RIPK3, and cleaved caspase-3 values were expressed relative to the total caspase-3 signal). For unmodified targets, their densitometric signals were first expressed relative to the same unmodified protein in a HT29 cell standard and then adjusted for differences in GAPDH (e.g. cIAP2 levels in one biopsy lysate was expressed relative to cIAP2 levels in $20\mu \mathrm{g}$ of untreated HT29 cell lysate, and then further adjusted for differences in GAPDH between these lysates).

For Figs. 6 and 7 and figs. S8 and S11, densitometric analysis was performed using ImageJ v1.54h (96). Immunoblot images were first converted to grayscale (8-bit), and background noise was reduced by applying a background subtraction with a rolling ball radius of 50 pixels. The images were then inverted to prepare for band selection. For each band of interest, integrated density (IntDen) was quantified. For PUMA analysis, the integrated density values for each band were normalized to TNF and Smac mimetic (TS) treated HT29 cells sample on the same membrane, then adjusted for differences in GAPDH. For iNOS analysis, the integrated density values for each band were normalized to non-IBD control on each membrane, then adjusted for differences in GAPDH.

IncuCyte cell death measurements

Organoid viability was assessed using the IncuCyte S3 (Sartorius) system as described $(98)$ . Briefly, organoids were plated into nontreated 96-well plates as outlined above. IncuCyte Cytotox Red Dye (Sartorius, 4632) was added to stain the dead cells at a dilution of 1: 20000 one hour before imaging. Throughout the assay, both brightfield and fluorescent images were collected with the phase/brightfield channel and red fluorescence channel (250 ms exposure) using a 4× objective and Spheroid scan type. Images of both channels were exported and analyzed through ImageJ 1.53t using a custom semi-automated macro. In brief, pairs of brightfield and red fluorescence images were cropped as shown in fig. S4D. The “MorphoLibJ” plugin $(99)$ was used to preprocess the brightfield images, then the images converted into a binary mask based on a threshold range of 0 to 132 pixel values. The cropped “Regions of Interest (ROI)” was measured and defined as the total organoid area. For red fluorescence images, the positive area was measured within the brightfield ROI and based on the manual threshold mask. Cell death was assessed by the percentage of red fluorescent positive organoid area relative to the total organoid area. MDA-MB-231, HepG2 and BMDM viability was also measured through IncuCyte S3 (Sartorius) imaging. Cells were seeded in triplicate in 96-well plates and were incubated in SPY505-DNA (1:1000, Spirochrome, SC101) and propidium iodide (PI, $0.3\mu \mathrm{g / ml}$ , Sigma-Aldrich, P4170) for 3 hours before imaging. Throughout the assay, both phase and fluorescent images were collected using the Phase channel, Green fluorescence channel (300 ms exposure) and Red fluorescence channel (400 ms exposure) with a $10\times$ objective and the Scan type of Standard. The algorithm setting was adjusted to accurately detect green and red puncta. To calculate the $\%$ PI positive cells (i.e., cell death), the puncta count for the red channel was divided by the green channel count and the result multiplied by 100.

Nitric oxide production Griess assay

Griess assays were performed as previously described $(53)$ . Cell supernatants were assayed in duplicate alongside a sodium nitrite standard curve ranging from 100 $\mu$ M to 1.56 $\mu$ M in OGM or ODM, which was assayed in triplicate. To each 25 $\mu$ L of cell supernatant, 25 $\mu$ L of sulfanilamide (1% w/v, Sigma) in phosphoric acid (5% v/v, Sigma) was added and incubated for 5 min. This was followed by the addition of 25 $\mu$ L of N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride (0.1% w/v, Sigma) in water. Absorbance was measured using a CLARIOstar Plus Microplate Reader (BMG LABTECH) and then interpolated from the background-corrected sodium nitrite standard curve.

Caspase DEVDase activity assay

The DEVDase assay measures executioner caspase (mainly caspase-3/7) activity by using a synthetic peptide substrate containing the DEVD sequence, which is specifically cleaved during apoptosis. Cleavage releases a fluorescent or chromogenic reporter, providing a quantitative readout of apoptotic caspase activity. Organoids were collected and lysed with DISC buffer (20 mM Tris-HCL pH7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA and 10% Glycerol) supplemented with cOmplete Protease Inhibitor Cocktail and phosphatase inhibitors. A substrate mixture of Ac-DEVD-AMC substrate (20 $\mu$ M, BD Pharmingen, 556449), dithiothreitol (2 mM) and Protease Assay Buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 10% glycerol) was made up fresh immediately before use. 20 $\mu$ L of cell lysates were incubated with 200 $\mu$ L of substrate mixture at 37 °C for 1 hour. Fluorescence was measured using a CLARIOstar Plus Microplate Reader (BMG LABTECH) with an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength range of 430-460 nm.

RNA isolation and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from organoids

Total RNA was isolated from organoids using the ISOLATE II RNA Mini Kit (Bioline, 52073) following the manufacturer's guidelines. cDNA was reverse transcribed from $1\mu \mathrm{g}$ of RNA using the SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18080-085), oligo (dT) nucleotides (Promega, C110B-C). Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) was performed on cDNA samples or nuclease-free water (control) using Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0223) and the ViiA 7 Real-time PCR system (Applied Biosystems). Samples were run in duplicate. Relative gene expression was normalized to the housekeeping reference gene HPRT and presented as the fold-change relative to unstimulated control sample or OGM sample, analysed using the $\Delta \Delta \mathrm{Ct}$ method (100). qRT-PCR primer sequences used in this study are listed in table S1.

Bulk RNA sequencing of intestinal biopsies and analysis

Samples were thawed, RNAlater was removed, then tissues were transferred into screw-capped tube pre-filled with 350 $\mu$ l of RA1 buffer of NucleoSP in RNAXS kit (Macherey-Nagel catalog no. SKU: 740902.250). Tissues were homogenized with 10 pcs of 3 mm acid-washed zirconium beads (OPS diagnostics catalog no. BAWZ 3000-300-23) in a Qiagen

TissueLyzer II (30 Hz, 5min). Homogenized samples were spun down for 1 minute at 11,000 $xg$ to remove tissue debris then RNA was purified using Nucleospin RNAXS column kit as per manufacturer's instructions without adding a carrier RNA. The purified RNA was quantified using Qubit™ RNA HS Assay kit (Thermo Fisher Scientific catalog no.Q32852) and RNA integrity was visualized in high sensitivity RNA ScreenTape (Agilent catalog no. 5067- 5579) using TapeStation 4200 (Agilent catalog no. G2991BA). Ten nanograms of RNA were used for preparing indexed libraries using SMARTer Stranded Total RNA-Seq Pico-Input Mammalian kit v.3 (Takara Bio. catalog no. SKU: 634487) using manufacturer's instructions with a couple of modifications, specifically 3 min of fragmentation at 94 °C and 13 cycles of PCR2. Library concentration was quantified by Qubit™ dsDNA Assay kit (Thermo Fisher catalog no.Q32851) and library size was determined using D1000 ScreenTape (Agilent catalog no. 5067-5582) and visualized in TapeStation 4200 (Agilent catalog no. G2991BA). Equimolar amounts of libraries were pooled and loaded for 150-bp paired-end sequencing on one S4 lane of NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, USA) as per manufacturer's instructions.

The paired-end 150-bp sequences were demultiplexed using CASAVA v1.8.2 and Cutadapt (v1.9) was used for read trimming $(101)$ . The trimmed reads were subsequently mapped to the human genome (GRCh38) using HISAT2 $(102)$ . FeatureCounts from the Subread package (version 1.34.7) was used for read counting after which genes <2 counts per million reads (CPM) in at least three samples were excluded from downstream analysis $(103, 104)$ . Count data were normalized using the trimmed mean of M-values method and differential gene expression analysis was performed using the limma-voom pipeline for pair-wise comparison (limma version 3.40.6) $(103, 105, 106)$ , or GraphPad Prism v10 for multiple group comparisons. Adjustment for multiple testing was performed per comparison using the false discovery rate method $(107)$ . Heatmaps of $\log_{2}$ fold changes in CPM were generated using GraphPad Prism v10. For pathway perturbation analysis, Gene Set Enrichment Analysis software v2.2.2 was used $(108)$ with the Human MSigDB hallmark (H) gene sets $(109)$ . For expression pattern analysis, unsupervised hierarchical clustering was used to identify subsets of highly correlated genes using the cluster R package. Under hierarchical clustering, expression data were first normalized and then the difference or distance between different genes and gene sets were derived to create a distance matrix using the Euclidean distance method. Optimal clusters were determined using the Elbow method, average Silhouette method and/or the Gap statistic method as indicated. The hclust function was then used to generate the dendrograms to visually represent the clustering $(110)$ . For transcription factor enrichment analysis, genes from clusters A-E were submitted to the ChIP-X Enrichment Analysis 3 (ChEA3) tool $(111)$ and the 10 most enriched transcription factors considered according to the default settings of ChEA3. Transcription factors were manually assigned to families and conveyed through Venn diagrams generated using the DeepVenn tool $(112)$ . For digital cytometry, the estimation of cell type abundance, and of correlations, in full transcriptome RNA-sequencing analysis was performed using CIBERSORTx $(113)$ . The signature matrix file used for CIBERSORTx analysis was the LM22 file from $(57)$ . For GSEA, GSEA software v4.3.3 $(108)$ was used with all gene sets from GO:BP (gene ontology biological process) of MSigDB $(109)$ .

Bulk RNA sequencing of organoids and analysis

For bulk RNA sequencing in Figs. 4 to 6 and figs. S5 and S6, total RNA was isolated from organoids using the ISOLATE II RNA Mini Kit (Bioline, 52073) following the manufacturer's guidelines. The quality of the extracted RNA was assessed using the Agilent 4200 TapeStation, and RNA samples with RNA integrity number (RIN) values greater than 9 used for further applications. For mRNA sequencing, $100\mathrm{ng}$ of total RNA was used to prepare $3^{\prime}$ mRNA-sequencing libraries following the QuantSeq $3^{\prime}$ mRNA-Seq Library Prep kit (Lexogen) protocol. The libraries were then sequenced on the NextSeq 500 (Illumina). The single-end 75 bp reads were demultiplexed using Casavav1.8.2 and Cutadapt (v1.9) (114) to remove poly A tails as well as adapters, and to remove the low quality reads with a quality score below 20. The reads shorter than 50 bases were discarded to ensure the high quality for the downstream analysis, assessed and validated by using fastQC (115). The reads were then aligned to the reference genome GRCh38 using STAR (116) and gene expression was quantified at exon level using featureCounts (103) to obtain the raw count data. Genes without a current symbol name were removed.

For bulk RNA sequencing in Fig. 5, total RNA was isolated from organoids using the NucleoSpin RNA XS Kit (Takara, 740902.250). The quality of the extracted RNA was assessed using the Agilent 4200 TapeStation, and RNA samples with RIN values greater than 9 used for further applications. Library preparation was performed using $100\mathrm{ng}$ of input RNA per sample with the TruSeq RNA Library Prep Kit (Illumina, CA, USA) as per manufacturer's instruction. The library was quantified using the Agilent Tapestation and the QubitTM RNA assay kit for Qubit 2.0 Fluorometer (Life technologies). Single indexes were used to barcode individual libraries. The indexed libraries were then prepared and diluted to $750\mathrm{pM}$ for single end (1x 132 base) sequencing on a NextSeq2000 instrument using the P4 100 cycle kit using v3 chemistry (Illumina, CA, USA) as per manufacturer's instructions. The base calling and quality scoring were determined using Real-Time Analysis on board software v2.4.6, and the FASTQ file generation and de-multiplexing used bcl2fastq conversion software v2.15.0.4.

Data filtration, normalization and differential expression analysis was conducted using mastR (117). The genes with low counts were filtered out using edgeR::filterByExpr (118) before the analysis, and raw count data was normalized using TMM (106). Differential expression analysis was performed by mastR using a limma-voom-treat (119) pipeline with default settings. For Figs. 4 to 6 and figs. S5 and S6, differential expression analyses were conducted with a two-factor design to fit a linear model with 'state' (cell differentiation state) and 'treat' (sample treatment) as the covariates. An empirical Bayes moderated t-statistic was generated and Benjamini–Hochberg multiple testing adjustment was performed to identify statistically significant genes in each comparison (adjusted p-value <0.05). For pathway perturbation analysis, GSEA software v2.2.2 was used (108) with the Human MSigDB hallmark (H) gene sets (109). Samples were scored using singscore (120) with marker genes derived from the LM22 signature matrix (113). Marker genes for each immune cell type were identified based on expression profiles in LM22 using the HDBSCAN clustering approach (121).

Single-cell RNA-sequencing data reanalysis

The raw counts of “non-IBD,” “IBD non-inflamed,” and “IBD inflamed” samples from $(51)$ were quality controlled using an R package scater $(122)$ . To analyze and visualize the high-dimensional scRNA-seq data, we used Principal Component Analysis (PCA) and Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). The IBD inflamed data were subset and renormalized using the same pipeline. A gene-set score for each individual cell in the sub-dataset was calculated using AUCell $(123)$ based on the cluster B marker list (table S1), respectively. The differential gene expression analysis was performed using a pseudo-bulked approach by mastR $(117)$ , which aggregated the raw counts into each pseudo-bulked samples by ‘state’, ‘sample’ and ‘ident’. The pseudo samples with less than 20 cells were excluded, leaving in 62 samples for analysis.

RNA quality evaluation for spatial transcriptomics

A 5 $\mu$ m section of each formalin-fixed paraffin-embedded biopsy was collected into a microcentrifuge tube and RNA extracted using the RNeasy FFPE Kit (Qiagen, catalog no.73504) according to the manufacturer's protocol. RNA concentration and fragmentation profile were measured using the TapeStation RNA High Sensitivity Screentape Kit (Agilent, catalog no. 5067-5579) and calculated using the DV200 metric.

Xenium gene panel

We designed a 480-gene panel for the Xenium platform to spatially detect: manually selected genes in the apoptotic, necroptotic (49) and pyroptotic cell death pathways, genes within known IBD-risk loci (46, 47, 124), and markers of various epithelial and nonepithelial cell types from the human gut atlas (125). The full list of genes in the Xenium panel is provided in table S1.

Tissue sectioning for Xenium spatial transcriptomics

Formalin-fixed paraffin-embedded tissue blocks were trimmed and faced on a calibrated rotary microtome (Leica Histocore BIOCUT), and 5 $\mu$ m sections were cut using fresh low-profile blades. The microtome, forceps, and surrounding surfaces were decontaminated with RNaseZAP (Sigma-Aldrich #R2020-250ML) before sectioning, and gloves were changed between samples to minimise cross-contamination. Sections were floated on 45°C Milli-Q water to allow gentle flattening and then mounted directly onto Xenium slides (10x Genomics, catalog no.PN-1000460). Xenium slides were then air-dried on the bench for at least 1 h and incubated at 42°C for 3 h before storing in a sealed desiccator at room temperature for $\leq$ 7 days before imaging.

Xenium spatial transcriptomic imaging

Mounted sections on Xenium slides were deparaffinised and decross-linked according to 10x Genomics' Demonstrated Protocol (CG000578, Rev F). Slides were prepared according to manufacturer's Xenium In Situ Gene Expression with Cell Segmentation Staining protocol (CG000749, Rev B), whereby custom probes were hybridised at 50°C overnight, washed, ligated, and amplified. To enhance cell segmentation accuracy, sections were stained with Xenium Cell Segmentation Add-On Kit (10x Genomics, 1000662) at 4°C overnight. Slides (and the required reagents) were then loaded onto the Xenium Analyser Instrument as per the Xenium Analyzer User Guide (G000584, Rev K). The appropriate codebook matching the gene panel was selected. A low-resolution, whole-slide image was then generated to mark regions of interest for spatial profiling. Data were acquired in iterative cycles of probe hybridization with fluorescent labels, image capture, and probe stripping through an automated sample and liquid handling device. The Xenium Onboard Analysis pipeline version 3.3.0.1 was run directly on the instrument for image processing, cell segmentation, image registration, decoding, deduplication and secondary analysis. After the run, slides were removed from the Xenium Analyser instrument and treated with 10 mM sodium hydrosulfite solution to remove quenching chemicals according to 10x Genomics' Demonstrated Protocol (CG000613, Rev B). This was followed by Mayer's Hematoxylin and Eosin Y staining, dehydration, coverslipping using Micromount (Leica) and re-imaging on the SLIDEVIEW VS200 slide scanner (Olympus). Note, all reagents (including water) were molecular-grade nuclease-free and slide incubations were performed by positioning a Xenium Thermocycler Adaptor (10x Genomics, catalog no.PN-3000954) on a thermal cycler (Bio-Rad catalog no. C1000 Touch) to ensure efficient and even heat transfer.

Spatial transcriptomics data preprocessing and downstream analysis

Cells were segmented with ProSeg (v3.0.10; (126)). Cells with $\geq$ 20 total transcript counts and total counts at or below the 98 $^{th}$ percentile were retained for analyses. Downstream analyses were performed in Scanpy (v1.11.2; (127)) and edgeR (v4.6.3; (128)). Batch effects were corrected using the Harmony algorithm in Scanpy. Unsupervised clustering was performed using the Leiden algorithm in Scanpy on all cells and separately on the epithelial subset, and clusters were annotated based on marker gene expression. Colonocyte #2 cells were stratified into cluster B $^{+}$ ( $\log_{2}$ CPM $\geq$ 15) and cluster B $^{-}$ ( $\log_{2}$ CPM < 15) subsets.

Neighbouring cells were defined as cells within a 35 $\mu$ m radius of a colonocyte #2 cell and were categorized as cluster B $^{+}$ colonocyte #2 neighbours, cluster B $^{-}$ colonocyte #2 neighbours, or shared neighbours (i.e. within 35 $\mu$ m of both cluster B $^{+}$ and cluster B $^{-}$ colonocyte #2 cells).

Pseudobulk differential expression analyses in edgeR included: (i) comparisons of cluster B gene-set and other IBD-associated cell death genes within each cell type across biopsy groups (non-IBD, IBD RHI 0 and IBD RHI 1 $^{+}$ ), (ii) cluster B $^{+}$ versus cluster B $^{-}$ colonocyte #2 within the IBD RHI 0 group, (iii) cluster B $^{+}$ versus cluster B $^{-}$ stem cells within the IBD RHI 0 group, and (iv) neighborhoods of cluster B $^{+}$ versus cluster B $^{-}$ colonocyte #2 (restricted to biopsies with >1% cluster B+ colonocyte #2 among all epithelial cells). Library sizes were normalized using the trimmed mean of M-values method. Gene-wise negative binomial generalized linear models were fitted using quasi-likelihood methods (glmQLFit), and differential expression was assessed with quasi-likelihood F tests. Genes with a false discovery rate of <0.05 were considered differentially expressed.

Pseudotime trajectories for epithelial cells were inferred using the Python implementation of Slingshot (129). Pixel-level cell-type patterns were visualized with FICTURE (130) using reference marker gene weights for annotated cell types; each rendered pixel corresponds to $0.5\mu m^{2}$ .

Database design

Quantitative and qualitative data from 5 arms of the study (patient history, clinical history, clinical data, histopathology scores, immunoblot quantitation) were managed using REDCap (131, 132) and Microsoft Excel. Due to the complexity of the RNA-sequencing data, these data were instead managed separately using RStudio v2024.4.2.764. All data were linked to the patient's study number (parent term) and the endoscopic classification of each biopsy (subparent term) to facilitate multiparametric analysis across the different arms of the study.

Data visualization and statistical analysis

For all data displayed as graphs, the measure of center, variance, and the number of independent replicates is stipulated in the respective figure legend. The numbers represented in all heatmaps are provided in table S1. Statistical tests were only applied to data that had been performed at least three times independently. The statistical test and the P value cutoffs are stipulated in the respective figure legends. Statistical tests were performed with GraphPad Prism v10, except for differential gene expression analyses (see above for details). For data in Figs. 4 to 7, each data point (symbols) depicted in graphs of organoids represents an independent biological replicate (i.e., a different donor), and the number of times each experiment was repeated is detailed in the figure legends. All graphs of HepG2 and MDA-MB-231 experiments display data points from experiments performed on the same cell line. Replicates from in vitro experiments were acquired either on different days or by different researchers with separate reagents and are displayed as the mean ± standard error of the mean (SEM).

REFERENCES AND NOTES

1. G. G. Kaplan, J. W. Windsor, The four epidemiological stages in the global evolution of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 18, 56–66 (2021). doi: 10.1038/s41575-020-00360-x; pmid: 33033392

2. A. N. Ananthakrishnan, Epidemiology and risk factors for IBD. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 12, 205–217 (2015). doi: 10.1038/nrgastro.2015.34; pmid: 25732745

3. C. A. Lamb et al., British Society of Gastroenterology consensus guidelines on the management of inflammatory bowel disease in adults. Gut 68, S1–S106 (2019). doi: 10.1136/gutjnl-2019-318484; pmid: 31562236

4. T. Raine et al., ECCO Guidelines on therapeutics in ulcerative colitis: Medical treatment. J. Crohns Colitis 16, 2–17 (2022). doi: 10.1093/ecco-jcc/jjab178; pmid: 34635919

5. H. Gordon et al., ECCO guidelines on therapeutics in Crohn's disease: Medical treatment. J. Crohns Colitis 18, 1531–1555 (2024). doi: 10.1093/ecco-jcc/jjae091; pmid: 38877997

6. A. Tursi et al., Effectiveness and safety of infliximab and adalimumab for ambulatory Crohn's disease patients in primary gastroenterology centres. Eur. J. Intern. Med. 25, 485–490 (2014). doi: 10.1016/j.ejim.2014.02.010; pmid: 24631020

7. A. Wilson et al., High infliximab trough concentrations are associated with sustained histologic remission in inflammatory bowel disease: A prospective cohort study. BMC Gastroenterol. 21, 77 (2021). doi: 10.1186/s12876-021-01650-7; pmid: 33602145

8. L. Galluzzi et al., Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 25, 486–541 (2018). doi: 10.1038/s41418-017-0012-4; pmid: 29362479

9. F. K. Chan et al., A role for tumor necrosis factor receptor-2 and receptor-interacting protein in programmed necrosis and antiviral responses. J. Biol. Chem. 278, 51613–51621 (2003). doi: 10.1074/jbc.M305633200; pmid: 14532286

10. W. J. Kaiser et al., RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature 471, 368–372 (2011). doi: 10.1038/nature09857; pmid: 21368762

11. A. Oberst et al., Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature 471, 363–367 (2011). doi: 10.1038/nature09852; pmid: 21368763

12. A. Kawahara, Y. Ohsawa, H. Matsumura, Y. Uchiyama, S. Nagata, Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with death domain. J. Cell Biol. 143, 1353–1360 (1998). doi: 10.1083/jcb.143.5.1353; pmid: 9832562

13. D. Vercammen et al., Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 187, 1477–1485 (1998). doi: 10.1084/jem.187.9.1477; pmid: 9565639

14. N. Holler et al., Fas triggers an alternative, caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule. Nat. Immunol. 1, 489–495 (2000). doi: 10.1038/82732; pmid: 11101870

15. S. He et al., Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell 137, 1100–1111 (2009). doi: 10.1016/j.cell.2009.05.021; pmid: 19524512

16. Y. S. Cho et al., Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell 137, 1112–1123 (2009). doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037; pmid: 19524513

17. L. Sun et al., Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell 148, 213–227 (2012). doi: 10.1016/j.cell.2011.11.031; pmid: 22265413

18. J. M. Murphy et al., The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity 39, 443–453 (2013). doi: 10.1016/j.immuni.2013.06.018; pmid: 24012422

19. A. L. Samson et al., MLKL trafficking and accumulation at the plasma membrane control the kinetics and threshold for necroptosis. Nat. Commun. 11, 3151 (2020). doi: 10.1038/s41467-020-16887-1; pmid: 32561730

20. S. E. Garnish et al., Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nat. Commun. 12, 2211 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-22400-z; pmid: 33850121

21. H. Nakano, S. Murai, K. Moriwaki, Regulation of the release of damage-associated molecular patterns from necroptotic cells. Biochem. J. 479, 677–685 (2022). doi: 10.1042/BCJ20210604; pmid: 35293986

22. G. R. D'Haens, S. van Deventer, 25 years of anti-TNF treatment for inflammatory bowel disease: Lessons from the past and a look to the future. Gut 70, 1396–1405 (2021). doi: 10.1136/gutjnl-2019-320022; pmid: 33431575

23. S. C. Davies et al., Oral Janus kinase inhibitors for maintenance of remission in ulcerative colitis. Cochrane Database Syst. Rev. 1, CD012381 (2020). pmid: 31984480

24. K. K. Jena et al., Type III interferons induce pyroptosis in gut epithelial cells and impair mucosal repair. Cell 187, 7533–7550.e23 (2024). doi: 10.1016/j.cell.2024.10.010; pmid: 39500322

25. C. Günther et al., Caspase-8 regulates TNF- $\alpha$ -induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature 477, 335–339 (2011). doi: 10.1038/nature10400; pmid: 21921917

26. G. van Loo, M. J. M. Bertrand, Death by TNF: A road to inflammation. Nat. Rev. Immunol. 23, 289–303 (2023). doi: 10.1038/s41577-022-00792-3; pmid: 36380021

27. D. Boehmer, I. Zanoni, Interferons in health and disease. Cell 188, 4480–4504 (2025). doi: 10.1016/j.cell.2025.06.044; pmid: 40845809

28. J. V. Patankar, C. Becker, Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 17, 543–556 (2020). doi: 10.1038/s41575-020-0326-4; pmid: 32651553

29. J. V. Patankar et al., E-type prostanoid receptor 4 drives resolution of intestinal inflammation by blocking epithelial necroptosis. Nat. Cell Biol. 23, 796–807 (2021). doi: 10.1038/s41556-021-00708-8; pmid: 34239062

30. M. Pierdomenico et al., Necroptosis is active in children with inflammatory bowel disease and contributes to heighten intestinal inflammation. Am. J. Gastroenterol. 109, 279–287 (2014). doi: 10.1038/ajg.2013.403; pmid: 24322838

31. A. Negroni et al., RIP3 AND pMLKL promote necroptosis-induced inflammation and alter membrane permeability in intestinal epithelial cells. Dig. Liver Dis. 49, 1201–1210 (2017). doi: 10.1016/j.dld.2017.08.017; pmid: 28844856

32. R. Wang et al., Gut stem cell necroptosis by genome instability triggers bowel inflammation. Nature 580, 386–390 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2127-x; pmid: 32296174

33. A. Nenci et al., Epithelial NEMO links innate immunity to chronic intestinal inflammation. Nature 446, 557–561 (2007). doi: 10.1038/nature05698; pmid: 17361131

34. R. Schwarzer, H. Jiao, L. Wachsmuth, A. Tresch, M. Pasparakis, FADD and caspase-8 regulate gut homeostasis and inflammation by controlling MLKL- and GSDMD-mediated death of intestinal epithelial cells. Immunity 52, 978–993.e6 (2020). doi: 10.1016/j.immuni.2020.04.002; pmid: 32362323

35. K. Weisel et al., A randomised, placebo-controlled study of RIPK1 inhibitor GSK2982772 in patients with active ulcerative colitis. BMJ Open Gastroenterol. 8, e000680 (2021). doi: 10.1136/bmjgast-2021-000680; pmid: 34389633

36. Sanofi, "Dose-finding study of SAR443122 in adult participants with ulcerative colitis (RESOLUTE)" (2022); https://clinicaltrials.gov/study/NCT05588843.

37. AbbVie, "Study of ABBV-668 oral capsules to assess adverse events and change in disease activity in adult participants with moderate to severe ulcerative colitis" (2023); https://clinicaltrials.gov/study/NCT05570006.

38. G. Talmon, T. Manasek, R. Miller, D. Muirhead, A. Lazenby, The apoptotic crypt abscess: An underappreciated histologic finding in gastrointestinal pathology. Am. J. Clin. Pathol. 148, 538–544 (2017). doi: 10.1093/ajcp/aqx100; pmid: 29140405

39. T. F. Bullen et al., Characterization of epithelial cell shedding from human small intestine. Lab. Invest. 86, 1052–1063 (2006). doi: 10.1038/labinvest.3700464; pmid: 16909128

40. M. J. D. Baars et al., Multiplex spatial omics reveals changes in immune-epithelial crosstalk during inflammation and dysplasia development in chronic IBD patients. iScience 27, 110550 (2024). doi: 10.1016/j.isci.2024.110550; pmid: 39165839

41. S. A. Hughes et al., Caspase-8-driven apoptotic and pyroptotic crosstalk causes cell death and IL-1β release in X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency. EMBO J. 42, e110468 (2023). doi: 10.15252/embj.2021110468; pmid: 36647737

42. Y. Shi, X. Cui, Y. Sun, Q. Zhao, T. Liu, Intestinal vitamin D receptor signaling ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis by suppressing necroptosis of intestinal epithelial cells. FASEB J. 34, 13494–13506 (2020). doi: 10.1096/fj.202000143RRR; pmid: 32779265

43. M. Zhou et al., ABIN3 negatively regulates necroptosis-induced intestinal inflammation through recruiting A20 and restricting the ubiquitination of RIPK3 in inflammatory bowel disease. J. Crohns Colitis 15, 99–114 (2021). doi: 10.1093/ecco-jcc/jjaa131; pmid: 32599618

44. S. Chiou et al., An immunohistochemical atlas of necroptotic pathway expression. EMBO Mol. Med. 16, 1717–1749 (2024). doi: 10.1038/s44321-024-00074-6; pmid: 38750308

45. D. Busingye, A. Pollack, K. Chidwick, Prevalence of inflammatory bowel disease in the Australian general practice population: A cross-sectional study. PLOS ONE 16, e0252458 (2021). doi: 10.1371/journal.pone.0252458; pmid: 34043730

46. J. M. Peloquin et al., Characterization of candidate genes in inflammatory bowel disease-associated risk loci. JCI Insight 1, e87899 (2016). doi: 10.1172/jci.insight.87899; pmid: 27668286

47. K. M. de Lange et al., Genome-wide association study implicates immune activation of multiple integrin genes in inflammatory bowel disease. Nat. Genet. 49, 256–261 (2017). doi: 10.1038/ng.3760; pmid: 28067908

48. H. M. Shulman et al., Histopathologic diagnosis of chronic graft-versus-host disease: National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: II. Pathology Working Group Report. Biol. Blood Marrow Transplant. 12, 31–47 (2006). doi: 10.1016/j.bbmt.2005.10.023; pmid: 16399567

49. C. R. Horne, A. L. Samson, J. M. Murphy, The web of death: The expanding complexity of necroptotic signaling. Trends Cell Biol. 33, 162–174 (2023). doi: 10.1016/j.tcb.2022.05.008; pmid: 35750616

50. L. Massimino et al., The Inflammatory Bowel Disease Transcriptome and Metatranscriptome Meta-Analysis (IBD TaMMA) framework. Nat. Comput. Sci. 1, 511–515 (2021). doi: 10.1038/s43588-021-00114-y; pmid: 38217242

51. K. Parikh et al., Colonic epithelial cell diversity in health and inflammatory bowel disease. Nature 567, 49–55 (2019). doi: 10.1038/s41586-019-0992-y; pmid: 30814735

52. J. Li et al., Identification and multimodal characterization of a specialized epithelial cell type associated with Crohn's disease. Nat. Commun. 15, 7204 (2024). doi: 10.1038/s41467-024-51580-7; pmid: 39169060

53. D. S. Simpson et al., Interferon- $\gamma$ primes macrophages for pathogen ligand-induced killing via a caspase-8 and mitochondrial cell death pathway. Immunity 55, 423–441.e9 (2022). doi: 10.1016/j.immuni.2022.01.003; pmid: 35139355

54. R. Karki et al., Synergism of TNF- $\alpha$ and IFN- $\gamma$ Triggers Inflammatory Cell Death, Tissue Damage, and Mortality in SARS-CoV-2 Infection and Cytokine Shock Syndromes. Cell 184, 149–168.e17 (2021). doi: 10.1016/j.cell.2020.11.025; pmid: 33278357

55. T. Krausgruber et al., Structural cells are key regulators of organ-specific immune responses. Nature 583, 296–302 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2424-4; pmid: 32612232

56. M. Uzzan et al., Ulcerative colitis is characterized by a plasmablast-skewed humoral response associated with disease activity. Nat. Med. 28, 766–779 (2022). doi: 10.1038/s41591-022-01680-y; pmid: 35190725

57. A. M. Newman et al., Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat. Methods 12, 453–457 (2015). doi: 10.1038/nmeth.3337; pmid: 25822800

58. J. Zhang et al., Epithelial Gasdermin D shapes the host-microbial interface by driving mucus layer formation. Sci. Immunol. 7, eabk2092 (2022). doi: 10.1126/sciimmunol.abk2092; pmid: 35119941

59. G. Brumatti et al., The caspase-8 inhibitor emricasan combines with the SMAC mimetic birinapant to induce necroptosis and treat acute myeloid leukemia. Sci. Transl. Med. 8, 339ra69 (2016). doi: 10.1126/scitranslmed.aad3099; pmid: 27194727

60. V. S. Marsden et al., Bcl-2-regulated apoptosis and cytochrome c release can occur independently of both caspase-2 and caspase-9. J. Cell Biol. 165, 775–780 (2004). doi: 10.1083/jcb.200312030; pmid: 15210727

61. P. G. Ekert et al., Apaf-1 and caspase-9 accelerate apoptosis, but do not determine whether factor-deprived or drug-treated cells die. J. Cell Biol. 165, 835–842 (2004). doi: 10.1083/jcb.200312031; pmid: 15210730

62. V. S. Marsden et al., Apoptosis initiated by Bcl-2-regulated caspase activation independently of the cytochrome c/Apaf-1/caspase-9 apoptosome. Nature 419, 634–637 (2002). doi: 10.1038/nature01101; pmid: 12374983

63. A. Kotschy et al., The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models. Nature 538, 477–482 (2016). doi: 10.1038/nature19830; pmid: 27760111

64. J. E. Vince et al., The mitochondrial apoptotic effectors BAX/BAK activate Caspase-3 and -7 to trigger NLRP3 inflammasome and Caspase-8 driven IL-1β activation. Cell Rep. 25, 2339–2353.e4 (2018). doi: 10.1016/j.celrep.2018.10.103; pmid: 30485804

65. A. Strasser, D. L. Vaux, Viewing BCL2 and cell death control from an evolutionary perspective. Cell Death Differ. 25, 13–20 (2017). doi: 10.1038/cdd.2017.145; pmid: 29099481

66. A. W. Roberts et al., Targeting BCL2 with venetoclax in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 374, 311–322 (2016). doi: 10.1056/NEJMoa1513257; pmid: 26639348

67. W. Qiu et al., PUMA-mediated intestinal epithelial apoptosis contributes to ulcerative colitis in humans and mice. J. Clin. Invest. 121, 1722–1732 (2011). doi: 10.1172/JCI42917; pmid: 21490394

68. B. A. Callus et al., Triggering of apoptosis by Puma is determined by the threshold set by prosurvival Bcl-2 family proteins. J. Mol. Biol. 384, 313–323 (2008). doi: 10.1016/j.jmb.2008.09.041; pmid: 18835564

69. E. A. Worthey et al., Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease. Genet. Med. 13, 255–262 (2011). doi: 10.1097/GIM.0b013e3182088158; pmid: 21173700

70. A. S. Lehle et al., Intestinal inflammation and dysregulated immunity in patients with inherited Caspase-8 deficiency. Gastroenterology 156, 275–278 (2019). doi: 10.1053/j.gastro.2018.09.041; pmid: 30267714

71. D. Cuchet-Lourenço et al., Biallelic RIPK1 mutations in humans cause severe immunodeficiency, arthritis, and intestinal inflammation. Science 361, 810–813 (2018). doi: 10.1126/science.aar2641; pmid: 30026316

72. Y. Li et al., Human RIPK1 deficiency causes combined immunodeficiency and inflammatory bowel diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 116, 970–975 (2019). doi: 10.1073/pnas.1813582116; pmid: 30591564

73. W. D. Cook et al., RIPK1- and RIPK3-induced cell death mode is determined by target availability. Cell Death Differ. 21, 1600–1612 (2014). doi: 10.1038/cdd.2014.70; pmid: 24902899

74. X. Li et al., RIP1-dependent linear and nonlinear recruitments of caspase-8 and RIP3 respectively to necrosome specify distinct cell death outcomes. Protein Cell 12, 858–876 (2021). doi: 10.1007/s13238-020-00810-x; pmid: 33389663

75. S. Olafsson et al., Somatic Evolution in Non-neoplastic IBD-Affected Colon. Cell 182, 672–684.e11 (2020). doi: 10.1016/j.cell.2020.06.036; pmid: 32697969

76. K. Nanki et al., Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature 577, 254–259 (2020). doi: 10.1038/s41586-019-1844-5; pmid: 31853059

77. S. Alvarez-Diaz et al., Necroptosis is dispensable for the development of inflammation-associated or sporadic colon cancer in mice. Cell Death Differ. 28, 1466–1476 (2021). doi: 10.1038/s41418-020-00673-z; pmid: 33230260

78. D. Turner et al., STRIDE-II: An update on the Selecting Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease (STRIDE) initiative of the International Organization for the Study of IBD (IOIBD): Determining therapeutic goals for treat-to-target strategies in IBD. Gastroenterology 160, 1570–1583 (2021). doi: 10.1053/j.gastro.2020.12.031; pmid: 33359090

79. E. J. Petrie et al., Viral MLKL homologs subvert necroptotic cell death by sequestering cellular RIPK3. Cell Rep. 28, 3309–3319.e5 (2019). doi: 10.1016/j.celrep.2019.08.055; pmid: 31553902

80. G. Dewson et al., Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell 36, 696–703 (2009). doi: 10.1016/j.molcel.2009.11.008; pmid: 19941828

81. R. F. Harvey, J. M. Bradshaw, A simple index of Crohn's-disease activity. Lancet 1, 514 (1980). doi: 10.1016/S0140-6736(80)92767-1; pmid: 6102236

82. R. S. Walmsley, R. C. Ayres, R. E. Pounder, R. N. Allan, A simple clinical colitis activity index. Gut 43, 29–32 (1998). doi: 10.1136/gut.43.1.29; pmid: 9771402

83. M. Daperno et al., Development and validation of a new, simplified endoscopic activity score for Crohn's disease: The SES-CD. Gastrointest. Endosc. 60, 505–512 (2004). doi: 10.1016/S0016-5107(04)01878-4; pmid: 15472670

84. K. W. Schroeder, W. J. Tremaine, D. M. Ilstrup, Coated oral 5-aminosalicylic acid therapy for mildly to moderately active ulcerative colitis. A randomized study. N. Engl. J. Med. 317, 1625–1629 (1987). doi: 10.1056/NEJM198712243172603; pmid: 3317057

85. T. Kucharzik et al., ECCO-ESGAR-ESP-IBUS Guideline on Diagnostics and Monitoring of Patients with Inflammatory Bowel Disease: Part 1: Initial diagnosis, monitoring of known inflammatory bowel disease, detection of complications. J. Crohns Colitis 19, jjaf106 (2025). doi: 10.1093/ecco-jcc/jjaf106; pmid: 40741688

86. Y. Hirokawa et al., Low-viscosity matrix suspension culture enables scalable analysis of patient-derived organoids and tumoroids from the large intestine. Commun. Biol. 4, 1067 (2021). doi: 10.1038/s42003-021-02607-y; pmid: 34518628

87. A. V. Jacobsen et al., The Lck inhibitor, AMG-47a, blocks necroptosis and implicates RIPK1 in signalling downstream of MLKL. Cell Death Dis. 13, 291 (2022). doi: 10.1038/s41419-022-04740-w; pmid: 35365636

88. E. J. Petrie et al., Conformational switching of the pseudokinase domain promotes human MLKL tetramerization and cell death by necroptosis. Nat. Commun. 9, 2422 (2018). doi: 10.1038/s41467-018-04714-7; pmid: 29930286

89. M. C. Tanzer et al., Combination of IAP antagonist and IFN $\gamma$ activates novel caspase-10- and RIPK1-dependent cell death pathways. Cell Death Differ. 24, 481–491 (2017). doi: 10.1038/cdd.2016.147; pmid: 28106882

90. C. M. Lee, S. Tripathi, E. T. Morgan, Nitric oxide-regulated proteolysis of human CYP2B6 via the ubiquitin-proteasome system. Free Radic. Biol. Med. 108, 478–486 (2017). doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2017.04.015; pmid: 28427998

91. C. Bossen et al., Interactions of tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor family members in the mouse and human. J. Biol. Chem. 281, 13964–13971 (2006). doi: 10.1074/jbc.M601553200; pmid: 16547002

92. A. Huber, C. Dijkstra, M. Ernst, M. F. Eissmann, Generation of gene-of-interest knockouts in murine organoids using CRISPR-Cas9. STAR Protoc. 4, 102076 (2023). doi: 10.1016/j.xpro.2023.102076; pmid: 36853714

93. N. E. Sanjana, O. Shalem, F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods 11, 783–784 (2014). doi: 10.1038/nmeth.3047; pmid: 25075903

94. P. J. Baker, S. L. Masters, "Generation of genetic knockouts in myeloid cell lines using a lentiviral CRISPR/Cas9 system" in Innate Immune Activation: Methods and Protocols, D. De Nardo, C. M. De Nardo, Eds. (Springer, 2018), pp. 41–55.

95. P. Bankhead et al., QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci. Rep. 7, 16878 (2017). doi: 10.1038/s41598-017-17204-5; pmid: 29203879

96. C. A. Schneider, W. S. Rasband, K. W. Eliceiri, NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods 9, 671–675 (2012). doi: 10.1038/nmeth.2089; pmid: 22930834

97. M. H. Mosli et al., Development and validation of a histological index for UC. Gut 66, 50–58 (2017). doi: 10.1136/gutjnl-2015-310393; pmid: 26475633

98. J. Pang, H. Chang, L. Whitehead, J. E. Vince, "Real-time tracking of cell death in human intestinal organoids: A quantitative imaging approach" in Methods in Cell Biology (Academic, 2026); https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2026.05.004.

99. D. Legland, I. Arganda-Carreras, P. Andrey, MorphoLibJ: Integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics 32, 3532–3534 (2016). doi: 10.1093/bioinformatics/btw413; pmid: 27412086

100. K. J. Livak, T. D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the $2(-\Delta \Delta C(T))$ method. Methods 25, 402–408 (2001). doi: 10.1006/meth.2001.1262; pmid: 11846609

101. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10 (2011). doi: 10.14806/ej.17.1.200

102. D. Kim, J. M. Paggi, C. Park, C. Bennett, S. L. Salzberg, Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat. Biotechnol. 37, 907–915 (2019). doi: 10.1038/s41587-019-0201-4; pmid: 31375807

103. Y. Liao, G. K. Smyth, W. Shi, featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923–930 (2014). doi: 10.1093/bioinformatics/btt656; pmid: 24227677

104. Y. Liao, G. K. Smyth, W. Shi, The R package Rsubread is easier, faster, cheaper and better for alignment and quantification of RNA sequencing reads. Nucleic Acids Res. 47, e47 (2019). doi: 10.1093/nar/gkz114; pmid: 30783653

105. C. W. Law, Y. Chen, W. Shi, G. K. Smyth, voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biol. 15, R29 (2014). doi: 10.1186/gb-2014-15-2-r29; pmid: 24485249

106. M. D. Robinson, A. Oshlack, A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biol. 11, R25 (2010). doi: 10.1186/gb-2010-11-3-r25; pmid: 20196867

107. Y. Benjamini, Y. Hochberg, Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. J. R. Stat. Soc. Series B Stat. Methodol. 57, 289–300 (1995). doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x

108. A. Subramanian et al., Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15545–15550 (2005). doi: 10.1073/pnas.0506580102; pmid: 16199517

109. A. Liberzon et al., The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 1, 417–425 (2015). doi: 10.1016/j.cels.2015.12.004; pmid: 26771021

110. M. Maechler, P. Rousseeuw, A. Struyf, M. Hubert, H. Hornik, "Title" (R package version 2.1.6, 2023); https://cran.r-project.org/web/packages/cluster/index.html.

111. A. B. Keenan et al., ChEA3: Transcription factor enrichment analysis by orthogonal omics integration. Nucleic Acids Res. 47, W212–W224 (2019). doi: 10.1093/nar/gkz446; pmid: 31114921

112. T. Hulsen, DeepVenn -- a web application for the creation of area-proportional Venn diagrams using the deep learning framework Tensorflow.js. arXiv:2210.04597 [cs.HC] (2022).

113. A. M. Newman et al., Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat. Biotechnol. 37, 773–782 (2019). doi: 10.1038/s41587-019-0114-2; pmid: 31061481

114. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10–12 (2011). doi: 10.14806/ej.17.1.200

115. S. Andrews, "FastQC" (2010); https://github.com/s-andrews/FastQC.

116. A. Dobin et al., STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15–21 (2013). doi: 10.1093/bioinformatics/bts635; pmid: 23104886

117. J. Chen, A. Mohamed, D. D. Bhuva, M. J. Davis, C. W. Tan, mastR: Marker Automated Screening Tool for multi-omics data. bioRxiv 590691 [Preprint] (2024); https://doi.org/10.1101/2024.04.24.590691.

118. M. D. Robinson, D. J. McCarthy, G. K. Smyth, edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139–140 (2010). doi: 10.1093/bioinformatics/btp616; pmid: 19910308

119. M. E. Ritchie et al., limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, e47 (2015). doi: 10.1093/nar/gkv007; pmid: 25605792

120. M. Foroutan et al., Single sample scoring of molecular phenotypes. BMC Bioinformatics 19, 404 (2018). doi: 10.1186/s12859-018-2435-4; pmid: 30400809

121. L. H. McInnes, J. Healy, "Accelerated hierarchical density based clustering" in IEEE International Conference on Data Mining Workshops (ICDMW), New Orleans, LA, USA, (IEEE, 2017); pp. 33–42; https://doi.org/10.1109/ICDMW.2017.12.

122. D. J. McCarthy, K. R. Campbell, A. T. L. Lun, Q. F. Wills, Scater: Pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics 33, 1179–1186 (2017). doi: 10.1093/bioinformatics/btw777; pmid: 28088763

123. S. Aibar et al., SCENIC: Single-cell regulatory network inference and clustering. Nat. Methods 14, 1083–1086 (2017). doi: 10.1038/nmeth.4463; pmid: 28991892

124. L. Jostins et al., Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature 491, 119–124 (2012). doi: 10.1038/nature11582; pmid: 23128233

125. R. Elmentaite et al., Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature 597, 250–255 (2021). doi: 10.1038/s41586-021-03852-1; pmid: 34497389

126. D. C. Jones et al., Cell simulation as cell segmentation. Nat. Methods 22, 1331–1342 (2025). doi: 10.1038/s41592-025-02697-0; pmid: 40404994

127. F. A. Wolf, P. Angerer, F. J. Theis, SCANPY: Large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15 (2018). doi: 10.1186/s13059-017-1382-0; pmid: 29409532

128. Y. Chen, L. Chen, A. T. L. Lun, P. L. Baldoni, G. K. Smyth, edgeR v4: Powerful differential analysis of sequencing data with expanded functionality and improved support for small counts and larger datasets. Nucleic Acids Res. 53, gkaf018 (2025). doi: 10.1093/nar/gkaf018; pmid: 39844453

129. K. Street et al., Slingshot: Cell lineage and pseudotime inference for single-cell transcriptomics. BMC Genomics 19, 477 (2018). doi: 10.1186/s12864-018-4772-0; pmid: 29914354

130. Y. Si et al., FICTURE: Scalable segmentation-free analysis of submicron-resolution spatial transcriptomics. Nat. Methods 21, 1843–1854 (2024). doi: 10.1038/s41592-024-02415-2; pmid: 39266749

131. P. A. Harris et al., Research electronic data capture (REDCap)—A metadata-driven methodology and workflow process for providing translational research informatics support. J. Biomed. Inform. 42, 377–381 (2009). doi: 10.1016/j.jbi.2008.08.010; pmid: 18929686

132. P. A. Harris et al., The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. J. Biomed. Inform. 95, 103208 (2019). doi: 10.1016/j.jbi.2019.103208; pmid: 31078660

133. Data for: J. Pang et al., A necroptotic-to-apoptotic signaling axis underlies inflammatory bowel disease, Dryad (2026); https://doi.org/10.5061/dryad.wm37pvn39.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Royal Melbourne Hospital Endoscopy Unit (3W) and anaesthetics staff, A. Trinh, E. Zhang, J. Winston, S. Sood, A. Mack, P. Tagkalidis, and P. Prichard for their assistance with endoscopic biopsy retrieval; patients for donating their tissues for this study; S. Hughes for assistance with the immunoblotting of patient samples; A. Hempel (WEHI), B. Rosengarten (Crohn's & Colitis Australia), and I. Wicks (WEHI) for constructive feedback of this work; the WEHI Monoclonal antibody facility staff for producing several antibodies used in this study; and the WEHI Histology team for high-level support with immunohistochemistry. We acknowledge the use of BioRender.com in the preparation of some figures. Funding: This work was supported by the Kenneth Rainin Foundation (Innovator Grants to J.M.M., A.L.S., B.C., and A.H.A.); the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC grants 1172929 and 2034104 to J.M.M., grant 2008692 to J.E.V., grants 2002965 and 2048925 to A.L.S., and grant 2008652 to E.D.H.); the Australian Research Council (ARC Future Fellowship FT190100266 to K.E.L.); the Stafford Fox Medical Research Foundation (OMS); operational infrastructure grants through the NHMRC Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme; and the Victorian State Government Operational Infrastructure Support. We gratefully acknowledge support from the Colonial Foundation. J.M.M. has received research funding from Anaxis Pharma Pty. Ltd. Scholarship support was provided to A.H.A. (Australian Commonwealth Government Research Training Program University of Melbourne Scholarship, Crohn's and Colitis Australia IBD PhD Scholarship, Avant Doctors in Training Scholarship, Gastroenterological Society of Australia Celltrion IBD

Fellowship); J.P. (University of Melbourne PhD Scholarship); W.C. (Australian Government Research Training Program Stipend Scholarship, Chism Indigenous PhD Top-up Scholarship, Ormond College Indigenous Scholarship, Ormond College Peter Callow Memorial Scholarship, University of Melbourne MDHS Indigenous Research Training Support Scheme, University of Melbourne Indigenous Accommodation Grant, WEHI PhD Top-up Scholarship); A.J. (NHMRC Dora Lush PhD Scholarship; WEHI ARCS Scholarship); and S.C. (WEHI InSPIRE internship program). Y.C. was supported by a donation from the estate of the late Judith C. Philpots. H.W. is funded by the Alexander von Humboldt Foundation, a Wellcome Trust Investigator Award (214342/Z/18/Z), a Medical Research Council Grant (MR/S00811X/1), a Cancer Research UK Programme Grant (A27323) and three collaborative research center grants (SFB1399, Project C06, SFB1530-455784452, Project A03 and SFB1403-414786233) funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) and CANcer TARgetting (CANTAR) funded by Netzwerke 2021. G.L. is funded by the Center for Biochemistry, Köln Fortune, CANcer TARgetting (CANTAR) funded by Netzwerke 2021, two collaborative research center grants (SFB1399, Project C06, SFB1530-455784452, Project A03 funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). and is associated with the collaborative SFB1403 also funded by the DFG. Author contributions: Conceptualization: J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P., E.D.H.; Methodology: J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P., Y.C., E.D.H.; Investigation: A.H.A., J.P., K.M.P., Y.Zho., S.N.Y., I.K., M.B., J.A.R., W.C., A.V.J., A.J., C.R.H., S.C., X.M., F.S., S.B.K., W.L., S.S., A.L.S., Y.Z., Y.C., R.Y., E.T., L.M.; Analysis: A.H.A., J.P., I.K., S.F., J.C., A.W., L.W.W., P.R., I.A., T.S., A.L.S., R.L., Y.Zho., Y.C.; Resources: A.H.A., S.S., A.M., A.P., N.S., G.I., T.T., D.S., A.E., W.B., F.Mc., B.C., G.L., H.W., O.M.S., M.C., A.L.S.; Supervision: Y.C., Y.Zha., O.S., L.G.R., E.D.H., K.L.R., R.B., S.E.N., K.E.L., B.C., A.L.S., J.E.V., J.M.M.; Writing – original draft: J.M.M., A.L.S., A.H.A., B.C., J.E.V., J.P.; Writing – review & editing: all authors. Competing interests: K.M.P., S.N.Y., A.V.J., C.R.H., K.E.L., A.L.S., and J.M.M. contribute to, or have contributed to, a project developing necroptosis pathway inhibitors in collaboration with Anaxis Pharma Pty. Ltd. A.T.E.

is also affiliated with the Department of Gastroenterology, Royal Hobart Hospital, Hobart, Australia. The remaining authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: All data supporting the findings of this study are included in the main manuscript or the supplementary materials. All raw immunoblot data are available online (133). Transcriptomic data are available from the Gene Expression Ontology repository under accession numbers: GSE330696 (bulk RNA sequencing of organoids treated with IFNγ and/or TNF); GSE331309 (bulk RNA sequencing of BCL2-overexpressing organoids treated with IFNγ and TNF, and also inhibitors of RIPK1, RIPK3, and MLKL); GSE282165 (bulk RNA sequencing of intestinal biopsies from patients with or without IBD); and GSE330953 (Xenium spatial transcriptomics of intestinal biopsies from patients with or without IBD). Reagents generated in this study are available upon request to the corresponding authors. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse. This research was funded in whole or in part by the National Health and Medical Research Council of Australia (grants 1172929, 2034101, 2008692, 2002965, 2048925, and 2008652), a cOAlition S organization. The author will make the Author Accepted Manuscript (AAM) version available under a CC BY public copyright license.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aeh7112 Figs. S1 to S12; Table S1; Movie S1; MDAR Reproducibility Checklist

Submitted 13 November 2024; resubmitted 1 April 2026; accepted 23 June 2026 10.1126/science.aeh7112

Hierarchical sensory processing in zebrafish thalamocortical-like circuits

Anh-Tuan Trinh*, Anna Maria Ostenrath, Ignacio del Castillo-Berges, Fanchon Cachin, Mina Koç, Susanne Kraus, Bram Serneels, Koichi Kawakami, Emre Yaksi*

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aec2171

INTRODUCTION: The mammalian cortex relies on distributed processing of information, supporting parallel and specialized computations ranging from sensory representations to multimodal integration and diverse cognitive operations. Thalamocortical projections are essential for shaping computational specializations across the cortex. Comparative evidence from birds, reptiles, amphibians, and fish indicates that the vertebrate pallium, the evolutionary ancestor of the mammalian cortex, is topographically organized into molecularly distinct nuclei. However, the parallelization and specialization of sensory computations across the thalamocortical circuits of nonmammalian vertebrates remain poorly understood.

RATIONALE: How the nonmammalian vertebrate pallium processes sensory information and whether convergent or divergent organizational principles apply across vertebrates remain open questions. This is particularly intriguing in teleost fish, where the pallium receives little or no input from first-order thalamofugal pathways (the primary sensory inputs of the mammalian cortex). Instead, a parallel tectofugal pathway through the preglomerular complex (PG) serves as the main sensory input. This raises two fundamental questions: How does the teleost pallium perform sensory computations without thalamofugal pathways, and how are these sensory circuits organized in teleost? In this work, we investigated how the zebrafish analog of thalamocortical circuits encodes and integrates sensory information.

RESULTS: We found that the PG is the primary hub relaying sensory-selective inputs from the midbrain and diencephalon to the zebrafish pallium. PG neurons are heterogeneous and organized into partially overlapping yet spatially segregated functional clusters specifically responding to visual and vibrational stimuli. These sensory-specific signals are preserved in the topographically organized PG axons projecting to the pallium. PG stimulation differentially recruits spatially distinct pallial regions. By contrast, the pallium exhibits reduced sensory selectivity and increased multimodal integration. Although some pallial neurons responded exclusively to light or vibration in the lateral or medial pallium, a substantial fraction responded to both. We also identified a class of “integrative neurons” in the anterior-central pallium that responded only when visual and vibrational stimuli were presented simultaneously. These neurons exhibit nonlinear (superadditive) responses, indicating higher-order computations rather than simple summation. Overall, sensory computations become progressively more complex along the posterior-to-anterior pallial axis.

CONCLUSION: We have provided key insights into the architecture and function of thalamocortical-like circuits in the teleost forebrain, laying the foundation for understanding how the nonmammalian vertebrate pallium receives and processes sensory information. Unlike mammalian primary sensory cortices,

Sensory processing across thalamocortical-like circuits in the zebrafish brain. Anatomical tracing and in vivo calcium imaging show that zebrafish PG neurons encode visual and vibrational stimuli in partially overlapping but spatially segregated clusters and project to topographically distinct pallial regions. Pallial responses exhibit decreasing sensory selectivity and increasing multimodal and nonlinear integration along the posterior-to-anterior axis.

dominated by thalamofugal inputs, the zebrafish pallium mainly receives sensory information through the tectofugal PG pathway. Anatomically, the zebrafish PG resembles the input-output organization of the avian and reptilian nucleus rotundus and the mammalian higher-order thalamus. Thus, the teleost pallium receives sensory information in a way different from that of the mammalian primary sensory cortices. Nevertheless, the regional specialization and hierarchical sensory computations in the zebrafish pallium resemble those of the avian pallium, which is organized into specialized nuclei. Despite differences from mammalian thalamocortical systems, zebrafish thalamocortical-like circuits converge on broad principles of increasingly complex sensory processing, including multisensory integration and nonlinear coincidence detection distributed across specialized pallial nuclei. These results suggest that hierarchical and regionally specialized parallel processing is a convergent feature of the vertebrate pallium, despite divergent input architectures across evolution.

NEUROSCIENCE

Hierarchical sensory processing in zebrafish thalamocortical-like circuits

Anh-Tuan Trinh $^{1}$ , Anna Maria Ostenrath $^{1}$ , Ignacio del Castillo-Berges $^{1}$ , Fanchon Cachin $^{1}$ , Mina Koç $^{2}$ , Susanne Kraus $^{1}$ , Bram Serneels $^{1}$ , Koichi Kawakami $^{3,4}$ , Emre Yaksi $^{1,5}$

Thalamocortical projections shape the functional regionalization and parallel sensory computations across the mammalian cortex. However, the principles of thalamocortical computations in nonmammalian vertebrates remain underexplored. In this work, we investigated how the zebrafish pallium, a homolog of the vertebrate cortex, receives and processes sensory information and how its architecture compares to thalamocortical circuits in other vertebrates. We revealed that the preglomerular complex (PG), a thalamocortical-like pathway, is the primary source of visual and vibrational information to the zebrafish pallium. PG and its pallial projections exhibit sensory-specific and topographically organized responses. By contrast, pallial neurons display topographically organized hierarchies, ranging from sensory-specific to multimodal and coincidence-detecting nonlinear responses. Our results suggest that hierarchies of sensory transformations across topographically organized thalamocortical-like circuits reflect a convergent principle across vertebrates.

The mammalian cortex exhibits spatially distributed computational specializations and hierarchies (1-4). These cortical hierarchies enable parallel neural computations ranging from sensory encoding (5, 6) to the integration of multiple information streams (1, 4, 7). They often utilize diverse coding strategies (8, 9) that give rise to cognitive function (8, 10). Molecular, anatomical, and physiological evidence from birds (11-14), reptiles (15-17), amphibians (18), and fish (19-23) (24) suggests that the vertebrate pallium, homolog of the mammalian cortex, exhibits multiple topographically organized specializations and hierarchies. Revealing convergent or divergent principles of how the vertebrate pallium receives and transforms information, remains a major experimental challenge.

Thalamocortical projections are essential for shaping cortical organization and specialization (3, 4, 25). Primary sensory cortices receive spatially organized inputs from first-order thalamic nuclei dedicated to specific modalities (5, 6). For example, the first-order visual thalamus, the lateral geniculate nucleus (LGN), receives direct retinal inputs and relays it to the primary visual cortex (V1), encoding orientation, direction, and spatial location (6, 26), whereas higher-order and associative cortices integrate multiple modalities through corticothalamic loops mediated by the high-order thalamus (2, 3, 25). For example, the pulvinar, a high-order thalamic nucleus receives information primarily from the superior colliculus (SC), visual, and high-order cortices (6, 27), and relays information to higher visual, motor, and frontal cortices involved in object recognition, spatial attention, and guiding movements (27, 28). Hence, the first- and high-order thalamic projections to the mammalian cortex represent parallel pathways with complementary functions. These parallel pathways are present in reptiles (29, 30) and birds (26, 30–33) and are involved in visual motion, perception, and spatial processing (15, 32, 34).

The teleost fish pallium located in the dorsal telencephalon, is composed of spatially organized, molecularly $(19, 35, 36)$ and functionally $(37–42)$ distinct regions. Ablating distinct teleost pallial regions resulted in impaired adaptive behaviors and learning $(37, 40)$ . The teleost thalamus proper (Th; developmentally comparable to the first-order thalamus) sends weak projections to the pallium $(43, 44)$ . Yet, a parallel teleost sensory relay hub, the preglomerular complex (PG) receives tectal innervations and projects to the pallium $(21, 44–48)$ . Despite the PG's central role as an important relay of sensory information to the teleost pallium, how sensory information is encoded in the PG and subsequently transformed and integrated in the pallium remains unknown.

In this work, we investigated how the zebrafish pallium receives and processes sensory information and how its architecture compares to thalamocortical circuits in other vertebrates.

Results

The PG is the primary source of diencephalic inputs to the zebrafish pallium

We asked how the zebrafish pallium receives sensory information. We used 21- to 28-day-old optically accessible juvenile zebrafish. Juvenile zebrafish can perform cognitively demanding behaviors, such as learning (49), social interactions (50), and adaptive behaviors (41, 51). To visualize the PG inputs and outputs, we iontophoretically injected TMR-dextran, a red fluorescent tracer (52, 53), into the juvenile zebrafish PG in whole-brain explants (Fig. 1, A and B). Anterogradely labeled PG axons were visible in the pallium of 10- and 21-day-old animals (Fig. 1B and fig. S1, A to C) and in electron microscopy (EM) (54) reconstructions of 7-day-old zebrafish (fig. S1, F to H, and movie S1). PG axons were only present in the ipsilateral hemisphere, predominantly innervating the dorsal medial (Dm), dorsal central (Dc), and dorsal lateral (Dl) telencephalon (Fig. 1, B and C). The same PG injections also revealed retrogradely labeled PG-innervating neurons in the ipsilateral diencephalic (Hyp, Th, PO, TLa) and mesencephalic (OT, SGN, TS) nuclei (Fig. 1, B and D, and fig. S2, A to E) as well as pallial Dm neurons projecting back to PG (Fig. 1C and fig. S2F). Dm to PG projections were also visible in EM reconstructions of 7-day-old zebrafish (fig. S1I).

Cortical projecting neurons of the mammalian thalamus are glutamatergic-labeled (6, 55). Yet, $\gamma$ -aminobutyric acid-releasing (GABAergic) thalamic interneurons and reticular neurons do not project to the cortex. The zebrafish PG is composed of both glutamatergic-labeled $[N = 6$ PG: $80.34 \pm 1.37\%$ Tg(vglut2a:DsRed) (56)] and GABAergic-labeled $[19.66 \pm 1.37\%$ , Tg(gad1b:GFP) (57)] neurons (Fig. 1E and fig. S2, G and H). Pallial injections of dextran-coupled fluorescent dyes revealed that none of the retrogradely labeled pallium-projecting PG neurons were colabeled with gad1b (green; Fig. 1, F to H), whereas around $90\%$ of them were colabeled with vglut2a (fig. S3). These experiments also revealed that PG is the primary input region of the zebrafish pallium, with only a small fraction ( $\sim 13\%$ ) of retrogradely labeled pallial-projecting neurons located in the zebrafish Th (Fig. 1, I and J, and fig. S4A). Spatially restricted pallial injections of TMR-dextran revealed that lateral PG neurons are retrogradely labeled upon Dl injections (fig. S4, B and D) and that medial PG neurons are labeled upon Dm injections (fig. S4, C and E). Lastly, retrograde labeling of PG neurons upon pallial injections was visible even in 5-day-old zebrafish larvae (fig. S1, D and E). Altogether, our results suggest that PG is the primary glutamatergic hub relaying diencephalic and mesencephalic information to distinct zebrafish pallial regions through anatomically segregated PG subregions.

Fig. 1. The PG is the major source of diencephalic inputs to the zebrafish pallium. (A) Example brightfield image of a dissected juvenile fish brain explant taken from the ventral side. Red stars mark the anatomically distinct lobes of the PG. (B) Example neurotracer (TMR-Dextran) injection in the PG of a juvenile fish brain explant. The red star marks the injection site. The white dashed line marks the outline of the brain. (C) Summary scheme of the observed extrinsic connectivity between the PG and the zebrafish dorsal telencephalon or pallium (N = 14 fish). (D) Summary scheme of the observed connectivity between the PG and diencephalic and mesencephalic structures (N = 14 fish). (E) Fluorescent image of a dissected juvenile zebrafish brain explant of the Tg(vglut2a:DsRed;gad1b:GFP) fishline; vglut2a neurons are in magenta, and gad1b neurons are in green. The white dashed line highlights the location of the PG. (F and G) Example neurotracer (TMR-dextran, in magenta) injection in the pallium of a juvenile Tg(gad1b:GFP) zebrafish (N = 8 fish). The dorsal plane is shown in (F), whereas the ventral plane is shown in (G). (H) Magnified view of the ipsilateral PG [in (G)] following the neurotracer injection in the pallium in (F) (left, merged imaged; center, green channel only; right, red channel only). (I) Number of retrogradely labeled neurons within the PG and Th following neurotracer injections in the pallium (N = 8 fish, **P < 0.01, Wilcoxon signed-rank test). (J) Pie chart illustrating the mean fraction of labeled neurons within the PG and thalamus proper following pallial neurotracer injections (N = 8 fish). PO, preoptic area; Hyp, hypothalamus; TLa, lateral torus; SGN, secondary gustatory nucleus; A, anterior; M, medial; L, lateral; P, posterior.

The zebrafish PG is composed of functionally heterogeneous neurons

Different mammalian thalamic subnuclei exhibit variable spontaneous ongoing activity (58, 59). We characterized the spatiotemporal features of ongoing PG activity in vivo using two-photon calcium imaging in head-restrained Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) (60) juvenile zebrafish at 10 to 14 days postfertilization (dpf) (Fig. 2A). We observed that ensembles of PG neurons with similar spontaneous calcium dynamics can optimally (fig. S5, A and B) be grouped into 6 k-means clusters (38, 41, 51, 61) (Fig. 2B). PG functional clusters/ensembles were organized into spatially segregated but partially overlapping PG zones (Fig. 2C and movie S2). Using a linear support vector machine decoder, we found that PG coordinates along the medial-lateral axis contributed substantially to this topography (fig. S5C). We also observed that nearby pairs of PG neurons exhibited higher correlations of spontaneous activity (38, 39, 41, 51, 61, 62) when compared with pairs of distant neurons (Fig. 2D and fig. S5D). Pairs of PG neurons also remained in the same cluster above chance levels (Fig. 2E), during two consecutive 4-min periods, a measure that we termed “cluster fidelity” (38, 39, 41, 51, 61). Lastly, we observed that correlations between PG neuron pairs remained stable during these consecutive periods (Fig. 2F). Our results demonstrate that the zebrafish PG is composed of functionally heterogeneous and topographically organized subnuclei.

The PG exhibits selective and topographically organized responses to different sensory modalities

In amniotes, the thalamus is divided into distinct first-order subnuclei that encode information from distinct sensory modalities (1, 5, 6, 55).

To investigate PG sensory computations, we measured its responses to red light flashes and mechanical vibrations. Ten-day-old $Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)$ (60) zebrafish allowed in vivo imaging of deeply located PG by expressing a fluorescent calcium indicator pan-neuronally. We observed that a fraction of PG neurons was excited by light or vibrations (Fig. 2G, left and right, respectively), whereas others were inhibited (Fig. 2, H and I, blue). Next, we asked whether PG neurons were selective for individual sensory modalities or were multisensory, specifically responding to both light and vibrations. We observed that a significantly larger fraction (light-exclusive, $11.6 \pm 1.4\%$ ; vibration-exclusive, $10.5 \pm 2.0\%$ ; multisensory, $3.3 \pm 0.6\%$ ) of PG neurons exclusively responded to one sensory modality compared with those that were multisensory (Fig. 2, J and K; light-exclusive versus multisensory, $P = 1.82 \times 10^{-4}$ ; vibration-exclusive versus multisensory, $P = 1.0 \times 10^{-3}$ ; Wilcoxon rank sum test; fig. S5E), highlighting the sensory selective nature of most PG neurons.

Furthermore, we asked whether subregions of PG exhibit topographically organized sensory responses. We observed higher response correlations between nearby PG neurons (Fig. 2, L and M) compared with chance levels. The spatial distribution of the sensory responding PG neurons was also more focal than chance (fig. S5F). Next, we compared spatial distributions of PG sensory responses across all spatially aligned animals. The two-dimensional (2D) spatial histograms of the PG responses appeared partially overlapping for both light and vibration responses (Fig. 2N, top). However, comparing these histograms revealed that the posterior-lateral PG neurons had a higher preference for light (orange), whereas the anterior-medial PG neurons preferred

D

A

E
F

L

H

K

|

Fig. 2. PG neurons form topographically organized functional ensembles and exhibit sensory selective responses. (A) Example two-photon microscopy image of a Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) zebrafish in vivo. White dashed lines mark the PG. (B) Example in vivo spontaneous ongoing PG activity clustered using k-means. Warm colors represent increased neural activity. (C) 3D reconstruction of PG neurons in the same example fish. The neurons are color-coded by the cluster identity, marked in (B). A, anterior; M, medial; L, lateral; P, posterior; D, dorsal. (D) Pairwise correlations of the PG neurons' spontaneous ongoing activity as a function of the distance between neuron pairs. The gray dashed line represents pairwise correlations when the distances are shuffled. The shaded region denotes the SEM ( $N = 11$ fish). (E) Cluster fidelity of the PG neurons during two consecutive spontaneous activity periods compared with a shuffled distribution of the cluster identities. (F) Pairwise Pearson's correlations ( $r^2$ ) of PG neuron pairs during two consecutive periods of spontaneous activity. Only significant correlations ( $P < 0.05$ ) are plotted. The probability density of pairwise correlations in the scatter plot is represented with a color gradient. The gray dots represent the pairwise correlations obtained from a shuffled distribution. The correlation coefficients for the shuffled (gray, $r^2 = 0.0003$ ) and observed data (black, $r^2 = 0.543$ ) were obtained following a linear fit represented by the black dashed line. The error bars denote the SEM ( $N = 11$ fish, *** $P < 0.001$ , paired Wilcoxon signed-rank test). (G and H) Overlaid 2D reconstruction of excited [neurons with increased calcium signals in red, (G)] and inhibited [neurons with decreased calcium signals in blue, (H)] PG neurons from all fish in response to light (left) and vibration (right) stimulation in vivo. The color gradient represents the spatial probability density of the

responding PG neurons. Nonresponding PG neurons are in dark gray, whereas neurons outside of PG are in light gray. (I) Time courses of the PG neurons' calcium signals in response to light (left) and vibrations (right). Warm colors indicate increased neural activity; cold colors indicate decreased activity. Mean calcium signals are shown at the bottom of each heatmap, shades indicate the SEM ( $N = 11$ fish). (J) Mean responses of all individual PG neurons upon light and vibration stimulation. The probability density of excited PG neurons upon light or vibration stimulation is color coded. Nonexcited neurons are shown as gray dots. (K) The fraction of responding PG neurons excited (red) and inhibited (blue) by either light or vibration (exclusive) or by both stimuli (multisensory) in individual fish (black open circles). (L and M) The pairwise correlation of the PG neurons' responses to light (L) and vibration (M) stimulation as a function of the distance between neuron pairs. The gray dashed line represents the pairwise correlations when the distances are shuffled. The shaded region denotes the SEM. ( $N = 11$ fish). (N) (Top) The locations of all light- (left) and vibration-excited (right) PG neurons from all fish are spatially aligned and overlayed in a 2D histogram. Warmer colors denote higher neuron counts per bin. (Bottom) The difference between the two 2D histograms is shown at the bottom left, whereas the $P$ values of each spatial bins are shown on the bottom right. Nonsignificant bins are represented on a grayscale, whereas significant spatial bins are shown in color. Warm colors indicate a spatial preference for the light stimulus, whereas cool colors denote a preference for the vibration stimulus ( $N = 11$ fish). The dashed line marks the anatomical boundary of the PG. Error bars represent the SEM ( $N = 11$ fish, *** $P < 0.001$ , Wilcoxon rank sum test).

the vibration stimuli (teal, Fig. 2N, bottom) despite individual variability (fig. S5G). Consistently, k-means clustering of individual PG neurons based on their light and vibrations responses revealed that PG clusters with different sensory preferences were partially segregated across space (fig. S5, H to K, and movie S3). Such sensory-evoked PG clusters partially overlapped with spontaneous-activity clusters in individual animals (fig. S6). Altogether, these results revealed that PG neurons exhibit selective sensory responses, and partially overlapping but segregated PG subregions prefer different sensory stimuli.

PG axons innervating zebrafish pallium are organized into topographical zones selective for different sensory modalities

Axonal projections from distinct thalamic nuclei play an important role in the functional and topographical organization of the amniote cortex (2, 6). We asked whether similar principles are also present in teleost fish. To examine this, we used a $Tg(gSAIzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s)$ transgenic fish line expressing transgenic calcium indicator GCaMP6s in PG axons projecting to the pallium. We confirmed that the GCaMP6s-expressing axons in the juvenile zebrafish pallium originate from the PG by injecting TMR-dextran into the PG and found strong overlap between the GCaMP6s and TMR-dextran signals (Fig. 3A). In vivo two-photon $Ca^{2+}$ imaging showed that the PG axons exhibited spontaneous ongoing activity (Fig. 3, B and C). K-means clustering (38, 39, 41, 51, 61) of ongoing PG axonal activity (Fig. 3C) revealed topographically segregated axonal clusters (Fig. 3, C and D; fig. S7, A and B; and movie S4). Calcium signals from nearby PG axonal pixels exhibited larger correlations than chance levels (Fig. 3E and fig. S7C). Ensembles of PG axons (Fig. 3F) and correlations (Fig. 3G) between PG axonal calcium dynamics remained stable across consecutive time periods. These results revealed that the spontaneous activity of the pallial PG axonal terminals is topographically organized.

We next examined what sensory information PG axons convey to the pallium. To do so, we measured the calcium signals of pallial PG axons in response to light and vibration stimuli and observed both excitation and inhibition (Fig. 3, H to J). We then asked whether these PG axons, similar to the PG neurons, are selective for individual sensory modalities. The distribution of PG axonal response amplitudes revealed a strong preference for either light or vibration stimuli (Fig. 3K and fig. S7D). Consequently, we observed a significantly larger fraction of PG axons responding exclusively to either light or vibrations when compared with a small fraction of multisensory axons (Fig. 3L; light exclusive versus multisensory, $P = 1.96 \times 10^{-4}$ ; vibration exclusive versus multisensory, $P = 5.92 \times 10^{-4}$ ; Wilcoxon rank sum test).

Subsequently, we investigated the topographical organization of sensory responses in the PG axons and observed that nearby axons exhibited more correlated sensory responses (Fig. 3, M and N) and greater focality than chance levels (fig. S7E). We also observed that PG axons that were spatially aligned across all fish exhibited topographically distinct sensory responses. Specifically, anterior-lateral axons exhibited light preference, and medial and posterior zones exhibited vibration preference (Fig. 3O and fig. S7F). Consistently, k-means clustering of pallial PG axons using joint visual and vibration responses revealed spatial segregation of PG axonal clusters across fish (fig S7, G to J). Sensory-evoked PG axonal clusters partially overlap with spontaneous-activity clusters in individual animals (fig. S7, K to M). Altogether, PG axons exhibit selective sensory responses that are partially segregated to topographically distinct pallial regions, similarly to the first-order thalamic projections onto the primary sensory regions of the mammalian cortex (3, 5, 6).

Spontaneous and evoked PG activity recruit topographically distinct pallial regions

Our results showed that PG neurons are the primary diencephalic input to the zebrafish pallium and that they selectively encode different sensory modalities. But how and where in the zebrafish pallium is the information from the PG received? To investigate this, we adopted two complementary approaches based on spontaneous and evoked PG activity. First, we asked which pallial regions showed strong correlations with the spontaneous activity of individual PG clusters. Because a standard juvenile zebrafish brain atlas is lacking, we utilized anatomical landmarks (21, 35, 38, 41, 51) to annotate individual pallial regions (fig. S8, A to C) and confirmed that these regions exhibit distinct spontaneous activity patterns in vivo (fig. S8D). We observed that pallial neurons with highest correlations to individual PG clusters are in the Dm and Dl, which largely overlap with pallial regions receiving PG axons (fig. S9, A to E), a pattern similar to the results of Granger causality analysis for PG to pallium connections (fig. S9, F to H).

Next, we investigated the PG to pallium connections using a causal approach by stimulating PG with bipolar glass microelectrode (38, 52) while volumetrically imaging neural activity in $Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)$ (60) juvenile zebrafish brain explants (Fig. 4A). Brief PG microstimulation (2 ms) evoked excitation and inhibition in both ipsi- and contralateral pallium (Fig. 4B). The ipsilateral pallium exhibited significantly more excitation than the contralateral pallium, whereas inhibition was evenly distributed across hemispheres (Fig. 4C; excited, $P = 0.0024$ ; Wilcoxon signed-rank test). Excited neurons with increased calcium signals were more prevalent in the Dm, Dc, Dl, and the anterior region of the pallium (Da) (Fig. 4B and fig. S10A). Faster (22 Hz) single-plane recordings in $Tg(elavl3:GCaMP6s)$ animals revealed that distinct pallial regions responded with different onsets, suggesting a temporal hierarchy in their recruitment upon PG activation (fig. S11, A to D). We observed that inhibited neurons were primarily located in the Da (Fig. 4B and fig. S10B). We also observed that the ipsilateral pallium responded with higher trial-to-trial Pearsons's correlations and hence exhibited more reliable responses to PG stimulation (Fig. 4, D and E, and fig. S10C). PG-evoked pallial activation was more reliable across those regions (fig. S10, C and D), with prominent responses (fig. S10, A and B). Microstimulating just outside of the PG elicited no pallial responses (fig. S10, E to J). Synaptic blockers, NBQX and APV (10 and 50 μM respectively), abolished PG-evoked pallial activation. (fig. S10, K

A

B
C

D

E

F

G

H

K

M

J

0

Fig. 3. The PG axons in the zebrafish pallium form topographically organized ensembles and exhibit sensory-selective responses. (A) Two-photon microscopy image of the PG axons in the zebrafish pallium expressing the transgenic calcium indicator GCaMP6s (green) in Tg(gSAlzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s) juvenile fish. These GCaMP6s-labeled axons are confirmed to originate from the PG by colabeling with TMR-dextran injection in the PG, as in Fig.1B (N = 3 fish). (B) Scheme illustrating the imaging area and location of the PG axonal projections in the zebrafish pallium, indicated by dashed lines. (C) Example calcium signals from pallial PG axons (detected in pixel units) during spontaneous ongoing activity, in an individual fish. The axonal activity was clustered using k-means into six different clusters. (D) (Top) Two-photon microscopy image of the PG axons in the same fish as in (C). (Bottom) 2D reconstruction of the detected PG axons color-coded by the k-means cluster identity from (C). (E) Pairwise correlations of the PG axons' spontaneous activity as a function of the distance between pixel pairs. The gray dashed line represents the pairwise correlations when the distances are shuffled. The shaded region denotes the SEM (N = 12 fish). (F) Cluster fidelity of the PG axons during two consecutive spontaneous activity periods compared with a shuffled distribution of the cluster. (G) Pairwise Pearson's correlations of the PG axonal pixels during two consecutive periods of spontaneous activity. Only significant correlations (P < 0.05) are plotted. The probability density of the pairwise correlations in the scatter plot is represented with a color gradient. The gray dots represent the pairwise correlations obtained from a shuffled distribution. The correlation coefficient for the shuffled (in gray, $r^{2} = 0.0008$ ) and observed data (in black, $r^{2} = 0.477$ ) were obtained following a linear fit,

indicated by the dashed line. The error bars represent the SEM ( $N = 12$ fish, $ * * P < 0.001$ , paired Wilcoxon signed-rank test). (H and I) Overlaid 2D reconstruction of the excited [in red, (H)] and inhibited [in blue, (I)] PG axonal pixels from all fish in response to light (left) and vibration (right) stimulation in vivo. The color gradient represents the spatial probability density of responding PG axons. Nonresponding PG axons are shown in gray ( $N = 12$ fish). (J) Time courses of the PG axonal calcium signals in response to light (left) and vibrations (right). Warm colors indicate increased neural activity; cool colors indicate decreased neural activity. Mean calcium signals are shown at the bottom of each heat map, and the shades indicate the SEM ( $N = 8$ fish). (K) Mean responses of all individual PG axonal pixels upon light and vibration stimulation. The probability density of excited PG axonal pixels upon light or vibration stimulation is color-coded. Nonexcited axons are shown as gray dots. (L) The fraction of responding PG axonal pixels excited (red) and inhibited (blue) by either light or vibration (exclusive) or by both stimuli (multisensory) in individual fish. (M and N) The pairwise correlation of the PG axonal responses to light (M) and vibration (N) stimulation as a function of the distance between axonal pixel pairs. The gray dashed line represents pairwise correlations when the distances are shuffled. The shaded region denotes the SEM. ( $N = 12$ fish). (O) (Top) The locations of all light- (left) and vibration-excited (right) PG axons from all fish are spatially aligned and overlayed in a 2D histogram. Warmer colors denote higher neuron counts per bin. (Bottom) The difference between the two 2D histograms is shown at the bottom left, whereas the $P$ values of each spatial binned are shown on the bottom right. Nonsignificant bins are represented in grayscale, whereas significant spatial bins are shown in color. Warm colors indicate a spatial preference for the light stimulus, whereas cool colors indicate a preference for the vibration stimulus ( $N = 12$ fish). Error bars represent the SEM ( $N = 12$ fish, $ * * P < 0.001$ , Wilcoxon rank sum test).

to N). Altogether, these results revealed that PG microstimulations elicited prominent and topographically organized responses across distinct pallial regions, except the dorsal posterior pallium (Dp).

Sensory responses in the zebrafish pallium are less selective and topographically organized

We next asked how sensory information is further processed in the zebrafish pallium. To measure sensory responses in vivo, we used head-restrained $(38, 39, 41, 51, 61)$ juvenile zebrafish $Tg(eval3:GCaMP6s)$ $(60)$ expressing GCaMP6s in all neurons. Upon light and vibration stimulation, we observed both excitation and inhibition across the pallium (Fig. 4, F to H). Unlike the PG neurons and axons, a large fraction of pallial neurons exhibited multisensory responses to both light and vibration stimuli, in addition to those pallial neurons exclusively responding to either light or vibration stimuli (Fig. 4, I and J, and fig. S12A). Nearby pallial neurons exhibited correlated activity (Fig. 4, K and L) and above-chance focality (fig. S12B) upon light and vibration stimulation. Despite a large fraction of multi-sensory pallial neurons, we observed that Dl and Dm displayed biased preferences for light and vibration stimuli respectively (Fig. 4M).

Multisensory representations are more prominent in the zebrafish pallium than in the PG

Our results showed that, unlike the PG, most pallial neurons are multisensory, responding to both light and vibrations (Fig. 4, I and J). This raises the possibility that some pallial neurons integrate information from parallel sensory information streams. To investigate this, we compared sensory integration from PG neurons (Fig. 5, A and D) with that from PG axons in the pallium (Fig. 5B) and pallial neurons (Fig. 5, C and E). We observed significantly more multisensory responses in pallial neurons than in pallial PG axons (Fig. 5, F to I; PG axons versus pallial neurons, P = 0.02; Dunn's test), particularly in pallial regions Dc and Dm (fig. S12, C to F). Moreover, light and vibration responses showed significantly higher Pearson's correlation (PG neurons versus pallial neurons, P = 0.0027; PG axons versus pallial neurons, P = 0.0051; Dunn's test) and cosine similarity (PG axons versus pallial neurons, P = 0.039; Dunn's test) in the pallium compared with those in PG neurons and axons (Fig. 5, J to L). These findings suggest that sensory selectivity decreases from the thalamic-like PG to the cortical-like pallium.

Hierarchies of sensory computations in the zebrafish pallium are topographically organized

We showed that sensory representations became more complex from PG to pallium, yet the pallium contained both modality-specific and multisensory neurons. We next asked how these different categories are spatially organized. We found that neurons responding exclusively to light or vibration are primarily located in distinct pallial zones, Dl and Dm, respectively (Fig. 6, A and B), resembling the modality-specific parcellation of the mammalian sensory cortices (2, 6). By contrast, multisensory neurons are located in the central-medial pallium, primarily in Dc and Dm (Fig. 6C).

Next, we examined pallial sensory integration by using a cross-modal stimulation (63) in which both light and vibration stimuli were delivered simultaneously (fig. S13, A to D). We then identified pallial neurons that did not respond to either light or vibration alone but responded only to their simultaneous presentation. We called these “integrative” neurons. Integrative neurons represented the largest fraction of pallial neurons (fig. S13E). Moreover, they were localized to a distinct anterior-central region of the pallium, the anterior Dc (Fig. 6D). These findings highlight a hierarchy and specialization of sensory computations across the zebrafish pallium, reflecting an increased complexity of information processing.

One could argue that integrative neurons in the pallium may arise owing to a thresholding effect. For example, a linear combination of light and vibration stimuli could drive weak pallial neurons above detection thresholds, falsely displaying nonlinearities. To address this possibility, we adopted an index quantifying multisensory nonlinearities $(51, 64)$ . According to this index, if a neuron's response to coincidental stimuli exceeds the linear sum of its responses to each stimulus alone, then it is classified as “superadditive” (Fig. 6, E to G, right). If the coincident response is weaker than the strongest individual response, then it is classified as “depressed” (Fig. 6, E to G, left). All other neurons are classified as “subadditive” (Fig. 6, E to G, center). When we mapped the spatial distribution of these different categories of pallial neurons (Fig. 6H), we found that depressed neurons, the largest fraction of pallial neurons (Fig. 6F), were located along the most anterior, posterior, and lateral margins of the pallium (Fig. 6H, left, and fig. S13F). Superadditive neurons were located in the anterior-central pallial regions (Fig. 6H, right, and fig. S13H), substantially overlapping with the spatial distribution of the integrative neurons (Fig. 6D). Most of integrative neurons were classified as superadditive (Fig. 6, I and J), highlighting the overlap between these populations. Subadditive neurons were found in posterior regions (Fig. 6H, center, and fig. S13G). Altogether, our results reveal a functional hierarchy and specialization of sensory computations in the zebrafish pallium with strong topographical regionalization (fig. S14).

Discussion

The first-order thalamus is the primary source of sensory information for the mammalian cortex $(1, 6, 25)$ . The zebrafish “thalamus proper” mediates various sensory computations $(65–67)$ . Yet, we found that the PG, rather than the thalamus proper, is the predominant source of extratelencephalic input to the zebrafish pallium, consistent with other teleosts $(20, 21, 45, 47, 48)$ . How does the teleost PG compare to the thalamic structures in other vertebrates? PG to pallium innervations are already present in 5-day-old zebrafish, consistent with the early development of mammalian thalamocortical projections $(68)$ . Similar to the mammalian thalamus $(6, 55)$ , the zebrafish PG is composed primarily of glutamatergic neurons, with a smaller population of GABAergic neurons. Only the glutamatergic PG neurons projected to the pallium, mirroring the mammalian thalamic relay neurons $(6, 55)$ . Hence, GABAergic PG neurons likely function as local interneurons

Fig. 4. Pallial responses evoked by PG activation and sensory stimulation are heterogeneous and topographically organized. (A) (Top) Scheme representing a microelectrode stimulation of the PG in juvenile zebrafish brain explants during two-photon calcium imaging of the pallial neurons (N = 12 fish). (Center) Scheme of the juvenile zebrafish pallium overlaid with the termination zone of the PG axons (left) and the anatomically identified locations of the pallial regions delineated by the dashed lines (right). (Bottom) Brightfield image indicating the location of the microsimulation electrode in the brain explant (denoted by the red star). The PG boundaries are highlighted by white dashed circles. (B) 2D reconstruction of all excited (red) and inhibited (blue) pallial neurons and nonresponding neurons (in gray) upon PG stimulation. The data from all fish are spatially aligned and overlaid. The color gradient represents the spatial probability density of the responding pallial neurons. Below each reconstruction is the number counts of excited (red) and inhibited (blue) neurons along the lateral-medial axis (N = 12 fish). (C) Fraction of excited (top) and inhibited (bottom) pallial neurons on the ipsi- and contralateral hemispheres in reference to the stimulated PG (N = 12 fish, **P < 0.01, paired Wilcoxon signed-rank test). (D) (Top) 2D reconstruction of the reliably responding pallial neurons upon repeated microstimulation trials. Pearson correlations of the trial-to-trial responses of the pallial neurons are color-coded only if the correlation P < 0.1. (Bottom) Number counts of the reliable responding pallial neurons along the lateral-medial axis (N = 12 fish). (E) Fraction of reliably activated neurons across trials plotted per hemisphere (N = 12 fish, *P < 0.05, paired Wilcoxon signed-rank test). (F and G) Overlaid 2D reconstruction of the excited [in red, (F)] and inhibited [in blue, (G)] pallial neurons

from all spatially aligned fish in response to light (left) and vibration (right) stimulation in vivo. The color gradient represents the spatial probability density of the responding pallial neurons. Nonresponding pallial neurons are shown in gray. (H) Time courses of the pallial neurons' calcium signals in response to light (left) and vibrations (right). Warm colors indicate increased neural activity; cool colors indicate decreased activity. Mean calcium signals are shown at the bottom of each heatmap; shades indicate the SEM (N = 10 fish). (I) Mean responses of all individual pallial neurons upon light and vibration stimulation. The probability density of excited pallial neurons upon light or vibration stimulation is color coded. Nonexcited neurons are shown as gray dots. (J) The fraction of responding pallial neurons excited (red) and inhibited (blue) by either light or vibration (exclusive) or by both stimuli (multisensory), in individual fish. (K and L) The pairwise correlation of the pallial neurons' responses to light (K) and vibration (L) stimulation as a function of the distance between pairs. The gray dashed line represents the pairwise correlations when the distances are shuffled. The shaded region denotes the SEM (N = 10 fish). (M) (Top) The locations of all light (left) and vibration (right) excited pallial neurons from all fish are spatially aligned and overlayed in a 2D histogram. Warmer colors denote higher neuron counts per bin. (Bottom) The difference between the two 2D histograms is shown at the bottom left, whereas the P values of each spatial binned are shown on the bottom right. Nonsignificant bins are represented in grayscale, whereas significant spatial bins are shown in color. Warm colors indicate a spatial preference for the light stimulus, whereas cool colors indicate a preference for the vibration stimulus (N = 10 fish). Error bars represent SEM (N = 10 fish, P < 0.05, Wilcoxon rank sum test).

or thalamic reticular-like neurons (3, 30), mediating interactions among PG neurons or modulating PG activity. Some support for inhibitory interactions within PG comes from anticorrelated ongoing activity between PG nuclei and from sensory-evoked inhibition in PG. Furthermore, multiple functional PG clusters aligned with the functional heterogeneity seen in the mammalian thalamus (4, 5, 25, 69). This suggests that the zebrafish PG likely contains heterogeneous groups of neurons specialized for distinct functions, similar to other teleosts (22, 44, 70, 71). Such functional regionalization aligns with the correlated ongoing and sensory-driven activity observed between nearby PG neurons. Although weak, we observed a functional topography along the medial-lateral PG axis. Additionally, posterolateral and anteromedial PG neurons showed different retrograde labeling upon Dm and Dl injections. Dissecting the PG architecture will be essential for understanding the interactions among its subnuclei.

Unlike the first-order mammalian thalamus, the zebrafish PG receives inputs from multiple mesencephalic and diencephalic regions, as in other teleosts (44, 45, 70, 72). We demonstrated that the optic tectum [OT; visual (44, 66, 73)] and the torus semicircularis [TS; auditory (74, 75)], the teleost homologs of the superior and inferior colliculi, are the primary inputs of the PG. The dominance of collicular afferents suggests that, in terms of input organization, the PG is analogous to the reptilian and bird nucleus rotundus (26, 30) and the mammalian pulvinar nucleus (10, 13, 26). We found that PG projects primarily to the pallial regions Dm, Dl, and Dc, which are analogous to the mammalian amygdala (37, 76), hippocampus (48, 77–79), and cortex (20, 80), respectively. Hence, the PG targets in the pallium are not the homologs of the mammalian primary sensory cortices receiving first-order thalamocortical projections. This is an important difference in how the zebrafish and mammalian pallium receive sensory information, despite analogous pallial sensory computations. In birds and reptiles, the nucleus rotundus projects to entopallium (13, 29–31, 33), whereas the avian thalamus targets the hyperpallium (or wulst), forming parallel ascending sensory pathways. Whereas the primary pallial targets of PG (Dm and Dl) show modality-segregated organization like the avian entopallium (81), Dc displays spatial overlap, highlighting evolutionary differences between PG and nucleus rotundus targets. The mammalian pulvinar projects to several higher-order cortical areas (27) and the amygdala (27), reminiscent of the PG projections to Dc and Dm. The pulvinar also receives feedback from higher-order cortices (6, 10, 27). We also observed pallial neurons projecting to PG. Hence, PG and pallium are reciprocally connected, resembling the mammalian corticothalamic loops (2, 55, 82). Understanding how these pallial-PG loops support functions such as integration across pallial regions or modalities, as in mammals, remains to be determined.

Mammals, birds, reptiles, and fish appear to have evolved two parallel cortical input pathways: thalamofugal and tectofugal connections. In visual processing, thalamofugal inputs are more dominant in mammals (6, 26), whereas in birds and reptiles, both pathways are prominent (26, 31, 33, 34). In zebrafish, the tectofugal pathway—from the tectum, through PG, to the pallium—is the more dominant route. Yet the connectivity and computations of the PG-pallium circuits closely resemble those of mammalian thalamocortical pathways despite reduced thalamofugal input. This mirrors findings that the avian tectofugal pathway performs visual computations similar to the mammalian thalamofugal pathway (26, 31, 83). These analogies rely on the function and connectivity of the PG described here, yet the PG's developmental and evolutionary origins remain controversial. Whereas some studies propose PG's mesencephalic origin (47) and its evolution only within teleost (44), others suggest a diencephalic origin for PG (84, 85) homologous to the mammalian dorsal thalamus (86). Establishing robust homologies between zebrafish PG and thalamic structures in other vertebrates requires comprehensive molecular comparison of cell types (17, 18, 69, 87, 88), complemented by developmental studies (5, 47, 84).

Distinct regions of the amniote pallium are dedicated to processing different sensory modalities $(1, 4, 5, 11, 29)$ . Sensory-specific topography is observed even in lampreys $(24)$ . Hodological studies in teleosts suggest that the Dl primarily encodes visual information, whereas the Dm processes auditory and gustatory inputs $(22, 70, 89)$ . We demonstrate that light and vibrational responses become progressively more segregated from PG to its axons and pallial targets, such as Dl and Dm. Although functional topography within the PG is limited, its projections drive topographically organized pallial responses with diverse functional features, similar to the mammalian thalamocortical circuits $(1, 5, 9)$ .

The zebrafish pallium does not simply mirror PG sensory inputs, but it transforms this input across distinct, topographically organized computational layers. Our results reveal a decrease in sensory selectivity as signals pass from PG axonal terminals to pallial neurons. We identified the posterior Dc as the primary pallial region for multisensory integration, resembling multisensory neurons with mixed selectivity across the mammalian cortex (7, 9, 90). This highlights multisensory integration as an important feature of the vertebrate pallium.

We uncovered a high degree of topographically organized nonlinearities in pallial sensory processing. These findings highlight the zebrafish pallium as a nonlinear transformer of sensory inputs. Such computations may underlie the role of the zebrafish pallium (especially Dc) in learning $(37, 40, 91)$ and spatial navigation $(42, 79)$ and mirrors learning related nonlinearities across the mammalian cortex $(7, 8, 92)$ .

In mammals, nonlinearities arise from distinct circuit motifs $(1, 2, 4, 8, 9)$ . Where and how do pallial nonlinearities emerge in teleosts? Anatomical studies revealed that the teleost pallium contains recurrent $(53, 78)$ , feedforward and feedback $(21, 22, 48, 70, 93)$ , and interhemispheric $(21, 52)$ connections. Such architectural motifs are also documented in the avian $(11-13)$ and reptilian pallium $(15)$ . PG stimulation produced a spreading wave of pallial activity, reaching regions without PG innervations and the contralateral pallium, suggesting a multisynaptic propagation. Moreover, $\sim40\%$ of pallial neurons exhibited competitive suppression during simultaneous light and vibration stimulation. Given that the zebrafish pallium is predominantly glutamatergic $(19, 40)$ , this stimulus competition is potentially mediated by feedback connections between glutamatergic pallial neurons and GABAergic subpallial neurons $(36, 93)$ . Consistently, stimulating glutamatergic PG also evoked inhibition in the anterior-pallium, likely via subpallial GABAergic circuits. Although we focused on the gross functional anatomy of PG-to-pallium connections, our findings underscore the need for a detailed anatomical, synaptic, and functional connectivity map of the zebrafish pallium. With its small, optically-accessible brain and powerful genetic toolkit, the zebrafish is well-positioned to become one of the first vertebrates to achieve a complete pallial connectome, by combining EM (54) and optogenetics (94), following the advances of the fruit fly connectome (95).

A

C

D

E

F

G

H

I

J

K
L

Fig. 5. Sensory representations become less selective as they are relayed from the PG to the pallium. (A to C) 2D reconstruction of the excited PG neurons [(A) N = 11 fish], PG axons [(B) N = 12 fish], and pallial neurons [(C) N = 10 fish] color coded by their sensory selectivity (orange for light exclusive, teal for vibration exclusive, purple for multisensory, and gray for all other neurons). (D) Example traces of different PG neurons classified as light exclusive (left), vibration exclusive (middle), and multisensory (right). Singe trial responses are shown as clear traces, whereas bold traces represent the mean response across trials. Trial responses are color coded by the sensory stimulus (orange, light; teal, vibration). (E) Same as (D), but for the pallial neurons. (F to H) Scatter plot of the mean sensory responses of the PG neurons (F), PG axons (G), and pallial neurons (H) using the same color code as in (A) to (C). (I) The fraction of multisensory responding neurons or units from all datasets across the PG to pallium. (J) Cumulative distribution of the sensory response correlations for all neurons or units across datasets (dark purple, pallial neurons; purple, PG axons; light purple, PG neurons). (K) Mean correlations between the multineuronal sensory representations across the different datasets. (L) Mean cosine similarity between the multineuronal sensory representations across the different datasets. Error bars represent the SEM. (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Kruskal-Wallis test followed by Dunn's test).

B

D

F

H

G

I

J

Fig. 6. Hierarchies of sensory representations are topographically organized across the zebrafish pallium. (A to D) Overlaid 2D reconstruction of the excited pallial neurons from all spatially aligned fish that are exclusively responding to light (A) or vibration (B) stimulation, multisensory pallial neurons responding to both light and vibrations (C), and integrative pallial neurons that did not respond to individual stimuli when presented alone but only responded when both light and vibrations were delivered simultaneously (D). The color gradient represents the spatial probability density of the excited pallial neurons. All other pallial neurons are shown in gray ( $N = 10$ fish). (E) Cumulative distribution of the interaction index for all pallial neurons. (F) The fraction of pallial neurons exhibiting additivity or depression in each individual fish ( $N = 10$ fish; $P < 0.01$ ; $P < 0.001$ ; Wilcoxon rank sum test). (G) Mean responses of the pallial neurons exhibiting depression (left), subadditivity (middle), and superadditivity (right) following the simultaneous delivery of both light and vibration stimuli (gold) when compared with the individual presentation of light (orange) and vibration (teal) stimuli. (H) 2D reconstruction of the pallial neurons exhibiting depression (left), subadditivity (middle), and superadditivity (right). The color gradient represents the spatial probability density of the classified pallial neurons. All other pallial neurons are shown in gray ( $N = 10$ fish). (I) 2D reconstruction of the previously identified integrative pallial neurons classified by their interaction index: yellow for superadditivity, blue for depressed, red for subadditivity, and gray for all other neurons. (J) The fraction of integrative pallial neurons exhibiting additivity or depression in each individual fish ( $**P < 0.001$ ; Wilcoxon rank sum test). Error bars represent the SEM.

Sensory-motor computations in the zebrafish midbrain and hindbrain have been extensively studied (94, 96–98). However, how (nonolfactory) sensory information is received and processed in the zebrafish pallium, the homolog of the mammalian cortex remains less understood. We demonstrated that despite minimal thalamofugal inputs, the zebrafish pallium has evolved convergent architectures and computations using tectofugal inputs relayed through the PG. These increasingly complex pallial response patterns align with the progressive recruitment of pallial neurons upon PG activation. Such segregated organization of pallial function suggests regional specialization of sensory computations and, to some extent, a hierarchical circuit arrangement. Future EM reconstructions (54) will be critical for revealing the connectivity motifs, architectural hierarchies, and regionalization of the zebrafish pallium. On one hand, regionalization of the zebrafish pallium resembles the nuclear, nonlaminated architecture of the avian pallium (12, 13, 32). On the other hand, the gradual increase of nonlinearities from posterior to anterior pallium resembles the functional specialization and hierarchy that coexist in the mammalian cortex, where posterior regions perform simpler sensory computations and anterior higher-order cortices handle more complex, integrative processes (1, 7, 90). Our results highlight regionalization as a fundamental feature of the vertebrate pallium. This regionalization likely supports the pallium's role as a parallel processor capable of performing multiple operations simultaneously, which should be further tested by using an expanded stimulus space. Whether this functional regionalization of the zebrafish pallium reflects distinct molecular features is still unknown. Recent transcriptomic studies have mapped the molecular topography of pallium in various vertebrates (14, 16–18, 88), including mammals (87), with unprecedented resolution. We anticipate that a molecular atlas of the zebrafish pallium will help align region specific functional and molecular signatures and enable cross-species comparisons of pallial neuron diversity.

Materials and methods

Zebrafish husbandry and strains

Juvenile (21 to 28 dpf) were used for the majority of the experiments except otherwise stated. All zebrafish were kept in 3.5 L tanks and maintained at a temperature of $28^{\circ}$ C, pH 7.2, $\sim700 \mu$ Siemens. Fish were kept on a 14:10 day/night cycle and all fish maintenance procedures have been approved by the Norwegian food and safety authority (NFSA). Zebrafish at this age are not sexually matured and hence, do have a gender yet. Fish from the following transgenic lies were used for the experiments: the Tg(vglut2a:DsRed;gad1b:GFP) which was generated by crossing the Tg(vglut2a:DSred) (56); Tg(gad1b:GFP) (57), the Tg(elavl3:GCaMP6s) (60), Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) (60), Tg(gSAIzGFFD707A:Gal4;UAS:GCaMP6s) which was created by crossing fish from the Tg(gSAIzGFFD707A:Gal4) and Tg(USA:GCaMP6s) (62), lines. The Tg(gSAIzGFFD707A:Gal4) was generated at the National Institute of Genetics (Mishima, Japan) using the Tol2 transposon-based gene trap and enhancer trap constructs (37, 99).

Samples size was determined from past experiments in the lab and only healthy fish were used for experimentation. For imaging experiments, only animals that showed bright fluorescence following screening with an epifluorescence microscope were used for experiments. Animals whose health was compromised and had to be euthanized were also excluded from our analysis.

Since the PG is a ventral structure, we used the Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) line to reliably image and segment individual PG neurons (Fig. 2 and figs. S5, S6, and S9). The nuclear-localized H2B-GCaMP6s provides higher brightness and clearer cell boundaries, which allowed confident identification of PG neurons at these depths. The same nuclear labeling also helped us image pallial neurons located in the ventral-most part of the whole-brain explant, which was positioned ventral-side-up for precise placement of micro-stimulation electrodes (Fig. 4, A to E, and fig. S10). For the fast ex vivo pallial imaging (fig. S11), in vivo PG-axon imaging (Fig. 3 and fig. S7) and pallial calcium imaging (Figs. 4, F to M, and 6 and figs. S8, S12, and S13), we used cytosolic GCaMP6s due to its higher sensitivity and dynamic range.

Ethical guidelines statement

All experimental procedures that performed on zebrafish juveniles were in accordance with the Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of the European Union. The procedures were approved by the Norwegian Food Safety Authorities, FOTS-ID:#30433, FOTS-ID:#24125, FOTS-ID:#25648.

Explant preparations

The explants were prepared as previously described in $(38)$ . In short, the fish were first anesthetized in ice-cooled artificial fish water (AFW, 1.2 g of marine salt in 20L of distilled water) and then euthanized by decapitation in oxygenated (Carbogen, 95% O₂/5% CO₂, Linde Corporation) artificial cerebrospinal fluid (ACSF). The ACSF was prepared by dissolving the following salts in distilled (reversed-osmosis, RO) water: 131 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.23 mM KH2PO₄, 2 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM glucose, 2.5 mM CaCl₂, and 20 mM NaHCO₃ $(52)$ . After euthanization, the underlying muscle tissue, jaws and eyes were first removed. Afterwards, the skin, dura and bones were carefully removed to provide the intact dissected brain with free access to the oxygenated ACSF. The extracted brain was then mounted to a small petri dish coated with Sylgard (World Precision Instruments) using tungsten pins prior to being transferred to the imaging setup (either epifluorescent or two-photon setups, see below) where the brain was constantly perfused with oxygenated ACSF. They were then used for either neurotracer or calcium imaging experiments (ex vivo $Ca^{2+}$ experiments section below).

Neurotracer injections

Anatomical tracing experiments were performed in juvenile zebrafish explants of the $Tg(elavl3:GCaMP6s)$ , $Tg(gad1b:GFP)$ and $Tg(vglut2a:DSred)$ fishlines. For these experiments, brains were visualized using a bright-field/epifluorescent microscope (Olympus BX51WL) controlled by a manual stage. Fluorescence from the dye was visualized using a green LED (530 nm) (M530L3, ThorLabs). Both a 5x air objective (Olympus, MPlanFLN NA 0.15) and a 10x water immersion objective (Olympus, MPlanFLN NA 0.3) were used to visualize the brain explants.

Tetramethylrhodamine dextran dyes (3000 MW, Thermofischer) were used to label cell bodies and projections of interests. For experiments using the $Tg(vglut2a:DSred)$ fish, we used the Alexa647-dextran dye (10,000 MW, Thermofischer) instead. Given that the dye is charged, we used iontophoresis to perform localized injection of the dye in our structure of interests. The neurotracer dye was loaded into borosilicate glass pipettes (1.00 mm; World Precision Instruments) which were pulled using a horizontal puller (P-2000, Shutter Instruments). Using a silver-wired electrode, we applied small electrical pulses at various intervals (Master8, A.M.P.I.) and amplitudes using a stimulating unit (ISO-Flex, A.M.P.I.) to control the size of the injection under the epifluorescence microscope. Small injections were performed using 200-400 pulses of 25 ms at an interval of 1Hz using currents of 0.2 mA. In contrast, big injections were done using 600-800 pulses with the same frequency and amplitude. Following the neurotracer injections, the explants were kept perfused with oxygenated ACSF for 3-4 hours before being incubated in the same ACSF at 4°C overnight. The samples were then fixed in 4% paraformaldehyde for 4-6 hours. Following the tissue fixation, the juvenile zebrafish brain explants underwent a tissue clearing process using the recommended protocol from the Binaree Tissue Clearing Kit (#HRTC-012, Binaree). In short, the tissue was incubated in the Binaree Starting solution at 4°C overnight. On the next day, the samples were transferred to a well plate containing 500 μL of Tissue Clearing Solution A and incubated at 37°C for 24 hours. Then, the samples were washed four times with RO water while shaking at 30 rpm at 4°C for 20 min each. The samples were then transferred to another well plate containing 500 μL of Tissue Clearing Solution B and incubated at 37°C for another 24 hours. Finally, the tissue was washed four times again with distilled (RO) water as done previously before being mounted on a microscope slide with the provided mounting solution from Binaree.

EM data analysis

EM data was obtained from $(54)$ . Neurons of interest within the preglomerular complex and pallium were identified and proofread in the Fish1 EM volume using Neuroglancer, a web-based visualization tool connected to the CAVE (Connectome Annotation Versioning Engine) backend $(100)$ . Proofreading involved examining raw electron micrographs in orthogonal cross-sections (xy, xz, and yz planes) alongside 3D neurite trajectory tracing, and manually correcting morphological errors in the automated segmentation, including merge errors, where distinct neuronal processes were incorrectly fused, and split errors, where continuous processes were fragmented across multiple segments. From the proofread candidates, a subset of high-quality complete reconstructions of “pallial-projecting PG neurons” and “PG-projecting pallial neurons” were selected for generating associated figures.

Confocal imaging and anatomical analysis

Once cleared, the explants were then imaged using a confocal microscope (Examiner Z1 LSM 880 confocal microscope, Zeiss) and using either a 10x (Zeiss, Plan-Apochromat NA 0.45) or 20x objective (Zeiss,

Plan-Apochromat, NA 0.8). Z-stack images were acquired using Zen 3.9 (Zeiss) and then further analyzed using either ImageJ/Fiji or Imaris 4.0 (Oxford Instruments). Cell counts were manually done in Imaris 4.0. We based our anatomical analysis on the anatomical landmarks identified in (21, 38) and the adult zebrafish brain atlas (AZBA) (35).

In vivo two-photon $Ca^{2+}$ imaging

For in vivo experiments, a two-photon microscope system (Scientifica) with a 20x water immersion objective (Zeiss 7 MP, W Plan-Apochromat NA 1.0) was used. Excitation was done using a mode-locked Ti:Saphire laser (MaiTai, Spectra Physics) tuned to 920 nm. Volumetric in vivo recordings were done across 8 planes using a Piezo (Physik Instrumente) at an acquisition rate of 2.2 – 3.4Hz per volume. Image sizes of $1536 \times 850$ pixels were used for the PG recordings while image sizes of $1536 \times 600$ pixels were used for the telencephalic recordings. All recordings were done using the SciScan software package (LabView).

For in vivo two-photon calcium imaging experiments, the juvenile zebrafish were first embedded in agarose as per (38, 39, 41, 51). In brief, the fish were embedded in low-melting point (LMP, Fisher Scientific) agarose (2.5% in AFW) in a recording dish (Fluorodish, World Precision Instruments) and waited for 20 min for the agarose to solidify. Afterwards, a triangular section of agarose around the nose, mouth and another triangular section encompassing the tail were removed with a scalpel. The embedded fish was then transferred to the recording setup where the recording dish was constantly perfused with heated (28°C, Warner Instrument Corporation), oxygenated (Carbogen) AFW for 30 min prior to the recording.

Prior to sensory stimulation, ongoing spontaneous activity was recorded for 10 min. Afterwards, sensory stimulation (either a red-light flash or a mechanical vibration) was presented to the fish at 1 min intervals, using parameters from previous studies $(39, 41, 51)$ . The red light was produced by a red LED (LZ1-00R105, LedEngin; 630-nm wavelength), which was placed in front of the fish. The light flashes were 200 ms long and had an intensity of 0.318 mW at 635nm, at the location of the fish during these experiments. Additionally, the mechanical vibrations were produced by applying 50 ms-long 6 V current to a solenoid tapper (SparkFunElectronics, ROB-10391) generating a vibration frequency spanning between 300-10000Hz $(51)$ . Both of which were controlled by an Arduino connected to the computer and initiated using Matlab (Mathworks). These sensory stimuli were delivered either individually (Figs. 2, 3, and 4 and figs. S5, S6, S7, and S12) or simultaneously (where the onsets were synchronized; Fig. 6 and fig. S13), and were all used in previous studies $(39, 41, 51)$ . Light, vibration or co-stimulation of light and vibration were repeated eight times with an interstimulus interval of 60 s. Finally, the time between stimulus conditions was 4 min.

Ex vivo Ca $^{2+}$ imaging

For explant calcium imaging experiments, a similar two-photon microscope setup (Scientifica) connected to a Ti:Saphire laser (MaiTai, Spectra Physics) tuned to 920 nm was used. The same acquisition software (SciScan, LabView) was also used except that a 16x water immersion objective (Nikon, NA 0.8, LWD 3.0) was used instead. Volumetric imaging of the entire telencephalon was achieved by imaging eight planes with an image size of $1536 \times 750$ pixels at a rate of 2.2-2.5Hz. For the fast-recording experiments (fig. S11), we imaged three separate single planes at a rate of 22 Hz.

Additionally, control microstimulation experiments were done using an epifluorescent microscope setup similar to the neurotracer experiments. In this case, a blue (470 nm) LED (M470L3, ThorLabs) was used to excite and visualize the GCaMP fluorescence. Fluorescent images were acquired using a QImaging camera (Teledyne Photometrics) and using the Occular image acquisition software (Teledyne Photometrics). Single-plane images of the explants were acquired at 40 Hz using a camera exposure setting of 4 ms.

Microelectrode stimulation

Glass pipette microelectrodes were prepared as in $(38)$ by first pulling borosilicate glass capillaries (1.00 mm; World Precision Instruments) using a horizontal puller (Model P-2000, Sutter Instruments). The glass electrodes had a resistance of $\sim$ 10-12 MOhm. Custom bipolar electrodes were created by gluing two glass electrodes using a two-component epoxy glue (Locite) so that the glass pipette tips were within 1-2 mm of each other. After, the glass pipettes were filled with ACSF and positioned in the brain using micro-manipulators (Scientifica). PG neurons were stimulated using a train of ten short (2 ms) current pulses (30-50 $\mu$ A) with an inter-stimulus interval of 60 s using a current isolator unit, a model DS3 (Digitimer). For the control experiments (fig. S10), a train of 40-50 $\mu$ A current pulses were used to stimulate the neurons in the PG and adjacent brain area ( $\sim$ 20 $\mu$ m outside of the PG).

Data analysis and quantification

Two-photon microscopy images were aligned using Suite2p (101) and then visually inspected for any aberrant motion artifacts, such as drift in the z dimension. Only those experiments with corrected motion and drift were used for further analysis. Regions of interest (ROI) corresponding to neurons were detected using a custom semi-automatic template-matching algorithm (38, 39, 51, 61, 62). The spatial positions of the ROIs were then extracted using custom Matlab scripts and the relative change in fluorescence ( $\Delta F/F$ ) was calculated for each neuron. For sensory and electrical stimulation experiments, the $\Delta F/F$ was calculated based on the 5 s baseline prior to each stimulation trial. In contrast, during ongoing spontaneous activity periods, the $\Delta F/F$ was calculated using a sliding baseline window of 6 min. Afterwards, the $\Delta F/F$ signals were filtered using a low-pass filter as described in Yaksi and Friedrich (102). The aforementioned $Ca^{2+}$ signal processing was all done in Matlab (Mathworks) using custom scripts. Delineation of the brain regions was done manually based on anatomical landmarks identified in (21, 38) and AZBA (35). For telencephalic recordings, only the dorsal telencephalon was analyzed and considered as the zebrafish pallium. The telencephalic PG axonal detection was done using the methods described in (41). Raw fluorescent images were first binned before a threshold-based algorithm was used to detect axonal pixels in a manually drawn region of the binned fluorescent image. Binned pixels with relative fluorescence intensity values greater than 25% of the maximum pixel value were considered as axonal pixels. Afterwards an independent component analysis was made to the fluorescent images to identify axonal ROIs (41) which were then manually inspected prior to further analysis.

Spontaneous ongoing neuronal activity of individual neurons was clustered into functional ensembles using the k-means clustering function in Matlab $(38, 51, 61)$ . We used correlations of neural activity as the distance metric between neurons. The optimal number of clusters used for the clustering was identified using the elbow method $(38, 41, 61)$ . In brief, the elbow method calculates the sum of intra-cluster distances for each cluster element, normalized by the sum of average intercluster distances for the actual data (black), and simulated data (gray, 100 iterations) with the same variance as the actual data but without cluster structure. This calculation was iterated for up to 30 k-means clusters. The relevant number of k-means clusters corresponds to the elbow point, where the black curve exhibits a prominent bend. Cluster centroids were initialized randomly and iterated 100 times until stable cluster identities were obtained. This analysis was done for both PG neuronal data (fig. S5, N = 11 fish), pallial PG axonal data (fig. S7, N = 12 fish), and in vivo recordings of spontaneous pallial activity (fig. S8, N = 10 fish).

To further quantify the topography of the functional PG ensembles, we fitted the positions of the PG neurons from individual animals across different axis (anterior-posterior, lateral-medial, dorsal-ventral and all 3D coordinates) into a linear support vector machine (SVM) model (103) in MATLAB (Matworks) and asked whether it can accurately predict the PG neuron cluster identities obtained from k-means clustering. The accuracy of the model was then determined using 10-fold cross-validation. This model was then compared to a shuffled model where the cluster labels along the tested spatial axis were randomly shuffled. Five-hundred such models were generated to compute the average classification accuracy of the shuffled model.

To assess whether the cluster identity of these neurons was stable across time, we used the cluster fidelity index $(38, 61)$ . In short, this index measures the probability of each neuron remaining in the same k-means cluster across consecutive time periods of 4 min separated by 30 s. These cluster fidelity values were then compared to a shuffled distribution where the cluster identities of each neuron were randomized.

To assess the functional topography of the PG and pallial recording units (neurons and axons) following sensory stimulations in vivo and the electrical micro-stimulations ex vivo, only responding units were considered for further analysis. These responding units were quantified as described in previous work $(38, 51)$ . In brief, neurons/axons were classified as positively responding (“excited”) when their mean responses across trials during a 5 s time window following the stimulus onset (response period) was greater than the mean plus 2.5 times the standard deviation of the baseline activity (5 s before the stimulus onset). In contrast, negatively responding (“inhibited”) neurons or axons were identified when the mean activity during the response period was smaller than the mean plus 1.5 times the standard deviation of the baseline activity.

To visualize the spatial distribution of responding units across fish, we have normalized the spatial positions along the X and Y dimensions of all identified ROIs (neurons or axonal pixels) per fish to a value between 0 and 1, that correspond to X and Y boundaries of the aligned brains. After spatial alignment, neurons from all recorded fish were then overlayed on top of each other and then visualized using a density plot based on a kernel smoothing function or as a 2D histogram. This 2D reconstruction of the responding neuron's spatial positions was done individually for each hemisphere of the brain except for Fig. 4B where we examined the ipsi- versus contralateral responses in the pallium. To quantify the topographic selectivity of our datasets, the counts from the vibration 2D histogram were then subtracted from the counts of the light 2D histogram before being smooth with a Gaussian filter to create the “difference” 2D histogram. To calculate the statistical relevance of spatial segregation in PG neurons, PG axons in the pallium, and pallial neurons in these 2D histograms, we calculated the statistical significance between visual and vibrational responses for each binned pixel and displayed the differences between visual and vibration responses in only those pixels showing significant differences.

To quantify whether the excited neurons or axons showed prominent spatial localization, we used a focality index $(39)$ . In short, the focality index ranges from 0 to 1 (0 indicating a highly random distribution, and 1 indicating a highly focal distribution of neurons). It was calculated as 1 minus the mean Euclidean distance of all excited neuronal pairs divided by the mean Euclidean distances for all neurons within one hemisphere. The average focality index of each hemisphere was then used to calculate the mean focality index per fish.

The time course traces of all responding or axonal pixels were sorted using Rastermap (104) and then visualized as heatmaps using Matlab (Mathworks).

To quantify the sensory selectivity of the responding units, we compare the mean responses vectors, which are the average response $(\Delta F/F)$ amplitudes of the excited units during the response period. To examine how sensory selectivity is represented across the sensory processing hierarchy, we correlated the mean sensory response vector following light and vibration stimulation across all recorded units (Fig. 5). Units that only responded to either light or vibration were classified as exclusive neurons or axons. The units that responded to both sensory stimuli were classified as multisensory neurons or axons.

Neurons responding only when both stimuli were presented simultaneously, but not when presented individually were classified as integrative neurons.

Since an anatomical atlas for the juvenile zebrafish pallium is not available, we annotated individual pallial regions in individual fish, using previously established anatomical landmarks (21, 35, 38, 41, 51) (fig. S8C). These landmarks provide reliable functional boundaries of pallial regions and neurons. To ensure the accuracy of our annotations, we confirmed that each delineated region exhibited distinct spontaneous activity patterns during in vivo recordings and exhibited selective preference to distinct k-means clusters (fig. S8D). The cluster selectivity index was then used to quantify the overlap between the delineated region and the functional clusters identified using k-means clustering (38). To calculate the cluster selectivity, we measured the sparseness of the clustered pallial neurons by comparing it to a random sampling of pallial neurons (39, 61). A cluster selectivity of 1 indicates that all neurons in a given pallial region belong to the exact same functional cluster, whereas a value of 0 indicates that neurons in that region are evenly distributed across all clusters and therefore not functionally distinct.

To examine the relationship of the PG ongoing and sensory-evoked activity in the pallium, we first clustered the spontaneous ongoing activity of the PG neurons using k-means clustering and used the mean activity of each cluster as a population vector. We then correlated this mean population vector to each individual pallial neuron. Pallial neurons with correlation values >0.4 were considered strongly correlated (fig. S9, C to E).

Granger causality analysis of individual pallial neurons to individual PG neurons was performed in Matlab (Mathworks) using the function “gctest” in the economic modeling toolbox. The top 10% of pallial neurons with the most significant $P < 0.05$ causal relationships with individual PG neurons were then used to examine their spatial distribution in the pallium. Different lag orders corresponding to a time delay of $\sim1$ , $\sim2$ , and $\sim3$ s were used to test for any significant causal relationship from the PG to the pallium (fig. S9, F to H).

To further quantify the response properties of pallial neurons (Fig. 6), we calculated an interactive index (51, 64). We measured the neuron's average response (R) to light, vibration or co-stimulation (light and vibration) during the responding period (5 s following the stimulus onset). Next, the interactive index was calculated using the following adapted equation:

$$ \mathrm{Interactiveindex} = \frac {R _ {\mathrm{Light} \& \mathrm{Vib}} - \max \left(R _ {\mathrm{Light}} , R _ {\mathrm{Vib}}\right)}{\max \left(R _ {\mathrm{Light}} , R _ {\mathrm{Vib}}\right)} \times 1 0 0 $$

If the interactive index is >100, then the neuron was classified as being “superadditive,” where its response to the costimulation was twice greater than its maximal response during individual stimulation. In contrast, if the interactive index is <0, then the neuron was classified as being “depressed,” as its costimulation response was smaller than the maximal response during individual stimulation. An interactive index value between 0 and 100 was classified as being “subadditive.”

All analysis figures were generated in Matlab (Mathworks) and then assembled in Illustrator (Adobe). EM reconstruction movie of PG neurons was generated in Blender, and all other movies were generated in Matlab (Mathworks).

Statistics

All statistical analyses were done in Matlab. Paired tests were performed using Wilcoxon signed-rank test, whereas nonpaired tests were performed using the Wilcoxon rank sum test. For comparison across delineated brain regions, a Kruskal-Wallis's test was first performed followed by post hoc Dunn's test. All error bars represent the standard error of the mean (SEM) unless specified elsewhere. Randomization for statistical comparison was done by shuffling the relevant variable within the dataset (for example cluster identities).

REFERENCES AND NOTES

1. K. D. Harris, G. M. Shepherd, The neocortical circuit: Themes and variations. Nat. Neurosci. 18, 170–181 (2015). doi: 10.1038/nn.3917; pmid: 25622573

2. S. M. Sherman, Thalamus plays a central role in ongoing cortical functioning. Nat. Neurosci. 19, 533–541 (2016). doi: 10.1038/nn.4269; pmid: 27021938

3. M. M. Halassa, S. M. Sherman, Thalamocortical Circuit Motifs: A General Framework. Neuron 103, 762–770 (2019). doi: 10.1016/j.neuron.2019.06.005; pmid: 31487527

4. J. A. Harris et al., Hierarchical organization of cortical and thalamic connectivity. Nature 575, 195–202 (2019). doi: 10.1038/s41586-019-1716-z; pmid: 31666704

5. T. Guillamón-Vivancos, M. Aníbal-Martínez, L. Puche-Aroca, F. J. Martini, G. López-Bendito, Sensory modality-specific wiring of thalamocortical circuits. Nat. Rev. Neurosci. 26, 623–641 (2025). doi: 10.1038/s41583-025-00945-y; pmid: 40745219

6. S. M. Sherman, R. W. Guillery, Exploring the thalamus and its role in cortical function (MIT press, 2006).

7. M. Rigotti et al., The importance of mixed selectivity in complex cognitive tasks. Nature 497, 585–590 (2013). doi: 10.1038/nature12160; pmid: 23685452

8. K. M. Tye et al., Mixed selectivity: Cellular computations for complexity. Neuron 112, 2289–2303 (2024). doi: 10.1016/j.neuron.2024.04.017; pmid: 38729151

9. K. D. Miller, Canonical computations of cerebral cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 37, 75–84 (2016). doi: 10.1016/j.conb.2016.01.008; pmid: 26868041

10. R. V. Rikhye, R. D. Wimmer, M. M. Halassa, Toward an Integrative Theory of Thalamic Function. Annu. Rev. Neurosci. 41, 163–183 (2018). doi: 10.1146/annurev-neuro-080317-062144; pmid: 29618284

11. M. Stacho et al., A cortex-like canonical circuit in the avian forebrain. Science 369, eabc5534 (2020). doi: 10.1126/science.abc5534; pmid: 32973004

12. A. Calabrese, S. M. Woolley, Coding principles of the canonical cortical microcircuit in the avian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 3517–3522 (2015). doi: 10.1073/pnas.1408545112; pmid: 25691736

13. J. Dugas-Ford, C. W. Ragsdale, Levels of homology and the problem of neocortex. Annu. Rev. Neurosci. 38, 351–368 (2015). doi: 10.1146/annurev-neuro-071714-033911; pmid: 26154980

14. E. Rueda-Alaña et al., Evolutionary convergence of sensory circuits in the pallium of amniotes. Science 387, eadp3411 (2025). doi: 10.1126/science.adp3411; pmid: 39946453

15. J. Fournier, C. M. Müller, I. Schneider, G. Laurent, Spatial Information in a Non-retinotopic Visual Cortex. Neuron 97, 164–180.e7 (2018). doi: 10.1016/j.neuron.2017.11.017; pmid: 29249282

16. M. A. Tosches et al., Evolution of pallium, hippocampus, and cortical cell types revealed by single-cell transcriptomics in reptiles. Science 360, 881–888 (2018). doi: 10.1126/science.aar4237; pmid: 29724907

17. D. Hain et al., Molecular diversity and evolution of neuron types in the amniote brain. Science 377, eabp8202 (2022). doi: 10.1126/science.abp8202; pmid: 36048944

18. J. Woych et al., Cell-type profiling in salamanders identifies innovations in vertebrate forebrain evolution. Science 377, eabp9186 (2022). doi: 10.1126/science.abp9186; pmid: 36048957

19. L. Anneser, C. Satou, H. R. Hotz, R. W. Friedrich, Molecular organization of neuronal cell types and neuromodulatory systems in the zebrafish telencephalon. Curr. Biol. 34, 298–312.e4 (2024). doi: 10.1016/j.cub.2023.12.003; pmid: 38157860

20. H. Ito, N. Yamamoto, Non-laminar cerebral cortex in teleost fishes? Biol. Lett. 5, 117–121 (2009). doi: 10.1098/rsbl.2008.0397; pmid: 18832057

21. J. Yáñez, M. Folgueira, I. Lamas, R. Anadón, The organization of the zebrafish pallium from a hodological perspective. J. Comp. Neurol. 530, 1164–1194 (2022). doi: 10.1002/cne.25268; pmid: 34697803

22. N. Yamamoto, H. Ito, Visual, lateral line, and auditory ascending pathways to the dorsal telencephalic area through the rostrolateral region of the lateral preglomerular nucleus in cyprinids. J. Comp. Neurol. 508, 615–647 (2008). doi: 10.1002/cne.21717; pmid: 18381599

23. M. Tibi et al., A telencephalon cell type atlas for goldfish reveals diversity in the evolution of spatial structure and cell types. Sci. Adv. 9, eadh7693 (2023). doi: 10.1126/sciadv.adh7693; pmid: 37910612

24. S. M. Suryanarayana, J. Pérez-Fernández, B. Robertson, S. Grillner, The evolutionary origin of visual and somatosensory representation in the vertebrate pallium. Nat. Ecol. Evol. 4, 639–651 (2020). doi: 10.1038/s41559-020-1137-2; pmid: 32203472

25. D. S. Roy, Y. Zhang, M. M. Halassa, G. Feng, Thalamic subnetworks as units of function. Nat. Neurosci. 25, 140–153 (2022). doi: 10.1038/s41593-021-00996-1; pmid: 35102334

26. E. I. Knudsen, Evolution of neural processing for visual perception in vertebrates. J. Comp. Neurol. 528, 2888–2901 (2020). doi: 10.1002/cne.24871; pmid: 32003466

27. N. Cortes, H. J. Ladret, R. Abbas-Farishta, C. Casanova, The pulvinar as a hub of visual processing and cortical integration. Trends Neurosci. 47, 120–134 (2024). doi: 10.1016/j.tins.2023.11.008; pmid: 38143202

28. R. Beltramo, M. Scanziani, A collicular visual cortex: Neocortical space for an ancient midbrain visual structure. Science 363, 64–69 (2019). doi: 10.1126/science.aau7052; pmid: 30606842

29. A. B. Butler, A. Reiner, H. J. Karten, Evolution of the amniote pallium and the origins of mammalian neocortex. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1225, 14–27 (2011). doi: 10.1111/j.1749-6632.2011.06006.x; pmid: 21534989

30. A. B. Butler, Evolution of the thalamus: A morphological and functional review. Thalamus Relat. Syst. 4, 35–58 (2008). doi: 10.1017/S1472928808000356

31. W. J. Clark, M. Colombo, The functional architecture, receptive field characteristics, and representation of objects in the visual network of the pigeon brain. Prog. Neurobiol. 195, 101781 (2020). doi: 10.1016/j.pneurobio.2020.101781; pmid: 32097689

32. O. Güntürkün, K. von Eugen, J. Packheiser, R. Pusch, Avian pallial circuits and cognition: A comparison to mammals. Curr. Opin. Neurobiol. 71, 29–36 (2021). doi: 10.1016/j.conb.2021.08.007; pmid: 34562800

33. J. Rose, The avian brain. Curr. Biol. 32, R1076–R1079 (2022). doi: 10.1016/j.cub.2022.07.072; pmid: 36283368

34. S. Watanabe, Effects of ectostriatal lesions on discriminations of conspecific, species and familiar objects in pigeons. Behav. Brain Res. 81, 183–188 (1996). doi: 10.1016/S0166-4328(96)89079-6; pmid: 8950015

35. J. W. Kenney et al., A 3D adult zebrafish brain atlas (AZBA) for the digital age. eLife 10, e69988 (2021). doi: 10.7554/eLife.69988; pmid: 34806976

36. T. Mueller, M. F. Wullimann, An evolutionary interpretation of teleostean forebrain anatomy. Brain Behav. Evol. 74, 30–42 (2009). doi: 10.1159/000229011; pmid: 19729894

37. P. Lal et al., Identification of a neuronal population in the telencephalon essential for fear conditioning in zebrafish. BMC Biol. 16, 45 (2018). doi: 10.1186/s12915-018-0502-y; pmid: 29690872

38. E. M. Bartoszek et al., Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Curr. Biol. 31, 3861–3874.e3 (2021). doi: 10.1016/j.cub.2021.08.021; pmid: 34416179

39. S. Fore et al., Functional properties of habenular neurons are determined by developmental stage and sequential neurogenesis. Sci. Adv. 6, eaaz3173 (2020). doi: 10.1126/sciadv.aaz3173; pmid: 32917624

40. T. Aoki et al., Imaging of neural ensemble for the retrieval of a learned behavioral program. Neuron 78, 881–894 (2013). doi: 10.1016/j.neuron.2013.04.009; pmid: 23684786

41. A. K. Mutlu et al., Topographically organized dorsal raphe activity modulates forebrain sensory-motor representations and contributes to defensive behaviors. Nat. Commun. 17, 6243 (2026). doi: 10.1038/s41467-026-75490-y

42. C. Yang et al., A population code for spatial representation in the zebrafish telencephalon. Nature 634, 397–406 (2024). doi: 10.1038/s41586-024-07867-2; pmid: 39198641

43. E. Rink, M. F. Wullimann, Connections of the ventral telencephalon (subpallium) in the zebrafish (Danio rerio). Brain Res. 1011, 206–220 (2004). doi: 10.1016/j.brainres.2004.03.027; pmid: 15157807

44. T. Mueller, What is the Thalamus in Zebrafish? Front. Neurosci. 6, 64 (2012). doi: 10.3389/fnins.2012.00064; pmid: 22586363

45. A. C. Giassi, T. T. Duarte, W. Ellis, L. Maler, Organization of the gymnotiform fish pallium in relation to learning and memory: II. Extrinsic connections. J. Comp. Neurol. 520, 3338–3368 (2012). doi: 10.1002/cne.23109; pmid: 22430442

46. N. Yamamoto, H. Ito, Fiber connections of the anterior preglomerular nucleus in cyprinids with notes on telencephalic connections of the preglomerular complex. J. Comp. Neurol. 491, 212–233 (2005). doi: 10.1002/cne.20681; pmid: 16134137

47. S. Bloch et al., Non-thalamic origin of zebrafish sensory nuclei implies convergent evolution of visual pathways in amniotes and teleosts. eLife 9, e54945 (2020). doi: 10.7554/eLife.54945; pmid: 32896272

48. M. F. Wullimann, T. Mueller, Teleostean and mammalian forebrains contrasted: Evidence from genes to behavior. J. Comp. Neurol. 475, 143–162 (2004). doi: 10.1002/cne.20183; pmid: 15211457

49. F. Palumbo, B. Serneels, R. Pelgrims, E. Yaksi, The Zebrafish Dorsolateral Habenula Is Required for Updating Learned Behaviors. Cell Rep. 32, 108054 (2020). doi: 10.1016/j.celrep.2020.108054; pmid: 32846116

50. E. Dreosti, G. Lopes, A. R. Kampff, S. W. Wilson, Development of social behavior in young zebrafish. Front. Neural Circuits 9, 39 (2015). doi: 10.3389/fncir.2015.00039; pmid: 26347614

51. A. M. Ostenrath et al., Inhibition mediated by group III metabotropic glutamate receptors regulates habenula activity and defensive behaviors. Nat. Commun. 16, 7187 (2025). doi: 10.1038/s41467-025-62115-z; pmid: 40764295

52. F. Kermen, P. Lal, N. G. Faturos, E. Yaksi, Interhemispheric connections between olfactory bulbs improve odor detection. PLOS Biol. 18, e3000701 (2020). doi: 10.1371/journal.pbio.3000701; pmid: 32310946

53. A. T. Trinh, E. Harvey-Girard, F. Teixeira, L. Maler, Cryptic laminar and columnar organization in the dorsolateral pallium of a weakly electric fish. J. Comp. Neurol. 524, 408–428 (2016). doi: 10.1002/cne.23874; pmid: 26234725

54. M. D. Petkova et al., A connectomic resource for neural cataloguing and circuit dissection of the larval zebrafish brain. bioRxiv, 2025.2006.2010.658982 (2025).

55. E. G. Jones, The thalamus (Springer Science & Business Media, 2012).

56. N. Miyasaka et al., From the olfactory bulb to higher brain centers: Genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish. J. Neurosci. 29, 4756–4767 (2009). doi: 10.1523/JNEUROSCI.0118-09.2009; pmid: 19369545

57. C. Satou et al., Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development 140, 3927–3931 (2013). doi: 10.1242/dev.099531; pmid: 23946442

58. W. Guido, S. M. Lu, S. M. Sherman, Relative contributions of burst and tonic responses to the receptive field properties of lateral geniculate neurons in the cat. J. Neurophysiol. 68, 2199–2211 (1992). doi: 10.1152/jn.1992.68.6.2199; pmid: 1491266

59. E. J. Ramcharan, J. W. Gnadt, S. M. Sherman, Higher-order thalamic relays burst more than first-order relays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 12236–12241 (2005). doi: 10.1073/pnas.0502843102; pmid: 16099832

60. N. Vladimirov et al., Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nat. Methods 11, 883–884 (2014). doi: 10.1038/nmeth.3040; pmid: 25068735

61. S. K. Jetti, N. Vendrell-Llopis, E. Yaksi, Spontaneous activity governs olfactory representations in spatially organized habenular microcircuits. Curr. Biol. 24, 434–439 (2014). doi: 10.1016/j.cub.2014.01.015; pmid: 24508164

62. C. Diaz Verdugo et al., Glia-neuron interactions underlie state transitions to generalized seizures. Nat. Commun. 10, 3830 (2019). doi: 10.1038/s41467-019-11739-z; pmid: 31444362

63. B. E. Stein, T. R. Stanford, Multisensory integration: Current issues from the perspective of the single neuron. Nat. Rev. Neurosci. 9, 255–266 (2008). doi: 10.1038/nrn2331; pmid: 18354398

64. R. A. Stevenson et al., Identifying and quantifying multisensory integration: A tutorial review. Brain Topogr. 27, 707–730 (2014). doi: 10.1007/s10548-014-0365-7; pmid: 24722880

65. L. A. L. Heap, G. Vanwalleghem, A. W. Thompson, I. A. Favre-Bulle, E. K. Scott, Luminance Changes Drive Directional Startle through a Thalamic Pathway. Neuron 99, 293–301.e4 (2018). doi: 10.1016/j.neuron.2018.06.013; pmid: 29983325

66. H. Baier, M. F. Wullimann, Anatomy and function of retinorecipient arborization fields in zebrafish. J. Comp. Neurol. 529, 3454–3476 (2021). doi: 10.1002/cne.25204; pmid: 34180059

67. A. Kramer, Y. Wu, H. Baier, F. Kubo, Neuronal Architecture of a Visual Center that Processes Optic Flow. Neuron 103, 118–132.e7 (2019). doi: 10.1016/j.neuron.2019.04.018; pmid: 31147153

68. G. López-Bendito, Z. Molnár, Thalamocortical development: How are we going to get there? Nat. Rev. Neurosci. 4, 276–289 (2003). doi: 10.1038/nrn1075; pmid: 12671644

69. J. W. Phillips et al., A repeated molecular architecture across thalamic pathways. Nat. Neurosci. 22, 1925–1935 (2019). doi: 10.1038/s41593-019-0483-3; pmid: 31527803

70. R. G. Northcutt, Forebrain evolution in bony fishes. Brain Res. Bull. 75, 191–205 (2008). doi: 10.1016/j.brainresbull.2007.10.058; pmid: 18331871

71. A. Wallach, A. Melanson, A. Longtin, L. Maler, Mixed selectivity coding of sensory and motor social signals in the thalamus of a weakly electric fish. Curr. Biol. 32, 51–63.e3 (2022). doi: 10.1016/j.cub.2021.10.034; pmid: 34741807

72. M. F. Wullimann, R. G. Northcutt, Visual and electrosensory circuits of the diencephalon in mormyrids: An evolutionary perspective. J. Comp. Neurol. 297, 537–552 (1990). doi: 10.1002/cne.902970407; pmid: 2384612

73. T. Isa, E. Marquez-Legorreta, S. Grillner, E. K. Scott, The tectum/superior colliculus as the vertebrate solution for spatial sensory integration and action. Curr. Biol. 31, R741–R762 (2021). doi: 10.1016/j.cub.2021.04.001; pmid: 34102128

74. J. Yáñez, M. H. Eguiguren, R. Anadón, Neural connections of the torus semicircularis in the adult Zebrafish. J. Comp. Neurol. 532, e25586 (2024). doi: 10.1002/cne.25586; pmid: 38289191

75. Z. Lu, R. R. Fay, Acoustic response properties of single units in the torus semicircularis of the goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 173, 33–48 (1993). doi: 10.1007/BF00209616; pmid: 8366473

76. B. A. Porter, T. Mueller, The Zebrafish Amygdaloid Complex - Functional Ground Plan, Molecular Delineation, and Everted Topology. Front. Neurosci. 14, 608 (2020). doi: 10.3389/fnins.2020.00608; pmid: 32765204

77. S. B. Elliott, E. Harvey-Girard, A. C. Giassi, L. Maler, Hippocampal-like circuitry in the pallium of an electric fish: Possible substrates for recursive pattern separation and completion. J. Comp. Neurol. 525, 8–46 (2017). doi: 10.1002/cne.24060; pmid: 27292574

78. A.-T. Trinh, S. E. Clarke, E. Harvey-Girard, L. Maler, Cellular and Network Mechanisms May Generate Sparse Coding of Sequential Object Encounters in Hippocampal-Like Circuits. eneuro 6, ENEURO.0108–0119.2019 (2019).

79. H. Fotowat, C. Lee, J. J. Jun, L. Maler, Neural activity in a hippocampus-like region of the teleost pallium is associated with active sensing and navigation. eLife 8, e44119 (2019). doi: 10.7554/eLife.44119; pmid: 30942169

80. T. Mueller, Z. Dong, M. A. Berberoglu, S. Guo, The dorsal pallium in zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae, Teleostei). Brain Res. 1381, 95–105 (2011). doi: 10.1016/j.brainres.2010.12.089; pmid: 21219890

81. R. G. Cook, T. B. Patton, T. Shimizu, Functional Segregation of the Entopallium in Pigeons. Philosophy 130, 59–86 (2013). pmid: 25018563

82. A. Hoerder-Suabedissen, Z. Molnár, Development, evolution and pathology of neocortical subplate neurons. Nat. Rev. Neurosci. 16, 133–146 (2015). doi: 10.1038/nrn3915; pmid: 25697157

83. Y. C. Wang, S. Jiang, B. J. Frost, Visual processing in pigeon nucleus rotundus: Luminance, color, motion, and looming subdivisions. Vis. Neurosci. 10, 21–30 (1993). doi: 10.1017/S0952523800003199; pmid: 8424926

84. M. F. Wullimann, Neural origins of basal diencephalon in teleost fishes: Radial versus tangential migration. J. Morphol. 281, 1133–1141 (2020). doi: 10.1002/jmor.21237; pmid: 32710814

85. M. F. Wullimann, N. Mokayes, I. Shainer, E. Kuehn, H. Baier, Genoarchitectonics of the larval zebrafish diencephalon. J. Comp. Neurol. 532, e25549 (2024). doi: 10.1002/cne.25549; pmid: 37983970

86. Y. Ishikawa et al., Developmental origin of diencephalic sensory relay nuclei in teleosts. Brain Behav. Evol. 69, 87–95 (2007). doi: 10.1159/000095197; pmid: 17230016

87. Z. Yao et al., A high-resolution transcriptomic and spatial atlas of cell types in the whole mouse brain. Nature 624, 317–332 (2023). doi: 10.1038/s41586-023-06812-z; pmid: 38092916

88. N. Hecker et al., Enhancer-driven cell type comparison reveals similarities between the mammalian and bird pallium. Science 387, eadp3957 (2025). doi: 10.1126/science.adp3957; pmid: 39946451

89. T. Kato, Y. Yamada, N. Yamamoto, Ascending gustatory pathways to the telencephalon in goldfish. J. Comp. Neurol. 520, 2475–2499 (2012). doi: 10.1002/cne.23049; pmid: 22247053

90. D. Badre, M. D'Esposito, Is the rostro-caudal axis of the frontal lobe hierarchical? Nat. Rev. Neurosci. 10, 659–669 (2009). doi: 10.1038/nrn2667; pmid: 19672274

91. M. Torigoe et al., Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nat. Commun. 12, 5712 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-26010-7; pmid: 34588436

92. M. T. Kaufman et al., The implications of categorical and category-free mixed selectivity on representational geometries. Curr. Opin. Neurobiol. 77, 102644 (2022). doi: 10.1016/j.conb.2022.102644; pmid: 36332415

93. Y. Tanimoto et al., Transgenic tools targeting the basal ganglia reveal both evolutionary conservation and specialization of neural circuits in zebrafish. Cell Rep. 43, 113916 (2024). doi: 10.1016/j.celrep.2024.113916; pmid: 38484735

94. A. B. Arrenberg, F. Del Bene, H. Baier, Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17968–17973 (2009). doi: 10.1073/pnas.0906252106; pmid: 19805086

95. M. Winding et al., The connectome of an insect brain. Science 379, eadd9330 (2023). doi: 10.1126/science.add9330; pmid: 36893230

96. A. M. Fernandes et al., Neural circuitry for stimulus selection in the zebrafish visual system. Neuron 109, 805–822.e6 (2021). doi: 10.1016/j.neuron.2020.12.002; pmid: 33357384

97. F. Del Bene et al., Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science 330, 669–673 (2010). doi: 10.1126/science.1192949; pmid: 21030657

98. M. Privat et al., Sensorimotor Transformations in the Zebrafish Auditory System. Curr. Biol. 29, 4010–4023.e4 (2019). doi: 10.1016/j.cub.2019.10.020; pmid: 31708392

99. K. Asakawa, K. Kawakami, The Tol2-mediated Gal4-UAS method for gene and enhancer trapping in zebrafish. Methods 49, 275–281 (2009). doi: 10.1016/j.ymeth.2009.01.004; pmid: 19835787

100. S. Dorkenwald et al., CAVE: Connectome Annotation Versioning Engine. Nat. Methods 22, 1112–1120 (2025). doi: 10.1038/s41592-024-02426-z; pmid: 40205066

101. M. Pachitariu et al., Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv 061507 [Preprint] (2017); https://doi.org/10.1101/061507.

102. E. Yaksi, R. W. Friedrich, Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods 3, 377–383 (2006). doi: 10.1038/nmeth874; pmid: 16628208

103. C. Cortes, V. Vapnik, Support-Vector Networks. Mach. Learn. 20, 273–297 (1995). doi: 10.1023/A:1022627411411

104. C. Stringer et al., Rastermap: A discovery method for neural population recordings. Nat. Neurosci. 28, 201–212 (2025). doi: 10.1038/s41593-024-01783-4; pmid: 39414974

105. A.-T. Trinh, E. Yaksi, Dataset for Trinh et al., 2026, Sigma2 (2026); https://doi.org/10.11582/2026.gvso70gj.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank M. Ahrens (HHMI, Janelia Farm, USA) and S. Higashijima (Okazaki Institute for Integrative Bioscience, Japan) for the transgenic fish lines. We thank the J. Lichtman and F. Engert labs for open access to whole-brain larval zebrafish EM data and the F. Collman lab for tools enabling automated reconstructions. We also thank S. Eggen, F. Acuña-Hinrichsen, V. Nguyen, and our fish facility support team for technical assistance. We thank M. Witter (NTNU, Norway), L. Maler (University of Ottawa, Canada), and the Yaksi lab for stimulating discussions. Funding: The JSPS KAKENHI grant (JP24K02008) to K.K. The European Horizon Marie-Curie individual postdoctoral fellowship (grant 101066743) to A.-T.T. NFR FRIPRO research grants 239973 and 314212 as well as the RCN Centres of Excellence scheme, project number 332640, to E.Y.. Work in the Yaksi lab is funded by the Kavli Institute for Systems Neuroscience at the Norwegian University of Science and Technology. Author contributions: Conceptualization: A.-T.T., E.Y.; Methodology: A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., M.K., S.K., B.S., K.K., E.Y.; Investigation: A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., M.K., S.K., B.S., E.Y.; Visualization: A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., E.Y.; Funding acquisition: A.-T.T., K.K., E.Y.; Project administration: E.Y.; Supervision: A.-T.T., E.Y.; Writing – original draft: A.-T.T., E.Y.; Writing – review & editing: A.-T.T., A.O., I.d.C.-B., F.C., S.K., B.S., K.K., E.Y. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials availability: Calcium imaging data are available at the NIRD repository (105). The analysis codes and figure-making–associated codes are available online at GitHub (https://github.com/yaksilab/PG-Pallium_

paper). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse. This research was funded in whole or in part by a European Horizon Marie-Curie individual postdoctoral fellowship (grant 101066743); as required the author will make the Author Accepted Manuscript (AAM) version available under a CC BY public copyright license.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aec2171 Figs. S1 to S14; MDAR Reproducibility Checklist; Movies S1 to S4 Submitted 11 September 2025; accepted 22 June 2026; published online 2 July 2026 10.1126/science.aec2171

Autism mutations rewire protein interaction networks to drive neurodevelopmental pathology

Belinda Wang†, Rasika Vartak†, Kelsey M. Hennick†, Yefim Zaltsman†, Zun Zar Chi Naing† et al.

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.ady4523

INTRODUCTION: Autism spectrum disorder (ASD) is characterized by extreme genetic heterogeneity, with more than 250 high-confidence risk (hcASD) genes identified to date. Defined by rare, large-effect coding variants, these genes show functional and developmental convergence in transcriptomic analyses. However, these approaches have provided only limited mechanistic insight and have not identified specific therapeutic targets beyond the genetic variants themselves. Because proteins are the primary functional units of the cell, mapping the physical ASD interactome—and determining how ASD variants rewire it—is essential to move beyond gene lists and broad pathophysiologic themes toward a deeper causal understanding of neurodevelopmental pathology.

RATIONALE: To augment our molecular understanding of ASD, we used affinity purification–mass spectrometry (AP-MS) to map 100 hcASD proteins and 54 patient-derived missense variants, substantially expanding the known ASD protein interaction landscape. By integrating these datasets with AlphaFold structural modeling and functional studies in Xenopus and human forebrain organoids, we investigated whether genetically distinct risk factors converge onto shared biology and if convergent neurodevelopmental phenotypes arise through the selective rewiring of protein-protein interactions (PPIs) by disease-associated variants.

RESULTS: The resulting ASD-PPI network contains more than 1800 interactions, 87% of which were previously unreported. The network, which is enriched in neural progenitor cells (NPCs) of the excitatory lineage, exhibits a highly interconnected architecture, with risk proteins converging onto shared complexes, including

DCAF7. Functional interrogation of selected interactions demonstrated that disruption of the previously uncharacterized DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 complex impairs progenitor proliferation and reduces forebrain size in vivo. Furthermore, patient-derived missense mutations frequently induced convergent PPI rewiring. Distinct FOXP1 mutations, for example, weakened its physical interaction with FOXP4, leading to gain-of-function redistribution of FOXP4 to ectopic genomic targets. In human forebrain organoids, this biochemical rewiring drove premature differentiation of cortical neurons and altered neural activity. Genetic deletion of FOXP4 in a FOXP1-mutant background rescued these neurodevelopmental defects; although the exact mechanism requires further determination, this suggests that the rewired interaction underlies the mutant phenotype.

CONCLUSION: Together, these findings define a dual-layered model of molecular convergence in ASD: convergence through shared interaction networks in the wild-type state and convergence through recurrent functional consequences of interaction rewiring in the mutant state. More broadly, this work establishes a scalable framework for systematic interrogation of the autism proteome, enables prioritization of druggable protein interfaces, and provides a rational foundation for precision therapeutic strategies aimed at restoring neurodevelopmental trajectories. □

Mapping the ASD interactome reveals molecular convergence. (A) Protein interactome of 100 hcASD proteins and 54 patient mutations reveals a highly convergent network of protein complexes. (B) Convergent protein complexes were prioritized for functional validation in human neural progenitors and Xenopus. (C) Mutation-driven rewiring, such as FOXP1-FOXP4 interaction disruption, alters brain development, for example, deep-layer neurogenesis in cortical organoids in FOXP1 mutant organoids. R513C, Arg $^{513}$ →Cys; R513H, Arg $^{513}$ →His; L327P, Leu $^{327}$ →Pro; CRISPRi, CRISPR interference; WT, wild type.

PROTEIN INTERACTIONS

Autism mutations rewire protein interaction networks to drive neurodevelopmental pathology

Belinda Wang $^{1}$ , Rasika Vartak $^{2,3}$ , Kelsey M. Hennick $^{1,4,5}$ , Yefim Zaltsman $^{1}$ †, Zun Zar Chi Naing $^{2,3,6}$ †§, Benjamin J. Polacco $^{2,3}$ , Ali Bashir $^{7}$ , Manon Eckhardt $^{2,3}$ , Mehdi Bouhaddou $^{2,3,6}$ ¶, Jiewei Xu $^{2,3,6}$ , Nawei Sun $^{1}$ , Micaela C. Lasser $^{1}$ , Yuan Zhou $^{2,3}$ , Justin McKeitney $^{2,3}$ , Keelan Z. Guiley $^{7}$ , Pawel Gniewek $^{7}$ , Una Chan $^{8}$ , Naufa Amirani $^{8}$ , Owen Griffiths $^{1,4,5}$ , Nishant Chadha $^{1,4,5}$ , Reshmi Tognatta $^{2,3}$ , Merve Cakir $^{2,3}$ , Martin Gordon $^{2,3}$ , Prachi Khare $^{2,3}$ , Sam Drake $^{1}$ #, Vanessa Drury $^{1}$ , David F. Burke $^{9}$ , Silvano Gonzalez $^{1}$ , Sahar Alkhairy $^{10}$ , Reuben Thomas $^{3}$ , Stephanie Lam $^{8}$ , Montana Morris $^{1}$ ††, Ethel Bader $^{1}$ , Mélanie Dos Santos $^{11}$ , Anastassia V. Komarova $^{11}$ , Maxwell Bennett $^{2,3}$ , Craig Ennis $^{2}$ , Octavio Castillo $^{1,2}$ , Yvonne Lim $^{2}$ , Robert Martin $^{2}$ , Meghan Seyler $^{1}$ ‡‡, Tierney Baum $^{1}$ §§, Rebecca Krasnoff $^{1}$ ¶¶, George Wang $^{1}$ , Sagnik Middya $^{1,4,5}$ , Sheng Wang $^{1}$ , Presley Pham $^{1}$ , Juan Arbelaez $^{1}$ , Dexter Pratt $^{12,13}$ , Sofia Bali $^{14}$ , Shivali Chag $^{2}$ , Julia A. Kaye $^{8,15}$ , Nadir Mahmood $^{7}$ ##, Lee Spraggon $^{2}$ , Thomas Rolland $^{16}$ , Shawn Hervey-Jumper $^{17}$ , James S. Fraser $^{2,14}$ , Thomas Bourgeron $^{16}$ , Steven Finkbeiner $^{8,15,18,19,20}$ , Caroline Demeret $^{11}$ , Danielle L. Swaney $^{2,3,6,19}$ , Sourav Bandyopadhyay $^{7}$ , Trey Ideker $^{12,13}$ , Pedro Beltrao $^{9,21}$ , Helen Rankin Willsey $^{1,22}$ , Ruth Hüttenhain $^{2,3,6}$ †††, Kirsten Obernier $^{2,3,}$ , Tomasz J. Nowakowski $^{1,2,4,5,17,23,}$ , Matthew W. State $^{1,2,24,}$ , A. Jeremy Willsey $^{1}$ ‡‡‡, Nevan J. Krogan $^{2,3,6,14*}$

Systematic mapping of protein-protein interaction (PPI) networks and determining how causal mutations rewire them in autism spectrum disorder (ASD) provide a powerful framework for uncovering disease mechanisms and therapeutic opportunities. Using affinity purification–mass spectrometry, we systematically mapped PPIs for 100 high-confidence ASD genes, uncovering more than 1800 interactions. By assessing the impact of pathogenic missense mutations, leveraging AlphaFold, and validating key findings in human-derived model systems, we identified marked convergence onto shared protein complexes in the wild-type state and convergent PPI rewiring driven by independent mutations. For example, distinct patient-derived variants in FOXP1 disrupt its interactions with FOXP4, leading to changes in cortical neurogenesis and neural activity in brain organoids. Overall, these findings link genetic variation to protein networks and convergent neurodevelopmental dysfunction in ASD.

Autism spectrum disorder (ASD) is a highly heritable neurodevelopmental syndrome characterized by marked genetic heterogeneity and interindividual clinical variability $(1-3)$ . Over the past 15 years, whole-exome sequencing studies have identified more than 250 large-effect risk genes based on rare, often de novo, protein-damaging variants $(4-7)$ . These large-effect coding mutations are strongly enriched among the most severely impaired individuals with ASD and co-occurring neurodevelopmental disorders, including intellectual disability, epilepsy, minimal or absent speech, and severe motor delay.

Despite this progress, translating high-confidence ASD risk (hcASD) genes into a deeper understanding of pathophysiology—and ultimately into effective, targeted therapies for the most severe forms of the disorder—remains a major challenge (8). This difficulty stems from extensive pleiotropy, the dynamism of the developing human brain, and limited knowledge of the physical interactions of ASD risk proteins and how mutations alter the structure and function of these protein complexes (9, 10). Two central unresolved questions are the degree to which diverse ASD proteins converge onto shared molecular complexes and how specific disease-causing mutations alter protein structure, interactions, function, and, ultimately, neurodevelopment.

One promising strategy is to examine bona fide ASD risk genes at the level of protein-protein interactions (PPIs) and whether disease-associated coding mutations selectively disrupt or rewire these interactions rather than simply abolishing gene function $(11)$ . If hcASD-associated mutations converge by rewiring shared protein complexes, then PPI networks should point to targetable causal mechanisms linking genetic variation to neurodevelopmental dysfunction. Testing this hypothesis requires systematic, large-scale, disease-relevant interaction maps that resolve both wild-type (WT) interactions and mutation-specific perturbations across a substantial fraction of the ASD proteome. However, such maps have been largely lacking.

Here, using affinity purification–mass spectrometry (AP-MS), we mapped PPIs for 100 hcASD genes and 54 patient-derived pathogenic variants (4). We generated these interaction maps in human embryonic kidney (HEK) 293 T cells to enable scalability and cross-disease comparability and then validated key findings across multiple experimental systems, including Xenopus tropicalis, human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neural progenitors, and forebrain organoids. This approach revealed a dual-layered architecture of molecular convergence in ASD: stable convergence of risk proteins onto shared complexes in the WT state and convergent patterns of mutation-induced PPI rewiring.

We demonstrate that proteins interacting with these 100 ASD risk genes form a highly interconnected network that recapitulates ASD-relevant risk gene expression patterns in the developing human brain and is enriched for additional ASD risk genes, but not schizophrenia risk genes. Functional validation of key interactions confirms that these mutations perturb early neurogenesis and alter electrophysiological properties. Together, these results indicate that genetically heterogeneous ASD risk genes and distinct mutations converge onto complexes and rewire PPIs, providing a mechanistic framework linking genetic variation to protein structure and function and, ultimately, to convergent neurodevelopmental pathology.

PPI mapping reveals ASD networks

We evaluated structural and functional relationships among identified hcASD genes (4) (Fig. 1A) through the mapping of 100 Streptagged hcASD proteins individually expressed in HEK293T cells using AP-MS, generating an ASD PPI network (ASD-PPI) (Fig. 1B; fig. S1, A to C; and table S1). HEK293T cells provide the tractability, proteomic depth, and established benchmarks required for high-throughput PPI mapping. This approach has previously enabled the large-scale identification of bona fide, stable, and often stoichiometric physical interactions present across cell types for cancer, heart disease, neurodegeneration, and infectious diseases [for example, see (12–19)]. The resulting network connects 100 hcASD proteins with 1074 unique high-confidence interactors via 1881 total interactions. These include 87% previously unidentified interactions, with a median of 11 interactors per hcASD protein (Fig. 1, C and D). These interactions reveal strong interconnectivity among hcASD proteins and convergence onto shared interactors and complexes (see next sections). The ASD-PPI captures a broader interaction landscape than existing PPI databases (Fig. 1E) and overlaps substantially with previously published, smaller ASD-PPI networks generated in neuronal cultures or brain tissue (fig. S1D and table S1), thus supporting its biological relevance.

A

B

C

D

E

Fig. 1. hcASD protein interaction mapping reveals interactors. (A) Study overview showing prior functional annotations of 100 hcASD genes, highlighting the most significant two genes per category [FDR < 0.05; (4)], generation of WT (ASD-PPI) and patient-derived mutant ( $ASD_{mut}$ -PPI) interaction networks, and downstream studies. (B) Workflow to generate PPI data for 100 hcASD genes in HEK293T cells. (C) Bar graph showing distribution of interactions within the ASD-PPI. (D) The distribution of the number of interactors per hcASD protein (median = 11). The red line indicates the LOESS-smoothed curve of the distribution. (E) Comparison of the number of hcASD proteins profiled and the number of hcASD-associated interactions in ASD-PPI and existing large-scale PPI datasets (54,67,68,89,90). Point size reflects the number of unique interactors for each dataset.

$^{1}$ Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, UCSF Weill Institute for Neurosciences, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{2}$ Quantitative Biosciences Institute, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{3}$ Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology, J. David Gladstone Institutes, San Francisco, CA, USA. $^{4}$ Department of Anatomy, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{5}$ Eli and Edythe Broad Center for Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{6}$ Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{7}$ Rezo Therapeutics, San Francisco, CA, USA. $^{8}$ Center for Systems and Therapeutics, Gladstone Institutes, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{9}$ European Molecular Biology Laboratory, European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Wellcome Genome Campus, Cambridge, UK. $^{10}$ Department of Computer Science and Engineering, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. $^{11}$ Interactomics, RNA and Immunity, Institut Pasteur, Paris, France. $^{12}$ Department of Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. $^{13}$ Institute for Genomic Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. $^{14}$ Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{15}$ Taube/Koret Center for Neurodegenerative Disease, Gladstone Institutes, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{16}$ Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, UMR3571 CNRS, IUF, Université Paris Cité, Paris, France. $^{17}$ Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{18}$ Department of Neurology, University of California, San Francisco, CA, USA. $^{19}$ Department of Physiology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{20}$ Neuroscience Graduate Program and Biomedical Sciences Program, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{21}$ Institute of Molecular Systems Biology, Department of Biology, ETH Zürich, Zurich, Switzerland. $^{22}$ Biohub, San Francisco, CA, USA. $^{23}$ Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. $^{24}$ Langley Porter Psychiatric Institute, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. *Corresponding author. Email: nevan.krogan@ucsf.edu (N.J.K.); jeremy@willseylab.com (A.J.W.); matthew.state@ucsf.edu (M.W.S.); tomasz.nowakowski@ucsf.edu (T.J.N.); kirsten. obernier@ucsf.edu (K.O.) †These authors contributed equally to this work. ‡Present address: Maze Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. §Present address: AstraZeneca, Boston, MA, USA. ¶Present address: Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA. #Present address: Altos Labs, South San Francisco, CA, USA. **Present address: Columbia University Mailman School of Public Health, New York, NY, USA. ††Present address: New York University Langone Medical Center, New York, NY, USA. ‡‡Present address: WAP Sustainability Consulting, Chattanooga, TN, USA. §§Present address: Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, Nashville, TN, USA. ¶¶Present address: New York University School of Medicine, New York, NY, USA. ##Present address: Nkarta, Inc., South San Francisco, CA, USA. †††Present address: Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford, Stanford, CA, USA. ‡‡‡Present address: Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA.

ASD-PPI interactors are expressed in the human brain and enriched for ASD genetic risk

ASD-PPI interactors recapitulate core transcriptional and genetic features of ASD risk genes. In RNA sequencing (RNA-seq) data from developing $(20)$ and adult human brain $(21)$ , the subset of interactors excluding hcASD genes (interactors $^{no\ hcASD}$ , n = 1043) is highly expressed in brain tissue and closely tracks hcASD gene expression patterns across pre- and postnatal development (Fig. 2, A to C; fig. S2A; and table S2). This subset recapitulates core expression signatures of ASD-associated genes, including elevated expression in prenatal cortex $(22)$ and adult cortex and cerebellum (fig. S2, B and C; and table S2) and shows intermediate evolutionary constraint greater than the HEK293T proteome but lower than hcASD genes (fig. S2D and table S2), suggesting that they may contribute to ASD through polygenic mechanisms. ASD-associated de novo damaging variants are enriched in both the full set of interactors (interactors, n = 1074) and interactors $^{no\ hcASD}$ , but not in the rest of the HEK293T proteome (Fig. 2D and table S2), indicating that the interactors themselves are genetically associated with ASD. This enrichment magnitude is comparable to interactors from ASD networks generated in neuronal cultures $(23)$ and from brain tissue $(24, 25)$ (fig. S2, E to G). ASD-PPI interactors also strongly overlap with ASD risk genes identified from recent large-scale sequencing studies $(5-7)$ , but not with genes implicated in schizophrenia $(26)$ , supporting a degree of specificity (Fig. 2E, fig. S2H, and table S2). To explore the potential of ASD-PPI for ASD gene discovery, we modeled networks of increasing size. As more hcASD genes are incorporated, enrichment of ASD-associated genetic variants progressively concentrates within interactors $^{no\ hcASD}$ (Fig. 2F) and captures a growing number of known and newly identified risk genes (hcASD+) $(6)$ , with no sign of saturation at 100 hcASD genes (Fig. 2G), suggesting that expanding the network could reveal additional risk genes. Together, these orthogonal analyses demonstrate that ASD-PPI captures ASD-relevant interactions.

To pinpoint ASD-relevant cell types, we examined ASD-PPI network expression in a prenatal human brain single-cell RNA-seq (scRNA-seq) atlas spanning cortical and subcortical cell types $(27)$ (Fig. 2H). Previous studies have implicated postmitotic excitatory and inhibitory neurons (ENs and INs) $(4, 6)$ . ASD-PPI shows strongest network expression in postmitotic ENs, with some enrichment in INs (Fig. 2I). However, expanding ASD-PPI by incorporating connections between interactors from the PPI meta database STRING $(28)$ increases the statistical weight of the highly connected interactors in the network. This reframing from a risk gene-centric to interactome-centric view shifted the enrichment away from mature neurons and toward neural progenitor cells (NPCs) of excitatory neurons (NPC-ENs) and, to a lesser extent, of inhibitory neurons (NPC-INs) (Fig. 2I). This pattern was consistent across three independent prenatal brain atlases (fig. S2I and table S2) and recapitulated with a smaller network generated in neurons [iPSC-derived EN PPI network (iEN-PPI) $(23)$ ; Fig. 2I]. These results indicate that ASD-relevant protein interactomes converge primarily on EN generation and early differentiation, a shift from prior reports that broadly implicated postmitotic neurons based on enrichment of hcASD genes alone $(4, 6)$ .

ASD-PPI reveals molecular convergence

Organizing hcASD proteins and their interactors by connectivity and similarity in Gene Ontology annotations $(29)$ (Fig. 3A and table S3) showed functional convergence consistent with previous results $(10, 22, 30, 31)$ . The ASD-PPI network shows high connectivity: 31% of hcASD proteins interact with each other, whereas 35% of interactors bind multiple hcASD proteins (fig. S3A and table S3), suggesting functional overlap. Consistent with this, the network exhibits an increase in edge density and average node degree, measures associated with molecular convergence, while demonstrating low modularity (Fig. 3B and fig. S3B). This reflects a dense, interconnected landscape across hcASD proteins rather than segregation into isolated modules. These values are more extreme than those observed in previously published AP-MS networks organized around unified biological themes, such as tyrosine kinases $[n = 90 (32)]$ or breast cancer genes $[n = 39 (12)]$ , indicating stronger molecular convergence in ASD-PPI (Fig. 3B and fig. S3B). Stratifying hcASD proteins by clinical phenotype $[ASD-predominant (ASD_{p}) versus broad neurodevelopmental (ASD_{NDD}) (4)]$ shows no increase in interactor overlap, suggesting no functional distinction between these hcASD subgroups (fig. S3, B and C; and table S3).

Several hcASD proteins interact with protein complexes previously linked to ASD through both known and previously unknown interactions. These include the Sin3 complex [progenitor cell proliferation and differentiation (33, 34)], the Mediator complex [transcription and neural stem cell identity (35, 36)], and the PAF1 complex [progenitor proliferation and neuronal migration (37–39)], with subunits CTR9 and LEO1 near or just below the threshold for high-confidence ASD association (Fig. 3, C to E; and fig. S3, D and E). Although individual components of the PAF1 complex did not meet the statistical thresholds for hcASD genes (4, 6), their high degree of connectivity to multiple hcASD proteins suggests a collective role in ASD pathobiology, consistent with recent clinical genetic evidence supporting PAF1 complex member LEO1 as an ASD risk gene (40). Additionally, 17 hcASD genes interact with the AP2-associated clathrin-mediated endocytosis complex (Fig. 3F), suggesting that these genes have diverse roles beyond gene regulation.

ASD-PPI is enriched for disease-relevant direct PPIs as predicted by AlphaFold

ASD-PPI includes both direct and indirect PPIs. To identify direct binding partners and their three-dimensional (3D) interaction interfaces, we repurposed AlphaFold-Multimer (AF) $(41, 42)$ to screen our ASD-PPI, which constrains the prediction of hcASD protein interactions across the human proteome to 1881 experimentally supported interactions (Fig. 4A and table S4). This included both hcASD-protein–interactor (hcASD-int; ASD-PPI) and interactor-interactor (int-int) pairs, the latter not directly assayed by our AP-MS. To identify a robust predictor of direct interactions, we evaluated several AF-derived metrics. The mean interface-predicted template modeling-score (mean ipTM) $(41)$ , which reflects the consistency and accuracy of predicted interaction interfaces, best distinguished hcASD-int pairs from negative controls (hcASD-random), with scores above 0.5 showing a 5- to 10-fold enrichment for likely direct contacts (Fig. 4B and fig. S4, A and B). This identified 113 high-confidence direct hcASD protein interactions [false discovery rate (FDR) 10 to 20%, 49 of 113 were previously unrecognized] (fig. S4C and table S4) and 466 indirect interactors connected to hcASD proteins via intermediate binding partners (int-int links; Fig. 4C and table S4). ASD-PPI showed nearly twice the rate of predicted direct interactions compared with iEN-PPI $(23)$ , suggesting that ASD-PPI is enriched for direct PPIs.

We validated a subset of predicted interactions using the NanoLuc (N2H) split luciferase binary interaction assay $(43, 44)$ , confirming 12 of 37 tested pairs ( $\sim32\%$ ) as direct binders (fig. S4D), in range with N2H performance on known direct interactors and greater than the 10 to 15% typically observed for AP-MS data $(45-47)$ . Several pairs that were negative in N2H (for example, NUP155-SMPD4, SETD5-TBL1X, GNAI1-TNFAIP8, DYRK1A-KIAA0232, and DYRK1A-DCAF7) were confirmed by immunohistochemistry-based colocalization in NPCs, providing orthogonal support for their physical proximity (fig. S4E and also see fig. S5E). The previously unknown PPI and AF-predicted interaction between NUP155 and SMPD4 (Fig. 4G), a protein linked to microcephaly $(48)$ , highlights the approach's value for uncovering key interactions in neurodevelopmental conditions.

The interaction between hcASD protein DYRK1A and DCAF7 exemplifies a high-confidence AF interface prediction (Fig. 4, B and D to F). Although established $(49)$ , its 3D structure remains unsolved. The

A

C

G

Fig. 2. ASD-PPI interactors are expressed in brain and enriched for ASD genetic risk. (A) Expression of hcASD genes, interactors $^{no\ hcASD}$ , and other HEK293T proteins in prenatal brain (20). (B and C) Expression correlation of hcASD genes versus interactors $^{no\ hcASD}$ across 524 brain samples [Pearson's coefficient of determination ( $R^{2}$ ) = 0.81, $P < 1 \times 10^{-15}$ ] (B) and developmental periods [(C) Spearman's correlation coefficient ( $\rho$ ) = 0.946]. (D and E) Interactor enrichment for ASD de novo damaging mutations (D) and ASD or schizophrenia risk genes (5–7,26) (E). (F and G) Effect of bait number on interactor ASD risk enrichment (F) and hcASD+ recovery (G). Shading in (G) indicates ±1 SD from the median across 1000 permutations. OR, odds ratio. (H) Prenatal brain scRNA-seq t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) (27). Endoth., endothelial; Div., dividing; Prog., progenitor; OPC, oligodendrocyte precursor cell. (I) Relative coexpression of ASD-PPI and iEN-PPI networks across cell types with and without STRING. Color indicates edge coexpression relative to other cell types for nominally significant cell types (P < 0.05); gray indicates others. Data were analyzed by Student's t test (A), one-sided Fisher's exact test [(D), (F), and (G)], or Wilcoxon rank-sum test (I). Nominally significant is P < 0.05, and significant is Bonferroni-adjusted P < 0.05. For boxplots, the center line represents the median, box limits are the interquartile range (IQR), and whiskers are ±1.5 × IQR. For dot-whisker plots, OR is ±95% confidence interval (CI). n.s. is not significant, *0.01 < P < 0.05, **0.001 < P < 0.01, and ***P < 0.001.

B

A

C

E

Fig. 3. ASD-PPI demonstrates molecular convergence among hcASD proteins. (A) ASD-PPI network map, with hcASD proteins and interactors positioned based on connectivity (AP-MS) and shared Gene Ontology (GO) terms. Interactor color reflects representative enriched GO categories that were selected to maximize coverage while minimizing redundancy. (B) Interactor overlap among bait pairs in ASD-PPI, breast cancer PPI (12), and kinome PPI (32), shown as the proportion of significant pairwise overlaps (hypergeometric $P < 0.05$ ). Proportions were converted to Z scores separately for each network by comparison with 1000 random degree-matched BioPlex networks (violins). (C to F) PPI networks showing hcASD protein interactions with the Sin3 (C), Mediator (D), PAF1 (E), and AP2-mediated clathrin-coated pit (F) complexes. Dark lines indicate AP-MS edges, thin gray lines indicate CORUM or STRING edges, and gray shading denotes CORUM complexes.

predicted interface matches the known DCAF7-binding region of DYRK1A (residues 80 to 100) (50) and shows high evolutionary conservation, consistent with selective pressure to preserve functionally important binding (Fig. 4, E and F). Deletion of this region (DYRK1A $^{\Delta80-100}$ ) disrupts binding to DCAF7 but not to FAM54C, which binds the DYRK1A catalytic domain (residues 156 to 479) (51) (fig. S4F and table S4). These findings demonstrate the ability of AF to predict direct PPIs as well as the specific interfaces mediating these interactions. We further confirmed that AF-predicted interfaces can model the impact of patient mutations: Targeted mutagenesis of the GNAI1-RIC8A interface showed that binding affinity correlates with predicted pathogenicity (see next sections and fig. S8E).

A

B

C

D

G

E

F

H

Fig. 4. AF predicts direct PPI interaction interfaces. (A) Workflow for AF interface predictions of hcASD-int (n = 1763) and int-int (n = 29,850) pairs. Example subnetwork shows AF-predicted edges linking two hcASD proteins via int-int interactions (purple). (B) Distribution of AF ipTM scores across PPI sets. The dotted line indicates the ipTM = 0.5 threshold, where hcASD protein-int pairs have \~5-fold enrichment over random controls. The comparison includes iEN-PPI (23) and hcASD-random (negative control). (C) Interactor counts per hcASD protein (gray), highlighting those predicted as direct by AF (blue). Purple lines denote interactors connected to hcASD proteins via AF-validated direct or mediated (int-int) paths. For hcASD proteins lacking direct AF edges, red lines indicate the largest AF-validated interactor complex. (D to F) AF-predicted DYRK1A-DCAF7 structure (D) colored by model confidence [predicted local distance difference test (pLDDT); (E)] or sequence conservation [ConSurf; (F)]. (G) AF-predicted NUP155-SMPD4 structure. (H) Relative coexpression of ASD-PPIs with or without AF int-int edges across brain cell types [(27); see Fig. 2H]. Color reflects relative network edge coexpression in each cell type compared with all others (Wilcoxon rank-sum test, estimated median difference). Nominally significant cell types (P < 0.05) are colored, and others are gray.

To determine whether the AF-supported direct interactome is enriched in specific cell types, we evaluated its expression across the three prenatal brain scRNA-seq cell atlases (27, 52, 53) as described above (see Fig. 2I and fig. S2I). The 113 AF-predicted direct hcASD-int pairs showed no cell-type enrichment; however, the inclusion of AF-predicted int-int connections led to an enrichment in NPCs, particularly NPC-ENs (Fig. 4H, fig. S4G, and table S4), consistent with our STRING-based findings (see previous sections; Fig. 2I and fig. S2I). This pattern was recapitulated with iEN-PPI (Fig. 2I and fig. S2I). Thus, the ASD interactome converges primarily on the generation and early differentiation of the excitatory lineage.

The DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 complex regulates neurogenesis and differentiation

To further explore molecular convergence, we focused on seven “hub interactors” that bind eight or more hcASD proteins (Fig. 5A and fig. S3A). Only the DCAF7 interactome showed strong enrichment for additional ASD risk genes [hcASD+; (6)] in available interactomes (54), suggesting that hcASD proteins converge on DCAF7 (Fig. 5B and table S5).

DCAF7 is an adaptor protein that interacts with hcASD proteins such as DYRK1A, regulating its nuclear translocation and protein interactions (for example, with HAP1) $(55)$ , and AUTS2 and SKI to regulate neuronal lineage specification, highlighting its role in neurodevelopment $(56)$ . Comparing interactor overlap with DCAF7 and its binding hcASD partners revealed that hcASD proteins DYRK1A and previously uncharacterized KIAA0232 share substantial interactor overlap with DCAF7 (Fig. 5D and table S5), and AF predicted both to be direct DCAF7 interactors (table S4). Endogenous DYRK1A AP-MS in iPSC-derived iENs recovered DCAF7 and KIAA0232 and showed considerable overlap with HEK293T cell-derived interactors (fig. S5, A and B). Sequential AP-MS in HEK293T cells further confirmed that these three proteins physically interact as a complex, whose 126 shared interactors are enriched for hcASD+ (Fig. 5E and fig. S5, C and D). All three proteins localize to mitotic spindles in HEK cells and NPCs (fig. S5E), consistent with previous findings for DYRK1A in Xenopus and human NPCs $(57, 58)$ . Furthermore, ASD-PPI interactors are enriched for proteins associated with mitotic spindle organization, such as centriolar satellites and centrosomes (fig. S5F and table S5).

We evaluated whether DCAF7, DYRK1A, and KIAA0232 share neurodevelopmental functions in vivo. Prior work showed that DYRK1A loss in Xenopus disrupts the cell cycle, increases apoptosis, and reduces telencephalon size (58). Using CRISPR-Cas9 mutagenesis in Xenopus, we found that knockout (deletion; KO) of dcaf7 or kiaa0232 phenocopies dyrk1a loss, reducing telencephalon size and linking this complex to an ASD-associated phenotype (Fig. 5F and table S5). To relate this to human clinical presentations, we analyzed cortical organoid scRNA-seq data from idiopathic ASD patients (59): The DCAF7-hcASD protein subnetwork was enriched among differentially expressed genes (DEGs) in normocephalic, but not macrocephalic, ASD (fig. S5G). This suggests that DCAF7 interactions contribute to ASD presentations without macrocephaly, consistent with the reduced forebrain growth observed in Xenopus.

To investigate cellular mechanisms, we used CRISPR-mediated knockdown (KD) in human iPSC-derived NPCs to reduce expression of DCAF7, DYRK1A, or KIAA0232. DCAF7 KD increased cell death during neuronal differentiation (fig. S5, H and I; and table S5), consistent with DCAF7's role in promoting cell viability (60). KD of either DCAF7 or KIAA0232 reduced the proportion of Ki67-positive NPCs, indicating impaired progenitor proliferation (fig. S5, J and K; and table S5). Global proteomics revealed coordinated changes after DCAF7 or KIAA0232 KD in NPCs (fig. S6A), enriched for hcASD+ and cell cycle, chromatin, and transcriptional regulators (fig. S6, B and C; and table S5). By contrast, DYRK1A KD modestly increased Ki67-positive NPCs (fig. S5, J and K), consistent with dose-dependent DYRK1A effects (61, 62). Indeed, although DYRK1A mRNA was markedly reduced, global proteomics detected only a marginal decrease in DYRK1A protein amounts (fig. S6D), suggesting robust posttranscriptional buffering in NPCs. Despite this buffering, the expression of critical neurogenic transcription factors—PAX6, FOXG1, and SOX2—that are in part regulated by DYRK1A (63–65) was down-regulated upon KD of all three complex members (Fig. 5, G and H; and table S5). Collectively, these data indicate that disruption of the DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 complex impairs neurogenesis across species.

hcASD gene missense mutations alter PPIs and result in convergent interaction changes

We next assessed how 54 patient-derived damaging de novo missense mutations predicted to be highly deleterious (4) across 30 hcASD proteins reconfigure PPIs (Fig. 6A and table S6). This mutant network $(\mathrm{ASD}_{\mathrm{mut}}\text{-PPI})$ identified 253 significantly altered interactions $(P < 0.05)$ , both gained or strengthened and lost or weakened (Fig. 6, B to D; table S6; and materials and methods). Lost interactions (136; 95 unique interactors) were enriched for hcASD proteins (fig. S7A and table S6), supporting a primary loss-of-function mechanism (66). Mapping these interactions in human NPCs confirmed strong overlap with our HEK293T data, with shared interactors significantly enriched for both mutation-sensitive and AF-predicted direct links (Fig. 6D, fig. S7B, and table S6), supporting network robustness across cellular contexts.

Given the convergence in ASD-PPI, we examined whether missense mutations in the same or across different hcASD genes cause shared protein interaction changes. In the 13 hcASD proteins with multiple variants, 45% of altered interactions were replicated across two or more mutants (for example, SLC6A1 and FOXP1 mutants; Fig. 6D and table S6). We additionally identified 15 interactors that showed consistent changes across two different hcASD mutants; for example, three FOXP1 mutants and one FOXP2 mutant lose interaction with FOXP4 (Fig. 6D; fig. S7, C and D; and table S6).

Integrating ASD $_{mut}$ -PPI with other PPI networks (23, 54, 67–70) (see materials and methods, fig. S7E, and table S6) revealed that differential interactions consistently converge on the functional modules identified in the WT network (Fig. 3, C to F). For example, both MKX mutants $[Arg^{93}\rightarrow Gly(R93G), L89F]$ enhance interactions with the Sin3 transcriptional repression complex, whereas both MYT1L mutants (H522Q, C504R) reduce interactions with the Mediator complex, suggesting dysregulation of gene expression regulation. Similarly, both STXBP1 mutants (R551C, A251T) and both AP2S1 mutants (R10W, G64D) show stronger interactions with vesicle transport and clathrin complexes, respectively. Collectively, these findings indicate that patient-derived mutation-driven interaction changes converge on key biological processes that govern neurodevelopment. [Single-letter abbreviations for the amino acid residues are as follows: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; and Y, Tyr.]

We next leveraged AF to prioritize direct interactions where an hcASD gene mutation is located at the predicted interaction interface (<10 Å; see materials and methods) (Fig. 7A). This identified 34 mutations across 22 hcASD genes at the interface of 216 interactions (table S7). Forty-six percent of interactions weakened in the mutant state are associated with a mutation at the interface, versus only 18% of strengthened interactions, suggesting that interface mutations are primarily disruptive (fig. S8A and table S7). For example, the PPP2R5D E198K mutation directly contacts the interaction interface (1.6 Å), leading to the loss of interaction with PPP4C (Fig. 7, B and C; and fig. S8B). By contrast, a mutation in GNAI1 I319T more distant to its interface with RIC8A (71) (6.1 Å) strengthens the PPI (Fig. 7, D and E; and fig. S8C). Targeted mutagenesis of this residue revealed that interaction affinity correlates with predicted pathogenicity: Whereas the benign variant I319V showed no change, three damaging variants altered RIC8A binding (fig. S8E). Finally, three FOXP1 missense variants evaluated in ASD $_{mut}$ -PPI disrupt its interaction with FOXP4 (Fig. 7F) and are predicted to be highly pathogenic (fig. S8F and table S7). Despite residing at different structural locations—FOXP1 R513H at the DNA interface and FOXP1 L327P at the FOXP1-FOXP4 interface (Fig. 7G, fig. S8D, and movie S1)—all variants consistently weaken the FOXP1-FOXP4 association (Fig. 7, H and I), which led us to prioritize FOXP1 for additional functional investigation.

A
Identify ASD-PPI hub interactors that bind ≥ 8 hcASD proteins

B

C

Prioritize DCAF7

D
Identify hcASD proteins with significant overlap with DCAF7 BioGRID interactors

E
Confirm DCAF7-DYRK1A-KIAA0232 interaction

H

F
G

Fig. 5. DCAF7 forms a complex with multiple hcASD proteins. (A) ASD-PPI “hub” interactors binding ≥8 hcASD proteins. (B) Enrichment of hcASD+ in known interactomes of hub interactors from BioGRID (54). The dashed line indicates OR = 1 (no enrichment). (C) Hub interactor DCAF7 binds eight hcASD proteins in ASD-PPI. (D) Overlap between DCAF7 BioGRID interactors and ASD-PPI interactors of hcASD proteins bound by DCAF7. (E) MS sequence coverage from sequential immunoprecipitation of DYRK1A and KIAA0232. (F) Xenopus telencephalon size after unilateral single guide RNA (sgRNA) injection targeting Dcaf7, Dyrk1a, or Kiaa0232 versus nontargeting control (sgNTC). Scale bar is 50 μm. (G) CRISPR KD in NPCs of DYRK1A (pink), DCAF7 (purple), and KIAA0232 (blue) mRNA in respective cell lines. (H) Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in KD NPCs showing PAX6, SOX2, and FOXG1 expression versus NTC expression. Data were analyzed by Fisher’s exact test (one sided, greater) [(B) and (D)], paired t test (F), or one-way analysis of variance (ANOVA) (H). P values are unadjusted (B) or corrected using the Bonferroni (D) or Dunnett (H) method. For dot-whisker plots in (B) to (D), dots represent OR, and whiskers represent 95% CI. For bar graphs, data are means ± SEM (n = 3 biological replicates). n.s. is not significant, *0.01 < P < 0.05, **0.001 < P < 0.01, and ***P < 0.001.

Collectively, our analysis of the WT and mutant networks revealed a dual-layered molecular convergence. First, the WT ASD-PPI identifies stable “molecular crossroads”—hub interactors such as DCAF7 that link disparate hcASD proteins into unified complexes. Second, the ASD $_{mut}$ -PPI reveals a “functional convergence” of patient-derived variants;

A

D

Fig. 6. Patient-derived hcASD gene missense mutations alter protein interactions. (A) Overview of the generation of the ASD patient-derived mutant network ( $ASD_{mut}$ -PPI). (B) Interaction changes between mutant and WT hcASD proteins, grouped by hcASD proteins with mutations labeled on the x axis. Significantly weakened (blue) or strengthened (red) hcASD protein interactions are highlighted, with mutant- or WT-specific interactions plotted at $\log_{2}FC$ (fold change) = $\infty$ and $-\infty$ , respectively. (C) Quantification of differential protein interactions showing hcASD mutant–enriched interactions (red) and WT hcASD–enriched interactions (blue). (D) Network view of significant differential interactions in $ASD_{mut}$ -PPI. Edge color reflects interaction specificity (blue, stronger in WT; red, stronger in mutant), and dashed edges indicate interactions specific to mutant or WT. CORUM protein complexes (yellow) and GO biological processes (blue) highlight functional modules disrupted within and across hcASD proteins. In (B) to (D), data were analyzed by pooled t test on intensity values, with FDR estimated using Storey's q method; interactors with $|\log_{2}FC(\text{Mut}/\text{WT})| \geq 1$ , FDR < 0.1, and P < 0.05 were considered significantly differential.

disparate mutations in the same genes, for example, MKX, STXBP1, and AP2S1, or different genes, for example, FOXP1 and FOXP2, drive similar directional changes in interaction strength within their respective functional modules. This suggests that although ASD risk is genetically heterogeneous, the molecular consequences of these mutations collapse onto a limited set of vulnerable protein systems.

hcASD gene mutations alter cortical neuron differentiation

FOXP1 encodes a forkhead box domain-containing transcription factor expressed in early brain development (72–75). To identify neurodevelopmental processes disrupted by ASD patient variants, we generated isogenic iPSC lines with a FOXP1 $^{R513H}$ allele, selected for its predicted high pathogenicity (Fig. 8, A and B; and fig. S8F). We confirmed the

A

B

D

C

G

H

1

Fig. 7. AF maps hcASD gene mutations to protein structures and interaction interfaces. (A) Workflow to prioritize protein interactions affected by hcASD gene mutations using AP-MS and AF structure predictions. (B, D, and F) Differential ASD ${mut}$ -PPI networks for PPP2R5D $^{E198K}$ (B), GNAI1 $^{I319T}$ (D), and FOXP1 $^{R513H}$ , FOXP1 $^{R513C}$ , and FOXP1 $^{L327P}$ (F). Edge colors and significant differential interactions are as in Fig. 6D. (C, E, and G) AF-predicted interactions for PPP2R5D-PPP4C with E198 at the interaction interface (C), GNAI1-RIC8A with I319 at the interaction interface (E), and model of the FOXP1-FOXP4 (yellow-green) complex visualizing the relative flexibility of structured DNA binding and coiled-coil domains (shown in surface rendering) mediated by interspacing intrinsically disordered regions (coil). Highlighted in red are FOXP1 residues R513 at the FOXP1 DNA-binding interface and L327 at the FOXP1-FOXP4 dimerization interface (G). (H) IP–Western blot of nontransfected control (NTC) or Strep-tagged FOXP1 $^{WT}$ , FOXP1 $^{R513C}$ , FOXP1 $^{R513H}$ , or FOXP1 $^{L327P}$ in HEK293T cells. (I) Quantification of data from (H). Data are shown as means ± SEM (n = 3 biological replicates). Data were analyzed by one-way ANOVA with Dunnett's correction; adjusted $P(P{\mathrm{adj}}) = 0.0011(\mathrm{FOXP1^{R513C}})$ , $P_{adj} = 0.0018(\mathrm{FOXP1^{R513H}})$ , and $P_{adj} = 0.0141(\mathrm{FOXP1^{L327P}})$ .

loss of FOXP1-FOXP4 interaction in FOXP1 $^{R513H/WT}$ iPSC-derived NPCs (fig. S9A) and assessed cell-type composition in organoids using immunostaining at time points that correspond to early (day 39) and late cortical neurogenesis (day 101) (76). During early neurogenesis, we found a reduction in PAX6 $^{+}$ progenitor cells and an increase in the abundance of both BCL11B $^{+}$ layer V neurons and TBR1 $^{+}$ layer VI/subplate neurons in FOXP1 $^{R513H/WT}$ compared with FOXP1 $^{WT/WT}$ (Fig. 8B). At day 101, we found no difference in the abundance of PAX6 $^{+}$ cells, but a reduction in BCL11B $^{+}$ cells in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids (Fig. 8B). The abundance of TBR1 $^{+}$ cells was lower in FOXP1 $^{R513H/WT}$ than in FOXP1 $^{WT/WT}$ , but this difference did not reach statistical significance after correcting for multiple comparisons. Concurrently, D101 FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids exhibited an increase in SATB2 $^{+}$ neurons (fig. S10B). These results suggest premature differentiation of cortical neurons in FOXP1 $^{R513H}$ forebrain organoids, consistent with prior findings across multiple in vivo, in vitro, and in silico models (22, 59, 77, 78).

B

D101

E

C

F

G

H

I

J

K

Fig. 8. hcASD variants alter deep-layer cortical neurogenesis in forebrain organoids. (A) Isogenic iPSC generation and differentiation workflows with validation (R513H; right). (B) Immunofluorescence images showing immunohistochemistry and quantification of PAX6+, TBR1+, and BCL11B+ cells at day 39 and day 101 in FOXP1 R513H/WT versus WT. EGF, epidermal growth factor; FGF, fibroblast growth factor; IHC, immunohistochemistry; SB, SB431542 (neurotrophin-3 and brain-derived neurotrophic factor); IWR, IWR-1-endo (small molecule); LDN, LDN-193189 (small molecule); WB, Western blot. (C and D) CUT&Tag analysis showing DNA binding overlap (C) and genomic distribution (D) of FOXP1 and FOXP4. (E and F) scRNA-seq uniform manifold approximation and projection (UMAP) visualization (E) and cell type-specific DEGs (F) in day 111 organoids. (G) Immunofluorescence images showing rescue of the day 39 differentiation phenotype in FOXP1 R513H/WT upon FOXP4 KO. (H and I) Multielectrode array recordings (H) and representative raster plots (I). (J) Immunofluorescence images showing immunohistochemistry and quantification of the FOXP1 L327 allelic series (WT, heterozygous, homozygous) at day 39 and day 101. (K) Pearson's correlation of EN-3 DEGs between variants. In (B), (G), and (J), data were analyzed by linear mixed model (day 39) or linear regression (day 101) followed by permutation testing and Benjamini-Hochberg correction; n = 10 to 13 organoids [(B); day 39, day 101], n = 2 to 6 [(G); day 39, day 101], n = 8 to 11 [(J); day 39], and n = 5 to 8 [(J); day 101]. Data were analyzed by Wilcoxon rank-sum test with Bonferroni correction in (F) and by one-sided Mann-Whitney U test in (I) with n = 6 organoids. For bar graphs, data are means ± SEM. Scale bars are 50 μm. CP, cortical plate; VZ, ventricular zone-like. n.s. is not significant; *0.01 < P < 0.05; **0.001 < P < 0.01; and ***P < 0.001.

To assess whether the mutation alters DNA binding, we performed CUT&Tag for FOXP1 and FOXP4 (79) (fig. S9B and table S8). In FOXP1 $^{WT/WT}$ organoids, 94.7% of FOXP4 peaks overlapped with FOXP1 peaks (Fig. 8C), consistent with their function as a heterodimer. By contrast, only 67.4% of FOXP4 peaks overlapped with FOXP1-bound peaks in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids (Fig. 8C). Although 85% of FOXP1 peaks in FOXP1 $_{R513H/WT}$ organoids overlap with those observed in FOXP1 $^{WT/WT}$ , only 37% of FOXP1 $^{R513H/WT}$ FOXP4 peaks overlapped with those in FOXP1 $^{WT/WT}$ , with 4700 FOXP4 peaks in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids not found in controls (Fig. 8D). These findings suggest that FOXP1 missense variants affect FOXP4 function, with the loss of FOXP1-FOXP4 physical interaction leads to gain of FOXP4 binding at new genomic sites.

Using scRNA-seq, we identified DEGs between the mutant and WT organoids in ENs. We identified three EN clusters along the maturation trajectory: cortical deep layer 6 and subplate neurons (EN-3: high expression of SOX5, NR4A2, TBR1), deep layer 5/6 neurons (EN-2: high expression of FOXP2, PBX3, and MEIS2), and deep layer 5 neurons (EN-1: high expression of FOXP1, ROBO1, and BCL11B). The greatest number of DEGs were found in the EN-3 cluster (Fig. 8, E and F; and fig. S9, C and D), corresponding to the population displaying premature differentiation in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids (Fig. 8B). DEGs in EN-3 were enriched for FOXP1 and FOXP4 targets (fig. S9E), and up-regulated genes with reduced FOXP1 binding in CUT&Tag were enriched for hcASD+ (fig. S9F and table S8). Of EN-3 DEGs, 43% and 32% showed new FOXP1 and FOXP4 binding, respectively. Furthermore, 21% exhibited a “switch” from lost FOXP1 binding to new FOXP4 binding (fig. S9, F and G; and table S8). These findings suggested a gain of function or loss of specificity of FOXP4 in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids, potentially compensating for or compounding the loss of FOXP1 binding at these loci.

To determine whether the disrupted FOXP1-FOXP4 PPI could contribute to the cortical neurogenesis phenotype (fig. S9A), we generated double-mutant iPSC lines with a loss-of-function mutation in FOXP4 in the FOXP1 $^{R513H/WT}$ background (FOXP1 $^{R513H/WT}$ -FOXP4 $^{KO}$ ; fig. S9H). Forebrain organoids showed deep-layer neuron proportions similar to controls (Fig. 8F). These data suggest that a gain of FOXP4 function may account for the cortical neurogenesis defects in the FOXP1 $^{R513H}$ organoids. Thus, the R513H mutation represents not merely a simple loss of FOXP1 function, but a pathogenic gain of function for its disrupted interactor, FOXP4. Although the exact rescue mechanism needs to be determined, these data demonstrate that FOXP4 deletion suppresses the FOXP1 mutant phenotype.

To connect the cellular defects in FOXP1 $^{R513H/WT}$ to functional properties, we recorded neural activity in organoids using multielectrode arrays. FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids showed consistently higher mean firing rates than the isogenic control organoids (Fig. 8, H and I; and fig. S9I). Additional analyses of population-level parameters did not reveal changes in the spike time tiling coefficient, interspike intervals, and various burst metrics (fig. S9, J and K), suggesting alterations in baseline firing rather than network-wide properties. These results suggest that altered differentiation of cortical neurons observed in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids has functional consequences similar to those observed in independent studies of human stem cell-derived neuronal cultures harboring mutations in hcASD genes (80, 81).

Finally, we examined whether iPSCs carrying the FOXP1 $^{L327P}$ mutation (fig. S10A), which resides at the predicted FOXP1-FOXP4 heterodimer interface and also leads to a loss of FOXP1-FOXP4 interaction, would phenocopy neurodevelopmental alterations identified in FOXP1 $^{R513H/WT}$ organoids. Similar to FOXP1 $^{R513H/WT}$ , we found an increase in BCL11B during early neurogenesis and a decrease at the later time point (Fig. 8J) with a concurrent increase in $\mathrm{SATB2^{+}}$ neurons (fig. S10B) and a reduction of $\mathrm{PAX6^{+}}$ cells in both $\mathrm{FOXP1^{L327P / L327P}}$ and $\mathrm{FOXP1^{L327P / WT}}$ organoids (Fig. 8J). $\mathrm{TBR1^{+}}$ cells were likewise increased in $\mathrm{FOXP1^{L327P / L327P}}$ early and decreased in $\mathrm{FOXP1^{L327P / WT}}$ organoids at a later time point (Fig. 8J). DEGs identified using scRNA-seq in organoids during late neurogenesis showed concordant effect size and directionality between heterozygous $\mathrm{FOXP1^{L327P / WT}}$ and $\mathrm{FOXP1^{R513H / WT}}$ genotypes in the EN-3 cluster (Fig. 8K and fig. S10C). The abundance of $\gamma$ -aminobutyric acid-containing (GABAergic) neurons was not altered in organoids with either the $\mathrm{FOXP1^{L327P}}$ or $\mathrm{FOXP1^{R513H}}$ mutation (fig. S10D), suggesting that the phenotypes were limited to the excitatory lineage. Thus, mutations that disrupt different structural domains of the FOXP1 protein phenocopy each other by destabilizing the FOXP1-FOXP4 heterodimer, leading to convergent phenotypes of premature progenitor exhaustion and aberrant deep-layer neurogenesis. Finally, to test whether cortical neurogenesis phenotypes are detected in the case of other ASD mutations, we introduced the E198K variant of high predicted pathogenicity (fig. S7E) into the endogenous locus of $PPP2R5D$ (82). Consistent with findings for FOXP1 mutations, during early neurogenesis, $\mathrm{PPP2R5D^{E198K / E198K}}$ organoids demonstrated a decrease in $\mathrm{PAX6^{+}}$ cells and an increase in $\mathrm{BCL11B^{+}}$ cells (fig. S10, E and F).

Discussion

Despite substantial progress in defining the genetic architecture of ASD, identifying causal molecular mechanisms and therapeutic targets has remained a central challenge $(10, 83)$ . Efforts to identify convergent biology across hcASD genes have largely relied on transcriptomic analyses and low-throughput functional studies, leaving the proteomic landscape comparatively underexplored. In particular, whether and how genetically heterogeneous ASD risk genes organize at the level of protein complexes—and how disease-causing mutations perturb these interactions—remain poorly defined.

Here, we integrated large-scale human genetics, AP-MS, and AF-based structural prediction to map the physical interactome of proteins implicated in ASD. Mapping PPIs for 100 hcASD genes and 54 patient-derived missense variants in HEK293T cells enabled the depth, reproducibility, and scale required for comprehensive interactome mapping and systematic mutant interrogation, consistent with prior applications of this approach across diverse disease contexts (12–19). Multiple orthogonal lines of evidence support the disease relevance of these data, including strong overlap with neuronal interaction networks, high coexpression with hcASD genes in the developing human brain, selective enrichment for ASD—but not schizophrenia—risk genes, and functional validation moving from HEK293T cells to Xenopus and human brain organoids.

Our data reveal a dual-layered molecular architecture underlying ASD, where ASD risk proteins converge onto stable, shared protein complexes and independent ASD-associated mutations induce convergent patterns of interaction rewiring. Together, these layers provide a mechanistic bridge between genetic variation and neurodevelopmental dysfunction and nominate specific protein complexes, interactions, and interfaces as candidate therapeutic entry points. The ASD-PPI network highlights molecular modules not readily detectable by gene-centric genetic studies alone $(4, 6)$ ; identification of the PAF1 complex as a central hub illustrates how coherent protein assemblies can harbor multiple ASD-relevant components whose individual genetic signals fall below stringent significance thresholds.

Despite extensive genetic and phenotypic heterogeneity of ASD, the substantial interactor overlap among hcASD proteins suggests that a relatively limited set of molecular pathways may underlie core ASD biology, particularly for the severe end of the ASD spectrum that is markedly enriched for large-effect coding mutations (4, 8, 84, 85). Although deleterious variants in the same genes have a very high degree of phenotypic variability, contributing to multiple neurodevelopmental conditions, including ASD, epilepsy, intellectual disability, and schizophrenia, the ASD network described here exhibits distinctiveness for ASD, as evidenced by the absence of enrichment for schizophrenia risk genes. These findings raise the possibility that disease specificity may emerge not simply from gene identity but from how mutations perturb protein networks within developmentally relevant contexts.

Systematic comparison of WT and mutant PPIs revealed recurrent gain and loss of interactions across multiple hcASD variants, highlighting shared molecular vulnerabilities across genetically distinct mutations. Integration of AF predictions enabled identification of candidate interaction interfaces affected by disease-causing mutations. Although AF was not designed for interaction discovery, its performance in this context, particularly when leveraging consistency across predictions rather than maximum scores, outperformed conventional approaches and enriched for physiologically relevant interactions. Interactions observed across multiple cellular contexts were more likely to exhibit high AF confidence and mutation sensitivity, suggesting that broadly conserved interactions may represent core functional nodes.

Functional validation in human NPCs and forebrain organoids demonstrated that mutation-induced PPI rewiring has direct consequences on neurodevelopment. FOXP1 variants disrupted FOXP1-FOXP4 interactions, altered DNA binding, and promoted ectopic recruitment of FOXP4 to additional genomic loci. Despite high expression of FOXP1 in ganglionic eminences (86), we did not detect similar differences in GABAergic neurogenesis, potentially owing to compensation by other FOXP family members (87). Our data suggest that FOXP4, which is highly enriched in cortical but not subcortical progenitors (27, 77), is responsible for altered glutamatergic neurogenesis. Altered cortical neurogenesis has been shown in recent reports using stem cell-derived models of ASD (59, 77), and we also detected a similar trend in organoids with a missense mutation in PPP2R5D. Together, these findings underscore the importance of altered timing of cortical neurogenesis to ASD (fig. S10G), consistent with high coexpression of hcASD genes in these cell types (4, 22), as well as findings from postmortem brain tissue (88).

Collectively, this study establishes a generalizable framework for mechanistic interpretation of genomic risk through PPI mapping. By integrating WT and mutant interactomes with structural modeling and human organoid systems, we enable causal inference at single-mutation resolution while maintaining the systemic context of the broader molecular landscape. Identification of both lost or weakened and aberrantly gained or strengthened interactions delineates complementary therapeutic strategies, including stabilization of disrupted complexes and inhibition of pathological interactions. More broadly, this platform prioritizes druggable protein interfaces and pathways, offering a rational foundation for precision therapies aimed at restoring neurodevelopmental trajectories and circuit-level function in ASD and establishing a generalizable blueprint for mechanistic drug discovery across neurological and psychiatric disease.

Materials and methods are available in the supplementary materials.

REFERENCES AND NOTES

1. C. Lord et al., Autism spectrum disorder. Nat. Rev. Dis. Primers 6, 5 (2020). doi: 10.1038/s41572-019-0138-4; pmid: 31949163

2. B. Tick, P. Bolton, F. Happé, M. Rutter, F. Rijsdijk, Heritability of autism spectrum disorders: A meta-analysis of twin studies. J. Child Psychol. Psychiatry 57, 585–595 (2016). doi: 10.1111/jcpp.12499; pmid: 26709141

3. M. J. Maenner et al., Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years – Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 sites, United States, 2020. MMWR Surveill. Summ. 72, 1–14 (2023). doi: 10.15585/mmwr.ss7202a1; pmid: 36952288

4. F. K. Satterstrom et al., Large-scale exome sequencing study implicates both developmental and functional changes in the neurobiology of autism. Cell 180, 568–584.e23 (2020). doi: 10.1016/j.cell.2019.12.036; pmid: 31981491

5. B. Trost et al., Genomic architecture of autism from comprehensive whole-genome sequence annotation. Cell 185, 4409–4427.e18 (2022). doi: 10.1016/j.cell.2022.10.009; pmid: 36368308

6. J. M. Fu et al., Rare coding variation provides insight into the genetic architecture and phenotypic context of autism. Nat. Genet. 54, 1320–1331 (2022). doi: 10.1038/s41588-022-01104-0; pmid: 35982160

7. X. Zhou et al., Integrating de novo and inherited variants in 42,607 autism cases identifies mutations in new moderate-risk genes. Nat. Genet. 54, 1305–1319 (2022). doi: 10.1038/s41588-022-01148-2; pmid: 35982159

8. C. Lord et al., The Lancet Commission on the future of care and clinical research in autism. Lancet 399, 271–334 (2022). doi: 10.1016/S0140-6736(21)01541-5; pmid: 34883054

9. N. Sestan, M. W. State, Lost in translation: Traversing the complex path from genomics to therapeutics in autism spectrum disorder. Neuron 100, 406–423 (2018). doi: 10.1016/j.neuron.2018.10.015; pmid: 30359605

10. H. R. Willsey, A. J. Willsey, B. Wang, M. W. State, Genomics, convergent neuroscience and progress in understanding autism spectrum disorder. Nat. Rev. Neurosci. 23, 323–341 (2022). doi: 10.1038/s41583-022-00576-7; pmid: 35440779

11. J. F. Greenblatt, B. M. Alberts, N. J. Krogan, Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease. Cell 187, 6501–6517 (2024). doi: 10.1016/j.cell.2024.10.038; pmid: 39547210

12. M. Kim et al., A protein interaction landscape of breast cancer. Science 374, eabf3066 (2021). doi: 10.1126/science.abf3066; pmid: 34591612

13. D. L. Swaney et al., A protein network map of head and neck cancer reveals PIK3CA mutant drug sensitivity. Science 374, eabf2911 (2021). doi: 10.1126/science.abf2911; pmid: 34591642

14. S. K. Hota et al., Brahma safeguards canalization of cardiac mesoderm differentiation. Nature 602, 129–134 (2022). doi: 10.1038/s41586-021-04336-y; pmid: 35082446

15. B. Gonzalez-Teran et al., Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease. Cell 185, 794–814.e30 (2022). doi: 10.1016/j.cell.2022.01.021; pmid: 35182466

16. T. E. Tracy et al., Tau interactome maps synaptic and mitochondrial processes associated with neurodegeneration. Cell 185, 712–728.e14 (2022). doi: 10.1016/j.cell.2021.12.041; pmid: 35063084

17. J. Batra et al., Protein interaction mapping identifies RBBP6 as a negative regulator of Ebola virus replication. Cell 175, 1917–1930.e13 (2018). doi: 10.1016/j.cell.2018.08.044; pmid: 30550789

18. D. E. Gordon et al., A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 583, 459–468 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2286-9; pmid: 32353859

19. S. Jäger et al., Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature 481, 365–370 (2011). doi: 10.1038/nature10719; pmid: 22190034

20. H. J. Kang et al., Spatio-temporal transcriptome of the human brain. Nature 478, 483–489 (2011). doi: 10.1038/nature10523; pmid: 22031440

21. GTEx Consortium, Genetic effects on gene expression across human tissues. Nature 550, 204–213 (2017). doi: 10.1038/nature24277; pmid: 29022597

22. A. J. Willsey et al., Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell 155, 997–1007 (2013). doi: 10.1016/j.cell.2013.10.020; pmid: 24267886

23. G. Pintacuda et al., Protein interaction studies in human induced neurons indicate convergent biology underlying autism spectrum disorders. Cell Genom. 3, 100250 (2023). doi: 10.1016/j.xgen.2022.100250; pmid: 36950384

24. N. Murtaza et al., Neuron-specific protein network mapping of autism risk genes identifies shared biological mechanisms and disease-relevant pathologies. Cell Rep. 41, 111678 (2022). doi: 10.1016/j.celrep.2022.111678; pmid: 36417873

25. Y. Gao et al., Proximity analysis of native proteomes reveals phenotypic modifiers in a mouse model of autism and related neurodevelopmental conditions. Nat. Commun. 15, 6801 (2024). doi: 10.1038/s41467-024-51037-x; pmid: 39122707

26. T. Singh et al., Rare coding variants in ten genes confer substantial risk for schizophrenia. Nature 604, 509–516 (2022). doi: 10.1038/s41586-022-04556-w; pmid: 35396579

27. T. J. Nowakowski et al., Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science 358, 1318–1323 (2017). doi: 10.1126/science.aap8809; pmid: 29217575

28. D. Szklarczyk et al., The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49, D605–D612 (2021). doi: 10.1093/nar/gkaa1074; pmid: 33237311

29. S. A. Aleksander et al., The Gene Ontology knowledgebase in 2023. Genetics 224, iyad031 (2023). doi: 10.1093/genetics/iyad031; pmid: 36866529

30. D. S. Manoli, M. W. State, Autism spectrum disorder genetics and the search for pathological mechanisms. Am. J. Psychiatry 178, 30–38 (2021). doi: 10.1176/appi.ajp.2020.20111608; pmid: 33384012

31. K. E. McCluskey et al., Autism gene variants disrupt enteric neuron migration and cause gastrointestinal dysmotility. Nat. Commun. 16, 2238 (2025). doi: 10.1176/appi.ajp.2020.20111608; pmid: 33384012

32. S. Kaushik et al., A tyrosine kinase protein interaction map reveals targetable EGFR network oncogenesis in lung cancer. bioRxiv 2020.07.02.185173 [Preprint] (2020); https://doi.org/10.1101/2020.07.02.185173.

33. D. Halder et al., Suppression of Sin3A activity promotes differentiation of pluripotent cells into functional neurons. Sci. Rep. 7, 44818 (2017). doi: 10.1038/srep44818; pmid: 28303954

34. A. Roopra et al., Transcriptional repression by neuron-restrictive silencer factor is mediated via the Sin3-histone deacetylase complex. Mol. Cell. Biol. 20, 2147–2157 (2000). doi: 10.1128/MCB.20.6.2147-2157.2000; pmid: 10688661

35. M. Quevedo et al., Mediator complex interaction partners organize the transcriptional network that defines neural stem cells. Nat. Commun. 10, 2669 (2019). doi: 10.1038/s41467-019-10502-8; pmid: 31209209

36. N. Ding et al., Mediator links epigenetic silencing of neuronal gene expression with x-linked mental retardation. Mol. Cell 31, 347–359 (2008). doi: 10.1016/j.molcel.2008.05.023; pmid: 18691967

37. M. J. Jurynec et al., The Paf1 complex and P-TEFb have reciprocal and antagonist roles in maintaining multipotent neural crest progenitors. Development 146, dev180133 (2019). doi: 10.1242/dev.180133; pmid: 31784460

38. C. Zhang et al., The X-linked intellectual disability protein PHF6 associates with the PAF1 complex and regulates neuronal migration in the mammalian brain. Neuron 78, 986–993 (2013). doi: 10.1016/j.neuron.2013.04.021; pmid: 23791194

39. N. J. Krogan et al., RNA polymerase II elongation factors of Saccharomyces cerevisiae: A targeted proteomics approach. Mol. Cell. Biol. 22, 6979–6992 (2002). doi: 10.1128/MCB.22.20.6979-6992.2002; pmid: 12242279

40. E. C. Ung, N. A. Borja, LEO1 haploinsufficiency is associated with developmental delays and autism spectrum disorder. J. Hum. Genet. 71, 109–111 (2026). doi: 10.1038/s10038-025-01410-5; pmid: 40993282

41. R. Evans et al., Protein complex prediction with AlphaFold-Multimer. bioRxiv 2021.10.04.463034 [Preprint] (2022); https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034.

42. P. Bryant, G. Pozzati, A. Elofsson, Improved prediction of protein-protein interactions using AlphaFold2. Nat. Commun. 13, 1265 (2022). doi: 10.1038/s41467-022-28865-w; pmid: 35273146

43. S. G. Choi et al., Maximizing binary interactome mapping with a minimal number of assays. Nat. Commun. 10, 3907 (2019). doi: 10.1038/s41467-019-11809-2; pmid: 31467278

44. Y.-C. Chen, S. V. Rajagopala, T. Stellberger, P. Uetz, Exhaustive benchmarking of the yeast two-hybrid system. Nat. Methods 7, 667–668 (2010). doi: 10.1038/nmeth0910-667; pmid: 20805792

45. V. J. Heintz, L. Wang, D. J. LaCount, NanoLuc luciferase as a quantitative yeast two-hybrid reporter. FEMS Yeast Res. 21, foab069 (2021). doi: 10.1093/femsyr/foab069; pmid: 34940882

46. X. Peng, J. Wang, W. Peng, F.-X. Wu, Y. Pan, Protein-protein interactions: Detection, reliability assessment and applications. Brief. Bioinform. 18, 798–819 (2017). pmid: 27444371

47. P. Braun et al., An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods 6, 91–97 (2009). doi: 10.1038/nmeth.1281; pmid: 19060903

48. P. Magini et al., Loss of SMPD4 causes a developmental disorder characterized by microcephaly and congenital arthrogryposis. Am. J. Hum. Genet. 105, 689–705 (2019). doi: 10.1016/j.ajhg.2019.08.006; pmid: 31495489

49. D. Yu, C. Cattoglio, Y. Xue, Q. Zhou, A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Res. 47, 4462–4475 (2019). doi: 10.1093/nar/gkz162; pmid: 30864669

50. F. Glenewinkel et al., The adaptor protein DCAF7 mediates the interaction of the adenovirus E1A oncoprotein with the protein kinases DYRK1A and HIPK2. Sci. Rep. 6, 28241 (2016). doi: 10.1038/srep28241; pmid: 27307198

51. Y. Miyata, E. Nishida, Identification of FAM53C as a cytosolic-anchoring inhibitory binding protein of the kinase DYRK1A. Life Sci. Alliance 6, e202302129 (2023). doi: 10.26508/Isa.202302129; pmid: 37802655

52. D. Polioudakis et al., A single-cell transcriptomic atlas of human neocortical development during mid-gestation. Neuron 103, 785–801.e8 (2019). doi: 10.1016/j.neuron.2019.06.011; pmid: 31303374

53. A. Bhaduri et al., An atlas of cortical arealization identifies dynamic molecular signatures. Nature 598, 200–204 (2021). doi: 10.1038/s41586-021-03910-8; pmid: 34616070

54. R. Oughtred et al., The BioGRID database: A comprehensive biomedical resource of curated protein, genetic, and chemical interactions. Protein Sci. 30, 187–200 (2021). doi: 10.1002/pro.3978; pmid: 33070389

55. J. Xiang et al., DYRK1A regulates Hap1-Dcaf7/WDR68 binding with implication for delayed growth in Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1224–E1233 (2017). doi: 10.1073/pnas.1614893114; pmid: 28137862

56. Q. Wang et al., WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 33, 206–214 (2018). doi: 10.1016/j.scr.2018.10.023; pmid: 30448639

57. M. Lasser et al., Pleiotropy of autism-associated chromatin regulators. Development 150, dev201515 (2023). doi: 10.1242/dev.201515; pmid: 37366052

58. H. R. Willsey et al., The neurodevelopmental disorder risk gene DYRK1A is required for ciliogenesis and control of brain size in Xenopus embryos. Development 147, dev189290 (2020). doi: 10.1242/dev.189290; pmid: 32467234

59. A. Jourdon et al., Modeling idiopathic autism in forebrain organoids reveals an imbalance of excitatory cortical neuron subtypes during early neurogenesis. Nat. Neurosci. 26, 1505–1515 (2023). doi: 10.1038/s41593-023-01399-0; pmid: 37563294

60. S. Frendo-Cumbo et al., DCAF7 regulates cell proliferation through IRS1-FOXO1 signaling. iScience 25, 105188 (2022). doi: 10.1016/j.isci.2022.105188; pmid: 36248734

61. S. Najas et al., DYRK1A-mediated cyclin D1 degradation in neural stem cells contributes to the neurogenic cortical defects in Down syndrome. EBioMedicine 2, 120–134 (2015). doi: 10.1016/j.ebiom.2015.01.010; pmid: 26137553

62. A. Recasens et al., Global phosphoproteomics reveals DYRK1A regulates CDK1 activity in glioblastoma cells. Cell Death Discov. 7, 81 (2021). doi: 10.1038/s41420-021-00456-6; pmid: 33863878

63. V. Graham, J. Khudyakov, P. Ellis, L. Pevny, SOX2 functions to maintain neural progenitor identity. Neuron 39, 749–765 (2003). doi: 10.1016/S0896-6273(03)00497-5; pmid: 12948443

64. N. C. Hettige et al., FOXG1 dose tunes cell proliferation dynamics in human forebrain progenitor cells. Stem Cell Reports 17, 475–488 (2022). doi: 10.1016/j.stemcr.2022.01.010; pmid: 35148845

65. S. F. Bellmaine et al., Inhibition of DYRK1A disrupts neural lineage specification in human pluripotent stem cells. eLife 6, e24502 (2017). doi: 10.7554/eLife.24502; pmid: 28884684

66. K. E. Samocha et al., Regional missense constraint improves variant deleteriousness prediction. bioRxiv 148353 [Preprint] (2017); https://doi.org/10.1101/148353.

67. E. L. Huttlin et al., The BioPlex Network: A systematic exploration of the human interactome. Cell 162, 425–440 (2015). doi: 10.1016/j.cell.2015.06.043; pmid: 26186194

68. M. Y. Hein et al., A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances. Cell 163, 712–723 (2015). doi: 10.1016/j.cell.2015.09.053; pmid: 26496610

69. A. Calderone, L. Castagnoli, G. Cesareni, mentha: A resource for browsing integrated protein-interaction networks. Nat. Methods 10, 690–691 (2013). doi: 10.1038/nmeth.2561; pmid: 23900247

70. K. Luck et al., A reference map of the human binary protein interactome. Nature 580, 402–408 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2188-x; pmid: 32296183

71. G. G. Tall, A. M. Krumins, A. G. Gilman, Mammalian Ric-8A (synembryn) is a heterotrimeric Gα protein guanine nucleotide exchange factor. J. Biol. Chem. 278, 8356–8362 (2003). doi: 10.1074/jbc.M211862200; pmid: 12509430

72. C. A. Pearson et al., Foxp1 regulates neural stem cell self-renewal and bias toward deep layer cortical fates. Cell Rep. 30, 1964–1981.e3 (2020). doi: 10.1016/j.celrep.2020.01.034; pmid: 32049024

73. C. Bacon et al., Brain-specific Foxp1 deletion impairs neuronal development and causes autistic-like behaviour. Mol. Psychiatry 20, 632–639 (2015). doi: 10.1038/mp.2014.116; pmid: 25266127

74. X. Li et al., Foxp1 regulates cortical radial migration and neuronal morphogenesis in developing cerebral cortex. PLOS ONE 10, e0127671 (2015). doi: 10.1371/journal.pone.0127671; pmid: 26010426

75. A. Ortiz et al., Cell type-specific roles of FOXP1 in the excitatory neuronal lineage during early neocortical murine development. Cell Rep. 44, 115384 (2025). doi: 10.1073/pnas.1315710110; pmid: 24277810

76. T. Kadoshima et al., Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 20284–20289 (2013). doi: 10.1073/pnas.1315710110; pmid: 24277810

77. B. Paulsen et al., Autism genes converge on asynchronous development of shared neuron classes. Nature 602, 268–273 (2022). doi: 10.1038/s41586-021-04358-6; pmid: 35110736

78. H. R. Willsey et al., Parallel in vivo analysis of large-effect autism genes implicates cortical neurogenesis and estrogen in risk and resilience. Neuron 109, 788–804.e8 (2021). doi: 10.1016/j.neuron.2021.01.002; pmid: 33497602

79. H. S. Kaya-Okur et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat. Commun. 10, 1930 (2019). doi: 10.1038/s41467-019-09982-5; pmid: 31036827

80. D. Trudler et al., Dysregulation of miRNA expression and excitation in MEF2C autism patient hiPSC-neurons and cerebral organoids. Mol. Psychiatry 30, 1479–1496 (2025). doi: 10.1038/s41380-024-02761-9; pmid: 39349966

81. F. P. McCready et al., Hypersynchronous iPSC-derived SHANK2 neuronal networks are rescued by mGluR5 agonism. Stem Cell Reports 20, 102718 (2025). doi: 10.1016/j.stemcr.2025.102718; pmid: 41270748

82. C. Loveday et al., Mutations in the PP2A regulatory subunit B family genes PPP2R5B, PPP2R5C and PPP2R5D cause human overgrowth. Hum. Mol. Genet. 24, 4775–4779 (2015). doi: 10.1093/hmg/ddv182; pmid: 25972378

83. A. J. Willsey et al., The Psychiatric Cell Map Initiative: A convergent systems biological approach to illuminating key molecular pathways in neuropsychiatric disorders. Cell 174, 505–520 (2018). doi: 10.1016/j.cell.2018.06.016; pmid: 30053424

84. I. lossifov et al., The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature 515, 216–221 (2014). doi: 10.1038/nature13908; pmid: 25363768

85. S. J. Sanders et al., Insights into autism spectrum disorder genomic architecture and biology from 71 risk loci. Neuron 87, 1215–1233 (2015). doi: 10.1016/j.neuron.2015.09.016; pmid: 26402605

The authors thank T. Tolpa and A. Olmsted for graphic design support for figures and all members of the Psychiatric Cell Map Initiative (PCMI; U01MH115747) for their invaluable discussions and support. T.J.N. is a New York Stem Cell Foundation Robertson Neuroscience Investigator, and H.R.W. is a Biohub–San Francisco Investigator. The authors used ChatGPT-3 and Gemini to shorten text sections during the preparation of this manuscript. After using this tool and service, the authors reviewed and edited the content as needed and take full responsibility for the content of the publication. Funding: This work was funded by National Institutes of Health (NIH) grants U01MH115747 (to N.J.K., A.J.W., M.W.S., T.I., and T.J.N.), U01MH116487 (to A.J.W. and M.W.S.), 10T2OD032742 (to N.J.K. and T.I.), U54CA274502 (to N.J.K. and T.I.), R01MH128364 (to T.J.N.), R01NS123263 (to T.J.N.), SF810018 (to T.J.N.), R25MH060482 (to N.J.K., A.J.W., M.W.S., T.I., and T.J.N.), and DP2OD040906 (to H.R.W.); Weill Institute for Neurosciences Startup Funding (to A.J.W.); a Weill Institute for Neurosciences Trailblazer Award (to A.J.W.); a Weill Institute for Neurosciences Weill Clinician-Scientist Award (to B.W.); a QBI Bold and Basic Award (to A.J.W.); California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) DISC4-16322 (to T.J.N. and N.J.K.); the Overlook International Foundation (to M.W.S. and A.J.W.); Schmidt Futures (to T.J.N.); the William K. Bowes, Jr. Foundation (to T.J.N.); and a Sorensen Foundation Career Award in Child & Adolescent Psychiatry (to B.W.). Author contributions: N.J.K. is the lead contact. Conceptualization: M.W.S., N.J.K.; Methodology: B.W., R.V., Z.Z.C.N., K.M.H., B.J.P., A.B., M.B., U.C., J.A.K., L.S., D.L.S., T.J.N., R.H., A.J.W.; Software: B.W., Z.Z.C.N., K.M.H., B.J.P., A.B., M.B., Y.Zh., J.M., K.Z.G., P.W., M.C., M.G., D.F.B., S.A., P.P., D.P.; Validation: B.W., R.V., K.M.H., B.J.P., P.K., M.D.S., A.V.K.; Formal analysis: B.W., R.V., Z.Z.C.N.,

LET YOUR KNOWLEDGE BLOSSOM

Visit the Science Custom Publishing sites today and grow your knowledge with a wide selection of booklets, podcasts, posters, sponsored features, and webinars!

Booklets

Podcasts

Posters

Sponsored Features

Webinars

Brought to you by the Science/AAAS Custom Publishing Office.

Science AAAS

Scan the code and start exploring the latest advances in science and technology innovation!

Science.org/custom-publishing

Foreshock productivity and rupture nucleation in injection-induced earthquakes in western Canada

Bei Wang*, Honn Kao*, Hongyu Yu*, Yan Jiang, Qiang Lin, Wenli Zhang, Jun Hua, Yushi Bai, Zhilong Chen, Peng Zhang, Ya Liu, Ryan Visser

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aed9893

INTRODUCTION: Injection-induced earthquakes (IIEs) associated with hydraulic fracturing (HF) and other subsurface fluid operations pose a growing challenge for seismic hazard mitigation. Traffic-light protocol (TLP) is central to many regulatory frameworks for mitigating IIE risks. The operational efficacy of TLP hinges on the assumption that damaging mainshocks are preceded by detectable foreshocks, offering a critical time window to modify or halt fluid injections. However, the validity of this assumption, particularly considering the variability in foreshock productivity and the underlying fault-loading processes governing IIE nucleation, remains poorly constrained.

RATIONALE: Resolving foreshock productivity against mainshocks is essential for short-term forecasting and industrial risk management. We examined foreshock activity before HF-induced earthquakes in the Western Canada Sedimentary Basin. Using continuous waveform data from 2014 to 2024, we built an enhanced catalog of $\sim 70,000$ earthquakes and identified 77 local magnitude $(M_{\mathrm{L}})\geq 3$ HF-induced mainshocks. We defined foreshocks operationally as events within $5\mathrm{km}$ and 5 days before each mainshock, matching the decision horizon of TLP. We combined injection records, seismogenic-index (SI) mapping, dynamic-triggering analysis, geomechanical and earthquake source parameters, interferometric synthetic aperture radar (InSAR) deformation measurements, repeating-earthquake and earthquake with hybrid-frequency waveforms (EHW) diagnostics, and Coulomb stress modeling. Together, these analyses allowed us to constrain foreshock timing, regional controls on foreshock productivity, and the fluid-mediated fault loading process during the transition from foreshocks to mainshock rupture.

RESULTS: Foreshocks are pervasive before $M_{L} \geq 3$ induced main-shocks in western Canada. Seventy-one of 77 mainshocks ( $\sim 92\%$ ) were preceded by foreshocks within the operational 5-day, 5-km window. These patterns, marked by temporal concentration and rate acceleration, are robust to alternative space-time windows and cannot be explained merely by background-only variability.

However, foreshock productivity varies from no foreshocks to more than 700 events. Fluid injection is required to initiate these sequences but does not alone explain this variability: Injection rate and cumulative volume show no clear first-order relation to foreshock productivity. Abundant foreshocks instead concentrate in high-SI regions and in cells with dynamic-triggering evidence, which is consistent with strong seismic response per injected volume and critically stressed fault patches. Low-SI regions without dynamic triggering tend to produce few or no foreshocks.

Sequence-specific analyses reveal that induced foreshocks nucleate mainshocks through three fluid-mediated loading paths. In the fluid-driven preslip with weakened source asperity model, aseismic slip and foreshocks occur both within and around the eventual rupture patch, progressively loading the mainshock zone as it is weakened. In the fluid-driven preslip with intact source asperity model, aseismic slip and nearby foreshocks load a locked patch that remains largely intact until failure. In the fluid-driven cascade triggering model, migrating

Foreshock productivity and fluid-mediated rupture nucleation of IIEs in western Canada. (A) Among $77 M_{L} \geq 3$ HF-induced mainshocks, 71 were preceded by foreshocks; bar heights denote foreshock counts within the 5-day, 5-km operational window and shading shows the seismogenic index. (B) Three inferred pathways: fluid-driven preslip with weakened source asperity, fluid-driven preslip with intact source asperity, and fluid-driven cascade. LOS, line of sight; Repeating Eq., repeating earthquake; Eq.-Eq. interaction, earthquake-to-earthquake interaction.

foreshocks increase Coulomb stress at the eventual hypocenter through earthquake-to-earthquake interactions aided by pore-pressure diffusion. Multiple lines of observations, including InSAR, repeating earthquakes, EHWs, and precise hypocentral relocation, help constrain these models.

CONCLUSION: The high prevalence of foreshocks supports a central assumption of TLP, but their highly variable productivity shows that warning capability is spatially conditioned. Regions with abundant foreshocks may provide useful short-term warnings but also require proper management of false alarms, whereas low-productivity regions may produce larger events with little warning from real-time seismic monitoring. These results suggest that proactive avoidance may be an effective strategy for some regions to mitigate induced seismic risk. TLP decisions should be region-conditioned with seismogenic susceptibility, real-time seismic-geodetic observations, and physics-based nucleation models to constrain evolving fault loading and guide operational responses. □

INDUCED SEISMICITY

Foreshock productivity and rupture nucleation in injection-induced earthquakes in western Canada

Bei Wang $^{1}$ , Honn Kao $^{2}$ , Hongyu Yu $^{3*}$ , Yan Jiang $^{2}$ , Qiang Lin $^{4}$ , Wenli Zhang $^{1}$ , Jun Hua $^{5}$ , Yushi Bai $^{1}$ , Zhilong Chen $^{1}$ , Peng Zhang $^{1}$ , Ya Liu $^{1}$ , Ryan Visser $^{2}$

Foreshock activity is a key consideration in traffic-light protocol (TLP) to mitigate seismic risk from injection-induced earthquakes (IIEs). However, the seismogenic processes of IIE foreshocks remain poorly understood. Using an enhanced western Canada catalog (2014–2024), we analyzed 77 IIE sequences to statistically delineate foreshock patterns before local magnitude ( $M_{L}$ ) ≥ 3 mainshocks. We found that 92% are preceded by foreshocks and that foreshock productivity and spatiotemporal patterns reflect the interplay among fluid injection, the seismogenic index, and the fault stress state. Sequence-specific analyses elucidate three nucleation models: fluid-driven preslip with weakened source asperity, fluid-driven preslip with intact source asperity, and fluid-driven cascade, highlighting the central role of fluids in enabling aseismic slip and interevent stress transfer before mainshock rupture. These results imply that IIE monitoring strategies should be spatially conditioned according to foreshock productivity.

Injection-induced earthquakes (IIEs), which are seismic events associated with hydraulic fracturing (HF), wastewater disposal, geothermal development, or carbon sequestration, have attracted substantial public and regulatory concerns, mainly owing to their growing frequency and occasional escalation to damaging magnitudes. Several cases of IIEs with magnitude $\geq5$ have resulted in structural damage to nearby communities (1-3). In response, most regulatory agencies have adopted a mitigation strategy and implemented the traffic-light protocol (TLP) as a tool to manage the induced seismic risk (4-7). Central to the TLP, however, are the assumptions that (i) potentially damaging earthquakes are preceded by smaller events (foreshocks) and (ii) halting injection operations upon detection of such foreshocks can reduce the likelihood of subsequent, presumably larger, mainshocks. Yet despite growing knowledge of the source processes of IIEs (8-10), the occurrence patterns of IIE foreshocks remain poorly constrained, and the effectiveness of these operational assumptions has not been systematically evaluated.

More broadly, foreshocks are widely recognized as one of the most informative short-term precursors to large earthquakes $(11-14)$ , yet the physical mechanisms linking them to the nucleation of mainshock rupture are still not well resolved. Two end-member models are often invoked: the preslip model, in which aseismic slip progressively loads the nucleation zone $(12, 14)$ , and the cascade model, in which earthquake-to-earthquake triggering drives a spatiotemporal migration of shear dislocation toward the eventual mainshock (11, 15). For the preslip model in particular, direct observational evidence remains elusive for most large earthquakes, owing to the subtle nature of preslip signals, limitations in observational capability, and the coexistence of multiple foreshock-generating processes (11, 13, 16, 17). Clarifying these processes is essential for improving short-term earthquake forecasting and enhancing hazard mitigation strategies (13, 18, 19). IIEs that occur in well-instrumented and operationally controlled environments can offer an ideal venue to systematically probe and validate the seismic nucleation process.

The Western Canada Sedimentary Basin (WCSB) is one of the most productive regions of unconventional hydrocarbon resources globally, where the majority of IIEs are associated with HF stimulations $(20)$ . In response to the drastic increase of HF-related IIEs, regional monitoring networks have been considerably expanded and enhanced during the past decade $(21)$ . The notable improvement in both quality and quantity of the regional seismic data enables the detection and localization of IIE foreshock activity at an unprecedented resolution, offering an exceptional opportunity to investigate the occurrence patterns of IIE foreshocks and address their implications for the seismogenic process of mainshocks.

In this study, we leveraged a decade of continuous waveform data to characterize the foreshock patterns preceding significant IIEs [local magnitude $(M_{\mathrm{L}}) \geq 3$ , HF-induced] in the WCSB. We measured how frequently detectable events occur in operationally relevant time windows before these mainshocks and tested whether foreshock productivity varies across the region. We then evaluated whether any variability could be explained by operational and geomechanical factors, including injection activity, injection seismic response (quantified by the seismogenic index, or SI), the stress state of source faults, and mainshock source properties. Lastly, we examined sequence-specific fault-loading processes linking foreshock activity to rupture initiation to assess whether the conceptual foreshock-mainshock frameworks developed for tectonic earthquakes are applicable to IIEs and to place TLP shut-in mandates in a mechanistic, testable context.

Foreshocks commonly precede $M_{L} \geq 3$ IIE mainshocks across the WCSB

To test the key TLP assumption that IIE mainshocks are preceded by foreshocks, we deployed a combination of EQTransformer (22) and the Seismicity-Scanning based on Navigated Automatic Phase-Picking (S-SNAP) method (23) on continuous seismic waveforms recorded by local seismic stations to search for earthquakes that occurred during 2014–2024 across the WCSB. A catalog with $\sim$ 70,000 events was built for the study area, with estimated magnitudes of completeness ( $M_{c}$ ) of 1.0, 0.7, and 1.2 for the northern Montney play (NMP), southern Montney play (SMP), and western Alberta, respectively (Fig. 1A, fig. S1, and supplementary text S1).

We first identified mainshocks spatiotemporally associated with HF operations and excluded aftershocks and smaller earthquakes that precede larger events (fig. S2); we then restricted analysis to $M_{L} \geq 3$ mainshocks because this magnitude range is operationally actionable under TLP (e.g., SMP M 3 red-light) and enables detailed per-sequence characterization (supplementary text S2.1). Overall, we obtained $77 M_{L} \geq 3$ mainshocks across the WCSB during the study period (Fig. 1A and table S1).

We defined a spatiotemporal window of 5-km and 5-day to associate foreshocks with each of the 77 selected mainshocks. We use the term “foreshock” in an operational, retrospective sense to denote earthquakes occurring within this prescribed spatiotemporal window before each $M_{L} \geq 3$ mainshock. This usage reflects a window-based definition to align with most TLP because regulatory actions must rely on real-time observations. The 5-km and 5-day spatiotemporal window is motivated by operational relevance and the short TLP decision horizon (e.g., the regulator requires a 5-day shut-in following a red-light event in NMP and SMP). To ensure that our conclusions are not sensitive to this choice, we also conducted sensitivity analyses incorporating longer and larger spatiotemporal windows (5 to 30 days and 5 to 10 km), month-scale diagnostics of local background seismicity, and operation-conditioned temporal null tests (supplementary text S2 and S3). To further improve the completeness of our foreshock detection, we deployed a template-matching method to identify uncataloged events preceding each mainshock (supplementary text S4).

Fig.1. Foreshock activity associated with IIEs ( $M_{L} \geq 3$ ) in the Western Canada Sedimentary Basin (WCSB), 2014–2024. (A) Map of the study area, encompassing the northern Montney play (NMP), southern Montney play (SMP), and western Alberta. Spatial distribution of 77 mainshocks analyzed in this study (colored stars), showing seismic stations (blue triangles). Colors of mainshocks correspond to identifiers listed in the legend (bottom table). The upper right inset shows the study region (black outline) of the WCSB; the inset with a pink outline shows the zoomed-in plot of the mainshocks located in NMP. The red and blue lines mark the boundary of Montney formation (Fm.) and Duvernay formation, which are commercially developed at depths of 1500 to 3500 m and 2500 to 4000 m, respectively (54,55). (B) Cumulative foreshock counts (within 5-km and 5-day windows preceding each mainshock). Color scheme matches that of (A). Red vertical dashed line marks mainshock occurrence. (Inset) Histogram of 5-day foreshock counts for the 77 mainshocks (data for 30-day window are shown in fig. S11). (C) Cumulative foreshock moment in the 5 days before each mainshock. Each line represents one sequence with color scheme matching that of (A). (Inset) Fraction of mainshocks preceded by at least one foreshock with magnitude above the prescribed thresholds within the 5-day and 5-km spatiotemporal window.

Foreshocks are pervasive across the WCSB, with 71 out of 77 mainshocks ( $\sim92\%$ ) accompanied by foreshocks during the previous 5-day period (Fig. 1B). This prevalence holds regionally, with 50 of 53 mainshocks ( $\sim94\%$ ) in the NMP, 7 of 8 mainshocks ( $\sim88\%$ ) in the SMP, and

14 of 16 mainshocks ( $\sim88\%$ ) in western Alberta accompanied by foreshocks. Approximately 70% of mainshocks are preceded by at least one $M_{L} \geq 2$ foreshock (and $\sim90\%$ by at least one $M_{L} \geq 1$ foreshock; Fig. 1C). Sensitivity analyses yielded consistent results regardless of spatiotemporal windows (5 to 30 days; 5 to 10 km; supplementary text S2 and figs. S3 to S5). These observations are also incompatible with a background-only null model, which predicts far fewer $M_{L} \geq 3$ mainshocks with preceding events and no comparable rate increase in the final 5 days. Moreover, operation-conditioned temporal null test results reveal that this high prevalence reflects not merely the existence of a prior event but rather a compression of HF-associated sequence productivity into short active intervals, manifesting as temporal concentration and rate acceleration of foreshocks within this fixed, operationally relevant time window (supplementary text S3 and figs. S6 to S8).

Foreshock productivity, however, varies markedly among individual mainshocks. For example, the $M_{L}$ 3.3 event on 11 September 2020 (event no. 21) was preceded by more than 700 foreshocks, whereas most other mainshocks were preceded by fewer than 100 events, a nearly 10-fold difference (Fig. 1B and table S1). Our observations, therefore, highlight strong sequence-to-sequence variability in foreshock productivity among HF-induced mainshocks.

Physical factors affecting foreshock occurrence patterns

To isolate and map the physical controls on IIE foreshock occurrence, we examined the canonical factors invoked for tectonic foreshocks and those specific to injection-induced systems.

Injection is necessary but insufficient to explain foreshock productivity

Fluid injection fundamentally distinguishes IIEs from tectonic events, playing an important role in the seismogenic process by elevating the pore pressure, transferring poroelastic stress, and promoting aseismic slip (10, 24–28). To probe the relationship between fluid injection and occurrence patterns of IIE foreshocks, we searched for HF stimulations conducted within predefined spatiotemporal windows.

For mainshocks preceded by foreshocks, these events exhibit clear temporal correlations with fluid injection activities (figs. S9 to S11), although the time lag between HF stimulations and the onset of foreshock sequence can vary from days to weeks. Injection parameters, such as injection rate and cumulative volume, are broadly comparable across mainshocks, with no clear first-order relationship to foreshock productivity or mainshock magnitude. Within NMP and SMP, foreshock-rich sequences appear to cluster in specific injection-depth intervals, although those intervals are not exclusive to foreshock-rich behavior (fig. S12). Thus, although fluid injection is a necessary condition for triggering IIE sequences, the observed variability in foreshock behavior suggests additional controls on nucleation.

SI maps foreshock susceptibility

We quantified the subsurface seismic response to injected fluid using the SI (29, 30), which measures seismicity productivity per unit injected volume and in which higher SI implies a higher likelihood of exceeding a prescribed magnitude threshold (30). SI values across our study area for each $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ cell (materials and methods) show that SI may correspond with the productivity of foreshocks (Fig. 2A).

Specifically, the six mainshocks lacking foreshocks (events no. 4, 14, 25, 38, 64, and 69) are located in areas where the SI values are relatively low (-2.5 to -3.4). These low-SI areas also host the majority of mainshocks with fewer foreshocks. By contrast, mainshocks with abundant foreshock activity tend to occur in areas with higher SI, such as the southern SMP, central NMP, and central western Alberta (SI of -1.8 to -2.1).

Previous studies suggest that relatively high SI values may be related to specific geological structures in the region, such as the Fort St. John graben complex in the Montney play $(31)$ and the Leduc reef and karst structures in the Duvernay play $(32, 33)$ , which are consistent with enhanced fault heterogeneity. Furthermore, the clustering of foreshock-rich sequences at specific injection depths (fig. S12) in northeast British Columbia (NEBC) could help identify highly seismogenic stratigraphic or structural domains, such as the Lower-Middle Montney Formation $(34)$ . The observed SI-foreshock relationship therefore supports the view that fault heterogeneity modulates foreshock susceptibility in injection-induced settings.

Fig. 2. Map of mainshock locations ( $M_{L} \geq 3$ ), associated foreshock abundance, and potential controlling factors. (A) Mainshocks with foreshocks are shown as stars; bar height indicates the number of foreshocks, with colors corresponding to those in Fig.1. Mainshocks without foreshocks are indicated by rectangles, and their event numbers are outlined by pink circles with pink arrows. The background shading represents the calculated seismogenic index (SI) values within each $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ cell (materials and methods). (Insets) Log-log plots of number of foreshocks per event ( $M \geq M_{c}$ , where $M_{c}$ denotes the regional magnitude of completeness) versus cumulative fluid injection volume (used to compute SI values). All insets share the same axis definitions, units, and limits (labeled on lower left inset). (B) Similar to (A), but background shading shows $\beta$ values for dynamic triggering within each cell. The top inset (globe) marks the locations of selected teleseismic events. The three lower insets illustrate detailed temporal earthquake distributions around three teleseismic earthquakes, including the southern SMP ( $\beta > 10$ ; 2019 M 6.4 Alaska event, where four mainshocks in this cell exhibit >300 foreshocks: events no. 9, 19, 21, and 40), the central NMP ( $\beta \sim 4.2$ ; 2018 M 6.8 Vancouver Island event), and central western Alberta ( $\beta \sim 4$ ; 2017 M 7.7 Commander Islands event); the dashed lines in each cell mark the timing of these three teleseismic events. $\beta$ values in each cell are derived from different teleseismic events.

Dynamic triggering probes the stress state of source faults

Dynamic triggering is well documented to probe the state of stress along fault planes, especially for fault patches that approach the critical state (35–37). In regions affected by fluid injections, the occurrence of dynamic triggering may suggest that a substantial number of fault patches have been brought close to failure by injection-related loading processes. The change of stress state would make them prone to seismic slip triggered by the small transient stress perturbation from teleseismic earthquakes (38–40).

Here, we used $\beta$ value >2 in the $1^{\circ}$ by $0.5^{\circ}$ cells (Fig. 2B and materials and methods) as statistical evidence for dynamic triggering (37, 41, 42). Notably, the three cells exhibiting evidence of dynamic triggering spatially coincide with the source areas of nearly all the mainshocks characterized by abundant foreshocks (Fig. 2B and figs. S13 and S14). In particular, all four mainshocks located within the southern SMP cell with the highest $\beta$ value have more than 300 foreshocks. By contrast, mainshocks accompanied by few or no foreshocks were generally located in regions lacking evidence of dynamic triggering. This positive association implicates the fault stress state as another critical factor governing foreshock productivity.

Variables such as earthquake magnitude, depth, faulting type, and regional heat flow (supplementary text S5) show no clear association with the total number of IIE foreshocks (figs. S15 to S19).

Fault-loading processes associated with IIE foreshocks

A key assumption of TLP is that shutting in injection operations can reduce the likelihood of a subsequent, potentially bigger mainshock. This assumption hinges on whether operational changes can modify the fault-loading trajectory and delay, or even arrest, rupture nucleation, which in turn requires identifying the fault-loading processes that link foreshocks to mainshock rupture initiation. Whether the cascade and preslip models used for interpreting tectonic foreshocks could adequately explain the loading processes of IIE mainshocks remains an open question because fluid injection introduces physical processes intrinsic to induced earthquakes but not necessarily all tectonic events. To address this, we examined the spatiotemporal distribution of foreshocks, searched for signatures of aseismic slip, and modeled Coulomb stress changes ( $\Delta$ CFS) induced by both coseismic slip and fluid injection at the mainshock hypocenter (materials and methods).

We first used interferometric synthetic aperture radar (InSAR) to detect surface deformation indicative of aseismic slip as evidence for the preslip model $(43)$ . Where InSAR constraints are limited, we inferred aseismic slip from the occurrence of repeating foreshocks within short time intervals (minutes to days) because the aseismic slip could restore the stress level required for the repeating ruptures of the same patch in a much shorter period $(12)$ . Additionally, we searched for earthquakes with hybrid-frequency waveforms (EHWs) within individual foreshock sequences, which are newly recognized seismic signals manifesting the transition from aseismic to seismic slip in fluid injection environments $(44)$ .

Direct preslip is associated with several IIE sequences, in which InSAR-observed ground deformation preceding the mainshocks—which is consistent with aseismic slip—is clearly resolved (e.g., events no. 28 and 45; Fig. 3, A and B). The seismic moment of aseismic-slip events no. 28 and 45 corresponds to equivalent magnitudes of approximately moment magnitude ( $M_{\mathrm{w}}$ ) 5.0 and $M_{\mathrm{w}}$ 3.8, respectively, generating Coulomb stress increases of $\sim 10$ kPa and $\sim 0.4$ kPa at the hypocenters of the respective mainshocks (figs. S20 and S21 and supplementary text S7). Moreover, spectral ratio analysis yields rupture radii of $\sim 210$ m and $\sim 230$ m for the mainshocks, respectively (supplementary text S6). These estimates suggest that multiple relocated foreshocks, with relative location uncertainties on the order of $100\mathrm{m}$ , fall within the inferred rupture zone of event no. 28, whereas no foreshocks can be resolved within the rupture zone of event no. 45.

By contrast, the occurrence of aseismic slip before the $M_{L}$ 3.3 mainshock on 11 September 2020 (event no. 21) is inconclusive from the InSAR observations. Nevertheless, its foreshocks are distributed across an extended area (Fig. 3C) with the characteristics of repeating earthquakes and EHWs. Several relocated foreshocks associated with event no. 21 appear to fall within its inferred rupture zone.

Sequences consistent with the cascade model are also observed, although the dynamic processes are clearly modified by fluid injections. For the 19 September 2022 $M_{L}$ 3.3 mainshock (event no. 34), foreshocks occur within $\sim$ 2 km of the mainshock and migrate northwestward (Fig. 3D). The evolving $\Delta$ CFS at the hypocenters during the foreshock sequence further supports the interpretation of a cascading triggering process (supplementary text S7). Additionally, our numerical simulation reveals that the $\Delta$ CFS induced by fluid injections also plays an important role in the seismogenic process (supplementary text S8 and fig. S23).

The complex interplay among stress perturbations caused by the injected fluids, the occurrences of aseismic slip, and the foreshock-mainshock geometry suggests that the traditional foreshock-mainshock models are insufficient. Accordingly, we formalized three fluid-mediated loading models leading to the main rupture: (i) fluid-driven preslip with weakened source asperity (preslip-WSA) model, (ii) fluid-driven preslip with intact source asperity (preslip-ISA) model, and (iii) fluid-driven cascade model, as schematically illustrated in Fig. 4.

In the preslip-WSA model, foreshock activity and aseismic slip occur not only around but also within the eventual mainshock patch, progressively degrading the fault strength before its failure. In this scenario, foreshocks do not merely precede the mainshock, they “puncture” the nucleation patch of the mainshock, creating localized weak spots that cumulatively reduce the effective normal stress and cohesion, thereby easing the transition to dynamic rupture (similar to Fig. 3, A and C). Whereas slip weakening is often formulated as a constitutive decrease in friction with slip (45), our observations suggest a patch-scale weakening mechanism in which discrete foreshock ruptures and aseismic slip work constructively to weaken the nucleation patch.

For the preslip-ISA model, the injected fluid initially promotes aseismic slip across an extended area, including the mainshock nucleation zone $(12, 14)$ . Crucially, the mainshock patch itself remains largely locked and mechanically intact. As the loading continues, aseismic slip and nearby foreshocks surrounding the locked patch raise $\Delta$ CFS within the patch, driving it over the critical state (also known as the nucleation threshold; Fig. 3B).

By contrast, for the fluid-driven cascade model, fluid injection facilitates the rupture of a small event initially, which subsequently triggers additional foreshocks and eventually the mainshock through successive static stress transfer (Fig. 3D).

Sequences without any foreshocks are difficult to reconcile with the cascade and preslip-WSA models because both require preceding foreshock activity to load and/or weaken the source zone. In such cases, the preslip-ISA model provides a more plausible explanation. For example, event no. 4 ( $M_{L}$ 4.6 on 17 August 2015) has no detectable foreshocks, yet a surface-deformation signal associated with the sequence is resolved. Although the interferogram spans the mainshock and may therefore include some coseismic displacement, our inversion favors an aseismic slip episode (fig. S24), which is consistent with a preslip-ISA interpretation.

Among the 77 cases included in this study, 5 can be classified as preslip-WSA, 23 as preslip-ISA, and 28 as cascade sequences (table S1). However, because of observational limitations, such as insufficient surface deformation detectable by InSAR and sparse seismic network coverage with limited waveform quality, 21 cases cannot be confidently attributed to any of the proposed models.

Implications for TLP and IIE risk management

Widespread foreshocks across the majority of observed IIE sequences support the central assumption of TLP—that continuous monitoring often provides detectable short-term warning before larger mainshocks.

C

D

Fig. 3. Direct InSAR observations and seismic evidence for foreshock-controlled nucleation preceding induced mainshocks. (A) Event no. 28. (Left) Ascending Sentinel-1 interferogram spanning 15 to 27 December 2021 before the mainshock (the second Sentinel-1 image was acquired \~19.5 hours before the mainshock). Colors show line-of-sight (LOS) displacement (blue to red; units as shown in color bar). The purple star marks the mainshock epicenter; gray circles denote repeating foreshocks. HF well, hydraulic fracturing well; cc, cross-correlation coefficient. (Upper right) Examples of repeating foreshocks and earthquakes with hybrid-frequency waveforms (EHWs). (Lower right) Mainshock rupture radius estimated with the spectral ratio method (supplementary text S6); blue circles are foreshocks located within the mainshock rupture zone, and gray circles lie outside. (B) Same as shown in (A) for event no. 45, except that no repeating foreshock or EHW is observed within the inferred rupture zone before the mainshock. (Left) Ascending Sentinel-1 interferogram spanning 2 to 14 July 2023. (Upper right) Mainshock corner frequency estimated with the spectral ratio method. (C) Aseismic slip inferred from repeating foreshocks and EHW for event no. 21. (Left) Map of foreshocks colored by time relative to the mainshock (purple star); black lines indicate HF wells. (Right) Panels as shown in (A); the corner frequency estimation is shown in fig. S22. (D) Cascade loading through earthquake-to-earthquake stress transfer for event no. 34. (Left) Foreshocks numbered chronologically. Eq., earthquake. (Right) Evolution of Coulomb stress change ( $\Delta$ CFS) at the mainshock depth, evaluated at successive stages of the foreshock sequence (supplementary text S7). Foreshocks that occurred before each $\Delta$ CFS snapshot are shown as gray circles, whereas foreshocks that occurred after the snapshot are shown as black circles.

However, foreshock productivity varies markedly, implying that TLP strategy should be conditioned according to the local seismogenic setting. In regions characterized by low SI and no evidence of dynamic triggering, where we observed systematically low or even zero foreshock productivity, warnings based on foreshock sequence may be limited or even absent; i.e., sequence-based warnings may provide little lead time, and the first detected event may already be the largest. In this scenario, TLP or other strategies should not rely exclusively on real-time seismic signals for regulatory decision-making. Instead, induced–seismic risk management should integrate enhanced real-time monitoring of geodetic and subsurface deformation with broader precautionary strategies, such as exclusion- or avoidance-based approaches in which the consequences of an unanticipated large event are unacceptable (46). Conversely, in high-SI regions, abundant foreshocks may provide credible earlier warnings, but TLP should explicitly manage the trade-off between missed events and false alarms. This also highlights an inherent conundrum: Areas with low SI generally present a lower hazard (which is beneficial), but the likelihood of a large event occurring without warning is higher (which poses a considerable risk). Thus, the challenge is to balance the benefits of reduced hazard in low-seismicity regions with the increased risk of unanticipated large events and to design TLP strategies that are responsive to both the probability of foreshocks and the potential for large, unpredicted ruptures.

When evaluating whether the injection shut-in mandated by TLP can prevent subsequent large events, the three fluid-mediated rupture-nucleation models may provide useful guidelines. In cascade-type sequences, the effectiveness of TLP would depend on whether shut-in occurs before the system enters a self-sustaining earthquake-to-earthquake triggering regime; whereas in fluid-driven preslip scenarios, the practical question for TLP shut-in is whether reducing or stopping injection can arrest injection-driven aseismic slip before it substantially loads the eventual mainshock patch. Theoretical, numerical, and hydromechanical models suggest that injection-driven aseismic slip can persist and continue to propagate after shut-in (47, 48); by contrast, laboratory injection experiments show that, under some hydraulic and frictional conditions, shut-in can rapidly arrest slip and allow the fault to relock (49). These inferences derive mainly from modeling and laboratory experiments, and the post-shut-in evolution of aseismic slip in industrial settings remains poorly constrained.

A Foreshock occurrence patterns:

B Fault-loading processes:

Fig. 4. Conceptual models for occurrence patterns and nucleation mechanisms of foreshocks in IIE. (A) Controls on foreshock productivity. (Left) Scenario 1 (abundant foreshocks), characteristic of regions with high SI and evidence of dynamic triggering. Small circles depict potential foreshock patches; the largest circle marks the eventual mainshock patch. Filled circles indicate critically stressed patches; open circles indicate noncritical patches. Dashed lines denote faults; blue arrows show fluid-migration and pore-pressure pathways. (Right) Scenario 2 (few or no foreshocks), typified by low SI and the absence of dynamic triggering; symbols are as shown at left. (B) Fault-loading and nucleation models. (Left) Fluid-driven preslip with weakened source asperity, in which pore-pressure diffusion (blue arrows) drives both aseismic slip (pink shading) and foreshock activity (gray stars) within and around the mainshock rupture zone (i.e., the source asperity; dashed ellipse). The aseismic slip is indicated by repeating earthquakes (Eq.; green stars), EHWs (yellow stars), and InSAR LOS displacement. Multiple foreshocks occur within the source asperity, progressively weakening the mainshock patch before failure. The red star denotes the hypocenter of the mainshock. Aseismic slip and the sequence are shown on a single fault plane for clarity. (Middle) Fluid-driven preslip with intact source asperity, in which injection-induced aseismic slip and nearby foreshocks jointly load the mainshock rupture zone. None of the resolvable foreshocks occur inside the source asperity, implying that it remains intact and locked until failure. (Right) Fluid-driven cascade model, in which an initial small event triggers subsequent foreshocks through static stress transfer, aided by pore-pressure diffusion (blue arrows), and the sequence terminates in mainshock rupture. Schematic not to scale. Eq.-Eq. Interaction, earthquake-to-earthquake interaction.

Prospective, operationally controlled studies that integrate dense seismic and geodetic monitoring into TLP decision frameworks are needed to evaluate shut-in efficacy and to improve short-term hazard forecasting.

The question of why only some earthquakes are preceded by foreshocks remains unresolved. Our results indicate that foreshock productivity could be jointly controlled by fault heterogeneity and the stress state of fault patches (Fig. 4). Conceptually, foreshocks represent failure of small fault patches, akin to ordinary small earthquakes (11, 13). In our study area, regions exhibiting high SI likely reflect a higher degree of fault heterogeneity, which could be caused by specific geological structures with abundant preexisting faults (31–34, 50). Moreover, the occurrence of dynamic triggering suggests a large population of critically stressed fault patches, a condition likely facilitated by injection-related stress changes (36). Taken together, high foreshock rates require both ingredients, substantial heterogeneity and a stressed fault patch population, whereas the absence of either condition might suppress foreshock occurrence.

Three considerations warrant emphasis regarding the involvement of aseismic slip in mainshock nucleation. First, direct observation of aseismic slip through InSAR remains inherently challenging because the deformation signals are small and spatially compact. Indeed, even for larger tectonic earthquakes, aseismic precursors are more often inferred from repeating earthquakes or systematic foreshock migration than resolved directly by InSAR (51, 52). Second, predominantly strike-slip ruptures may generate unresolvable InSAR signals depending on the fault-satellite geometry (43). Third, we cannot rule out the possibility that the aseismic slip and the foreshocks and mainshock occurred on separate fault structures as a result of location uncertainties. If so, fluid-driven aseismic slip could redistribute stress across a fault network and advance failure on adjacent structures.

There may be additional factors that could affect or modulate the foreshock productivity [e.g., the bounded magnitude growth (53)], and hybrid scenarios may occur where fault-loading processes jointly contribute to the nucleation of the mainshock rupture. Overall, a more nuanced, quantitative framework is needed to evaluate the relative roles of aseismic slip and earthquake-to-earthquake interactions in triggering induced mainshocks.

On the basis of the observed foreshock patterns, their controlling factors, and the three inferred fluid-mediated rupture-nucleation models, we argue that the performance of TLP could be considerably enhanced if regulatory decisions are based on the spatial variation of local and regional seismogenic conditions rather than fixed magnitude thresholds. Such region-conditioned monitoring strategies, paired with comprehensive real-time seismic and geodetic observations, can effectively constrain the state of stress loading and guide operational responses accordingly. Taken together, the retrospective metrics (SI, dynamic triggering) and prospective observations (dense arrays, InSAR and global navigation satellite system) linked through physics-based models (cascade, preslip-WSA, and preslip-ISA) offer a practical route from post hoc explanation to quantitative short-term forecasting, bringing us closer to the goal of minimizing the occurrence of damaging IIEs and mitigating their associated seismic risk.

Materials and methods are available in the supplementary materials.

REFERENCES AND NOTES

1. X. Lei, Z. Wang, J. Su, The December 2018 ML 5.7 and January 2019 ML 5.3 Earthquakes in South Sichuan Basin Induced by Shale Gas Hydraulic Fracturing. Seismology. Res. Lett. 90, 1099–1110 (2019). doi: 10.1785/0220190029

2. K.-H. Kim et al., Assessing whether the 2017 $M_{w}$ 5.4 Pohang earthquake in South Korea was an induced event. Science 360, 1007–1009 (2018). doi: 10.1126/science.aat6081; pmid: 29700224

3. K. M. Keranen, H. M. Savage, G. A. Abers, E. S. Cochran, Potentially induced earthquakes in Oklahoma, USA: Links between wastewater injection and the 2011 Mw 5.7 earthquake sequence. Geology 41, 699–702 (2013). doi: 10.1130/G34045.1

4. H. Kao, R. Visser, B. Smith, S. Venables, Performance assessment of the induced seismicity traffic light protocol for northeastern British Columbia and western Alberta. Leading Edge 37, 117–126 (2018). doi: 10.1190/tle37020117.1

5. R. Schultz, G. Beroza, W. Ellsworth, J. Baker, Risk-Informed Recommendations for Managing Hydraulic Fracturing-Induced Seismicity via Traffic Light Protocols. Bull. Seismol. Soc. Am. 110, 2411-2422 (2020). doi: 10.1785/0120200016

6. R. Schultz, G. C. Beroza, W. L. Ellsworth, A risk-based approach for managing hydraulic fracturing-induced seismicity. Science 372, 504–507 (2021). doi: 10.1126/science.abg5451; pmid: 33926953

7. W. Zhou et al., Managing Induced Seismicity Risks From Enhanced Geothermal Systems: A Good Practice Guideline. Rev. Geophys. 62, e2024RG000849 (2024). doi: 10.1029/2024RG000849

8. P. Segall, S. Lu, Injection-induced seismicity: Poroelastic and earthquake nucleation effects. J. Geophys. Res. Solid Earth 120, 5082–5103 (2015). doi: 10.1002/2015JB012060

9. D. W. Eaton, R. Schultz, Increased likelihood of induced seismicity in highly overpressured shale formations. Geophys. J. Int. 214, 751–757 (2018). doi: 10.1093/gji/ggy167

10. T. S. Eyre et al., The role of aseismic slip in hydraulic fracturing-induced seismicity. Sci. Adv. 5, eaav7172 (2019). doi: 10.1126/sciadv.aav7172; pmid: 31489366

11. W. L. Ellsworth, F. Bulut, Nucleation of the 1999 Izmit earthquake by a triggered cascade of foreshocks. Nat. Geosci. 11, 531–535 (2018). doi: 10.1038/s41561-018-0145-1

12. C. Tape et al., Earthquake nucleation and fault slip complexity in the lower crust of central Alaska. Nat. Geosci. 11, 536–541 (2018). doi: 10.1038/s41561-018-0144-2

13. R. E. Abercrombie, J. Mori, Occurrence patterns of foreshocks to large earthquakes in the western United States. Nature 381, 303–307 (1996). doi: 10.1038/381303a0

14. D. A. Dodge, G. C. Beroza, W. L. Ellsworth, Detailed observations of California foreshock sequences: Implications for the earthquake initiation process. J. Geophys. Res. 101 (B10), 22371–22392 (1996). doi: 10.1029/96JB02269

15. W. Sun et al., Rupture Cascade Initiated by Wastewater Disposal: Nucleation and Domino Effect of Canada's Largest Induced Earthquake. Geophys. Res. Lett. 53, e2025GL118405 (2026). doi: 10.1029/2025GL118405

16. X. Chen, P. M. Shearer, Analysis of Foreshock Sequences in California and Implications for Earthquake Triggering. Pure Appl. Geophys. 173, 133–152 (2016). doi: 10.1007/s00024-015-1103-0

17. S. Seif, J. D. Zechar, A. Mignan, S. Nandan, S. Wiemer, Foreshocks and Their Potential Deviation from General Seismicity. Bull. Seismol. Soc. Am. 109, 1–18 (2018). doi: 10.1785/0120170188

18. L. M. Jones, Foreshocks (1966-1980) in the San Andreas system, California. Bull. Seismol. Soc. Am. 74, 1361–1380 (1984).

19. J. Mori, R. E. Abercrombie, Depth dependence of earthquake frequency-magnitude distributions in California: Implications for rupture initiation. J. Geophys. Res. 102, 15081–15090 (1997). doi: 10.1029/97JB01356

20. G. M. Atkinson, D. W. Eaton, N. Igonin, Developments in understanding seismicity triggered by hydraulic fracturing. Nat. Rev. Earth Environ. 1, 264–277 (2020). doi: 10.1038/s43017-020-0049-7

21. A. M. Farahbod, J. F. Cassidy, H. Kao, D. Walker, Collaborative studies of regional seismicity in northeast British Columbia. Can. Soc. Explo. Gephys. Recorder 39, 40–44 (2014).

22. S. M. Mousavi, W. L. Ellsworth, W. Zhu, L. Y. Chuang, G. C. Beroza, Earthquake transformer—an attentive deep-learning model for simultaneous earthquake detection and phase picking. Nat. Commun. 11, 3952 (2020). doi: 10.1038/s41467-020-17591-w; pmid: 32770023

23. F. Tan, H. Kao, E. Nissen, D. Eaton, Seismicity-Scanning Based on Navigated Automatic Phase-Picking. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 3802–3818 (2019). doi: 10.1029/2018JB017050

24. H. Yu et al., Well Proximity Governing Stress Drop Variation and Seismic Attenuation Associated With Hydraulic Fracturing Induced Earthquakes. J. Geophys. Res. Solid Earth 125, e2020JB020103 (2020). doi: 10.1029/2020JB020103

25. G. M. Atkinson et al., Hydraulic fracturing and seismicity in the Western Canada Sedimentary Basin. Seismol. Res. Lett. 87, 631–647 (2016). doi: 10.1785/0220150263

26. M. Weingarten, S. Ge, J. W. Godt, B. A. Bekins, J. L. Rubinstein, High-rate injection is associated with the increase in U.S. mid-continent seismicity. Science 348, 1336–1340 (2015). doi: 10.1126/science.aab1345; pmid: 26089509

27. K. Deng, Y. Liu, R. M. Harrington, Poroelastic stress triggering of the December 2013 Crooked Lake, Alberta, induced seismicity sequence. Geophys. Res. Lett. 43, 8482–8491 (2016). doi: 10.1002/2016GL070421

28. H. Yu, R. M. Harrington, Y. Liu, B. Wang, Induced Seismicity Driven by Fluid Diffusion Revealed by a Near-Field Hydraulic Stimulation Monitoring Array in the Montney Basin, British Columbia. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 4694–4709 (2019). doi: 10.1029/2018JB017039

29. S. A. Shapiro, C. Dinske, C. Langenbruch, F. Wenzel, Seismogenic index and magnitude probability of earthquakes induced during reservoir fluid stimulations. Leading Edge 29, 304–309 (2010). doi: 10.1190/1.3353727

30. R. M. H. Dokht, H. Kao, A. Babaie Mahani, R. Visser, Spatiotemporal analysis of seismotectonic state of injection-induced seismicity clusters in the Western Canada Sedimentary Basin. J. Geophys. Res. Solid Earth 126, e2020JB021362 (2021). doi: 10.1029/2020JB021362

31. B. Wang, H. Kao, H. Yu, R. Visser, S. Venables, Physical factors controlling the diverse seismogenic behavior of fluid injections in Western Canada. Earth Planet. Sci. Lett. 589, 117555 (2022). doi: 10.1016/j.epsl.2022.117555

32. R. Schultz et al., Linking fossil reefs with earthquakes: Geologic insight to where induced seismicity occurs in Alberta. Geophys. Res. Lett. 43, 2534–2542 (2016). doi: 10.1002/2015GL067514

33. E. Galloway, T. Hauck, H. Corlett, D. Pană, R. Schultz, Faults and associated karst collapse suggest conduits for fluid flow that influence hydraulic fracturing-induced seismicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E10003–E10012 (2018). doi: 10.1073/pnas.1807549115; pmid: 30297421

34. B. Wang et al., Unveiling key factors governing seismogenic potential and seismogenic productivity of hydraulic fracturing pads: Insights from machine learning in the Southern Montney Play. Earth Planet. Sci. Lett. 626, 118511 (2024). doi: 10.1016/j.epsl.2023.118511

35. D. P. Hill et al., Seismicity remotely triggered by the magnitude 7.3 Landers, California, earthquake. Science 260, 1617–1623 (1993). doi: 10.1126/science.260.5114.1617; pmid: 17810202

36. E. E. Brodsky, N. J. van der Elst, The Uses of Dynamic Earthquake Triggering. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 42, 317–339 (2014). doi: 10.1146/annurev-earth-060313-054648

37. D. P. Hill, S. G. Prejean, Treatise on Geophysics, G. Schubert, Ed. (Elsevier, 2007), pp. 257–291.

38. N. J. van der Elst, H. M. Savage, K. M. Keranen, G. A. Abers, Enhanced remote earthquake triggering at fluid-injection sites in the midwestern United States. Science 341, 164–167 (2013). doi: 10.1126/science.1238948; pmid: 23846900

39. A. Peña Castro, S. L. Dougherty, R. Harrington, E. S. Cochran, Delayed dynamic triggering of disposal-induced earthquakes observed by a dense array in northern Oklahoma. J. Geophys. Res. Solid Earth 124, 3766–3781 (2019). doi: 10.1029/2018JB017150

40. B. Wang et al., Isolated cases of remote dynamic triggering in Canada detected using cataloged earthquakes combined with a matched-filter approach. Geophys. Res. Lett. 42, 5187–5196 (2015). doi: 10.1002/2015GL064377

41. M. V. Matthews, P. A. Reasenberg, Statistical methods for investigating quiescence and other temporal seismicity patterns. Pure Appl. Geophys. 126, 357–372 (1988). doi: 10.1007/BF00879003

42. P. A. Reasenberg, R. W. Simpson, Response of regional seismicity to the static stress change produced by the Loma Prieta earthquake. Science 255, 1687–1690 (1992). doi: 10.1126/science.255.5052.1687; pmid: 17749422

43. R. Bürgmann, P. A. Rosen, E. J. Fielding, Synthetic Aperture Radar Interferometry to Measure Earth's Surface Topography and Its Deformation. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 28, 169–209 (2000). doi: 10.1146/annurev.earth.28.1.169

44. H. Yu, R. M. Harrington, H. Kao, Y. Liu, B. Wang, Fluid-injection-induced earthquakes characterized by hybrid-frequency waveforms manifest the transition from aseismic to seismic slip. Nat. Commun. 12, 6862 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-26961-x; pmid: 34824197

45. Y. Ito, M. J. Ikari, Velocity- and slip-dependent weakening in simulated fault gouge: Implications for multimode fault slip. Geophys. Res. Lett. 42, 9247–9254 (2015). doi: 10.1002/2015GL065829

46. G. M. Atkinson, Strategies to prevent damage to critical infrastructure due to induced seismicity. Facets 2, 374–394 (2017). doi: 10.1139/facets-2017-0013

47. A. B. Jacquey, R. C. Viesca, Nucleation and Arrest of Fluid-Induced Aseismic Slip. Geophys. Res. Lett. 50, e2022GL101228 (2023). doi: 10.1029/2022GL101228

48. A. Sáez, B. Lecampion, Post-injection aseismic slip as a mechanism for the delayed triggering of seismicity. Proc.-Royal Soc., Math. Phys. Eng. Sci. 479, 20220810 (2023). doi: 10.1098/rspa.2022.0810

49. L. Wang, G. Kwiatek, E. Rybacki, M. Bohnhoff, G. Dresen, Injection-Induced Seismic Moment Release and Laboratory Fault Slip: Implications for Fluid-Induced Seismicity. Geophys. Res. Lett. 47, e2020GL089576 (2020). doi: 10.1029/2020GL089576

50. A. F. Peña Castro et al., Stress Chatter via Fluid Flow and Fault Slip in a Hydraulic Fracturing-Induced Earthquake Sequence in the Montney Formation, British Columbia. Geophys. Res. Lett. 47, e2020GL087254 (2020). doi: 10.1029/2020GL087254

51. A. Kato et al., Propagation of slow slip leading up to the 2011 $M_{w}$ 9.0 Tohoku-Oki earthquake. Science 335, 705–708 (2012). doi: 10.1126/science.1215141; pmid: 22267578

52. M. Bouchon et al., Extended nucleation of the 1999 $M_{w}$ 7.6 Izmit earthquake. Science 331, 877–880 (2011). doi: 10.1126/science.1197341; pmid: 21330536

53. R. Schultz et al., The bound growth of induced earthquakes could de-risk hydraulic fracturing. Commun. Earth Environ. 6, 995 (2025). doi: 10.1038/s43247-025-02881-2; pmid: 41377648

54. Alberta Energy Regulator/Alberta Geological Survey (AER/AGS), "Energy Briefing Note: The ultimate potential for unconventional petroleum from the Montney Formation of British Columbia and Alberta" (AER/AGS Information Series 144, 2013); https://www.cer-rec.gc.ca/en/data-analysis/energy-commodities/natural-gas/report/archive/ultimate-potential-montney-formation/the-ultimate-potential-unconventional-petroleum-from-montney-formation-british-columbia-alberta-energy-briefing-note.pdf.

55. A. Preston, G. Garner, K. Beavis, O. Sadiq, S. Stricker, Duvernay Reserves and Resources Report: A Comprehensive Analysis of Alberta's Foremost Liquids-Rich Shale Resource (2016); https://static.aer.ca/prd/documents/reports/DuvernayReserves_2016.pdf.

56. R. M. H. Dokht, H. Kao, S. Venables, GSC-BCER Induced Seismicity Study, International Federation of Digital Seismograph Networks (2018); https://doi.org/10.7914/fz33-f679.

57. Y. Liu, J. McKenzie, R. Harrington, McGill Dawson-Septimus Induced Seismicity Study, International Federation of Digital Seismograph Networks (2017); https://doi.org/10.7914/fj0y-da31.

58. Geological Survey of Canada, Public Safety Geoscience Program Canadian Research Network, International Federation of Digital Seismograph Networks (2013); https://doi.org/10.7914/SN/PQ.

59. Alberta Geological Survey/Alberta Energy Regulator, Regional Alberta Observatory for Earthquake Studies Network, International Federation of Digital Seismograph Networks (2013); https://doi.org/10.7914/SN/RV.

60. Natural Resources Canada, Canadian National Seismograph Network, International Federation of Digital Seismograph Networks (1975); https://doi.org/10.7914/SN/CN.

61. U.S. Geological Survey, Earthquake Hazards Program, Advanced National Seismic System (ANSS) Comprehensive Catalog of Earthquake Events and Products (USGS, 2017); https://doi.org/10.5066/F7MS3QZH.

62. R. Visser, H. Kao, B. Wang, H. Yu, Earthquake catalog for northeastern British Columbia and western Alberta between 2014–2024, version v2, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20698725.

63. P. Wessel et al., The Generic Mapping Tools Version 6. Geochem. Geophys. Geosyst. 20, 5556–5564 (2019). doi: 10.1029/2019GC008515

64. G. D. Mossop, I. Shetsen, Eds., Geological Atlas of the Western Canada Sedimentary Basin (Canadian Society of Petroleum Geologists and Alberta Research Council, 1994).

ACKNOWLEDGMENTS

We thank G. Atkinson, R. Schultz, and an anonymous reviewer for their constructive comments and suggestions that greatly improved the quality of this work. We are grateful to T. Sun, who serves as the NRCan internal reviewer of this article, and Y. Xu, Y. Liu, S. Venables, R. Dokht, and J. Gosselin for insightful discussions. Funding: This work was supported by National Science and Technology Major Project 2024ZD1002702-2 (B.W.), the Startup Fund from the Zhejiang University of Technology grant (B.W.), NRCan's Environmental Geoscience Program (H.K.), NRCan's GeoEnergy Program (H.K.), National Natural Science Foundation of China grants 42374056 and 92479202 (H.Y.), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada RGPIN-2022-04724 (Y.J.), and National Natural Science Foundation of China grant U24A20319 (Q.L.). Author contributions: Conceptualization: B.W., H.K., H.Y.; Methodology: B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., P.Z., Y.L., R.V.; Investigation: B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., P.Z., Y.L., R.V.; Visualization: B.W., H.K., H.Y., Y.J., Q.L., W.Z., J.H., Y.B., Z.C., R.V.; Funding acquisition: B.W., H.K., H.Y., Y.J.; Project administration: H.K.; Supervision: B.W., H.K., H.Y.; Writing – original draft: B.W., H.K., H.Y., Y.J.; Writing – review & editing: B.W., H.K., H.Y., Y.J. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials availability: The continuous waveforms are recorded by the Canadian National Seismograph Network (FDSN network code CN), regional research networks established by the Geological Survey of Canada and Alberta Geological Survey (PQ, 1E and RV), and several broadband seismic stations operated by McGill University and Ruhr-University Bochum (XL and RU) (56–60). All waveform data are available online at the EarthScope Seismological Facility for the Advancement of Geoscience (SAGE, NSF award 2435260). The fluid injection data are retrieved from the online database maintained by the BC Energy Regulator (BCER) (https://www.bc-er.ca/, last accessed 30 April 2025) and Alberta Energy Regulator (AER) (https://www.aer.ca/data-and-performance-reports/activity-and-data/lists-and-activities/hydraulic-fracture-fluid-data, last accessed 20 August 2025). The teleseismic events are obtained from the USGS earthquake catalog (https://earthquake.usgs.gov/earthquakes/search/, last accessed 15 August 2025) (61). The original catalogs for NEBC are available online as Geological Survey of Canada Open File reports (https://www.earthquakescanada.nrcan.gc.ca/pprs-pprp/index-en.php), and an enhanced version of the catalog is archived at Zenodo (62). The original catalog for western Alberta is obtained at https://geology-ags-aer.opendata.arcgis.com/datasets/ags-aer:.alberta-earthquakes/about. Copernicus Sentinel-1 SAR scenes (Level-1 SLC, IW mode) used for InSAR were downloaded from NASA's Alaska Satellite Facility Distributed Active Archive Center (ASF DAAC) via the Vertex (ASF Data Search) portal. Maps were generated using Generic Mapping Tools (63). The geological context derives from the online Geological Atlas of the Western Canada Sedimentary Basin (https://ags.aer.ca/publications/atlas-western-canada-sedimentary-basin) (64). All other data needed to evaluate the conclusions in the paper are included in the paper or the supplementary material. No physical materials or samples were generated or collected for this study. License information: Copyright © 2026 the authors; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science subject to: Canadian Crown copyright, © His Majesty the King in Right of Canada, as represented by the Minister of Natural Resources, 2026. No claim to original US government works. All other rights reserved by American Association for the Advancement of Science. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aed9893

Materials and Methods; Supplementary Text S1 to S8; Figs. S1 to S24; Tables S1 to S4; References (65–124)

Submitted 26 November 2025; accepted 24 June 2026

Recovering signatures of archaic hominin introgression using ancestral recombination graphs

Yulin Zhang*, Arjun Biddanda*, Sarah A. Johnson, Colm O'Dushlaine, Priya Moorjani*

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aef8874

INTRODUCTION: The sequencing of Neanderthal and Denisovan genomes has revealed extensive interbreeding between modern humans and now-extinct archaic hominins, transforming our understanding of human evolutionary history. However, many archaic populations that contributed to modern human ancestry—particularly those lacking preserved fossils or DNA—remain uncharacterized. Existing computational methods cannot detect these contributions as they rely on either an archaic reference genome or an unadmixed outgroup. As a result, the full extent and complexity of archaic introgression remain unknown.

RATIONALE: Ancestral recombination graphs (ARGs) encode the full genealogical history of a set of samples across the genome, providing a record of the ancestral population relationships over time. Gene flow from a deeply divergent archaic source is expected to leave two distinctive signatures in the ARG: (i) unusually deep coalescent branches, reflecting the long evolutionary separation between the introgressing lineage and the recipient population, and (ii) long stretches of the genome over which introgressed lineages persist as contiguous haplotypes, reflecting the limited number of recombination events since the gene flow event. We developed TRACE (Tracking Archaic Contributions via ARG Estimation), a reference- and outgroup-free method that identifies introgressed archaic segments in contemporary genomes by scanning inferred ARGs for these signatures.

RESULTS: We validate TRACE by performing extensive simulations and show that it has high precision and low false discovery rate across a range of demographic scenarios and parameters. Applied to data from the 1000 Genomes Project, TRACE recovers the known signatures of Neanderthal introgression in all non-Africans and Denisovan introgression in Asians and Oceanians, with population-level patterns consistent with prior estimates.

Beyond these established signals, TRACE identifies extensive segments of ghost archaic ancestry—from a previously uncharacterized hominin lineage—in both African and non-African populations. We find ghost ancestry persists within Neanderthal and Denisovan ancestry deserts, genomic regions previously interpreted as depleted of archaic introgression and thought to be specific to Homo sapiens. This challenges the prevailing interpretation of these regions and suggests that selection acting against introgressed ancestry has not been uniform across all archaic sources. In Oceanian populations, TRACE detects a substantial enrichment of unusually deep coalescent lineages within Denisovan ancestry segments compared with Neanderthal segments, consistent with a model of super-archaic gene flow into modern humans through Denisovans. Together, these results point to multiple layers of introgression—both direct and mediated through other archaic groups—that have shaped modern human genomes.

TRACE infers archaic ancestry without reference genomes. (Top) TRACE uses inferred ARGs to characterize archaic ancestry across the genome (Neanderthal, blue; Denisovan, orange; ghost, red; super-archaic, green). (Middle) TRACE recovers known introgression signals, detects ghost ancestry within archaic deserts, and identifies super-archaic gene flow enriched in Oceanian Denisovan segments. (Bottom) Schematic phylogeny of introgression events across the course of human evolution.

CONCLUSION: TRACE is a genealogy-based method for mapping archaic ancestry without the need for archaic reference genomes, revealing hidden layers to our evolutionary past. Using ARGs inferred from modern genomes alone, the method recovers signatures of introgression from archaic hominins for whom no DNA is available, including ghost and super-archaic lineages. With continued progress in ARG reconstruction, TRACE will increasingly advance our understanding of the legacy of extinct populations to present-day human genetic diversity. □

INTROGRESSION

Recovering signatures of archaic hominin introgression using ancestral recombination graphs

Yulin Zhang $^{1}$ †, Arjun Biddanda $^{2,3}$ †, Sarah A. Johnson $^{1}$ , Colm O'Dushlaine $^{3‡}$ , Priya Moorjani $^{1,4*}$

Admixture between modern humans and extinct hominins has shaped the genomes of present-day individuals, but reconstructing this history has been constrained by the scarcity of archaic samples and unadmixed outgroup populations. We introduce TRACE, a reference- and outgroup-free approach that uses features of ancestral recombination graphs to identify archaic ancestry. Simulations demonstrate that TRACE achieves high precision and low false discovery rates. Applied to 1000 genomes, TRACE recovers known Neanderthal and Denisovan introgression and uncovers ghost admixture from uncharacterized hominins in both Africans and non-Africans. Ghost ancestry persists in Neanderthal and Denisovan ancestry deserts, challenging their interpretation as Homo sapiens-specific regions. In Oceanians, TRACE finds that deep lineages are enriched in Denisovan compared with Neanderthal regions, supporting super-archaic introgression. TRACE enables mapping of archaic introgression without archaic reference genomes.

The sequencing of the Neanderthal and Denisovan genomes has transformed our understanding of human evolution, revealing evidence for gene flow between modern humans and archaic hominins (1-5). Most non-Africans living today possess 1 to $2\%$ Neanderthal ancestry, whereas Asians and Oceanians harbor $\sim 0.1$ to $5\%$ Denisovan ancestry (6, 7). Archaic ancestry has had a major impact on human adaptation and disease, contributing to a range of traits such as skin pigmentation, high altitude adaptation, and immune function (8-14). To date, however, only six high-coverage archaic genomes have been published—four Neanderthal and two Denisovan—all from Eurasia. Thus, our knowledge of the evolutionary history and impact of archaic ancestry outside Eurasia and at deeper timescales remains incomplete (1-3, 5, 15, 16).

Several studies have posited that gene flow from other unknown archaic hominins—for whom no genomic sequences currently exist—may have occurred both within and outside Africa (17–31). Genetic analyses of present-day African populations have identified highly divergent haplotypes that cannot be explained by known demographic histories, hinting at “ghost” introgression (17–29, 31). At deeper timescales, analysis of the Altai Denisovan genome suggests that they harbor ancestry from a deeply divergent population, referred to as “super-archaic”, that split from modern humans around 0.9 to 1.4 million years ago (Mya) (2, 3, 32). Ghost lineages refer broadly to any unsampled archaic population contributing to modern genomes, whereas super-archaic ancestry specifically denotes contributions from lineages that diverged before the common ancestor of modern humans and Neanderthals/Denisovans. Super-archaic ancestry likely introgressed into modern humans through Denisovan gene flow and thus may be present in Asians and Oceanians. These histories, however, remain poorly understood as most available methods for studying archaic introgression rely on either sequenced archaic genomes (33), an outgroup population without archaic ancestry (18, 34–36), or both (6, 37). As the oldest ancient genome from Africa is less than 20,000 years old (26) and recovering hominin DNA older than a million years outside of permafrost is improbable (38), methods without such requirements are needed.

With the availability of new methods to reconstruct ancestral recombination graphs (ARGs) (39–42), it is now possible to infer the full evolutionary history of a set of sequences in a computationally tractable manner. An ARG provides a complete record of all the coalescence and recombination events and specifies a complete genealogy at each position in the genome (43–46). Importantly, gene flow from deeply divergent lineages is expected to leave distinct signatures in the ARG—such as unusually deep coalescent events—that can be used to detect introgression, even in the absence of archaic reference genomes (42).

We introduce TRACE (Tracking Archaic Contributions Via ARG Estimation), a method for identifying footprints of archaic ancestry in modern human genomes by leveraging features of ARGs constructed from contemporary genomes alone, requiring neither an archaic reference genome nor an unadmixed outgroup population. We perform extensive simulations to characterize the reliability of TRACE under a range of demographic scenarios, using true and inferred ARGs. We then apply TRACE to whole-genome sequences of individuals from worldwide populations to reconstruct the evolutionary history and legacy of archaic gene flow in modern humans.

Results

TRACE identifies archaic gene flow using ARGs

TRACE infers archaic ancestry by leveraging genealogical information encoded in ARGs. The central idea is that archaic introgression leaves two characteristic signatures in the sequence of marginal trees within an ARG: long branches and long haplotypes. First, long branches arise because introgression from a deeply divergent population introduces lineages that coalesce much further back in time than nonintrogressed lineages (47). In the ARG, this appears as branches with deep coalescence times that span the interval between the divergence time of the archaic and modern lineages ( $T_{archaic}$ ) and the time of the admixture event ( $T_{admix}$ ) (Fig. 1A) (42). Second, because admixture is more recent than divergence, introgressed segments are expected to be longer than those arising from incomplete lineage sorting (ILS), as less time has elapsed since admixture for recombination to break down the ancestry tracts (48).

TRACE is implemented as a hidden Markov model with two states—archaic human and modern human. As input, it uses ARGs inferred from phased whole-genome sequences of contemporary individuals. For each marginal tree and focal haplotype, we examine (i) the length of the branch ancestral to the focal sample at time t and (ii) the number of other coalescent events on the tree that fall within the same time window (Fig. 1B and fig. S1). The parameter t—which defines the time cutoff for identifying “long” branches—is specified by the user and represents the proxy for the divergence time between the introgressing lineages. The optimal performance of TRACE is achieved when t is close to the true divergence time $T_{archaic}$ ; if t is set to be much older than $T_{archaic}$ , some true signals may be missed if the introgressed archaic lineage coalesces with modern human lineages before t. Alternatively, if t is set too young, archaic inference results can be sensitive to other recent demographic events (fig. S3).

To validate TRACE, we simulated genome sequences for three populations including Africans, non-Africans and Neanderthals, incorporating an Out-of-Africa (OOA) bottleneck and $\sim2\%$ Neanderthal gene flow into non-Africans (22, 49). We applied TRACE to detect archaic ancestry in non-Africans using true ARGs for non-Africans (target, n = 100)

B

D

Fig. 1. Conceptual overview and validation of TRACE. (A) Schematic of local genealogy relating four haplotypes under a demographic scenario of introgression, where introgression affecting the focal haplotype (green dot) creates long branches (orange branch) ancestral to that sample. Specifically, the long branch spans the timepoint of t generations, which is a user-defined timescale to identify archaic events inferred by TRACE, and is shown in the interval between the divergence time of the archaic and modern lineages lineages ( $T_{archaic}$ ) and the time of the admixture event ( $T_{admix}$ ) in this figure. Individuals without archaic ancestry (black dots) coalesce at the standard rate within the ancestral population, generating coalescent events during the timespan of the orange branch, which is modeled in the single-genealogy emission distribution. Note that time intervals are not drawn to scale. (B) Illustration of how the tree sequences are related to emission distributions of the focal branch lengths and the number of nonfocal coalescent events. Coalescent events that are incorporated into the emission distribution for each marginal tree are shown in blue (which occur during the span of the orange branch overlapping t). For simulations of a constant size model (solid line) and an Out-of-Africa (OOA) model (dashed line), we show the precision (purple), recall (pink), and FDR (brown) when applying different haplotype length cutoffs (x-axis) in TRACE and using (C) ground-truth ARGs and (D) SINGER-inferred ARGs. Precision and recall fall between 0 and 1, shown as the “rate” on the left y-axis; FDR falls between 0 and 0.02, shown on the right y-axis. See also supplementary text section S1 to S3.

and Africans $n = 100$ . We constructed ARGs jointly across populations to minimize the impact of population bottlenecks on the inference (figs. S2 to S6). Applying t = 15,000 generations close to the divergence time between Neanderthals and modern humans (4) and focusing on ancestry segments longer than 0.05 centi-Morgans (cM) to distinguish introgressed segments from ILS (50), we find that TRACE exhibits high accuracy and high recall (92 and 71%, respectively). The false discovery rate is very low (FDR < 0.25%) as shown by applying TRACE to populations without archaic ancestry (Fig. 1C and supplementary text section S1.3). Compared with published archaic inference methods hmmix (34), Sprime (35), and IBDmix (33), TRACE does not require a sequenced archaic genome or an unadmixed outgroup. In simulations, we observe that even small amounts of archaic gene flow into the outgroup can bias reference-free methods such as hmmix and Sprime, whereas TRACE maintains high sensitivity and specificity (fig. S7). Reference-based methods such as IBDmix are not applicable to ghost ancestry inference, and can only recover $<0.1\%$ ghost ancestry in simulations (table S8). TRACE shows robust performance across a range of additional demographic models and parameters, including varying proportions of Neanderthal ancestry (0.5 to 10%), divergence times ( $\sim9250$ to 24,300 generations), introgression times (725 to 5725 generations), target sample sizes (10 to 200), and misspecification of parameter t (figs. S3 to S8 and supplementary text section S2).

Next, we applied TRACE to ARGs inferred using two recently published methods, SINGER (40) and Relate (42). Similar to the performance with true ARGs, TRACE achieves high precision ( $\sim90\%$ ) and low FDR ( $<0.25\%$ ) using the inferred ARGs (Fig. 1, C and D, and fig. S9). However, the recall is substantially lower with inferred ARGs compared with true ARGs. For the OOA model (fig. S2B), TRACE recovers less than 10% of true segments using Relate and approximately 50% using SINGER, compared with $\sim80\%$ recall using true ARGs (fig. S9). Furthermore, recall decreases under more complex demographic models, though SINGER maintains higher recall than Relate (around 30%) under most demographic scenarios (fig. S10). Thus, we applied TRACE to SINGER-inferred ARGs for subsequent analysis of empirical data (supplementary text section S3 and figs. S9 to S14).

Evidence of ghost admixture in modern human populations before the OOA migration

We analyzed 503 phased whole-genome sequences from the 1000 Genomes Project (1000G) using SINGER reconstructed ARGs (no archaic genomes included). To identify archaic introgression signals, we applied TRACE with t = 15,000 generations [or 420,000 years, assuming a generation time of 28 years (51)], close to the estimated divergence time between modern humans and Neanderthals (4). To minimize the impact of ILS, we retained archaic segments longer than 50 kilobase pairs (kbp) and 0.05 cM (which translates to FDR < 0.2% in simulations, Fig. 1D). We then compared variants on the inferred archaic segments with four high-coverage sequenced archaic genomes [three Neanderthal (2, 3, 5) and one Denisovan (1)] to identify the source of archaic ancestry. For comparison, we also applied IBDmix (using the Altai Neanderthal and Altai Denisovan genomes) and hmmix (using 426 sub-Saharan Africans as outgroup) (supplementary text section S4).

ancestry—introgression from an archaic lineage more distantly related to Neanderthals and Denisovans—in all modern human populations studied. We detected 0.5 to 1.1% of ghost ancestry on average across populations (Fig. 2A). Most ghost ancestry segments found in non-Africans are shared with sub-Saharan Africans, while both East and West Africans harbor a greater diversity of distinct ghost segments consistent with the reduction in genetic diversity in non-Africans caused by the OOA bottleneck (Fig. 2B and figs. S23 and S24). Ghost segments exhibit deep divergence in marginal trees and show nearly identical genetic affinity to both sequenced Neanderthal and Denisovan genomes, indicating that they originated from an unsequenced lineage equally related to both archaic groups (Fig. 2C and figs. S17 to S19). The average coalescence time between the ghost and modern human segments, inferred from introgressed segments, is approximately 0.83 Mya (95% CI: 0.83 to 0.84 Mya, table S6).

Several additional lines of evidence support our results of ghost ancestry in modern humans. First, we find that genomic regions harboring ghost ancestry exhibit elevated heterozygosity levels, a pattern also observed for Neanderthal and Denisovan segments (fig. S25). The elevation in heterozygosity is consistent with a model of introgression from a deeply divergent lineage $(56)$ and, notably, suggests that the ghost ancestry signal is not an artifact of ARG inference. Second, across all tested populations, ghost ancestry segments are shorter than Neanderthal and Denisovan segments, reflecting a more ancient introgression event predating Neanderthal gene flow (fig. S26). Additionally, we validated in simulations that in a model lacking ghost introgression, TRACE infers negligible levels of ghost ancestry (0.07%, 95% CI: 0 to 0.3%), markedly below the estimates from empirical data. By contrast, simulations including a ghost lineage produced results that closely matched empirical observations (tables S7 to S9, figs. S27 and S28, and supplementary text section S5). Furthermore,

A

In non-African populations, TRACE identifies 0.8 to 1% Neanderthal ancestry per individual in Europeans, East Asians, and South Asians (Fig. 2A). We recovered minimal Denisovan ancestry in Europeans (0.03%), with higher levels in East and South Asians (0.10% each), consistent with published results (35, 52–55). More than 90% of Neanderthal and 70% of Denisovan segments identified by TRACE were also inferred by hmmix or IBDmix (table S4). In both West and East Africans, TRACE detects less than 0.1% combined Neanderthal and Denisovan ancestry per individual. Around half of the Neanderthal segments identified in sub-Saharan Africans by TRACE were also inferred by IBDmix (table S4; hmmix was not applied as there is no reliable outgroup for sub-Saharan Africans). We note that TRACE recovers less total Neanderthal and Denisovan ancestry compared with some previous studies (33, 54, 55), owing to the lower recall with inferred ARGs, though the recovered segments show no obvious bias relative to those identified by hmmix and IBDmix (supplementary text section S4.3 and S5.2, table S7, figs. S10, S15, and S16). Nevertheless, TRACE robustly reconstructs the major features of Neanderthal and Denisovan introgression across global populations.

Beyond Neanderthal and Denisovan ancestry, TRACE revealed “ghost” archaic we computed the site frequency spectrum (SFS) and conditional SFS (cSFS) for variants present on archaic segments identified by TRACE (figs. S20 to S22). While Neanderthal and Denisovan segments show the expected "U-shape" (17), ghost segments display distinct SFS and cSFS patterns that are consistent with a model of pre-OOA ghost introgression in simulations (fig. S29 and S30).

B

C

Fig 2. Archaic ancestry in global populations. (A) Proportion of archaic ancestry per genome recovered by TRACE using t = 15,000 generations that are >50 kbp and >0.05 cM for 1000G populations. Archaic segments are classified as Neanderthal (blue), Denisovan (orange), and ghost (red) based on allele sharing with sequenced Neanderthal and Denisovan genomes (supplementary text section S4.2). (B) The amount of total (dark) and shared (light) ghost archaic ancestry per genome between West Africans and non-Africans. (C) Affinity of ghost segments for Neanderthal (x-axis) and Denisovan (y-axis) genomes in West Africans, calculated as the proportion of derived mutations on the segment shared with Neanderthal and Denisovan sequences.

Together, these findings suggest that an unknown archaic population, which diverged more than 500,000 years ago, introgressed into the common ancestors of all modern humans prior to the OOA migration, resulting in similar patterns of ghost ancestry in non-Africans and Africans.

The landscape of ghost ancestry in modern humans

To explore the legacy of ghost ancestry in modern humans, we examined the genome-wide distribution of ghost ancestry in global populations. Across all ghost haplotypes identified in all populations (sub-Saharan Africans and non-Africans) by TRACE, we recovered 1548.75 Mbp or 71.54% of the accessible genome (Fig. 3, supplementary text section S6). Broadly, the genome-wide patterns of ghost ancestry segments resemble those expected from hybridization between deeply divergent lineages (57–59). We find that ghost ancestry decreases in proximity to functional elements [lower B score (60); $\rho_{Spearman} = 0.45$ , $P < 10^{-5}$ ] and in regions of low recombination ( $\rho_{Spearman} = 0.34$ , $P < 10^{-5}$ ), reflecting stronger effects of linked selection in these regions (61, 62). These patterns mimic those seen in Neanderthal and Denisovan introgression maps (6, 53) as well as

A

patterns of hybridization across nonhuman species (59) (fig. S31 and S32, table S10, and supplementary text section S6.1).

We also scanned for “peaks” of ghost ancestry, defined as regions where the frequency of ghost ancestry exceeded two standard deviations above the population-specific genome-wide average. Across all tested populations, we identified 1932 peaks of ghost ancestry (average length 61 kbp, SD 64 kbp) (supplementary text section S6.2, Fig. 3, and table S13). This result contrasts with the smaller number of 1155 and 160 peaks of Neanderthal and Denisovan ancestry, respectively (average length 84.97 and 76.54 kbp). We find that ghost ancestry peaks are overrepresented in sub-Saharan African populations relative to non-African populations, which is consistent with the lower genetic diversity in non-Africans (figs. S33 and S34). Several genes intersect with high-frequency peaks of ghost ancestry, such as CSMD1 and RBFOX1, with an overall functional enrichment for immune and metabolic complexes, including the major histocompatibility and lipoprotein complexes ( $P < 10^{-5}$ using binomial test; figs. S35 and S36). We also identify 97 deserts of ghost ancestry (i.e., regions that are at least 10 Mbp long and have less than 0.1% frequency of ghost ancestry). These deserts are only found in non-African populations, with nearly half (43.3%) shared between different non-African groups, likely formed during the OOA bottleneck (supplementary text section S6.3 and figs. S37 and S38). We do not identify any ghost ancestry deserts in sub-Saharan Africans (though this may depend on the specific frequency and haplotype length thresholds applied). Overall, we find large heterogeneity in the distribution of ghost ancestry tracts across the genome.

Fig. 3. Characterizing the distribution of archaic ancestry using TRACE. (A) Estimated peaks of archaic ancestry from TRACE—including ghost ancestry—aggregated across all populations. Genomic regions masked as centromeric or genomic regions with no called variants (excluded from ARG inference) are shown in white. Previously estimated deserts of archaic (Neanderthal and Denisovan) ancestry are shown as gray highlights. (B) Frequency of Neanderthal and Denisovan ancestry across non-African populations and ghost ancestry across all populations within the chromosome 7 archaic desert [shown as dashed gray box in (A)]. The y-axis in the top panel reflects the frequency of Neanderthal and Denisovan ancestry whereas the y-axis in the bottom panel reflects the frequency of ghost ancestry within the region.

Neanderthal and Denisovan deserts are often considered candidates of Homo sapiens-specific regions (7, 63). We examined ghost ancestry in five Neanderthal and Denisovan shared deserts identified by two previous studies (figs. S39 to S45, tables S11 and S12, and supplementary text section S6.4) (7, 53). We replicate the absence of both ancestries in two deserts but find non-negligible Neanderthal or Denisovan ancestry in some others consistent with recent studies (7, 53, 54, 63, 65). Nevertheless, all five regions contain substantial ghost ancestry, even after restriction to longer and more confidently inferred segments (>100 kbp; Fig. 3B, figs. S39 and S40, and table S11). For example, the shared archaic desert on chromosome 7 containing the FOXP2 gene has a ghost ancestry peak at $13.3\%$ frequency (Fig. 3B), and the Neanderthal desert on chromosome 3 contains a ghost peak of $\sim 20\%$ frequency overlapping CSNK2A2IP (fig. S40). Our findings suggest that ghost ancestry is often present in previously defined archaic deserts, providing additional context to putative Homo sapiens-specific evolutionary changes.

Detecting super-archaic ancestry in Oceanians

Previous studies examining patterns of allele sharing between Neanderthals, Denisovans, and modern humans have suggested Denisovans may harbor ancestry from a super-archaic population $(1, 2, 32)$ . Among modern humans, Oceanians and Southeast Asians derive the highest proportion of Denisovan ancestry $(52)$ . We therefore reasoned that a fraction of super-archaic ancestry may have been inherited through Denisovan gene flow and may persist within Denisovan-introgressed segments in present-day Oceanians. To test this, we analyzed 92 high-coverage whole-genome sequences from Oceanian individuals including 25 individuals from Papuan New Guinea $(65)$ and 67 individuals from Vanuatu and

Santa Cruz Islands (52). We reconstructed the ARGs using SINGER along with 1000G YRI individuals and applied TRACE with t = 15,000 generations to detect archaic ancestry (supplementary text section S7.1).

In Oceanian individuals, TRACE inferred an average of 0.73% Neanderthal, 0.66% Denisovan, and 0.33% ghost ancestry (Fig. 4A), lower than estimates from previous studies (52) and from other 1000G non-Africans (Fig. 2A and fig. S46). Because Neanderthals and Denisovans coalesce with each other [t = 13,600 to 16,900 (2)] before coalescing with modern humans, many of the long branches are not detected when using t = 15,000 generations as the time cutoff. The higher archaic introgression proportion further exacerbates this effect, as a larger fraction of coalescent events occur among archaic lineages (supplementary text section S7.2, table S15, and figs. S47 and S57). Simulations mimicking the demographic history of Oceanians replicated this underestimation (supplementary text section S8 and tables S15 and S16). Despite lower recall, more than 90% of the Neanderthal and Denisovan segments detected by TRACE overlap with those from hmmix or IBDmix (table S14). TRACE-detected archaic segments showed consistent archaic affinity patterns (fig. S48) and site frequency spectra (SFS/cSFS, fig. S49) with 1000G data. Furthermore, ghost segments in Oceanians overlapped with those detected in 1000G populations (fig. S50), consistent with a shared origin in modern humans.

To identify super-archaic introgression, we screened for “super-deep” coalescent events within Denisovan-introgressed segments with t = 31,500 generations (inferred divergence time between the super-archaic lineage and modern humans) $(32)$ , requiring at least 10 kbp and 0.01 cM to distinguish from ILS, and applied the same analysis to Neanderthal introgressed segments for comparison. We find a significantly higher proportion of super-deep lineages in Denisovan than in Neanderthal segments ( $P < 10^{-5}$ using a binomial test; Fig. 4 and supplementary text section S7.3). Simulations show that this pattern is inconsistent with a model lacking super-archaic introgression but is recapitulated by a model including super-archaic introgression into Denisovans (Fig. 4C, figs. S56, S58, and S59, and tables S15 and S16). Furthermore, super-archaic fragments within introgressed Denisovan segments exhibit distinct genetic features that differentiate them from the background Denisovan ancestry, including much deeper coalescence times with modern humans, longer genomic lengths than mean ILS length from Neanderthal deep lineages, and low affinity to both Neanderthal and Denisovan reference genomes (assuming no super-archaic ancestry at the same locus in sequenced Denisovan, supplementary text section S8.4, fig. S60, and table S17). Using these features, we detected super-archaic segments in simulations with 70.2% accuracy (95% CI: 66.4 to 74.1%, supplementary text section S8.5).

A

B

C

Fig. 4. Super-archaic ancestry detected using TRACE within Oceanian (OCN) genomes. (A) Total proportion of Neanderthal, Denisovan, and ghost ancestries across all sampled Oceanian individuals (B) Detected super-archaic ancestry in the MHC region lying on the background of Denisovan ancestry. (C) Denisovan segments have a substantially higher proportion of super-deep lineages than Neanderthal segments, a signal reflective of super-archaic ancestry in simulations ( $P < 10^{-5}$ , $P = 1.00$ , $P < 10^{-5}$ ) to real data OCN, no super-archaic simulation, and super-archaic simulation respectively; using binomial test).

Applied to Oceanian genomes, we infer that the super-archaic segments embedded within Denisovan ancestry tracts range between 20 to 83 kbp (average: 37.6 kbp) and contribute approximately 0.3% of the total detected Denisovan ancestry in Oceanians (table S18 and fig. S51). This estimate constitutes a very conservative lower bound on the true fraction of super-archaic ancestry, as our analysis is restricted to Denisovan-introgressed regions, requires segments of at least 20 kbp, and excludes loci where the sequenced Denisovan carries super-archaic ancestry (figs. S60 and S61 and supplementary text section S7.4). We validated that super-archaic segments exhibit higher nucleotide divergence from both modern humans (sub-Saharan Africans) and Altai Denisovans (compared with other Denisovan-introgressed regions), suggesting the signal is not an artifact of ARG inference (fig. S52). Using the marginal trees from SINGER, we estimate the coalescence time between super-archaic and modern human lineages to be approximately 1.77 Mya (95% CI: 1.69 to 1.83 Mya), consistent with earlier reports (2, 32).

We evaluated the potential functional effects of super-archaic segments recovered from Oceanian genomes by characterizing common gene annotations and patterns of functional enrichment (Fig. 4B). Several genic regions harbor high proportions ( $>70\%$ ) of super-archaic tracts such as RNF39, PPP1R11, and POLR1H within the major histocompatibility complex (MHC) (Fig. 4B and fig. S53) and CYP24A1, which is a part of the cytochrome P450 family and a critical regulator of vitamin D degradation in humans (fig. S54) (30, 66–69). Gene ontology analysis reveals considerable enrichment for several pathways including MHC and activity-related cytoskeleton, after multiple hypothesis testing (fig. S55).

Discussion

We introduce TRACE, a framework for detecting archaic introgression from ARGs inferred from contemporary genomes alone. TRACE's reference- and outgroup-free design enables the reconstruction of introgression histories that are difficult to resolve with existing approaches, including ghost and super-archaic introgression. As with any ARG-based method, TRACE's performance depends on the accuracy and scalability of the underlying ARG inference, with reduced recall using inferred ARGs relative to ground-truth genealogies. As ARG reconstruction methods continue to advance, the reliability and resolution of TRACE will improve, illuminating episodes of evolutionary history of humans and other species lacking direct genomic references.

Applied to modern human data, TRACE recovers known Neanderthal and Denisovan ancestry and identifies previously uncharacterized signatures of archaic ancestry at varying time points in human history. We find evidence for at least one ghost introgression predating the OOA expansion that contributed ancestry to all present-day populations. This finding is most consistent with a discrete introgression event as in (17) but extends that model by showing that the event affected all modern human populations rather than being localized to West Africans. Given that our inferred ghost lineage diverged around the time of the Neanderthal–modern human split (table S6), it represents a more recent event than the proposed deep structure scenarios, involving a population split (>1.5 Mya) followed by later integration through either a single rejoining event around 300 kya (23) or multiple “merger” events (27). Finally, we infer deeply diverged lineages embedded within Denisovan ancestry in Oceanians, consistent with an additional, indirect contribution from a super-archaic hominin to modern humans. These results point to multiple layers of introgression—both direct and mediated through other archaic groups—shaping modern human genomes.

Beyond the timing and demographic context of these introgression events, their hominin sources remain an open question. Archaeological records document numerous archaic forms with unclear amounts, if any, of potential contribution to modern humans (30, 66, 67). The ghost lineage, with a divergence time similar to that of Neanderthals, could plausibly correspond to Middle Pleistocene Homo groups (70–72) or African Homo heidelbergensis populations (73–75) that directly admixed with modern human ancestors before the OOA dispersal. For the super-archaic lineage, one potential candidate—compatible with the split time of approximately 1.8 Mya—is Homo erectus, as suggested by earlier studies (2, 16, 32).

TRACE also illuminates the enduring genomic legacy of archaic ancestry in modern humans. Both ghost and super-archaic ancestry are markedly enriched in functional regions highlighting their role in human adaptation. Moreover, ghost ancestry persists within genomic regions previously identified as deserts of Neanderthal and Denisovan introgression. These deserts have often been interpreted as regions intolerant to archaic introgression as a result of positive selection for Homo sapiens-specific variation or strong purifying selection against archaic introgressed alleles (57–59). Instead, the persistence of deeply diverged ghost ancestry in these regions suggests lineage-specific selection against Neanderthal and Denisovan introgression, rather than positive selection for modern human variation. This pattern implies that differences in genetic load or epistatic incompatibilities associated with Neanderthal and Denisovan lineages—rather than with divergence time alone—shaped Neanderthal and Denisovan ancestry deserts.

Several open questions remain: First, the number, timing, and geographic locations of the inferred ghost introgression events are still uncertain; although our results support at least one pre-OOA introgression event affecting all modern human populations, additional episodes of gene flow among structured African populations may have occurred but remain difficult to resolve with present data. Second, the origin and geographic extent of the super-archaic lineage remains unresolved, including whether this ancestry entered modern humans exclusively through Denisovans or also through direct admixture with ancestors of modern humans. We anticipate that future studies, including new Denisovan reference genomes, may help to further pinpoint the timing and origin of these super-archaic sequences (75). Finally, while we detect signatures of selection influencing the distribution of ghost ancestry in the genome, the functional impacts of introgressed archaic regions, including their roles in immunity and metabolism, have yet to be fully characterized. Future studies that integrate additional ancient genomes at deep timescales, particularly from Africa and Asia, will be critical for refining the timing, sources, and evolutionary consequences of these introgression events.

Materials and methods are available in supplementary materials.

REFERENCES AND NOTES

1. M. Meyer et al., A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science 338, 222–226 (2012). doi: 10.1126/science.1224344; pmid: 22936568

2. K. Prüfer et al., The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains. Nature 505, 43–49 (2014). doi: 10.1038/nature12886; pmid: 24352235

3. K. Prüfer et al., A high-coverage Neandertal genome from Vindija Cave in Croatia. Science 358, 655–658 (2017). doi: 10.1126/science.aao1887; pmid: 28982794

4. R. E. Green et al., A draft sequence of the Neandertal genome. Science 328, 710–722 (2010). doi: 10.1126/science.1188021; pmid: 20448178

5. F. Mafessoni et al., A high-coverage Neandertal genome from Chagyrskaya Cave. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 117, 15132–15136 (2020). doi: 10.1073/pnas.2004944117; pmid: 32546518

6. S. Sankararaman et al., The genomic landscape of Neanderthal ancestry in present-day humans. Nature 507, 354–357 (2014). doi: 10.1038/nature12961; pmid: 24476815

7. B. Vernot et al., Excavating Neandertal and Denisovan DNA from the genomes of Melanesian individuals. Science 352, 235–239 (2016). doi: 10.1126/science.aad9416; pmid: 26989198

8. F. Racimo, S. Sankararaman, R. Nielsen, E. Huerta-Sánchez, Evidence for archaic adaptive introgression in humans. Nat. Rev. Genet. 16, 359–371 (2015). doi: 10.1038/nrg3936; pmid: 25963373

9. A. J. Sams et al., Adaptively introgressed Neandertal haplotype at the OAS locus functionally impacts innate immune responses in humans. Genome Biol. 17, 246 (2016). doi: 10.1186/s13059-016-1098-6; pmid: 27899133

10. M. Dannemann, J. Kelso, The Contribution of Neanderthals to Phenotypic Variation in Modern Humans. Am. J. Hum. Genet. 101, 578–589 (2017). doi: 10.1016/j.ajhg.2017.09.010; pmid: 28985494

11. E. Huerta-Sánchez et al., Altitude adaptation in Tibetans caused by introgression of Denisovan-like DNA. Nature 512, 194–197 (2014). pmid: 25043035

12. X. Wei et al., The lingering effects of Neanderthal introgression on human complex traits. eLife 12, e80757 (2023). doi: 10.7554/eLife.80757; pmid: 36939312

13. H. Zeberg, S. Pääbo, The major genetic risk factor for severe COVID-19 is inherited from Neanderthals. Nature 587, 610–612 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2818-3; pmid: 32998156

14. F. L. Mendez, J. C. Watkins, M. F. Hammer, Neandertal origin of genetic variation at the cluster of OAS immunity genes. Mol. Biol. Evol. 30, 798–801 (2013). doi: 10.1093/molbev/mst004; pmid: 23315957

15. D. Massilani et al., A high-coverage Neandertal genome from the Altai Mountains reveals population structure among Neandertals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 123, e2534576123 (2026). doi: 10.1073/pnas.2534576123; pmid: 41871248

16. S. Peyrégne et al., A high-coverage genome from a 200,000-year-old Denisovan, bioRxiv 2025.10.20.683404 [Preprint] (2025); doi: 10.1101/2025.10.20.683404

17. A. Durvasula, S. Sankararaman, Recovering signals of ghost archaic introgression in African populations. Sci. Adv. 6, eaax5097 (2020). doi: 10.1126/sciadv.aax5097; pmid: 32095519

18. V. Plagnol, J. D. Wall, Possible ancestral structure in human populations. PLOS Genet. 2, e105 (2006). doi: 10.1371/journal.pgen.0020105; pmid: 16895447

19. J. D. Wall, A. Ratan, E. Stawiski, GenomeAsia 100K Consortium, Identification of African-Specific Admixture between Modern and Archaic Humans. Am. J. Hum. Genet. 105, 1254–1261 (2019). doi: 10.1016/j.ajhg.2019.11.005; pmid: 31809748

20. M. F. Hammer, A. E. Woerner, F. L. Mendez, J. C. Watkins, J. D. Wall, Genetic evidence for archaic admixture in Africa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15123–15128 (2011). doi: 10.1073/pnas.1109300108; pmid: 21896735

21. J. Hey et al., Phylogeny estimation by integration over Isolation with Migration models. Mol. Biol. Evol. 35, 2805–2818 (2018). doi: 10.1093/molbev/msy162; pmid: 30137463

22. A. P. Ragsdale, S. Gravel, Models of archaic admixture and recent history from two-locus statistics. PLOS Genet. 15, e1008204 (2019). doi: 10.1371/journal.pgen.1008204; pmid: 31181058

23. A. P. Ragsdale et al., A weakly structured stem for human origins in Africa. Nature 617, 755–763 (2023). doi: 10.1038/s41586-023-06055-y; pmid: 37198480

24. J. Lachance et al., Evolutionary history and adaptation from high-coverage whole-genome sequences of diverse African hunter-gatherers. Cell 150, 457–469 (2012). doi: 10.1016/j.cell.2012.07.009; pmid: 22840920

25. P. Hsieh et al., Model-based analyses of whole-genome data reveal a complex evolutionary history involving archaic introgression in Central African Pygmies. Genome Res. 26, 291–300 (2016). doi: 10.1101/gr.196634.115; pmid: 26888264

26. M. Lipson et al., Ancient DNA and deep population structure in sub-Saharan African foragers. Nature 603, 290–296 (2022). doi: 10.1038/s41586-022-04430-9; pmid: 35197631

27. T. Cousins, A. Scally, R. Durbin, A structured coalescent model reveals deep ancestral structure shared by all modern humans. Nat. Genet. 57, 856–864 (2025). doi: 10.1038/s41588-025-02117-1; pmid: 40102687

28. P. Skoglund et al., Reconstructing prehistoric African population structure. Cell 171, 59–71.e21 (2017). doi: 10.1016/j.cell.2017.08.049; pmid: 28938123

29. B. Lorente-Galdos et al., Whole-genome sequence analysis of a Pan African set of samples reveals archaic gene flow from an extinct basal population of modern humans into sub-Saharan populations. Genome Biol. 20, 77 (2019). doi: 10.1186/s13059-019-1684-5; pmid: 31023378

30. E. M. L. Scerri et al., Did our species evolve in subdivided populations across Africa, and why does it matter? Trends Ecol. Evol. 33, 582–594 (2018). doi: 10.1016/j.tree.2018.05.005; pmid: 30007846

31. S. Fan et al., Whole-genome sequencing reveals a complex African population demographic history and signatures of local adaptation. Cell 186, 923–939.e14 (2023). doi: 10.1016/j.cell.2023.01.042; pmid: 36868214

32. M. J. Hubisz, A. L. Williams, A. Siepel, Mapping gene flow between ancient hominins through demography-aware inference of the ancestral recombination graph. PLOS Genet. 16, e1008895 (2020). doi: 10.1371/journal.pgen.1008895; pmid: 32760067

33. L. Chen, A. B. Wolf, W. Fu, L. Li, J. M. Akey, Identifying and interpreting apparent Neanderthal ancestry in African individuals. Cell 180, 677–687.e16 (2020). doi: 10.1016/j.cell.2020.01.012; pmid: 32004458

34. L. Skov et al., Detecting archaic introgression using an unadmixed outgroup. PLOS Genet. 14, e1007641 (2018). doi: 10.1371/journal.pgen.1007641; pmid: 30226838

35. S. R. Browning, B. L. Browning, Y. Zhou, S. Tucci, J. M. Akey, Analysis of human sequence data reveals two pulses of archaic Denisovan admixture. Cell 173, 53–61.e9 (2018). doi: 10.1016/j.cell.2018.02.031; pmid: 29551270

36. A. Durvasula, S. Sankararaman, A statistical model for reference-free inference of archaic local ancestry. PLOS Genet. 15, e1008175 (2019). doi: 10.1371/journal.pgen.1008175; pmid: 31136573

37. M. Steinrücken, J. P. Spence, J. A. Kamm, E. Wieczorek, Y. S. Song, Model-based detection and analysis of introgressed Neanderthal ancestry in modern humans. Mol. Ecol. 27, 3873–3888 (2018). doi: 10.1111/mec.14565; pmid: 29603507

38. L. Orlando et al., Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse. Nature 499, 74–78 (2013). doi: 10.1038/nature12323; pmid: 23803765

39. J. Kelleher et al., Inferring whole-genome histories in large population datasets. Nat. Genet. 51, 1330–1338 (2019). doi: 10.1038/s41588-019-0483-y; pmid: 31477934

40. Y. Deng, R. Nielsen, Y. S. Song, Robust and accurate Bayesian inference of genome-wide genealogies for hundreds of genomes. Nat. Genet. 57, 2124–2135 (2025). doi: 10.1038/s41588-025-02317-9; pmid: 40921789

41. M. D. Rasmussen, M. J. Hubisz, I. Gronau, A. Siepel, Genome-wide inference of ancestral recombination graphs. PLOS Genet. 10, e1004342 (2014). doi: 10.1371/journal.pgen.1004342; pmid: 24831947

42. L. Speidel, M. Forest, S. Shi, S. R. Myers, A method for genome-wide genealogy estimation for thoUSA.nds of samples. Nat. Genet. 51, 1321–1329 (2019). doi: 10.1038/s41588-019-0484-x; pmid: 31477933

43. R. C. Griffiths, Neutral two-locus multiple allele models with recombination. Theor. Popul. Biol. 19, 169–186 (1981). doi: 10.1016/0040-5809(81)90016-2

44. R. R. Hudson, Properties of a neutral allele model with intragenic recombination. Theor. Popul. Biol. 23, 183–201 (1983). doi: 10.1016/0040-5809(83)90013-8; pmid: 6612631

45. D. Y. C. Brandt, X. Wei, Y. Deng, A. H. Vaughn, R. Nielsen, Evaluation of methods for estimating coalescence times using ancestral recombination graphs. Genetics 221, iyac044 (2022). doi: 10.1093/genetics/iyac044; pmid: 35333304

46. R. Nielsen, A. H. Vaughn, Y. Deng, Inference and applications of ancestral recombination graphs. Nat. Rev. Genet. 26, 47–58 (2025). doi: 10.1038/s41576-024-00772-4; pmid: 39349760

47. M. S. Hibbins, M. W. Hahn, Phylogenomic approaches to detecting and characterizing introgression. Genetics 220, iyab173 (2022). doi: 10.1093/genetics/iyab173; pmid: 34788444

48. P.-R. Loh et al., Inferring admixture histories of human populations using linkage disequilibrium. Genetics 193, 1233–1254 (2013). doi: 10.1534/genetics.112.147330; pmid: 23410830

49. F. Baumdicker et al., Efficient ancestry and mutation simulation with msprime 1.0. Genetics 220, iyab229 (2022). doi: 10.1093/genetics/iyab229; pmid: 34897427

50. S. Sankararaman, N. Patterson, H. Li, S. Pääbo, D. Reich, The date of interbreeding between Neandertals and modern humans. PLOS Genet. 8, e1002947 (2012). doi: 10.1371/journal.pgen.1002947; pmid: 23055938

51. P. Moorjani et al., A genetic method for dating ancient genomes provides a direct estimate of human generation interval in the last 45,000 years. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113, 5652–5657 (2016). doi: 10.1073/pnas.1514696113; pmid: 27140627

52. J. Choin et al., Genomic insights into population history and biological adaptation in Oceania. Nature 592, 583–589 (2021). doi: 10.1038/s41586-021-03236-5; pmid: 33854233

53. S. Sankararaman, S. Mallick, N. Patterson, D. Reich, The combined landscape of Denisovan and Neanderthal ancestry in present-day humans. Curr. Biol. 26, 1241–1247 (2016). doi: 10.1016/j.cub.2016.03.037; pmid: 27032491

54. E. Kerdoncuff et al., 50,000 years of evolutionary history of India: Impact on health and disease variation. Cell 188, 3389–3404.e6 (2025). doi: 10.1016/j.cell.2025.04.027; pmid: 40578318

55. L. Skov et al., The nature of Neanderthal introgression revealed by 27,566 Icelandic genomes. Nature 582, 78–83 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2225-9; pmid: 32494067

56. L. Li, T. J. Comi, R. F. Bierman, J. M. Akey, Recurrent gene flow between Neanderthals and modern humans over the past 200,000 years. Science 385, eadi1768 (2024). doi: 10.1126/science.adi1768; pmid: 38991054

57. I. Juric, S. Aeschbacher, G. Coop, The strength of selection against Neanderthal introgression. PLOS Genet. 12, e1006340 (2016). doi: 10.1371/journal.pgen.1006340; pmid: 27824859

58. K. Harris, R. Nielsen, The genetic cost of Neanderthal introgression. Genetics 203, 881–891 (2016). doi: 10.1534/genetics.116.186890; pmid: 27038113

59. B. M. Moran et al., The genomic consequences of hybridization. eLife 10, e69016 (2021). doi: 10.7554/eLife.69016; pmid: 34346866

60. G. McVicker, D. Gordon, C. Davis, P. Green, Widespread genomic signatures of natural selection in hominid evolution. PLOS Genet. 5, e1000471 (2009). doi: 10.1371/journal.pgen.1000471; pmid: 19424416

61. S. Myers, L. Bottolo, C. Freeman, G. McVean, P. Donnelly, A fine-scale map of recombination rates and hotspots across the human genome. Science 310, 321–324 (2005). doi: 10.1126/science.1117196; pmid: 16224025

62. G. Coop, X. Wen, C. Ober, J. K. Pritchard, M. Przeworski, High-resolution mapping of crossovers reveals extensive variation in fine-scale recombination patterns among humans. Science 319, 1395–1398 (2008). doi: 10.1126/science.1151851; pmid: 18239090

63. A. B. Wolf, J. M. Akey, Outstanding questions in the study of archaic hominin admixture. PLOS Genet. 14, e1007349 (2018). doi: 10.1371/journal.pgen.1007349; pmid: 29852022

64. L. N. M. Iasi et al., Neanderthal ancestry through time: Insights from genomes of ancient and present-day humans. Science 386, eadq3010 (2024). doi: 10.1126/science.adq3010; pmid: 39666853

65. A.-S. Malaspinas et al., A genomic history of Aboriginal Australia. Nature 538, 207–214 (2016). doi: 10.1038/nature18299; pmid: 27654914

66. E. Y. Hallett et al., Major expansion in the human niche preceded out of Africa dispersal. Nature 644, 115–121 (2025). doi: 10.1038/s41586-025-09154-0; pmid: 40533559

67. E. Armstrong, M. Tallavaara, P. O. Hopcroft, P. J. Valdes, North African humid periods over the past 800,000 years. Nat. Commun. 14, 5549 (2023). doi: 10.1038/s41467-023-41219-4; pmid: 37684244

68. D. R. Nelson, The cytochrome p450 homepage. Hum. Genomics 4, 59–65 (2009). doi: 10.1186/1479-7364-4-1-59; pmid: 19951895

69. G. Jones, D. E. Prosser, M. Kaufmann, Cytochrome P450-mediated metabolism of vitamin D. J. Lipid Res. 55, 13–31 (2014). doi: 10.1194/jlr.R031534; pmid: 23564710

70. M. Roksandic, P. Radović, X.-J. Wu, C. J. Bae, Resolving the “muddle in the middle”: The case for Homo bodoensis sp. nov. Evol. Anthropol. 31, 20–29 (2022). doi: 10.1002/evan.21929; pmid: 34710249

71. W. B. Reiner et al., OH 83: A new early modern human fossil cranium from the Ndutu beds of Olduvai Gorge, Tanzania. Am. J. Phys. Anthropol. 164, 533–545 (2017). doi: 10.1002/ajpa.23292; pmid: 28786473

72. A. A. Mturi, New hominid from lake ndutu, Tanzania. Nature 262, 484–485 (1976). doi: 10.1038/262484a0

73. A. Mounier, M. Mirazón Lahr, Virtual ancestor reconstruction: Revealing the ancestor of modern humans and Neandertals. J. Hum. Evol. 91, 57–72 (2016). doi: 10.1016/j.jhevol.2015.11.002; pmid: 26852813

74. C. Stringer, The status of Homo heidelbergensis (Schoetensack 1908). Evol. Anthropol. 21, 101–107 (2012). doi: 10.1002/evan.21311; pmid: 22718477

75. D. L. G. Miedzianogora, C. Shipton, M. Pope, Homo heidelbergensis and the origins of The Middle Stone Age: The Kabwe (Broken Hill) lithic assemblage. Afr. Archaeol. Rev. 42, 659–682 (2025). doi: 10.1007/s10437-025-09642-8

76. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_software (Zenodo, 2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.21541833.

77. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_pipline (Zenodo, 2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20213447.

78. Y. Zhang, A. Biddanda, S. Johnson, C. O'Dushlaine, P. Moorjani, Trace_data (Zenodo, 2026); https://doi.org/10.5281/ZENODO.19685110.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank R. Nielsen, N. Patterson, D. Reich, T. Wang, I. Hariharan and members of the Moorjani and McCoy labs for helpful discussions. We thank Y. Deng for technical support with SINGER, and L. Skov for helpful discussions related to hmmix and IBDmix. We thank N. Patterson, M. Slatkin, E. Kerdoncuff, S. Joseph, M. Tassia, J. Ross-Ibarra and R. McCoy for comments on the manuscript. Funding: P.M. was supported by Burroughs Wellcome Fund (Career Award at the Scientific Interface) and P.M. and Y.Z. were supported by the National Science Foundation (CAREER 2338710 to P.M.) S.J. was supported by the NHGRI training grant (5T32HG000047-22). Author contributions: Conceptualization: Y.Z., A.B., C.O.D., and P.M.; Data curation: Y.Z., S.A.J., A.B., C.O.D., and P.M.; Formal analysis: Y.Z., A.B.; Funding acquisition: P.M.; Methodology: Y.Z., A.B., and P.M.; Software: Y.Z. and A.B.; Supervision: C.O.D., P.M.; Validation: Y.Z., and P.M.; Writing– original draft: Y.Z., A.B., and P.M.; Writing– review & editing: Y.Z., A.B., S.A.J., C.O.D., and P.M. Competing interests: Y.Z., A.B., S.A.J., and P.M. declare no competing interests. C.O.D. is currently employed at insitro, San Francisco, CA 94080, USA. insitro had no involvement in the design or implementation of the work presented here. Data, code, and materials availability: No new materials were generated for this study. All resources used in this study are listed and available in tables S1 and S2. The software implementation of TRACE is available on Zenodo (76). A full pipeline to replicate figures in the manuscript can be found as well (77) and the population-specific archaic ancestry tracts after filtering are available on Zenodo (78). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/content/page/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aef8874

Supplementary text; Figs. S1 to S61; Tables S1 to S18; References (79–101);

Submitted 6 February 2026; accepted 25 June 2026; published online 30 July 2026

10.1126/science.aef8874

Distinct sex chr. recruitment

Genomic predisposition is associated with the direction of sex chromosome evolution

Yang Zhou†, Jiazheng Jin†, et al.

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aec3449

INTRODUCTION: Sex-determination systems are highly diverse across vertebrates, ranging from environmental sex determination (ESD) to genetic sex determination (GSD), with GSD typically taking the form of male heterogamety (XY) or female heterogamety (ZW). Sex chromosomes evolve rapidly within and between lineages, raising the question of why particular ancestral chromosomes are recurrently recruited as sex chromosomes.

RATIONALE: Although the processes underlying sex chromosome formation and differentiation have been studied extensively, factors associated with transitions between different sex-determination systems remain elusive. Theoretical models suggest that environmental instability may favor transitions from ESD to GSD, but empirical support is limited. It is also unclear why some lineages evolve XY systems whereas others evolve ZW systems. Geckos provide an unusually informative model for addressing these questions: The clade exhibits exceptional diversity in sex determination, including temperature-dependent sex determination (TSD) as well as multiple independently evolved XY and ZW systems at various stages of differentiation. We combined chromosome-level genome assemblies, phylogenetic reconstruction, and comparative transcriptomics to explore the interplay between environmental pressures, genomic architecture, and evolutionary constraints shaping sex chromosome evolution.

RESULTS: We produced chromosome-level genome assemblies for 19 gecko species, spanning all seven extant families and capturing TSD, XY, and ZW systems. Together with three published gecko genomes, ancestral karyotype reconstruction revealed that the 22 sex chromosome systems across 20 GSD species arose independently from 17 ancestral chromosomes. Despite this independence, their origins are

Constrained pathways of sex

chromosome evolution. Most gecko sex chromosomes originated independently from different ancestral chromosomes. Five of 11 datable origins coincide near the MMCT [\~10 million years ago (Mya)]. Regions ancestrally enriched in TPEGs tend to evolve into ZW systems, whereas regions depleted of such genes tend to evolve into XY—a pattern observed across multiple independent amniote sex chromosome origins. [Gecko silhouette is copyrighted by Stuart V. Nielsen]

nonrandom in time: Five of the 11 datable lineages began differentiating their sex chromosomes within a 7 million to 12 million year window, coinciding with the Middle Miocene Climatic Transition (MMCT). The direction of evolution is also nonrandom. Comparative transcriptomic analysis of the oldest sex-differentiated regions (SDRs) showed that ancestral gene content is associated with the subsequent sex chromosome trajectory: Regions containing an excess of testis preferentially expressed genes (TPEGs) over the genomic background tend to evolve into ZW systems, whereas regions with reduced TPEG proportions tend to evolve into XY—a pattern observed across multiple independent amniote sex chromosome origins. Across gecko lineages, Y and W chromosomes exhibited age-dependent patterns of gene retention, and most geckos evolved partial dosage balance between sexes through up-regulation of sex-linked genes in the heterogametic sex.

CONCLUSION: Our results suggest that the repeated independent origins of sex chromosomes in geckos reflect the combined influence of external environmental context and intrinsic genomic content. Major climatic change may have created conditions favoring transitions from ESD to GSD, whereas preexisting differences in ancestral gene expression appear to be associated with whether male or female heterogamety subsequently evolves. Together, these findings indicate that sex chromosome evolution follows constrained pathways shaped by ancestral genomic predisposition and broader environmental context, rather than purely stochastic processes. □

Corresponding authors: Peng Shi (ship@mail.kiz.ac.cn); Guojie Zhang (guojiezhang@zju.edu.cn) †These authors contributed equally to this work. Cite this article as Y. Zhou et al., Science 393, eaec3449 (2026). DOI: 10.1126/science.aec3449

External environmental fluctuation + Intrinsic genomic predisposition is associated with sex chromosome evolution

Genomic predisposition is associated with the direction of sex chromosome evolution

Yang Zhou $^{1,2\dagger}$ , Jiazheng Jin $^{3\dagger}$ , Chuan Jiang $^{4}$ , Olga Dudchenko $^{5,6,7}$ , Brendan J. Pinto $^{8,9\dagger}$ , Zane Colaric $^{5}$ , Ruqayya Khan $^{5}$ , Arina D. Omer $^{5}$ , Xuemei Li $^{10}$ , Zhenzhen Song $^{10,11}$ , Li Han $^{12}$ , Wanyi Chen $^{1,10}$ , Lichun Jiang $^{13}$ , Zhangyue Song $^{13}$ , David Weisz $^{5,6,7}$ , Yun Xia $^{14}$ , Yin Qi $^{14}$ , Zhengqing Cao $^{1,15}$ , Yudian Peng $^{1,16}$ , Zexian Zhu $^{17}$ , Qi Zhou $^{17}$ , Yan Liu $^{18}$ , Xiaosong Gu $^{18}$ , Stuart V. Nielsen $^{19}$ , Aaron H. Griffing $^{8,20,21}$ , Tariq Ezaz $^{22}$ , Arthur Georges $^{23}$ , Ian Brennan $^{24}$ , Erez Lieberman Aiden $^{5,6,7,25}$ , Tony Gamble $^{8,26,27}$ , Peng Shi $^{28,29}$ , Guojie Zhang $^{17,30}$

Sex chromosome evolution is among the most dynamic genomic innovations in vertebrates, yet why some lineages evolve XY while others evolve ZW remains unclear. Using chromosome-level genomes from 19 geckos, we found that gecko sex chromosomes originated independently from 16 ancestral chromosomes. Their origins are nonrandom in both time and direction. Five of 11 datable origins coincide near the Middle Miocene Climatic Transition (\~10 million years ago). Ancestral gene content is associated with the direction of evolution, with testis-enriched regions tending to evolve into ZW and testis-depleted regions into XY, a pattern observed across multiple amniote sex chromosome origins. Geckos with genetic sex determination repeatedly evolve partial dosage balance through up-regulation in the heterogametic sex. Sex chromosome evolution thus follows constraints from ancestral genomic predisposition and environmental context.

Sex-determination systems are exceptionally diverse across vertebrates, ranging from environmental sex determination (ESD) to genetic sex determination (GSD). Transitions between these systems have occurred repeatedly, yet factors underlying these transitions remain incompletely understood $(1-3)$ . Although theoretical models predict that ESD should evolve under stable environmental conditions and GSD under fluctuating conditions $(1)$ , empirical support is limited. Furthermore, when GSD does evolve, the factors determining whether male heterogamety (XY) or female heterogamety (ZW) systems emerge are largely unknown $(4)$ . Key unresolved issues include what triggers GSD evolution $(1, 5)$ , why particular genomic regions are repeatedly recruited as sex chromosomes $(6-8)$ , and what determines the evolutionary direction toward XY or ZW $(9, 10)$ .

The genomic consequences of sex chromosome evolution extend far beyond sex determination itself, influencing fundamental aspects of gene regulation, dosage compensation, and genome organization (11–14). An unresolved question is whether the genomic content of ancestral regions influences their evolutionary fate as sex chromosomes, or whether sex-biased gene expression patterns emerge only after sex chromosome establishment (2, 4, 12). Moreover, the mechanisms governing gene survival during the progressive degeneration of Y and W chromosomes vary drastically across species, with some retaining most ancestral genes while others undergo extensive gene loss (2, 15, 16).

Geckos exhibit pronounced variation in sex-determination systems, including temperature-dependent sex determination and both XY and ZW genetic systems at various stages of differentiation $(17-19)$ . This diversity spans from recently evolved, homomorphic sex chromosomes to ancient, highly differentiated systems $(20)$ . The phylogenetic distribution of different sex-determination systems in geckos suggests multiple independent transitions between ESD and GSD, providing opportunities to test hypotheses about the ecological and genomic factors driving sex chromosome evolution $(18, 19)$ . In this study, we analyzed 19 gecko species, representing $\sim70\%$ of currently known independent sex chromosome origins across all gecko families, capturing the documented diversity of sex-determination mechanisms $(18, 19)$ . By combining chromosome-level genome assemblies with comparative transcriptomic analyses across this natural diversity, we explored the environmental pressures, genomic architecture, and evolutionary constraints that shape sex chromosome evolution.

Chromosome-level genome assembly and sex chromosome identification across gecko lineages

We generated high-quality chromosome-level assemblies for 19 gecko species representing all seven families of geckos (infraorder Gekkota) using an integrated approach combining PacBio long reads (continuous long reads or circular consensus sequencing), 10X Genomics link reads [or single-tube long fragment reads $(21)$ ], and Hi-C sequencing technologies (Fig. 1 and tables S1 to S3). This dataset provides high-quality genomic coverage across the three major vertebrate sex-determination systems: temperature-dependent sex determination (TSD; 3 species), XY (5 species), and ZW (11 species), encompassing the full spectrum of sex chromosome differentiation stages from homomorphic to highly heteromorphic states $(17-19)$ . Compared with the published gecko assemblies, our newly generated dataset exhibits marked improvement in both sequence continuity and completeness (fig. S1 and table S3), with an average scaffold N50 of 132.83 Mb, BUSCO completeness of 93.74%, and a gap ratio of 0.08% (table S3). Approximately 96% of each assembly was assigned to chromosomes (table S3). Genome size ranges from 1.6 to 2.5 Gb across most species except for Nephrurus levis ( $\sim$ 3 Gb), whose expanded size primarily results from extensive proliferation of long terminal repeats and long interspersed nuclear elements (fig. S2 and tables S4 and S5).

Fig. 1. Gecko genome assemblies, phylogeny, and sex-linked sequence dataset. Genomic phylogeny of gecko with divergence times as branch lengths. J, Jurassic; K, Cretaceous; Pg, Paleogene; N, Neogene. Species name color: red, generated in this study; black, published. The sex-determination systems (SDS) are also shown at the leaf node: blue, XY; orange, ZW; gray; TSD. Bubble plots illustrate key assembly and sex chromosome parameters. The bubble sizes have been scaled to each panel and are not comparable across panels. [All gecko photos are copyrighted by Stuart V. Nielsen, Aaron H. Griffing, or Tony Gamble, except Lepidodactylus listeri (copyrighted by Luis Mata under CC BY-NC 4.0) and Thamnophis elegans (copyrighted by Inklein under CC BY-SA 3.0)]

We identified putative X and Y (or Z and W) chromosomes and their sex-differentiated regions (SDRs) in 12 out of 16 GSD species through integrated analysis of sex-biased sequencing depth patterns and Hi-C interaction signals (table S6 and fig. S3). For three species with homomorphic sex chromosomes (22–24), Thecadactylus rapicauda, Heteronotia binoei, and Gekko japonicus, we failed to resolve both sex chromosomes (figs. S4 to S6), probably because of extremely low sequence divergence between the sex chromosome pair. Nevertheless, we identified their SDR with resequencing or restriction site-associated DNA sequencing data of multiple male and female individuals (methods and figs. S4 to S6). In Pygopus nigriceps, which has an XX/XY system (25), we assembled the complete X chromosome and identified its SDR and pseudoautosomal region (PAR) (fig. S7) but discovered no detectable male-specific sequence in either genomic or transcriptomic data (supplementary text), suggesting that the Y-SDR has undergone extreme degeneration. Hi-C contact maps revealed evidence of multiple sex chromosome systems in two species, Sphaerodactylus inigoi (XX/XY1Y2) and Coleonyx brevis (X1X1X2X2/X1X2Y) (fig. S8), likely derived from sex chromosome-autosome fusions (26–28).

The quality and biological relevance of our sex chromosome assemblies were validated by multiple lines of evidence. Our assembled sex chromosomes have recovered known sex-linked markers from previous cytogenetic and molecular studies in 10 species (18, 28–30) (table S6). The sex-linked sequence assemblies are highly continuous, with $>95\%$ of X- or Z-linked sequences assembled into single scaffolds for 15 GSD species. Although Y- or W-linked sequences appeared relatively fragmented owing to repetitive element complexity, $>90\%$ of sequences were still assembled into a single scaffold in 8 out of the

16 GSD species (Fig. 1 and table S6). Comparison with published karyotypes (22–24, 31–36) further confirmed the high completeness of our Y/W dataset (Fig. 1 and table S7).

Annotation of these high-quality assemblies, based on homologous protein evidence and RNA sequencing data from brain, eye, tail, and gonadal tissues of both sexes, yielded an average of 20,319 protein-coding genes per species (table S8). The number of identified gametolog pairs varied drastically across species, ranging from only 14 in Hemidactylus frenatus to 1506 in Sphaerodactylus inigoi, with the ratio of gametolog pairs to total X/Z-SDR genes spanning from 11.23% (Nephrurus levis) to >90% (genus Correlophus) (tables S9 and S10).

To establish the evolutionary framework for comparative analysis, we constructed a phylogenetic tree using whole-genome alignments from our 19 chromosome-level assemblies along with three published gecko genomes (Sphaerodactylus townsendi, Paroedura picta, and Lepidodactylus listeri) and two outgroups (Lacerta agilis and Thamnophis elegans). Our phylogeny based on 89.84 Mb whole-genome alignment (table S11) strongly supports (local posterior probability = 1.00) established gecko relationships while providing precise divergence time estimates through fossil calibration (37, 38) (Fig. 1 and fig. S9). This analysis indicates that geckos diverged from all other snakes and lizards about 191 million years ago (Mya), followed by rapid radiation during the late Cretaceous to early Paleogene (Fig. 1).

Independent origins but limited homology of sex chromosomes in geckos

The diversity of sex-determination systems and sex chromosomes across geckos has long suggested extensive evolutionary lability (18, 19, 39).

Previous studies have indicated that sex chromosomes originated independently multiple times from TSD ancestors within this clade rather than resulting from frequent sex chromosome turnover events (3). However, the extent to which these independent origins are truly random, whether particular chromosomes are preferentially reused, and how much homology is retained at the level of SDRs have remained unresolved.

We inferred the ancestral karyotype evolution of geckos using the 22 chromosome-level gecko assemblies with two outgroup species, with Correlophus sarasinorum as the reference. Our reconstruction revealed that the gecko most recent common ancestor had 2n = 38 chromosomes (Fig. 2A and tables S11 to S13), confirming the ancestral karyotype inferred from cytogenetic data (40). This karyotype configuration remains largely intact in extant species such as the genus Correlophus and Nephrurus levis, which show no detectable interchromosomal rearrangements relative to the ancestral state (figs. S10 and S11). Consistent with earlier work, our comparative genomic analyses provide strong evidence that gecko sex chromosomes originated independently across lineages. Incorporating three additional published GSD geckos with available SDR data (Saltuarius cornutus, Coleonyx elegans, and Cyrtodactylus pharbaungensis) (19, 41, 42), we found that the 22 sex chromosome systems across 20 GSD species are derived from 17 different gecko ancestral chromosomes (GACs) (Fig. 2B and fig. S12). This pattern of repeated sex chromosome recruitment across gecko lineages confirms the widespread independence of sex chromosome origins established by previous studies while substantially extending our understanding through chromosome-scale assemblies and explicit SDR identification across a broader phylogenetic range.

Fig. 2. Repeated independent origins of gecko sex chromosomes. (A) Reconstructed ancestral karyotype of Gekkota and the evolution of sex chromosomes in each GSD species. Branch to tip is color coded for each GSD species according to the GACs that evolved into sex chromosomes. For most GSD species, three chromosomes are shown (from left to right): proto sex chromosome, X or Z, and Y or W. In species with lowly differentiated sex chromosomes, proto sex chromosome (left) and a merged representation of the sex chromosomes (XY or ZW) (right) is shown. Chromosomal rearrangements occurred during sex chromosome evolution are highlighted in yellow (inversion) and orange (translocation). The number of inferred rearrangements from proto sex chromosome to current sex chromosome(s) are shown in the order of inversion, translocation, fission, and fusion. Homology between sex chromosomes in human, platypus, chicken, and snake and GACs are shown at the top. (B) Distribution of conserved blocks detected as SDR in all studied geckos. Boxes are color coded by GAC as in (A). The number of times a conserved block is used as SDR is indicated on the right. Conserved blocks with significant nonrandomness (before FDR correction) are highlighted by red asterisks. When blocks are small and in close proximity to each other, we use only one asterisk to mark a region in the genome that is constituted by multiple continuous significant blocks. (C) Upset plot for one-to-one ortholog gene on X- or Z-linked SDR. The color of the bar plot on the left corresponds to the GACs.

Within this overall pattern of independent origins, sex chromosome recruitment exhibits some genomic predisposition effects (Fig. 2B). For example, the GAC16 independently evolved into a ZZ/ZW system in four separate lineages: Correlophus spp., Nephrurus levis, Cyrtodactylus pharbaungensis, and Gehyra insulensis. Whereas Nephrurus levis adopted a ZZ/ZW system from GAC16, its sister lineage Pygopus nigriceps independently established an XX/XY system from GAC11. Similarly, GAC11 was also co-opted as an XX/XY system in the distantly related Hemidactylus mabouia, GAC2 independently evolved into a XX/XY system in both Sphaerodactylus species, and GAC5 convergently evolved into a ZZ/ZW system in both Hemidactylus frenatus and Thecadactylus rapicauda, although the latter underwent a fission event that retained only part of GAC5 as its sex chromosome (Fig. 2A). These findings echo the parallelism observed between Gekko hokouensis and birds, which use homologous ancestral chromosomes for sex determination (43). Moreover, we observed that the same GAC could give rise to sex chromosomes with opposite heterogamety patterns. For example, GAC10 evolved into ZZ/ZW in Aristelliger praesignis but XX/XY in Coleonyx brevis (fig. S12). Similar cases can be found between Gekko japonicus X and a part of Christinus marmoratus Z that originated from fusion of GAC9 and GAC18, and between Coleonyx brevis X2 and Saltuarius cornutus Z from GAC13.

Despite the broad independent sex chromosome recruitment with some predisposition effect at the chromosome level, the underlying SDRs remain largely nonhomologous (fig. S13). For instance, although the sex chromosome of both Nephrurus levis and Correlophus spp. evolved from GAC16, their PARs are located at opposite ends of the chromosome. In Aristelliger praesignis, the SDR spans nearly the entire GAC10, whereas in Coleonyx brevis, the SDR covers only $\sim$ 10% of the same ancestral chromosome, with the remainder functioning as PAR. The SDRs of Hemidactylus mabouia and Pygopus nigriceps overlap by only $\sim$ 23% despite both originating from GAC11. In extreme cases, such as Hemidactylus frenatus versus Thecadactylus rapicauda and Christinus marmoratus versus Gekko japonicus, SDRs show no overlap despite sharing the same ancestral chromosomal origin.

To rule out the possibility of sex chromosome turnovers involving different chromosomes, potentially caused by a new sex-determining mutation in a previously autosomal locus or the translocation of the ancestral sex-determining gene to another chromosome (3), we compared the sequence divergence and gene content between sex chromosomes across different species. Sex chromosome identity between X/Y (or Z/W) pairs varies considerably across species, ranging from 88.65 to $99.97\%$ (Fig. 3A), with the most diverged sex chromosomes found in Z/W of Paroedura stumpffi, and the most similar in Correlophus spp. and Heteronotia binoei ( $>95\%$ identity; Fig. 3A). All observed X/Y (or Z/W) sequence divergences fall well below the divergence level observed between each other's closest relatives in our sampling (fig. S14), excluding scenarios of the involvement of an ancestral sex chromosome followed by turnover to different chromosomes. Gene-level analysis provides additional support for independent origins. Most SDR genes in any given species correspond to autosomal genes in other gecko species, and when shared SDR genes do exist, they cluster by species rather than by sex chromosome identity (Fig. 2C, figs. S15 to S18, and tables S9 and S14 to S16). These phylogenetic patterns provide evidence against sex chromosome turnover scenarios and support the repeated independent recruitment model.

Our findings also address a critical methodological concern in testing theories of nonrandom sex chromosome evolution. Previous studies often treated entire chromosomes as analytical units without distinguishing SDRs from PARs (8, 44–46), potentially obscuring evolutionary complexity as PARs retain autosomal-like characteristics including recombination and dosage effects (47). To overcome this limitation, we used evolutionarily conserved syntenic blocks as units, providing unprecedented resolution for testing nonrandom recruitment patterns. Across the 23 species with reliably identified SDRs, we observed 98 conserved syntenic blocks that independently and repeatedly (twice or more) evolved into SDRs. When each block was evaluated against its own length-corrected null distribution, only 12 of 98 showed excess recruitment before correction for multiple testing, and none remained significant after false discovery rate (FDR) correction (table S13). This indicates that recruitment of specific genomic regions is generally weak or absent at the syntenic block level. When we repeated this analysis using whole chromosomes as units, we observed significant enrichment of GAC16 but also detected false positives on GAC18, where SDRs between Christinus marmoratus and Gekko japonicus show no actual homology (fig. S13).

Temporal distribution of sex chromosome divergence in geckos

The numerous independent origins of sex chromosomes across gecko lineages present a natural experiment for investigating the evolutionary forces that drive transitions from ancestral ESD to GSD $(11, 15)$ . To explore whether such innovations are stochastic or driven by shared environmental pressures, we estimated the timing of sex chromosome divergence across all GSD gecko species using the substitution rate of the noncoding region before and after sex chromosome differentiation, after correcting for male mutation bias in each lineage (methods). We found that the sex chromosome ages vary widely, ranging from 5.90 million years (Myr) in Phyllodactylus wirshingi to 54.45 Myr in Aristelliger praesignis (Fig. 3A, figs. S19 to S22, and tables S17 and S18). To validate our divergence time estimates, we independently estimated stratum ages using fourfold degenerate sites, obtaining highly consistent results [Pearson's correlation coefficient $(r) = 0.97, P = 6.99 \times 10^{-13}$ ; table S18]. We also inferred de novo mutation rate from the whole-genome alignment using RAxML (Randomized Axelerated Maximum Likelihood), and calculated age by dividing the X/Y (or Z/W) divergence with the inferred de novo mutation rate after correcting for male mutation bias (methods), obtaining highly consistent results (Pearson's r = 0.99, $P = 3.98 \times 10^{-16}$ ; table S18).

Despite originating from different ancestral chromosomes and evolving independently across distantly related gecko lineages that diverged 7.33 million to 87.62 million years ago (Fig. 1), sex chromosomes in many gecko species began diverging within a relatively narrow temporal window (Fig. 3A). Specifically, 5 out of 11 species with GSD showed sex chromosome divergence times clustering between 7 and 12 Mya, with an average of 9.55 Mya (Fig. 3A and table S18). To test whether this temporal concentration deviates from random expectation, we performed a phylogenetically constrained Monte Carlo simulation (methods). Null replicates rarely produced as many origins in the 7- to 12-Mya window as observed (P < 0.01; fig. S23), supporting a nonrandom temporal distribution. Although this clustering does not represent a universal pattern across geckos, it does suggest that sex chromosome divergence occurred contemporaneously in multiple independent lineages. This temporal clustering around 10 Mya coincides with the Middle Miocene Climatic Transition (MMCT), a period of pronounced global cooling, aridification, and habitat fragmentation that profoundly affected terrestrial ecosystems worldwide (48). This paleoclimatic event has been associated with biogeographic reorganizations in numerous vertebrate lineages (49–51), raising the possibility that environmental changes during this period may have created selective pressures that favored transitions from TSD to GSD.

To evaluate the broader generality of this pattern, we conducted a meta survey of 32 independent estimates of sex chromosome origins across amniotes, including 11 robust estimates in this study and 21 published estimates (table S19 and fig. S24). This dataset highlights a key limitation of currently available data: Because fully resolved X–Y (or Z–W) sequences and clearly defined evolutionary strata remain

B

C

Fig. 3. Gecko sex chromosome divergence and evolution. (A) Gecko divergence times and estimated sex chromosome ages. Bars are colored by GACs that evolved into sex chromosomes (Fig. 2); translucent regions indicate $95\%$ confidence intervals. Historical temperature data (88) are shown as average changes per 1.5 Myr (pink, warming; green, cooling). The middle panel shows the surviving gametolog pairs percentage, and the right panel shows X/Y (or Z/W) sequence identity distribution. (B) Proportion of testis (left) and ovary (right) preferentially expressed genes on the oldest X/Z-SDR relative to genomic background. Red dots indicate the focal gecko, while black dots indicate the ancestral states indicative by the difference in the other geckos. Background colors denote significant higher (red), lower (blue), or no difference (white) proportions. Wilcoxon rank sum test $ * P < 0.01$ and $P < 0.05$ . (C) Proportions of ancestral genes changing into tissue-preferential expression in XY and ZW species. XY species show more genes evolving into ovary-biased expression, whereas ZW species show more genes evolving into testis-biased expression. No significant differences were observed for genes evolving bias in other tissues or ubiquitous expression. Wilcoxon rank sum test $ * P < 0.01$ and $P < 0.05$ .

unavailable for many systems, robust temporal inference is restricted to only four lineages outside of geckos (table S19 and fig. S24). Within these constraints, we observed that sex chromosomes in amniotes appear nonrandomly distributed in time, with concentrations in an early Cretaceous interval previously noted $(52)$ as well as around $\sim30$ Mya involving Siebenrockiella, Saltuarius, Paroedura stumpffi, Nephrurus levis, and Furcifer (table S19 and fig. S24). However, given the limited sample size, uncertainties in molecular dating, regional climatic heterogeneity, and lineage-specific evolutionary trajectories, we cannot formally test for synchrony or draw definitive conclusions about universal patterns. These preliminary observations nonetheless provide a foundation for future comparative analyses as genomic resources expand and suggest that the temporal clustering observed in geckos may represent a testable framework for understanding sex-determination evolution across amniotes (11, 15).

We next sought to examine the molecular mechanisms underlying the subsequent evolution of sex chromosomes. According to evolutionary theories, sex chromosomes can evolve through two primary mechanisms: successive stepwise recombination suppression that creates discrete “evolutionary strata” $(53)$ , or gradual progression of sequence divergence across the chromosome $(2)$ . Our analysis revealed clear evolutionary strata in seven gecko species, while five species exhibited gradual differentiation patterns (figs. S25 to S28 and table S17). Genomic rearrangements are usually believed to be one of the driving forces of strata formation, which can initiate recombination suppression between sex chromosomes $(11, 13)$ . We observed a prominent asymmetry in rearrangement patterns: Synteny was well preserved between X (or Z) chromosomes and their autosomal homologs, indicating that most strata-associated rearrangements occurred specifically on the Y and W chromosomes (Fig. 2A). We only found X-linked inversions in Pygopus nigriceps and Z-linked inversions in Aristelliger praesignis (Fig. 2A). This pattern mirrors observations in mammals, where Y-specific rearrangements predominate (53, 54), but contrasts with birds, where both Z and W chromosomes undergo rearrangements (55). Most rearrangements between X and Y, or between Z and W, are associated with strata, with rearrangements found near the stratum boundary (fig. S25), consistent with their role in recombination suppression. Among gecko rearrangements, inversions were overwhelmingly prevalent, comprising 75 and 73% of rearrangements on X/Z and Y/W chromosomes, respectively, highlighting their fundamental role in establishing recombination suppression (Fig. 2A). We also identified cases of complex sex chromosome architecture, including multiple sex chromosome systems arising through independent fusion events in Sphaerodactylus inigoi (XX/XY1Y2) and Coleonyx brevis (X1X1X2X2/X1X2Y) (Fig. 2A and supplementary text). These genomic rearrangements and subsequent gene degeneration on Y/W chromosomes likely create evolutionarily stable “traps” that maintain GSD systems without reversal to ESD or turnover to different sex chromosomes.

The rate of sex chromosome divergence is fundamentally influenced by sex-specific mutation patterns. The “faster male” hypothesis proposes that males accumulate mutations at higher rates than females owing to increased cell divisions during spermatogenesis $(56, 57)$ . In vertebrates with high male mutation bias, the accumulation of mutations on the sex chromosomes, particularly on the Y or W, leads to rapid divergence and, in many cases, to progressive degeneration of the nonrecombinant chromosomes $(16)$ . Our analysis showed that geckos exhibited a relatively low male mutation bias (0.74 to 1.51) compared with mammals (2.0 to 2.6) and birds (2.5 to 4.1) $(58)$ (table S18). The lower male mutation bias in geckos may slow the process of the sex chromosome differentiation and degeneration. This reduced mutation bias may explain the observation that geckos maintain relatively homomorphic sex chromosomes $(20)$ and low sexual dimorphism over long evolutionary timescales $(59–66)$ . Although we observed that XY geckos tend to have higher male mutation bias than ZW geckos (Wilcoxon rank sum test, P = 0.0112; fig. S29), this likely reflects estimation challenges or lineage-specific variation in mutation processes between sexes rather than systematic biological differences between sex chromosome systems $(57)$ .

Ancestral gene content is associated with the direction of sex chromosome evolution

The multiple independent transitions into GSD systems in geckos show that certain ancestral chromosomes tend to evolve into XY while others preferentially give rise to ZW (Fig. 2B). For example, all five geckos that recruited GAC16 as the sex chromosome evolved into ZW systems, whereas both Sphaerodactylus recruited GAC2 into XY systems. This nonrandom pattern raises a fundamental question about whether the ancestral gene contents of autosomal region predispose them toward specific sex-determination system.

To answer this question, we conducted a comparative transcriptomic analysis, focusing on genes within the oldest SDR, which best preserve the ancestral genomic context that existed before sex chromosome establishment. We excluded genes from younger SDR, as their expression patterns may have been confounded by sex-specific selective pressures that emerged after the establishment of XY or ZW (67–69). We categorized genes by tissue expression preference (methods) and compared the proportion of genes with tissue bias between the oldest SDR and the genomic background (i.e., autosomes and PAR). Compared with the genomic background, Z consistently harbored a higher proportion of testis preferentially expressed genes (TPEGs), whereas X showed a tendency toward lower TPEG proportion (Fig. 3B). This observation suggested two potential explanations: Either these differences represented preexisting ancestral states that influenced sex chromosome evolution, or genes underwent masculinization or feminization after sex chromosome formation.

To distinguish between these possibilities, we examined the expression profile of the orthologous genes in other gecko species where these regions remain autosomal, thereby serving as proxies for the ancestral state. This analysis revealed that 10 of the oldest regions exhibited significantly different TPEG proportions compared with the genomic background in other geckos, indicating that these regions already had biased gene content before evolving into sex chromosomes (Wilcoxon rank sum test P < 0.05; Fig. 3B and table S20). Among regions that showed significantly higher TPEG proportions than genomic background, 83.33% (5 of 6) evolved into the ZW system (Fig. 3B, orange boxes with red background). Conversely, among regions with significantly lower TPEG proportions, 75.00% (three of four) evolved into the XY system (Fig. 3B, blue boxes with blue background). Although the association does not reach statistical significance (Yates-corrected chi-square test P = 0.236), probably because of the limited sample size, the trend motivated us to assess whether the association generalizes across vertebrates more broadly.

We extended our analysis beyond geckos to examine 39 species across major vertebrate lineages, representing 15 independent amniote sex chromosome origins and 24 anamniote origins (fig. S30 & table S21). Across multiple amniote lineages with independently evolved sex chromosomes, we observed consistent patterns. In species with XY systems, including therian mammals (human), monotremes (platypus), snake (Eryx tataricus), and turtle (Staurotypus triporcatus), their SDRs consistently showed significantly lower ancestral TPEG proportions compared with genomic background (Wilcoxon rank sum test P < 0.05; fig. S30). Conversely, in birds (chicken) with a ZW system, its oldest SDR showed elevated ancestral TPEG proportion, although this difference did not reach statistical significance (P = 0.1232; fig. S30). Quantitatively, this pattern is present across all amniotes analyzed, with five of six regions with significantly higher TPEGs evolving into ZW systems, and seven of eight regions with significantly lower TPEGs evolving into XY (Yates-corrected chi-square test P = 0.0353). In contrast, this associative relationship was weaker or absent in amphibians and fishes (fig. S30). Among 16 frog species examined, ancestral SDRs showed no consistent correspondence between TPEG content and sex chromosome type, with both XY and ZW systems evolved from regions with either elevated or reduced ancestral TPEG proportions. In fishes, we detected no ancestral SDRs with significantly altered TPEG proportions relative to genomic background. These taxonomic differences suggest that the predictive power of ancestral gene expression may be specific to amniotes rather than universal across vertebrates. One possible explanation could be that amniotes use internal fertilization (70, 71), which may intensify postcopulatory sexual selection and may amplify the evolutionary significance of testis-expressed gene content. By contrast, amphibians and fishes typically reproduce through external fertilization with massive gamete production (70, 71), potentially relaxing such selective constraints.

While our analysis focused primarily on testis-biased genes, we also examined expression patterns in other tissues including ovary. Regions with biased expression in ovary and nongonadal tissues appeared to evolve randomly into either XY or ZW systems, lacking the predictive power observed for testis-biased genes (Fig. 3B, fig. S31, and table S20). This specificity may reflect the distinct evolutionary pressures associated with testis function, which represents one of the most rapidly evolving tissue types owing to intense sexual selection and sperm competition (72, 73).

Our findings also revealed evidence for secondary evolutionary processes after sex chromosome establishment. Many species exhibited even more extreme TPEG proportions in their current SDRs compared with the orthologous regions in other species (Fig. 3C), indicating post-establishment masculinization or feminization. When we compared expression changes between XY and ZW species, we found that

Z chromosomes showed significantly higher rates of genes evolving into testis-preferential expression, whereas X chromosomes showed higher rates of genes evolving into ovary-preferential expression. Notably, genes changing expression preference into somatic tissues showed no significant differences between XY and ZW systems (Fig. 3C), suggesting that the observed evolutionary bias in SDR is specific to gonadal rather than general tissue-expression evolution.

It is important to note that ancestral gene content does not deterministically control sex chromosome fate. Six regions in our dataset showed unbiased TPEG content compared with the background yet still evolved into sex chromosomes (four XY and two ZW) (Fig. 3B), indicating that other factors also influence this evolutionary process. Nevertheless, this work provides the systematic empirical evidence that ancestral genomic context is associated with the direction of sex chromosome evolution and offers a potential explanation for the non-random patterns of sex-determination systems (i.e., XY or ZW) observed across diverse taxa.

An age-dependent gene retention mechanism in Y/W chromosomes

The evolutionary trajectory of sex chromosomes is marked by recombination suppression and progressive degeneration of the heterogametic chromosome (16), yet the mechanisms governing gene survival during this process remain incompletely understood. Our comparison of gene numbers between sex chromosomes and their ancestral autosomal counterparts revealed variability in degeneration extent across gecko species (Fig. 3A). This variation follows expected temporal patterns, with gene loss occurring rapidly during early evolutionary stages followed by a marked deceleration over time (fig. S32), consistent with theoretical predictions (74) and empirical studies in other vertebrate lineages (55, 75).

To understand the evolutionary forces governing gene survival, we investigated two primary hypotheses that have emerged from studies of ancient sex chromosome systems in mammals, birds, and snakes (42, 54). The first proposes that genes beneficial to the heterogametic sex are preferentially retained and potentially amplified. The second suggests that dosage-sensitive genes essential for maintaining balanced expression between sexes are protected from degeneration. Despite the diverse genomic backgrounds from which these sex chromosomes evolved, surviving genes consistently showed enrichment for fundamental cellular functions, such as nucleic acid binding and heterocyclic compound binding, but lack of enrichment for gonadal development or other sex-specific roles (table S22). This pattern supports dosage sensitivity, rather than sex-specific utility, as the primary driver of gene retention in geckos. This finding aligns with patterns seen in birds and snakes, suggesting a shared evolutionary strategy across sauropsids that contrasts with the mixed retention strategies in mammals (54, 76).

To further dissect the mechanisms underlying gene retention, we conducted a detailed comparative analysis of genes on the X/Z that had retained their Y/W gametologs versus those that had lost them. We examined three key features previously associated with gene retention, haploinsufficiency (HI), expression breadth, and evolutionary constraint (dN/dS, the ratio of nonsynonymous to synonymous substitution rates) (54, 76) (table S23). In species with more diverged sex chromosomes, particularly Aristelliger praesignis and Paroedura stumpffi, genes with retained gametolog pairs show significantly higher HI score and broader expression patterns, along with lower dN/dS than genes without gametolog pairs (Fig. 4A and table S23). This pattern mirrors observations from ancient sex chromosome systems in mammals, birds, and caenophidian snakes (54, 76), suggesting convergent evolution toward similar retention mechanisms despite independent origins. However, Nephrurus levis exhibited an intermediate pattern, with significant differences in HI score and expression breadth but not dN/dS (Fig. 4A and table S23), indicating that the relative importance of these factors may shift during sex chromosome evolution.

Most gecko species with younger sex chromosomes showed no significant differences between genes with retained gametolog pairs and those that without gametolog pairs across these features. Only a few exceptions appeared in Sphaerodactylus inigoi, and Phyllodactylus wirshingi differed in expression breadth, whereas H. mabouia differed in HI score (Fig. 4A and table S23). This age-dependent variation in retention mechanisms suggests that the early stages of sex chromosome differentiation may be governed by different selective pressures or that insufficient time has elapsed for strong selection to act on gene retention. This observation suggests that the retention mechanisms may not be uniform across all stages of sex chromosome evolution and highlights the importance of studying systems at various evolutionary stages.

Even among gecko species with similar estimated ages (7 million to 13 million years), Y/W gene retention rates varied widely, from 20 to 97% (Fig. 3A). This variation cannot be explained by differences in HI, expression breadth, or evolutionary constraint, as we found no significant correlations between these factors and retention rates (fig. S33; P > 0.05). The fact that these species have nonhomologous SDRs suggests that ancestral gene content may influence retention patterns (77, 78), although our current analysis could not definitively establish this relationship. Other influences, such as differences in effective population size, recombination landscape, mating system, or lineage-specific biological constraints, potentially affect retention patterns in ways not captured by our current analytical framework (79). The nonhomologous nature of SDRs across gecko species means that each system began with different ancestral gene complements, potentially creating distinct evolutionary trajectories even under similar selective regimes. Future work incorporating population genomic data and expanded phylogenetic sampling will be necessary to disentangle these factors' relative contributions.

Diverse degree of dosage balance with consistent heterogametic up-regulation

The degeneration of sex chromosome creates a fundamental genomic imbalance between sexes, as the heterogametic sex carries only one functional copy of genes that exist in two copies in the homogametic sex $12, 80, 81$ . This loss of genes on the Y/W can lead to dosage imbalance, potentially leading to deleterious effects to organism fitness $82$ . While diverse taxa vary in both the extent and mechanism of dosage balance (DB) and dosage compensation (DC), the underlying principles governing this diversity are not yet fully understood $80$ .

We examined DB between sexes across 12 GSD gecko species with fully resolved SDRs. By comparing expression levels of sex-linked genes between the homogametic and heterogametic sex across multiple somatic tissues, we found that most geckos exhibit partial DB, with X:XX (or Z:ZZ) expression ratios typically between 0.5 and 1 (Fig. 4B and table S24). However, three geckos (Christinus marmoratus, Hemidactylus mabouia, and Sphaerodactylus inigoi) appear to exhibit full DB with similar expression levels between sexes (Fig. 4B and table S24). The degree of DB varied substantially among species but showed no correlation with sex chromosome divergence level (fig. S34; P > 0.05), nor did it differ between XY and ZW systems (Fig. 4B). This pattern persisted even among species sharing homologous SDRs such as Aristelliger praesignis (ZW) and Coleonyx brevis (XY), which display similar levels of DB despite evolving opposite heterogametic systems (fig. S35). Together, these results suggest that the degree of DB may be shaped by lineage-specific or gene-level properties rather than by sex chromosome system or age.

To further explore the variation among genes, we classified X/Z genes into genes with retained gametolog pairs and genes without gametolog pairs. Across species, genes without gametolog pairs generally exhibited stronger DB between sexes than those with retained gametolog pairs (Fig. 4B and fig. S36; paired Wilcoxon signed-rank test P < 0.05). When expression of the Y/W gametolog was included, genes with retained gametolog pairs in the heterogametic sex (i.e., X/Z+Y/W) reached expression levels comparable to the homogametic sex and exhibited

A

Fig. 4. Examination of the factors of Y/W chromosome gene survival in geckos. (A) Comparison of HI score, expression breadth, and dN/dS between X/Z genes with gametolog pairs (X/ZGP) and X/Z genes without gametolog pairs (X/ZOP). Unlike the observations in humans and birds, only a few geckos exhibited significant differences between XZ/GP and X/ZOP. Species are ordered by sex chromosome age. **P < 0.01, *P < 0.05. (B) The pattern of dosage balance in geckos. Comparison of the ratio of expression level between homogametic (hom) sex and heterogametic (het) sex in the somatic tissues (brain, eye, and tail) of the geckos. For Sphaerodactylus inigoi, the expression ratio pattern of left head and right head are shown on the brain and eye row, respectively. Log₂(hom/het) of zero indicates complete dosage compensation, and log₂(hom/het) of one indicates no dosage compensation.

stronger DB compared with genes without gametolog pairs (Fig. 4B and fig. S36; paired Wilcoxon signed-rank test P < 0.05). This pattern is consistent with a buffering model in which gene regulatory networks partially compensate for reduced copy number when one homolog is missing but achieve near-normal expression when both copies are present (82). This gene-by-gene variation in dosage balance based on gametolog availability further supports the role of intrinsic network resilience in responding to dosage imbalances, with factors such as chromatin accessibility potentially mediating this regulatory flexibility (83).

To determine the regulatory direction underlying DB, we distinguished DC from DB (80) by comparing current to ancestral sex-linked gene levels inferred from orthologous autosomal genes in related species. This phylogenetic approach revealed that DC in geckos operates through up-regulation in the heterogametic sex rather than down-regulation in the homogametic sex. Expression level in the homogametic sex remained similar to the ancestral autosomal state, while the heterogametic sex showed elevated expression of sex-linked genes, with compensation ratios generally exceeding 0.5-fold of the expected dosage difference (fig. S37 and table S24). This pattern was observed irrespective of whether species displayed partial or full DB and parallels the mode of regulation reported in birds and snakes (13, 84). This suggests that partial up-regulation in the heterogametic sex represents an evolutionarily common regulatory response that can persist across diverse taxa without necessarily evolving into complete chromosome-wide compensation.

Discussion

Our comparative genomic analysis of 19 gecko species provides insights into the evolutionary dynamics of sex chromosome systems.

Gecko sex chromosomes evolved independently from 16 different ancestral chromosomes, with 5 of 11 datable origins coinciding near the MMCT ( $\sim$ 10 Mya). The nonrandom temporal distribution of gecko GSD origins, supported by Monte Carlo simulation, coincides with MMCT and raises the possibility of an association between large-scale environmental change and concordant shifts in sex-determination systems. This pattern suggests that shared environmental context may influence the concordant timing of sex chromosome divergence across multiple independently evolving gecko lineages. By increasing environmental variability and reducing the reliability of temperature cues, such events may have favored GSD as a mechanism for stabilizing sex ratios (1, 85, 86).

Our analyses also showed that ancestral gene expression is associated with evolutionary trajectories, with testis-enriched genomic regions preferentially evolving into ZW systems, whereas testis-depleted regions favor XY evolution. The mechanistic basis for this pattern likely reflects evolutionary optimization of sex-biased gene expression during the transition to genetic sex determination. Testis-enriched regions may be preferentially recruited into ZW systems because subsequent W chromosome degeneration minimally affects male-specific functions, while the Z chromosome can maintain essential male-biased expression patterns. Conversely, testis-depleted regions more readily evolve into XY systems because Y chromosome degeneration has more consequences for male reproductive function. The extension of this pattern to mammals, some snakes, and turtles indicates that genomic predisposition may represent a contributing factor in the direction of sex chromosome evolution across amniotes. Nevertheless, we acknowledge that the test remains statistically limited $n = 14$ , and broader datasets will be required to test its robustness under formal clade-balanced sampling.

On the basis of these findings, we propose a unified evolutionary model that integrates environmental pressures, genomic predisposition, and evolutionary constraints into a coherent framework for understanding sex chromosome evolution (Fig. 5) composed of four phases. In phase 1 (“environmental destabilization”), major climatic transitions increase environmental variance and unpredictability, creating selective pressures that destabilize TSD and favor the evolution of GSD. In phase 2 (“biased genomic recruitment”), the transition to GSD is not random but rather reflects genomic predisposition, with testis-enriched chromosomal regions preferentially recruited into ZW and testis-depleted regions into XY, optimizing the maintenance of sex-biased gene expression. In phase 3 (“progressive differentiation”), after recruitment, sex chromosomes undergo differentiation through recombination suppression, creating either discrete evolutionary strata or gradual differentiation patterns. And in phase 4 (“evolutionary stabilization”), progressive Y/W chromosome degeneration, coupled with the evolution of dosage compensation mechanisms, creates evolutionary constraints that stabilize sex chromosome systems and prevent turnover. This framework moves beyond descriptive accounts to relate environmental context and ancestral gene content. It suggests that sex chromosome diversity across vertebrates may reflect nonrandom responses to environmental pressures operating within the constraints of genomic architecture. The model’s integration of multiple evolutionary scales—from environmental triggers to molecular mechanisms—provides an improved understanding of how fundamental genomic innovations arise and persist in natural populations.

Several areas warrant future investigation. Assembly challenges in highly homomorphic sex chromosome pairs limited our ability to fully resolve their structure and estimate sex chromosome ages in a subset of species, and advances in long-read sequencing will help overcome these constraints. Establishing direct mechanistic links between paleoclimatic events and sex-determination transitions will require additional independently datable GSD origins and complementary lineage-specific paleoclimate content. Sex-determination systems remain unknown for the majority of gecko species $(18, 19)$ , and broader taxonomic sampling may reveal additional systems that could refine the temporal distribution pattern and evaluate the generality of patterns reported here. Although our analyses suggest a possible association between ancestral TPEG abundance and the evolution of XY versus ZW, the underlying regulatory mechanisms warrant deeper investigation. The absence of canonical vertebrate sex-determining genes from some gecko SDRs (supplementary text and table S25), despite their presence at autosomal locations, suggests that sex-determination pathways from geckos may use novel molecular mechanisms, and our preliminary candidate genes provide important starting points for functional validation.

Fig. 5. Model of sex chromosome evolution. Ancestral amniotes are hypothesized to have environmental sex determination, for example, TSD (17,18). Environmental instability may trigger the transition from TSD to a GSD system. The proportion of TPEGs influence whether the XY or ZW system will evolve. Specifically, the region or chromosome with a higher proportion of TPEGs than the genomic background tends to evolve into the ZW system, whereas the region or chromosome with a lower proportion of TPEGs than the genomic background tends to evolve into the XY system. After the establishment of the GSD system, the Z chromosome would further masculinize by evolving more genes preferentially expressed in testis, while the X chromosome is feminized by evolving more genes preferentially expressed in ovary. Despite the degeneration of the Y/W chromosome, some genes may still survive on the chromosome. However, the survival of Y/W chromosome genes in different species might be affected by their difference in sex chromosome age and different selection forces. [Gecko silhouette is copyrighted by Stuart V. Nielsen]

Materials and methods are available in the supplementary materials.

REFERENCES AND NOTES

1. J. J. Bull, Sex determining mechanisms: An evolutionary perspective. Experientia 41, 1285–1296 (1985). doi: 10.1007/BF01952071; pmid: 3899710

2. B. L. S. Furman et al., Sex chromosome evolution: So many exceptions to the rules. Genome Biol. Evol. 12, 750–763 (2020). doi: 10.1093/gbe/evaa081; pmid: 32315410

3. B. Vicoso, Molecular and evolutionary dynamics of animal sex-chromosome turnover. Nat. Ecol. Evol. 3, 1632–1641 (2019). doi: 10.1038/s41559-019-1050-8; pmid: 31768022

4. L. Kratochvil et al., Expanding the classical paradigm: What we have learnt from vertebrates about sex chromosome evolution. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200097 (2021). doi: 10.1098/rstb.2020.0097; pmid: 34304593

5. S. D. Sarre, T. Ezaz, A. Georges, Transitions between sex-determining systems in reptiles and amphibians. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 12, 391–406 (2011). doi: 10.1146/annurev-genom-082410-101518; pmid: 21801024

6. T. Ezaz, K. Srikulnath, J. A. Graves, Origin of amniote sex chromosomes: An ancestral super-sex chromosome, or common requirements? J. Hered. 108, 94–105 (2017). doi: 10.1093/jhered/esw053; pmid: 27634536

7. D. Bachtrog et al., Are all sex chromosomes created equal? Trends Genet. 27, 350–357 (2011). doi: 10.1016/j.tig.2011.05.005; pmid: 21962970

8. L. Kratochvil, T. Gamble, M. Rovatsos, Sex chromosome evolution among amniotes: Is the origin of sex chromosomes non-random? Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200108 (2021). doi: 10.1098/rstb.2020.0108; pmid: 34304592

9. E. Adkins-Regan, H. K. Reeve, Sexual dimorphism in body size and the origin of sex-determination systems. Am. Nat. 183, 519–536 (2014). doi: 10.1086/675303; pmid: 24642496

10. T. Lesaffre, J. R. Pannell, C. Mullon, An explanation for the prevalence of XY over ZW sex determination in species derived from hermaphroditism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 121, e2406305121 (2024). doi: 10.1073/pnas.2406305121; pmid: 39316051

11. A. E. Wright, R. Dean, F. Zimmer, J. E. Mank, How to make a sex chromosome. Nat. Commun. 7, 12087 (2016). doi: 10.1038/ncomms12087; pmid: 27373494

12. Z. Zhu, L. Younas, Q. Zhou, Evolution and regulation of animal sex chromosomes. Nat. Rev. Genet. 26, 59–74 (2025). doi: 10.1038/s41576-024-00757-3; pmid: 39026082

13. J. A. M. Graves, Evolution of vertebrate sex chromosomes and dosage compensation. Nat. Rev. Genet. 17, 33–46 (2016). doi: 10.1038/nrg.2015.2; pmid: 26616198

14. P. A. Saunders, A. Muyle, Sex chromosome evolution: Hallmarks and question marks. Mol. Biol. Evol. 41, msae218 (2024). doi: 10.1093/molbev/msae218; pmid: 39417444

15. D. Bachtrog et al., Sex determination: Why so many ways of doing it? PLOS Biol. 12, e1001899 (2014). doi: 10.1371/journal.pbio.1001899; pmid: 24983465

16. D. Bachtrog, Y-chromosome evolution: Emerging insights into processes of Y-chromosome degeneration. Nat. Rev. Genet. 14, 113–124 (2013). doi: 10.1038/nrg3366; pmid: 23329112

17. M. Pokorná, L. Kratochvíl, Phylogeny of sex-determining mechanisms in squamate reptiles: Are sex chromosomes an evolutionary trap? Zool. J. Linn. Soc. 156, 168–183 (2009). doi: 10.1111/j.1096-3642.2008.00481.x

18. T. Gamble et al., Restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq) reveals an extraordinary number of transitions among gecko sex-determining systems. Mol. Biol. Evol. 32, 1296–1309 (2015). doi: 10.1093/molbev/msv023; pmid: 25657328

19. B. Augstenová, E. Pensabene, M. Veselý, L. Kratochvíl, M. Rovatsos, Are geckos special in sex determination? Independently evolved differentiated ZZ/ZW sex chromosomes in carphodactylid geckos. Genome Biol. Evol. 13, evab119 (2021). doi: 10.1093/gbe/evab119; pmid: 34051083

20. T. Gamble, A review of sex determining mechanisms in geckos (Gekkota: Squamata). Sex Dev. 4, 88–103 (2010). doi: 10.1159/000289578; pmid: 20234154

21. O. Wang et al., Efficient and unique cobarcoding of second-generation sequencing reads from long DNA molecules enabling cost-effective and accurate sequencing, haplotyping, and de novo assembly. Genome Res. 29, 798–808 (2019). doi: 10.1101/gr.245126.118; pmid: 30940689

22. M. Schmid, C. Steinlein, T. Haaf, A. Mijares-Urrutia, Nascent ZW sex chromosomes in Thecadactylus rapicauda (Reptilia, Squamata, Phyllodactylidae). Cytogenet. Genome Res. 143, 259–267 (2014). doi: 10.1159/000366212; pmid: 25247775

23. C. Moritz, Parthenogenesis in the endemic Australian lizard Heteronotia binoei (Gekkonidae). Science 220, 735–737 (1983). doi: 10.1126/science.220.4598.735; pmid: 17813878

24. Y. Shibaike et al., Chromosome evolution in the lizard genus Gekko (Gekkonidae, Squamata, Reptilia) in the East Asian islands. Cytogenet. Genome Res. 127, 182–190 (2009). doi: 10.1159/000303334; pmid: 20339290

25. M. Rovatsos et al., Do male and female heterogamety really differ in expression regulation? Lack of global dosage balance in pygopodid geckos. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200102 (2021). doi: 10.1098/rstb.2020.0102; pmid: 34304587

26. B. J. Pinto et al., Chromosome-level genome assembly reveals dynamic sex chromosomes in neotropical leaf-litter geckos (Sphaerodactylidae: Sphaerodactylus). J. Hered. 113, 272–287 (2022). doi: 10.1093/jhered/esac016; pmid: 35363859

27. M. Pokorná et al., Differentiation of sex chromosomes and karyotypic evolution in the eye-lid geckos (Squamata: Gekkota: Eublepharidae), a group with different modes of sex determination. Chromosome Res. 18, 809–820 (2010). doi: 10.1007/s10577-010-9154-7; pmid: 20811940

28. S. E. Keating, E. Greenbaum, J. D. Johnson, T. Gamble, Identification of a cis-sex chromosome transition in banded geckos (Coleonyx, Eublepharidae, Gekkota). J. Evol. Biol. 35, 1675–1682 (2022). doi: 10.1111/jeb.14022; pmid: 35665979

29. S. E. Keating, A. H. Griffing, S. V. Nielsen, D. P. Scantlebury, T. Gamble, Conserved ZZ/ZW sex chromosomes in Caribbean croaking geckos (Aristelliger: Sphaerodactylidae). J. Evol. Biol. 33, 1316–1326 (2020). doi: 10.1111/jeb.13682; pmid: 32662190

30. S. V. Nielsen, J. D. Daza, B. J. Pinto, T. Gamble, ZZ/ZW sex chromosomes in the endemic Puerto Rican leaf-toed gecko (Phyllodactylus wirshingi). Cytogenet. Genome Res. 157, 89–97 (2019). doi: 10.1159/000496379; pmid: 30685761

31. V. A. Trifonov et al., Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843–855 (2011). doi: 10.1007/s10577-011-9241-4; pmid: 21987185

32. K. McBee, J. Bickham, J. Dixon, Male heterogamety and chromosomal variation in Caribbean geckos. J. Herpetol. 21, 68–71 (1987). doi: 10.2307/1564380

33. M. Koubová et al., Sex determination in Madagascar geckos of the genus Paroedura (Squamata: Gekkonidae): are differentiated sex chromosomes indeed so evolutionary stable? Chromosome Res. 22, 441–452 (2014). doi: 10.1007/s10577-014-9430-z; pmid: 25056523

34. K. Matsubara et al., Non-homologous sex chromosomes in two geckos (Gekkonidae: Gekkota) with female heterogamety. Cytogenet. Genome Res. 143, 251–258 (2014). doi: 10.1159/000366172; pmid: 25227445

35. E. Pensabene, B. Augstenová, L. Kratochvíl, M. Rovatsos, Differentiated sex chromosomes, karyotype evolution, and spontaneous triploidy in carphodactylid geckos. J. Hered. 115, 262–276 (2024). doi: 10.1093/jhered/esae010; pmid: 38366660

36. M. Pokorná et al., Strong conservation of the bird Z chromosome in reptilian genomes is revealed by comparative painting despite 275 million years divergence. Chromosoma 120, 455–468 (2011). doi: 10.1007/s00412-011-0322-0; pmid: 21725690

37. J. D. Daza, V. R. Alifanov, A. M. Bauer, A redescription and phylogenetic reinterpretation of the fossil lizard Hoburogekko suchanovi Alifanov, 1989 (Squamata, Gekkota), from the Early Cretaceous of Mongolia. J. Vertebr. Paleontol. 32, 1303–1312 (2012). doi: 10.1080/02724634.2012.702706

38. R. R. Reisz, J. Müller, Molecular timescales and the fossil record: A paleontological perspective. Trends Genet. 20, 237–241 (2004). doi: 10.1016/j.tig.2004.03.007; pmid: 15109777

39. M. Stöck et al., A brief review of vertebrate sex evolution with a pledge for integrative research: Towards 'sexomics'. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200426 (2021). doi: 10.1098/rstb.2020.0426; pmid: 34247497

40. M. King, Unbuckling the cladistic straight jacket: An exercise in elementary cytogenetics and a reply to Kluge (1994). Herpetologica 50, 222–237 (1994).

41. E. Pensabene, L. Kratochvil, M. Rovatsos, Independent evolution of sex chromosomes in eublepharid geckos, a lineage with environmental and genotypic sex determination. Life 10, 342 (2020). doi: 10.3390/life10120342; pmid: 33322017

42. S. E. Keating et al., Sex chromosome turnover in bent-toed geckos (Cyrtodactylus). Genes 12, 116 (2021). doi: 10.3390/genes12010116; pmid: 33477871

43. A. Kawai et al., The ZW sex chromosomes of Gekko hokouensis (Gekkonidae, Squamata) represent highly conserved homology with those of avian species. Chromosoma 118, 43–51 (2009). doi: 10.1007/s00412-008-0176-2; pmid: 18685858

44. D. L. Jeffries et al., A rapid rate of sex-chromosome turnover and non-random transitions in true frogs. Nat. Commun. 9, 4088 (2018). doi: 10.1038/s41467-018-06517-2; pmid: 30291233

45. A. El Taher, F. Ronco, M. Matschiner, W. Salzburger, A. Böhne, Dynamics of sex chromosome evolution in a rapid radiation of cichlid fishes. Sci. Adv. 7, eabe8215 (2021). doi: 10.1126/sciadv.abe8215; pmid: 34516923

46. K. A. Behrens, S. Koblmueller, T. D. Kocher, Diversity of sex chromosomes in vertebrates: Six novel sex chromosomes in basal haplochromines (Teleostei: Cichlidae). Genome Biol. Evol. 16, evae152 (2024). doi: 10.1093/gbe/evae152; pmid: 39073759

47. S. P. Otto et al., About PAR: The distinct evolutionary dynamics of the pseudoautosomal region. Trends Genet. 27, 358–367 (2011). doi: 10.1016/j.tig.2011.05.001; pmid: 21962971

48. T. Westerhold et al., An astronomically dated record of Earth's climate and its predictability over the last 66 million years. Science 369, 1383–1387 (2020). doi: 10.1126/science.aba6853; pmid: 32913105

49. J. L. Blois, E. A. Hadly, Mammalian response to Cenozoic climatic change. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 37, 181–208 (2009). doi: 10.1146/annurev.earth.031208.100055

50. J. Agustí, L. Cabrera, M. Garcés, M. Llenas, “Mammal turnover and global climate change in the late Miocene terrestrial record of the Vallès-Penedès Basin (NE Spain)” in The Evolution of Neogene Terrestrial Ecosystems in Europe, J. Agustí, L. Rook, P. Andrews, Eds., vol. 1 of Hominoid Evolution and Climate Change in Europe (Cambridge Univ. Press, 1999), pp. 397–412.

51. V. Hernández-Ballarín, P. Peláez-Campomanes, Impact of global climate in the diversity patterns of middle Miocene rodents from the Madrid Basin (Spain). Palaeogeogr. Palaeoclimatol. Palaeoecol. 472, 108–118 (2017). doi: 10.1016/j.palaeo.2017.01.029

52. R. Marin et al., Convergent origination of a Drosophila-like dosage compensation mechanism in a reptile lineage. Genome Res. 27, 1974–1987 (2017). doi: 10.1101/gr.223727.117; pmid: 29133310

53. B. T. Lahn, D. C. Page, Four evolutionary strata on the human X chromosome. Science 286, 964–967 (1999). doi: 10.1126/science.286.5441.964; pmid: 10542153

54. D. W. Bellott et al., Mammalian Y chromosomes retain widely expressed dosage-sensitive regulators. Nature 508, 494–499 (2014). doi: 10.1038/nature13206; pmid: 24759411

55. Q. Zhou et al., Complex evolutionary trajectories of sex chromosomes across bird taxa. Science 346, 1246338 (2014). doi: 10.1126/science.1246338; pmid: 25504727

56. C.-I. Wu, A. W. Davis, Evolution of postmating reproductive isolation: The composite nature of Haldane's rule and its genetic bases. Am. Nat. 142, 187–212 (1993). doi: 10.1086/285534; pmid: 19425975

57. T. Miyata, H. Hayashida, K. Kuma, K. Mitsuyasu, T. Yasunaga, Male-driven molecular evolution: A model and nucleotide sequence analysis. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52, 863–867 (1987). doi: 10.1101/SQB.1987.052.01.094; pmid: 3454295

58. L. A. Bergeron et al., Evolution of the germline mutation rate across vertebrates. Nature 615, 285–291 (2023). doi: 10.1038/s41586-023-05752-y; pmid: 36859541

59. L. Kratochvil, D. Frynta, Body size, male combat and the evolution of sexual dimorphism in eublepharid geckos (Squamata: Eublepharidae). Biol. J. Linn. Soc. Lond. 76, 303–314 (2002). doi: 10.1111/j.1095-8312.2002.tb02089.x

60. B. E. Dial, L. C. Fitzpatrick, The energetic costs of tail autotomy to reproduction in the lizard Coleonyx brevis (Sauria: Gekkonidae). Oecologia 51, 310–317 (1981). doi: 10.1007/BF00540899; pmid: 28310013

61. A. Atzori et al., Advances in methodologies of sexing and marking less dimorphic gekkonid lizards: The study case of the Moorish gecko, Tarentola mauritanica. Amphib. Reptil. 28, 449–454 (2007). doi: 10.1163/156853807781374719

62. J. G. Phillips, T. J. Hagey, M. Hagemann, E. Gering, Analysis of morphological change during a co-invading assemblage of lizards in the Hawaiian Islands. Evol. Biol. 51, 257–268 (2024). doi: 10.1007/s11692-024-09631-w

63. R. A. How, M. A. Cowan, R. J. Teale, L. H. Schmitt, Environmental correlates of reptile variation on the Houtman Abrolhos archipelago, eastern Indian Ocean. J. Biogeogr. 47, 2017–2028 (2020). doi: 10.1111/jbi.13881

64. J. F. Husak, Sex, size & gender roles: Evolutionary studies of sexual size dimorphism. Ornithol. Appl. 112, 183–185 (2010). doi: 10.1525/cond.2010.112.1.183

65. L. A. Anjos, C. F. D. Rocha, Reproductive ecology of the invader species gekkonid lizard Hemidactylus mabouia in an area of southeastern Brazil. Iheringia Ser. Zool. 98, 205–209 (2008). doi: 10.1590/S0073-47212008000200006

66. D.-I. Kim et al., Patterns of morphological variation in the Schlegel's Japanese gecko (Gekko japonicus) across populations in China, Japan, and Korea. J. Ecol. Environ. 43, 34 (2019). doi: 10.1186/s41610-019-0132-5

67. A. Y. Albert, S. P. Otto, Sexual selection can resolve sex-linked sexual antagonism. Science 310, 119–121 (2005). doi: 10.1126/science.1115328; pmid: 16210543

68. H. K. Reeve, D. W. Pfennig, Genetic biases for showy males: Are some genetic systems especially conducive to sexual selection? Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1089–1094 (2003). doi: 10.1073/pnas.0337427100; pmid: 12540829

69. I. M. Hastings, Population genetics: XYZW as nature's language of love? Heredity 96, 278–279 (2006). doi: 10.1038/sj.hdy.6800795; pmid: 16508665

70. A. F. Kahrl, R. R. Snook, J. L. Fitzpatrick, Fertilization mode drives sperm length evolution across the animal tree of life. Nat. Ecol. Evol. 5, 1153–1164 (2021). doi: 10.1038/s41559-021-01488-y; pmid: 34155385

71. A. F. Kahrl, R. R. Snook, J. L. Fitzpatrick, Fertilization mode differentially impacts the evolution of vertebrate sperm components. Nat. Commun. 13, 6809 (2022). doi: 10.1038/s41467-022-34609-7; pmid: 36357384

72. D. Brawand et al., The evolution of gene expression levels in mammalian organs. Nature 478, 343–348 (2011). doi: 10.1038/nature10532; pmid: 22012392

73. Z. Y. Wang et al., Transcriptome and translatome co-evolution in mammals. Nature 588, 642–647 (2020). doi: 10.1038/s41586-020-2899-z; pmid: 33177713

74. D. Bachtrog, The temporal dynamics of processes underlying Y chromosome degeneration. Genetics 179, 1513–1525 (2008). doi: 10.1534/genetics.107.084012; pmid: 18562655

75. J. F. Hughes et al., Strict evolutionary conservation followed rapid gene loss on human and rhesus Y chromosomes. Nature 483, 82–86 (2012). doi: 10.1038/nature10843; pmid: 22367542

76. D. W. Bellott, D. C. Page, Dosage-sensitive functions in embryonic development drove the survival of genes on sex-specific chromosomes in snakes, birds, and mammals. Genome Res. 31, 198–210 (2021). doi: 10.1101/gr.268516.120; pmid: 33479023

77. D. Charlesworth, The timing of genetic degeneration of sex chromosomes. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B 376, 20200093 (2021). doi: 10.1098/rstb.2020.0093; pmid: 34247501

78. D. Crowson, S. C. H. Barrett, S. I. Wright, Purifying and positive selection influence patterns of gene loss and gene expression in the evolution of a plant sex chromosome system. Mol. Biol. Evol. 34, 1140–1154 (2017). doi: 10.1093/molbev/msx064; pmid: 28158772

79. J. A. Graves, Sex chromosome specialization and degeneration in mammals. Cell 124, 901–914 (2006). doi: 10.1016/j.cell.2006.02.024; pmid: 16530039

80. L. Gu, J. R. Walters, Evolution of sex chromosome dosage compensation in animals: A beautiful theory, undermined by facts and bedeviled by details. Genome Biol. Evol. 9, 2461–2476 (2017). doi: 10.1093/gbe/evx154; pmid: 28961969

81. S. Ohno, Sex Chromosomes and Sex-Linked Genes, vol. 1 of Monographs on Endocrinology (Springer, 2013).

82. J. A. Birchler, N. C. Riddle, D. L. Auger, R. A. Veitia, Dosage balance in gene regulation: Biological implications. Trends Genet. 21, 219–226 (2005). doi: 10.1016/j.tig.2005.02.010; pmid: 15797617

83. A. Catalán, J. Merondun, U. Knief, J. B. W. Wolf, Chromatin accessibility, not 5mC methylation covaries with partial dosage compensation in crows. PLOS Genet. 19, e1010901 (2023). doi: 10.1371/journal.pgen.1010901; pmid: 37747941

84. D. R. Schield et al., The origins and evolution of chromosomes, dosage compensation, and mechanisms underlying venom regulation in snakes. Genome Res. 29, 590–601 (2019). doi: 10.1101/gr.240952.118; pmid: 30898880

85. M. W. Pennell, J. E. Mank, C. L. Peichel, Transitions in sex determination and sex chromosomes across vertebrate species. Mol. Ecol. 27, 3950–3963 (2018). doi: 10.1111/mec.14540; pmid: 29451715

86. N. Valenzuela, V. A. Lance, Eds., Temperature-Dependent Sex Determination in Vertebrates (Smithsonian Institution Scholarly Press, 2004).

87. J. Jin, Dived-Jin/Gecko_Sexchromosome: Gecko_sexchromosome, v1.0.0, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.18973980.

88. J. Hansen, M. Sato, G. Russell, P. Kharecha, Climate sensitivity, sea level and atmospheric carbon dioxide. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A 371, 20120294 (2013). doi: 10.1098/rsta.2012.0294; pmid: 24043864

ACKNOWLEDGMENTS

We thank P. Doughty for assistance with fieldwork and permitting. We also gratefully acknowledge the support of the K.C. Wong Education Foundation. We also acknowledge the Information Technology Center of Zhejiang University and China Mobile Zhejiang Co. Ltd. (Hangzhou Branch) for providing the computation resource. Genome assembly was performed in association with the DNA Zoo Consortium (www.dnazoo.org), which acknowledges support from Illumina, IBM, and the Pawsey Supercomputing Center.

Funding: This work was supported by National Natural Science Foundation of China (grant 32388102) to G.Z. and P.S., Shenzhen Science and Technology Program (grant RCBS20231211090513005) and the Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2023QNRC001) to Y.Z., Fundamental and Interdisciplinary Disciplines Breakthrough Plan of the Ministry of Education of China (JYB2025XDXM508), NSF-DEB 1657662 to T.G., and the New Cornerstone Science Foundation through the XPLORER Prize and K.C. Wong Education Foundation and Zhejiang University Global Partnership Fund to G.Z. E.L.A. was supported by the Welch Foundation (Q-1866), an NIH Encyclopedia of DNA Elements Mapping Center Award (UM1HG009375), a US-Israel Binational Science Foundation Award (2019276), the Behavioral Plasticity Research Institute (NSF DBI-2021795), and an NSF Physics Frontiers Center Award (NSF PHY-2019745).

Author contributions: Conceptualization: G.Z., T.G., P.S., Y.Z.; Resources: T.G., B.J.P., X.G., Y.L., S.V.N., A.H.G., T.E., A.G., I.B.; Data generation: Zhe.S., O.D., Z.Co., R.K., A.D.O., L.J., Zha.S.; Formal analysis: Y.Z., J.J., C.J., X.L., Zhe.S., L.H., W.C., B.J.P., O.D., D.W., E.L.A., Y.X., Y.Q., Z.Co., Z.Ca., Y.P., Z.Z., Q.Z.; Writing – original draft: Y.Z., J.J.; Writing – review & editing: G.Z., Y.Z., T.G., B.J.P., A.H.G.; Visualization: Y.Z., J.J., C.J., W.C., A.H.G.; Supervision: G.Z., Y.Z., E.L.A.; Funding acquisition: P.S., G.Z., T.G., Y.Z., E.L.A.

Competing interests: E.L.A. and O.D. hold patents related to Hi-C. E.L.A. is on the scientific advisory board of Colossal Biosciences.

Data, code, and materials availability: The gecko genome and transcriptome data have been deposited at GenBank (project accession PRJNA1288340) and CNGBdb (accession CNP0005488). Hi-C data are available at NCBI under PRJNA512907 (accession numbers SRR35123232–SRR35123304). Public databases used in this study include NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), UniProt (https://www.uniprot.org/), and Repbase (https://www.girinst.org/repbase/). Important data generated by this study are available at Figshare (https://figshare.com/s/31833ea74c36f3f36fdd). In-house scripts used in this study are available on GitHub (https://github.com/Dived-Jin/Gecko_Sexchromosome) and Zenodo (87). No new materials were generated for this study.

License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aec3449

Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S37; Tables S1 to S25; References (89–177); MDAR Reproducibility Checklist

Submitted 16 September 2025; resubmitted 15 March 2026; accepted 24 June 2026

10.1126/science.aec3449

AAAS.ORG/COMMUNITY

AAAS' Member Community is a one-stop destination for scientists and STEM enthusiasts alike. It's “Where Science Gets Social”: a community where facts matter, ideas are big and there’s always a reason to come hang out, share, discuss and explore.

Member COMMUNITY AAAS

Nonviral delivery of chemically modified tRNA rescues nonsense mutations in cystic fibrosis

Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/science.aeb0054

Jingan Chen†, Muye Zhou†, Songtao Dong†, Fanglin Gong, Rasangi Tennakoon, Breanna Y. Seto, Ziyan Rachel Chen, Zhichang Peter Zhou, Jingyi Pan, Yue Xu, Sijin Luozhong, Colette Maya Macarios, Santiago Tijaro-Bulla, Tanja Gonska, Jim Hu, Haissi Cui*, Bowen Li*

INTRODUCTION: Nonsense mutations introduce premature termination codons (PTCs) into messenger RNAs (mRNAs), preventing full-length protein production and accounting for $\sim$ 11% of human genetic diseases. Current therapeutic strategies remain limited: Gene-editing approaches can face challenges related to delivery, immunogenicity, and off-target effects, whereas pharmacological readthrough agents have shown limited efficacy or considerable toxicity. Suppressor transfer RNAs (sup-tRNAs), whose anticodons are engineered to read through PTCs, offer an RNA-level strategy for restoring endogenous protein synthesis without altering the genome. This reversibility, transcript-level action, limited detectable off-target activity, and potential applicability across diseases sharing the same nonsense codon make sup-tRNAs attractive therapeutic candidates. However, their therapeutic translation has been limited by suboptimal readthrough, immune activation, short functional persistence, and inefficient delivery to disease-relevant tissues.

RATIONALE: RNA modifications have emerged as key regulators of RNA stability, translation, immunogenicity, and therapeutic performance. Mature endogenous tRNAs are extensively modified for shaping tRNA folding, stability, aminoacylation, decoding, and interactions with the translational machinery. We thus hypothesized that installing defined chemical modifications into engineered sup-tRNAs could improve their activity and suitability as medicines. In parallel, effective translation of tRNA therapeutics requires cargo-tailored delivery vehicles capable of efficiently transporting structured tRNA molecules to disease-relevant tissues. We combined site-specific tRNA engineering with a large lipid nanoparticle (LNP) screen to develop a nonviral delivery platform optimized for sup-tRNA cargo. We used cystic fibrosis (CF) as a disease model to evaluate the therapeutic efficacy of this sup-tRNA platform because nonsense mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene represent an unmet clinical need.

RESULTS: We synthesized various chemically modified sup-tRNAs and systematically tested the effects of site-specific modifications. Incorporation of $N^{1}$ -methyladenosine ( $m^{1}A$ ) at position 57 or 58 improved sup-tRNA function, increasing PTC readthrough by up to 10.6-fold for an arginine sup-tRNA. This modification also improved aminoacylation, increased functional persistence, reduced innate immune activation, and benefited sup-tRNAs charged with different amino acids. Screening more than 1000 ionizable lipids identified TTP-3 (tRNA-tailored pulmonary delivery-3), an LNP optimized for sup-tRNA cargo. After intratracheal administration in mice, TTP-3 LNPs efficiently delivered sup-tRNAs to airway epithelial and progenitor cells and showed preliminary aerosolization compatibility. Mango II aptamer insertion enabled in vivo tracking of sup-tRNA biodistribution, revealing delivery to epithelial progenitor cells relevant to CFTR expression and airway repair. In CFTR-mutant bronchial epithelial cells, modified sup-tRNAs

LNP delivery of chemically modified sup-tRNAs for pulmonary nonsense-mutation rescue. Sup-tRNAs decode PTCs to overcome nonsense mutations. Chemical RNA modifications improved sup-tRNA therapy efficacy by enhancing PTC readthrough and functional persistence while reducing immune activation. A tailored LNP delivered modified sup-tRNAs to airway epithelial cells after intratracheal administration, restoring full-length CFTR production and chloride-channel function. ARS, aminoacyl-tRNA synthetase. [Figure created with BioRender.com]

restored CFTR protein expression and channel activity. In a CFTR R553X mouse model, LNP-sup-tRNA treatment improved CFTR-dependent swelling in intestinal organoids. In a CF patient-derived organoid model carrying a complex CFTR genotype, cotreatment with sup-tRNAs and Trikafta restored CFTR function, consistent with complementary restoration of protein production and modulator-responsive CFTR activity.

CONCLUSION: This work establishes a chemically modified, nonvirally delivered sup-tRNA platform for rescuing disease-causing nonsense mutations. Site-specific m $^{1}$ A57/58 modification provides a chemical strategy for enhancing sup-tRNA activity, persistence, and tolerability, whereas TTP-3 LNPs illustrate the importance of cargo-specific delivery design for structured tRNA therapeutics. The aptamer-tagging approach further provides a general method for tracking tRNA biodistribution and cell type targeting in vivo. These findings provide broadly applicable engineering insights for the future development of tRNA-based medicines. □

Nonviral delivery of chemically modified tRNA rescues nonsense mutations in cystic fibrosis

Jingan Chen $^{1,2}$ †, Muye Zhou $^{1}$ †, Songtao Dong $^{1}$ †, Fanglin Gong $^{1,2}$ , Rasangi Tennakoon $^{3}$ , Breanna Y. Seto $^{1,3}$ , Ziyan Rachel Chen $^{4,5}$ , Zhichang Peter Zhou $^{4}$ , Jingyi Pan $^{4}$ , Yue Xu $^{1}$ , Sijin Luozhong $^{1}$ , Colette Maya Macarios $^{3}$ , Santiago Tijaro-Bulla $^{3}$ , Tanja Gonska $^{4,6}$ , Jim Hu $^{4,5}$ , Haissi Cui $^{3,}$ , Bowen Li $^{1,2,3,7,}$

Suppressor transfer RNAs (sup-tRNAs) can rescue disease-causing nonsense mutations by promoting readthrough of premature termination codons (PTCs). Their clinical translation is limited by suboptimal activity and inefficient in vivo delivery. In this work, we combined site-specific chemical modification of sup-tRNAs with cargo-tailored pulmonary lipid nanoparticle (LNP) engineering to overcome these barriers. Incorporation of N $^{1}$ -methyladenosine in sup-tRNAs improved PTC readthrough, enhanced tRNA aminoacylation, prolonged functional persistence, and reduced innate immune activation. High-throughput ionizable lipid screening and formulation optimization identified a sup-tRNA–tailored LNP that efficiently delivered chemically modified sup-tRNAs to the lung. This approach restored cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) expression and function in bronchial epithelial cells, mouse models, and patient-derived organoids. Thus, LNP-delivered, chemically engineered sup-tRNAs represent a potential therapeutic platform for treating nonsense mutations.

Nonsense mutations introduce premature termination codons (PTCs) into mRNAs, prematurely terminating mRNA translation and producing truncated, nonfunctional proteins. These mutations mostly arise from single-nucleotide substitutions within coding regions and account for $\sim$ 11% of human genetic disorders, typically causing loss-of-function phenotypes (1–3). Pharmacological readthrough agents generally exhibit limited efficacy and dose-limiting toxicity, whereas gene-replacement and genome-editing strategies require careful evaluation of immunogenicity, off-target effects, and long-term safety (4–6). Transfer RNAs (tRNAs), which decode mRNA codons by delivering amino acids to the ribosome, have emerged as a broadly applicable therapeutic modality (7, 8). By replacing the anticodon to recognize PTCs, tRNAs can be engineered into suppressor tRNAs (sup-tRNAs), which are aminoacylated by endogenous aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) and restore full-length protein synthesis through translational readthrough (Fig. 1A) (9–11). Sup-tRNAs can also indirectly stabilize target transcripts by preventing nonsense-mediated decay while minimally perturbing normal translation termination, which makes them a potentially precise and safe strategy for treating nonsense mutations (12, 13).

Previous studies have demonstrated therapeutic rescue of nonsense mutations using either DNA-encoded sup-tRNAs delivered by adeno-associated virus (AAV) or unmodified in vitro transcribed sup-tRNAs delivered by lipid nanoparticles (LNPs) $(14-21)$ . However, clinical translation remains limited by insufficient efficacy and inefficient delivery. Readthrough efficiency depends on the local sequence context, translation velocity, and the identity of the inserted amino acid, and even sequence-optimized sup-tRNAs often fail to achieve therapeutically meaningful rescue $(21-26)$ . Endogenous mature tRNAs contain extensive posttranscriptional nucleoside modifications that regulate folding, stability, decoding, and translational fidelity (Fig. 1B) $(27-33)$ . We hypothesized that introducing defined chemical modifications into therapeutic sup-tRNAs would enhance their stability and readthrough activity.

Efficient in vivo delivery represents a second major barrier to sup-tRNA therapy. Although AAV vectors can provide durable expression, their immunogenicity and limited capacity for redosing restrict clinical utility $(34, 35)$ . LNPs offer a clinically validated, nonviral alternative with versatile cargo encapsulation, low immunogenicity, and compatibility with repeated administration $(36-38)$ . However, existing LNP-mediated sup-tRNA delivery has relied on formulations optimized for hepatic mRNA delivery, leaving efficient extrahepatic tRNA delivery largely unexplored. This limitation is particularly relevant to cystic fibrosis (CF), where $\sim10\%$ of patients harbor nonsense mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene and cannot benefit from approved CFTR modulators, such as Trikafta $(39)$ . In this work, we addressed these challenges by combining site-specific chemical modification of sup-tRNAs with pulmonary LNP engineering.

Select chemical modifications improve sup-tRNA PTC readthrough efficiency and lower immunogenicity

To test the effect of chemical modifications on sup-tRNA, we first studied their impact on Gly-sup-tRNA. We selected GlyTGAchr19trna2 (14) as the blueprint for glycyl-sup-tRNA-mediated UGA readthrough because previous sequence-optimization approaches had yielded limited improvement (21, 26). First, we synthesized various chemically modified sup-tRNAs with both naturally occurring and other modifications at distinct structural regions of the tRNA (40). Modifications were installed in the D-loop, T-loop, anticodon loop, and acceptor stem (Fig. 1C). D-loop variants included tGM1 [1-methylguanosine at position 9 $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{G}9)]$ , tGM2 [1-methyladenosine $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}26)]$ , tGM3 $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{G}9$ and $\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}26)$ , and tGM4 $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}14)$ . $\mathrm{m}^{1}\mathrm{G}9$ and $\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}26$ can occur individually or together in tRNAs (28). T-loop variants included tGM5 $[5,2^{\prime}$ -O-dimethyluridine $(\mathrm{m}^{5}\mathrm{Um}54)]$ and tGM6 $(\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}57/58)$ . Typically, T-loop $\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}$ modification occurs at position 57 or 58 in tRNAs, and because GlyTGAchr19trna2 lacks adenine at position 58, we introduced the $\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}$ modification at position 57. Anticodon-loop variants included tGM7 [5-methylcytidine $(\mathrm{m}^{5}\mathrm{C}32)]$ , tGM8 $[2^{\prime}$ -O-methyladenosine (Am37)], and tGM9 [N6-methyladenosine $(\mathrm{m}^{6}\mathrm{A}37)]$ . Inspired by the immunogenicity-reducing effects of pseudouridine $(\Psi)$ in mRNA therapeutics, we also created a variant with $\Psi$ only (tGM10, $100\%$ $\Psi$ ). Additionally, we designed another variant (tGM11) incorporating $\Psi$ specifically at position 34 of the anticodon because pseudouridylation of mRNA at the PTCs enhances near-cognate tRNA readthrough (41). Finally, we synthesized tGM12 containing $\mathrm{m}^{1}\mathrm{A}72$ near the CCA end.

To evaluate the efficiency of these chemically modified sup-tRNA variants in decoding PTCs, we generated a reporter cell line based on BEAS-2B (lung epithelial) expressing NanoLuc luciferase (NLuc) with a PTC (UGA) $(14)$ (Fig. 1D) and transfected sup-tRNAs using Lipofectamine MessengerMAX for readthrough assay. The modifications added to the tRNA in variants tGM1, tGM2, tGM3, and tGM6 successfully improved readthrough efficiency compared with the unmodified counterpart (fig. S1). On the basis of these results, we explored a potential synergistic effect by combining beneficial modifications, which led to the design of tGM13 (m $^{1}$ G9, m $^{1}$ A26, and m $^{1}$ A57) and tGM14 (m $^{1}$ G9, m $^{1}$ A26, m $^{6}$ A37, and m $^{1}$ A57). We then tested all fourteen variants together at the same dosage level. At 24 hours posttreatment, increased PTC readthrough was observed for tGM1 (2.2-fold), tGM2 (2.1-fold), < 0.0001|< 0.0001|< 0.0001|0.1372|< 0.0001|< 0.0001|> 0.9999|< 0.0001|0.3657|< 0.0001|< 0.0001|< 0.0001|< 0.0001

A
B
D

E

F

G

Fig. 1. Effect of RNA chemical modifications on sup-tRNA readthrough efficiency and immunogenicity. (A) Illustration of sup-tRNA-mediated readthrough of PTCs to restore full-length protein synthesis. (B) Naturally occurring chemical modifications in tRNAs. (C) Schematic representation of glycine sup-tRNAs engineered with a 5'-UCA-3' anticodon to decode the UGA stop codon, incorporating various site-specific RNA modifications (tGM1 to tGM14). (D) Scheme of the NanoLuc luciferase (NLuc) with PTC reporter system for evaluating readthrough efficiency of sup-tRNA variants. (E) Comparative assessment of sup-tRNA variant readthrough activity in NLuc-PTC reporter at

different time points (12, 24, and 48 hours posttreatment) with the same dosage level (300 ng per $10^{5}$ cells). Readthrough assays were performed after Lipofectamine MessengerMAX-mediated tRNA transfection. Values represent fold changes relative to untreated controls. $n = 4$ independent replicates. (F and G) Immunogenicity profiling of sup-tRNA variants in THP-1 dual-reporter cells, which monitor the activation of the IRF pathway (F) and NF- $\kappa$ B signaling pathway (G). Sup-tRNA variants were delivered using SM-102 LNPs. Data are means $\pm$ SDs; $n = 4$ independent replicates. In (E), $P$ values for 24-hour data were calculated by one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparison test versus unmodified sup-tRNA. In (F) and (G), $P$ values were calculated by one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test. ns, not significant.

tGM3 (2.1-fold), tGM6 (2.4-fold), tGM9 (1.1-fold), and tGM13 (1.9-fold) relative to the unmodified sup-tRNA (Fig. 1E). Among these, tGM6 showed the largest improvement (2.4-fold). By contrast, tGM4 (0.9-fold), tGM5 (0.3-fold), tGM8 (0.2-fold), tGM10 (0.2-fold), tGM11 (0.6-fold), tGM12 (0.5-fold), and tGM14 (0.4-fold) reduced readthrough activity, whereas tGM7 produced readthrough levels comparable to the unmodified counterpart. This trend remained consistent across three time points (12, 24, and 48 hours posttreatment). We further evaluated all variants in additional cell lines, including HepG2, C2C12, and THP-1. Although absolute PTC readthrough values differed among cell lines, the relative performance of the variants was largely conserved, which indicates that readthrough efficiency was preserved across cellular contexts (fig. S2).

We next assessed the immunogenicity of the sup-tRNA variants in THP-1 dual-reporter cells (human monocytes), which enable simultaneous monitoring of nuclear factor $\kappa$ B (NF- $\kappa$ B) and interferon regulatory factor (IRF) pathway activation. To distinguish immunogenic effects arising from the delivery vehicle versus the tRNA variants, the library was formulated into LNPs containing either of two ionizable lipids with distinct inflammatory profiles—SM-102 (lower inflammatory potential) or cKK-E12 (higher inflammatory potential)—with the same formulation. At the tRNA dose used in the readthrough assays, delivery by SM-102 LNPs, which cause minimal intrinsic immune activation, showed that the unmodified sup-tRNA activated the IRF pathway, whereas none of the chemically modified variants triggered detectable IRF activation (Fig. 1F). NF- $\kappa$ B signaling was activated only by tGM13 and tGM14, both containing multiple modifications (Fig. 1G). To further characterize these inflammatory responses, we performed dose-response analyses concomitantly with cell-viability measurements. Cell viability remained high across all variants and doses, which indicated that the observed responses were not attributable to cytotoxicity (fig. S3). Similar trends observed across SM-102 and cKK-E12 formulations suggested that the differences primarily reflected varying tRNA modifications rather than LNP-induced immunogenicity. This unintended NF- $\kappa$ B activation may explain the absence of synergistic enhancement in readthrough activity observed for variants combining multiple modifications that were beneficial by themselves. Together, these results highlight the importance of site-specific modifications, especially m $^{1}$ A57/58, in improving PTC readthrough efficiency while maintaining a favorable immunological profile.

m $^{1}$ A58 modification enhances aminoacylation efficiency and extends PTC readthrough duration

tRNAs are charged with the correct amino acid by ARSs, and the efficiency of this process influences mRNA translation and cellular homeostasis (42) (Fig. 2A). Efficient aminoacylation is particularly critical for sup-tRNA therapies as a prerequisite for function. However, changing the anticodon to generate sup-tRNAs can reduce ARS recognition and lower aminoacylation activity toward sup-tRNAs. We thus evaluated the aminoacylation efficiency toward modified Gly-sup-tRNA variants using recombinant human glycyl-tRNA synthetase (GARS1) (43). In vitro incubation with GARS1 and subsequent analysis of tRNA charging levels by acid gel (Fig. 2B and fig. S4) showed that $84\%$ of native Gly-tRNA was aminoacylated. In comparison, aminoacylation levels were lowered upon mutation of the anticodon to sup-tRNA $(\sim 30\%)$ as expected because the anticodon serves as an identity motif in Gly-tRNA (44, 45). In several sup-tRNA variants, chemical modifications caused substantially increased charging relative to the unmodified sup-tRNA, including tGM1 ( $\sim55\%$ ), tGM2 ( $\sim51\%$ ), tGM3 ( $\sim68\%$ ), tGM6 ( $\sim63\%$ ), and tGM13 ( $\sim57\%$ ). Other variants were charged similarly to the unmodified sup-tRNA (tGM7, $\sim35\%$ ; tGM8, $\sim29\%$ ; and tGM9, $\sim30\%$ ), whereas some modifications resulted in reduced tRNA aminoacylation (tGM5, $\sim13\%$ ; tGM10, $\sim11\%$ ; and tGM12, $\sim16\%$ ). Overall, efficiently aminoacylated tRNA variants displayed higher readthrough reporter activity in cell assays, which suggests that tRNA aminoacylation was a limiting factor for sup-tRNA potency. In line with this, tGM10, with 100% U→Ψ substitution, was minimally aminoacylated, which indicated that extensive Ψ modifications severely disrupted ARS recognition and consequently explained the low readthrough rates observed in cells. Notably, tGM13 and tGM14, which each combine multiple modifications, were less efficiently charged compared with single-modified variants. This reduction also matched our observations in cell-based reporter assays, highlighting that combining modifications may inadvertently impair aminoacylation and thereby limit therapeutic efficacy in addition to activating the NF-κB pathway (Fig. 1G). Additionally, we explored the importance of the 5' monophosphate in sup-tRNAs (46). We synthesized an alternative version with a 5' hydroxyl group of the most effective variant, tGM6, which substantially reduced readthrough capability compared with its 5' monophosphate counterpart (Fig. 2C). This finding highlights the critical role of the correct 5' end in preserving the high therapeutic efficiency of sup-tRNAs.

To evaluate whether the beneficial effects of the modification in glycine sup-tRNAs could extend to other sup-tRNAs, we synthesized $m^{1}A58$ -modified versions of arginine and tryptophan sup-tRNAs. The Arg-sup-tRNA sequence was derived from a previously optimized variant known as tRT6 (21). We modified tRT6 with $m^{1}A58$ (referred to as tRM6 in our study). Introducing the $m^{1}A58$ modification significantly enhanced PTC readthrough efficiency in both Arg- and Trp-sup-tRNAs (Fig. 2D and fig. S5), although the magnitude of enhancement differed between the two scaffolds. Notably, tRM6 exhibited an $\sim$ 10.6-fold increase in PTC readthrough efficiency. To accurately quantify the effect of the $m^{1}A58$ modification on sup-tRNA aminoacylation kinetics, we performed filter binding assays using radiolabeled amino acids. The $m^{1}A58$ -modified Arg-sup-tRNA variant tRM6 was more efficiently aminoacylated compared with both the native arginine tRNA (tR) and the unmodified Arg-sup-tRNA (tRT6). tRM6 was 2.3-fold more efficiently charged compared with tR and 1.7-fold more compared with tRT6 (Fig. 2, E and F).

We next investigated whether the m $^{1}$ A58 chemical modification could extend the tRNA half-life and the duration of sup-tRNA-mediated PTC readthrough activity in vitro and in vivo. Reporter cells treated with the modified tRM6 still generated NLuc signal after 30 days, whereas the unmodified tRT6 group showed a rapid decline in signal (Fig. 2G). To directly assess sup-tRNA persistence, we performed tRNA sequencing (tRNA-seq) of CF human bronchial epithelial (HBE) cells after treatment with tRM6 or tRT6. The modified sup-tRNA remained more abundant over time and showed significantly greater retention on day 35 than the unmodified tRNA, with an estimated apparent half-life of $\sim$ 29 days (tRM6) compared with $\sim$ 12 days (tRT6) (fig. S6). Additionally, the m $^{1}$ A58 site in tRM6 remained modified throughout the whole time course, at levels comparable to the modification of endogenous arginine tRNA at position 58. By contrast, the unmodified tRT6 showed only minimal modification, indicating limited endogenous methylation after delivery. tRM6 remained predominantly aminoacylated at later time points, indicating sustained integrity and activity. These results indicate that m $^{1}$ A58 modification enhanced functional

B

E
F

○ No tRNA □ tR (native) ▽ tRT6 (unmodified) △ tRM6 (m $^{1}$ A $_{58}$ modified)

G

H

Fig. 2. Characterization of aminoacylation, versatility, and persistence of chemically modified sup-tRNAs. (A) Simplified schematic illustrating aminoacylation of tRNAs by ARSs. The structural depiction of glycyl-tRNA synthetase in complex with Gly-tRNA was adapted from PDB ID 4KR2 (RCSB Protein Data Bank). (B) Aminoacylation efficiency of Gly-tRNA variants catalyzed by glycyl-tRNA synthetase (GARS1) (+) compared with nonaminoacylated controls (−). Aminoacylated tRNAs (open circles) display slower electrophoretic migration than nonaminoacylated tRNAs (filled circles). n = 3 or 4 independent replicates. (C) Effect of 5'-hydroxyl (-OH) and 5'-monophosphate (-P) ends on the readthrough efficiency of sup-tRNA assessed by NLuc_PTC reporter. n = 5 independent replicates. (D) Enhanced readthrough

efficiency after the installation of m $^{1}$ A58 across different sup-tRNAs (arginine and tryptophan sup-tRNAs; note that separate y-axis scales are used). n = 5 independent replicates. (E and F) Aminoacylation kinetics (E) and quantitative comparison of aminoacylation efficiency at 30 min (F) of arginine sup-tRNA variants using radiolabeled amino acids. n = 3 independent replicates. (G and H) Evaluation of functional persistence of unmodified (tRT6) and m $^{1}$ A58-modified (tRM6) sup-tRNAs measured by NLuc_PTC reporter in vitro in cell culture (G) and in vivo in the liver of a LumA-PTC reporter mouse line (H). n = 3 biological replicates. Cell-based readthrough and sup-tRNA persistence assays in (C), (D), and (G) were performed using Lipofectamine MessengerMAX-mediated transfection; in vivo persistence in (H) was assessed after hepatic LNP delivery. Data are means ± SDs. P values were calculated by two-tailed unpaired Student's t test in (C) and (D) and one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test in (F).

persistence. We also compared modified sup-tRNA with exogenous NLuc-encoding mRNA. In the NLuc_PTC reporter cell line, delivery of tRM6 produced more sustained reporter luminescence than direct delivery of NLuc-encoding mRNA over the course of 14 days (fig. S7). Consistent with this functional difference, NLuc mRNA abundance decreased to less than $1\%$ of day 1 levels by day 14, indicating superior stability of modified sup-tRNA compared with mRNA. These findings support an advantage of sup-tRNA-based therapy through the prolonged restoration of endogenous protein over mRNA-based gene replacement for treating disorders caused by nonsense mutations.

For in vivo validation, we used a transgenic LumA mouse model containing a firefly luciferase (FLuc) gene with a UGA PTC (R387X) $(47)$ . After intravenous administration, FLuc luminescence signals in the liver of tRM6-treated mice remained substantially higher than in tRT6-treated animals and lasted beyond 30 days (Fig. 2H), which underscores the persistent efficacy of m $^{1}$ A58-modified sup-tRNAs in vivo. Repeated dosing further highlighted the advantage of chemical tRNA modification. After administration on days 0, 14, and 28, the modified sup-tRNA group showed a rapid rebound after each dose and maintained comparable peak activity across all three dosing cycles, whereas the unmodified group exhibited progressively weaker responses with each subsequent administration (fig. S8). This divergence suggests that chemical modification improved the durability of redosing, likely by increasing RNA stability and reducing innate immune sensing that could dampen mRNA translation after repeated RNA delivery.

High-throughput screening to develop LNPs for sup-tRNA pulmonary delivery

Next, we opted to develop a delivery system tailored to sup-tRNAs. LNPs typically comprise ionizable lipids, cholesterol, helper lipids, and PEGylated lipids, with ionizable lipids being the key component for determining delivery potency, biocompatibility, and cell specificity $(48)$ ; because of this, the lipids are the most commonly adjusted component. Owing to the limited understanding of lipid structure-activity relationships, we used high-throughput approaches to screen diverse lipids for LNP development $(49–51)$ . To optimize LNPs specifically for pulmonary sup-tRNA delivery, we combined simple building blocks using a Ugi four-component reaction (Ugi-4CR) $(52, 53)$ , which enabled rapid, one-pot synthesis of chemically diverse ionizable lipids (Fig. 3A). By systematically combining 10 amine headgroups, 5 aldehyde linkers, 5 carboxylic acid tails, and 4 isocyanide tails (Fig. 3B), we efficiently synthesized a library of 1000 structurally distinct ionizable lipids in a single day using automated robotic synthesis. To determine whether there are specific LNP design considerations to maximize sup-tRNA delivery, we screened the same 1000-member ionizable lipid library in parallel using either sup-tRNA (a small and highly structured RNA) or mRNA (a larger RNA). These 1000 ionizable lipids were used in the same LNP formulation along with helper lipid, cholesterol, and PEGylated lipid to encapsulate either sup-tRNAs or mRNAs (Fig. 3C) for delivery to BEAS-2B cells. The two screens produced markedly different structure-activity maps, and lipid performance across the library showed only a weak correlation between sup-tRNA and mRNA delivery (Fig. 3, D and E, and fig. S9). Thus, the lipid structure requirements for efficient delivery differ substantially between RNA modalities, supporting the need for cargo-specific lipid screening.

In CF patients, a dense mucus barrier impedes delivery to lung epithelial cells. We thus used a CF-relevant air-liquid interface (ALI) culture model, where bronchial epithelial reporter cells are coated with artificial mucus, to realistically evaluate mucus penetration and cellular transfection by LNPs (Fig. 3F). In this ALI model, we further tested the top 10 ionizable lipids identified from our initial screen and ultimately identified the most promising ionizable lipid candidate, hereafter named TTP-3 (tRNA-tailored pulmonary delivery-3) (fig. S10). TTP-3 exhibited superior transfection performance compared with commercial benchmark lipids when tested with identical formulations, including A10-LIN, which was developed for pulmonary mRNA delivery, and the FDA-approved MC3 (Onpattro), designed for small interfering RNA (siRNA) delivery (Fig. 3G). Notably, A10-LIN still performed favorably relative to several top candidates in the secondary screen, although it was less effective than TTP-3. This suggests that mRNA delivery performance was not a reliable predictor of sup-tRNA delivery efficiency, which supports cargo-specific LNP development rather than extrapolation across RNA modalities. To further optimize the formulation of TTP-3 LNPs, we used a design of experiments (DoE) approach (54, 55) to systematically evaluate seven critical parameters known to influence the transfection efficiency of LNPs: (i) ionizable lipid to RNA mass ratio, (ii) ionizable lipid molar ratio, (iii) type of helper lipid, (iv) helper lipid molar ratio, (v) type of sterol lipid, (vi) sterol lipid molar ratio, and (vii) PEGylated lipid molar ratio (Fig. 3H). Various statistically representative LNP formulations were tested in the ALI model coated with mucus, which allowed us to incorporate both epithelial transfection and the airway mucus barrier into the optimization workflow. The optimized LNP formulation was obtained by using a desirability function, defined by the experimentally observed maximized transfection efficiency across conditions. The resulting optimal formulation for pulmonary sup-tRNA delivery consisted of a 13.5:1 ionizable lipid-to-tRNA mass ratio with $60\%$ TTP-3, $10\%$ DOPE, $27.5\%$ $\beta$ -sitosterol, and $2.5\%$ PEGylated lipid (Fig. 3I). By contrast, parallel DoE optimization of TTP-3 LNPs carrying mRNA converged on a different formulation (fig. S11), which indicates that both ionizable lipid selection and the optimal LNP composition are cargo dependent. In a mucus-filled parallel channel assay, the TTP-3 with optimized LNP formulation showed the highest diffusivity, exceeding both a TTP-3 formulation prepared according to the Onpattro formulation and MC3 under the same benchmark formulation (fig. S12), which supports its suitability for diffusion in airway mucus. This optimized TTP-3 LNP formulation demonstrated superior sup-tRNA pulmonary delivery in vivo through intratracheal administration in the LumA (FLuc R387X) transgenic reporter mouse model, significantly outperforming both A10-LIN and MC3 LNPs (Fig. 3, J and K, and fig. S13).

Adaptation of sup-tRNA delivery through inhalation would be important for clinical translation, particularly with regard to patient acceptability and repeated dosing (56–58). Hence, we also assessed the feasibility of nebulizing TTP-3 LNPs loaded with sup-tRNA and confirmed that the nebulized formulation retained PTC readthrough capability in the NLuc_PTC reporter cell system, albeit to a lesser degree than preparations that did not undergo nebulization (fig. S14). To protect LNPs during the nebulization process, we considered increasing polyethylene glycol (PEG) content above 2.5 mol %; however, higher PEG levels progressively reduced transfection efficiency. Addition of

A

C
B

D

E

F

G
H

|
LNP Formulation Optimization

J
LumA Mouse Model (Luciferase R387X)

K

Fig. 3. High-throughput synthesis, screening, and optimization of an ionizable lipid library for sup-tRNA pulmonary delivery. (A) Illustration of the Ugi four-component reaction. The library was synthesized from diverse amines (headgroups), aldehydes (linkers), carboxylic acid tails (tail A), and isocyanide tails (tail B). (B) Chemical structures of the four components in the synthesis library. (C) Schematic depiction of LNP assembly and subsequent high-throughput screening. (D) High-throughput screening results of the lipid library. (Top) BEAS-2B reporter cells treated with LNP-sup-tRNA. (Bottom) BEAS-2B cells treated with LNP-FLuc mRNA. Heatmaps show normalized luminescence

intensity ( $\log_{2}$ RLU) representing transfection efficiency. (E) Pearson correlation comparing lipid performance for sup-tRNA versus mRNA delivery across the screened library. (F) Schematic overview of the ALI culture model incorporating artificial mucus, designed to mimic the viscous mucus characteristic of the CF lung environment. (G) Evaluation of the top 10 performing ionizable lipids from the initial screen in CF-mimicking ALI culture. n = 3 independent replicates. (H) Chemical structure of the best-performing ionizable lipid (TTP-3) and a summary of key experimental parameters for LNP formulation optimization. (I) Response surface plots showing desirability function-based optimization of TTP-3 LNP formulation parameters, identifying optimal conditions for sup-tRNA delivery. (J) Illustration of the LumA_PTC transgenic mouse model (Fluc R387X), used to assess pulmonary sup-tRNA transfection efficiency by measuring functional luciferase protein restoration. (K) Representative IVIS results of lungs obtained at day 3 after intratracheal administration of LNP-tRM6 (1.25 mg/kg) with different ionizable lipids. All LNPs used shared the same formulation optimized from the DoE study (I). n = 3 or 4 biological replicates. Data are means ± SDs. P values in (K) were calculated by one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test.

poloxamer 188, which stabilizes LNPs during nebulization (59), improved postnebulization encapsulation efficiency and better preserved sup-tRNA activity (fig. S14). These preliminary results support compatibility with aerosolization; however, further optimization of LNP formulation and nebulization conditions could benefit delivery through inhalation. Overall, these findings highlight the importance of a tailored LNP platform to enable effective pulmonary delivery of sup-tRNAs for the treatment of genetic lung disorders.

Fluorescent aptamer-based tracking demonstrates efficient sup-tRNA delivery to lung epithelial and CFTR-resident progenitor cells

To track the biodistribution and cellular targeting efficiency of the optimized LNP for tRNA delivery, we inserted the Mango II fluorogenic aptamer (60, 61) into the variable loop of the sup-tRNA sequence. Upon binding to its fluorophore ligand, the aptamer strongly enhances its fluorescence, which enables direct visualization of tRNA molecules (Fig. 4A). To confirm that aptamer insertion did not compromise sup-tRNA function, we evaluated its performance in NLuc_PTC reporter cells. The Mango II-modified sup-tRNA retained substantial read-through activity, albeit showing a reduction of $\sim 30$ to $40\%$ compared with sup-tRNA alone (fig. S15). Aptamer insertion had no detectable effect on cell viability, LNP encapsulation efficiency, or particle size, which indicated that the modification did not alter key physicochemical properties relevant to delivery and biodistribution. Consequently, the Mango II-modified sup-tRNA (tRNA_Aptamer) was used as a fluorescent tracking probe in subsequent in vivo biodistribution studies.

After intratracheal administration of the LNP-tRNA_Aptamer complex to mice, we analyzed the cellular distribution of the tRNA_Aptamer in the lung using flow cytometry (Fig. 4B and fig. S16). In TTP-3 LNP-treated animals, \~60% of all tRNA_Aptamer-positive cells were epithelial cells, whereas immune and endothelial cells made up \~9% and \~8%, respectively (Fig. 4, C and D). This epithelial-dominant transfection profile is highly beneficial for CF therapy because CFTR mutations primarily affect lung epithelial cells. By contrast, MC3 LNPs (Onpattro) predominantly transfected endothelial cells (\~50%) and immune cells (\~15%), with substantially fewer positive epithelial cells (\~19%). Within the epithelial cell population, \~32% of cells were tRNA_Aptamer positive after treatment with TTP-3 LNP compared with 13% after MC3 LNP treatment (Fig. 4E). We next evaluated the cellular delivery of TTP-3 LNPs to CFTR-relevant airway epithelial populations (fig. S17), including ciliated cells, club cells, ionocytes, and basal stem cells (56, 62). Basal cells are critical target cells for a durable therapeutic benefit owing to their long lifespan and regenerative capacity in the airway epithelium (63, 64). TTP-3 LNPs achieved robust delivery across these populations, targeting 22% of ciliated cells, 19% of club cells, and 32% of basal cells, as shown by tRNA_Aptamer internalization (Fig. 4F). Ionocytes, though rare, exhibited around 15% transfection efficiency—a notable result given their high endogenous CFTR expression (fig. S18). Immunofluorescence staining of lung tissue further confirmed TTP-3 LNP-mediated delivery to these key epithelial and progenitor cells in both the small airways and bronchi (Fig. 4G). Together, these findings established fluorescent aptamer-based tRNA labeling as a generalizable tracking platform for studying the biodistribution and cell type-specific localization of tRNA-based therapeutics.

Therapeutic efficacy of chemically modified sup-tRNAs in CF disease models

We next assessed the therapeutic efficacy of our chemically modified sup-tRNAs in CF disease models. First, we treated 16-HBEge (HBE) cells carrying the CFTR G542X variant with tGM6 (Fig. 5A) but observed only moderate CFTR protein restoration. Given the superior read-through efficiency of tRM6 in the NLuc_PTC reporter systems (Fig. 2D), we thus tested tRM6 for CFTR restoration in HBE G542X cells. Although tRM6 introduces arginine rather than glycine at the PTC site, previous studies indicated that CFTR G542R remains functional (17, 65). Immunoblot analysis confirmed better CFTR restoration with tRM6 compared with tGM6 (Fig. 5, B and C), highlighting the dependency on high sup-tRNA readthrough efficiency to achieve the desired therapeutic outcome.

Next, we extended our investigation to HBE cells with the R1162X CFTR variant, where tRM6 robustly restored CFTR protein (Fig. 5, D and E, and fig. S19) and maintained substantial CFTR levels beyond 40 days after treatment (fig. S20). Functional validation, using a fluorescence-based assay of membrane potential changes (FLIPR) (66, 67), confirmed enhanced CFTR ion channel activity in tRM6-treated HBE R1162X cells (Fig. 5, F and G). To determine whether sup-tRNA-mediated CFTR expression was accompanied by broader cellular restoration, we performed RNA-seq on sup-tRNA-treated HBE R1162X cells and compared them with untreated R1162X and wild-type (WT) HBE cells. Sup-tRNA treatment increased CFTR transcript abundance to $>10\%$ of WT levels (figs. S21 and S22). Treatment-associated gene-expression changes were enriched for processes related to ion transport, extracellular organization, and epithelial homeostasis, partially overlapping with pathways that distinguished WT from untreated mutant cells (Fig. 5, H to J). Thus, sup-tRNA-mediated rescue of CFTR expression and function was associated with a broader shift toward restoring healthy gene expression.

We also examined potential off-target readthrough at canonical stop codons. Ribosome profiling of sup-tRNA-treated HBE R1162X cells showed that ribosome occupancy remained concentrated within coding regions, with low 3' untranslated region (3'UTR) signal downstream of annotated canonical stop codons and no global increase relative to untreated cells (fig. S23). Minimal off-target readthrough was evident both transcriptome-wide and at the endogenous CFTR transcript. This selectivity likely arose from the distinct sequence context of canonical stop codons and PTCs: Native stop codons reside within a 3'UTR/poly(A)-associated messenger ribonucleoprotein (mRNP) context in which poly(A)-binding protein (PABP) functionally cooperates with eRF1/eRF3-guanosine 5'-triphosphate (GTP) to accelerate termination, allowing release factors to efficiently outcompete sup-tRNAs (68). By contrast, PTCs occur within coding regions and are more distant from poly(A)-bounded PABP, which makes them more permissive to sup-tRNA-mediated decoding.

Next, we assessed the pulmonary and systemic safety of intratracheal LNP-sup-tRNA administration in mice. BALF and serum cytokine profiling showed a transient, dose-dependent inflammatory response at day 1, most evident at 5 and $10\mathrm{mg / kg}$ , whereas 1- and $3\mathrm{-mg}/$ kg-treated groups remained near phosphate-buffered saline (PBS) controls; in all groups, cytokine levels largely returned to baseline by day 14 (fig. S24). Lung histopathology, BALF complement activation,

B

C

D

F

E

G

Fig. 4. Aptamer-based visualization reveals epithelial tropism of TTP-3 LNP-delivered sup-tRNAs in vivo. (A) Schematic illustration of sup-tRNA modified by fusing a Mango II aptamer to its variable loop. The aptamer specifically binds to thiazole orange (TO)-biotin, generating a fluorescent signal suitable for tracking sup-tRNA biodistribution in vivo. (B) Intratracheal dosing and analysis workflow for delivering tRNA_Aptamer encapsulated within LNPs into mouse lungs with three doses at $1\mathrm{mg / kg}$ . (C and D) Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plots (C) and corresponding pie charts (D) to describe the identity and percentage of tRNA_Aptamer-positive cells in mouse lungs after delivery by TTP-3 or MC3 LNP formulations. $n = 3$ biological replicates. Data in the pie charts are shown as means. (E) Representative flow cytometry histograms and corresponding quantitative analysis comparing the distribution of tRNA_Aptamer-positive cells within epithelial, endothelial, and immune cell populations in mouse lungs. $n = 3$ biological replicates. (F) Gating schemes of flow cytometry experiments showing representative quantifications of tRNA_Aptamer-positive percentages within epithelial cell subsets, including ciliated cells (acetylated tubulin+), club cells $(\mathrm{CCSP + })$ , and basal cells $(\mathrm{KRT5 + })$ . $n = 3$ biological replicates. (G) Representative immunofluorescence imaging of lung sections demonstrating tRNA_Aptamer localization in epithelial subsets in small airways and bronchi. Scale bars, $500~{\mu\mathrm{m}}$ (whole-lung overview) and $100~{\mu\mathrm{m}}$ (small-airway and bronchial images). Data are means $\pm$ SDs. $P$ values were calculated by one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test in (E) and two-tailed unpaired Student's $t$ test in (F).

A

E

C

H HBE R1162X Treated/Untreated

J
HBE CFTR Wildtype/R1162X (Untreated)

K CFTR R553X Mouse Model

L

M

N

0

P

R
CF Patient-derived Intestinal Organoids

Q

Fig. 5. Therapeutic efficacy of sup-tRNAs in cellular, mouse, and patient-derived CF models. (A) Treatment schematic for CFTR-mutant HBE cells. (B to E) Immunoblot and densitometric quantification of CFTR restoration in HBE G542X [(B) and (C)] and HBE R1162X [(D) and (E)] cells after treatment. (F and G) Representative FLIPR traces and quantification of forskolin-stimulated CFTR activity in HBE R1162X cells. (H to J) Poly(A)-RNA-seq analysis. [(H) and (I)] Treated versus untreated HBE R1162X cells. (J) Untreated WT HBE cells versus untreated HBE R1162X cells. In the volcano plot (H), vertical dashed lines depict a twofold change, and horizontal dashed lines indicate adjusted

P < 0.05. Hierarchical clustering and gene ontology enrichment of differentially expressed genes. (K and L) Intratracheal dosing scheme in CFTR R553X mice and lung CFTR mRNA expression after treatment. (M) Experimental workflow illustrating ex vivo rescue of CFTR function in intestinal organoids derived from R553X homozygous CF mice. (N and O) Representative brightfield and calcein-AM fluorescence images. Quantification of normalized intestinal organoid swelling (n = 5). Scale bars for uncropped images, 1 mm. (P) Workflow for establishing intestinal organoids from a CF patient with complex CFTR mutations and their functionality assessment by Ussing chamber. (Q) Representative electrophysiological voltage traces from Ussing chamber assays of patient-derived intestinal organoids treated with DMSO (control), G418, Trikafta, LNP-sup-tRNA, or a combination of LNP-sup-tRNA and Trikafta. (R) Quantification of CFTR-mediated ion transport responses as reported by Ussing chamber assays. Data are means ± SDs. For quantifications in (C), (E), (G), and (L), n = 3 biological replicates; P values were calculated by one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparison test versus the indicated controls. In (R), n = 3 or 4 replicates from independently prepared organoid-derived monolayers from one CF participant; P values were calculated by one-way ANOVA with Tukey's multiple-comparison test for indicated pairwise comparisons. ns, not significant.

and immune-cell profiling showed a similar pattern, with acute inflammation and leukocyte recruitment peaking early after the administration of higher doses and substantial resolution by day 14 (fig. S25). Serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were unchanged across groups, indicating no detectable hepatotoxicity. Together, this supported the tolerability of LNP-sup-tRNA at therapeutic doses, with limited systemic toxicity and transient, dose-dependent pulmonary inflammation.

We then evaluated therapeutic efficacy in vivo using a CFTR R553X mouse model (62). Mice received three intratracheal doses of LNP-sup-tRNA treatment. Lung tissues collected 2 days after the final treatment showed that the combination of tRM6 and TTP-3 produced the greatest increase in CFTR mRNA, whereas unmodified tRT6- or MC3-based comparison groups showed weaker rescue (Fig. 5, K and L). Because CF mouse models lack overt lung pathology (69), we assessed CFTR functional rescue in intestinal organoids derived from R553X mice (Fig. 5M) (70). CFTR activity was assayed through forskolin-induced swelling (FIS), where CFTR-mediated ion and water influx into the organoid lumen was highest after tRM6-TTP-3 treatment and lower in groups with unmodified sup-tRNA or nonoptimized LNPs (Fig. 5, N and O, and fig. S26). The combination of optimally modified tRM6, which enhanced intrinsic PTC readthrough, and the sup-tRNA-tailored TTP-3 LNP, which improved delivery of the RNA cargo, led to the most promising results.

Furthermore, we tested the therapeutic efficacy of sup-tRNAs in organoids derived from a CF patient with complex CFTR mutations (S466X/R1070Q/R553X/1716G/A) (Fig. 5P). This variant encompasses multiple classes of CFTR defects, including two nonsense mutations, one missense mutation, and one polymorphism, representing a particularly challenging clinical scenario for therapeutic intervention. The clinically approved CFTR modulator (Trikafta) and the readthrough inducing aminoglycoside G418 were included for comparison. tRM6 and serine sup-tRNA (tSA2T5) (21) were used to suppress the nonsense mutations. Ussing chamber measurements showed that neither G418 nor Trikafta alone effectively restored CFTR functionality in patient organoids (Fig. 5Q). These results were consistent with clinical observations where CF patients lacking sufficient full-length CFTR protein production did not benefit from existing CFTR modulators. Class I nonsense mutations reduce or abolish full-length CFTR production, restricting Trikafta-mediated correction and potentiation. Notably, combining LNP-sup-tRNAs with Trikafta led to a significant increase in CFTR function (Fig. 5R). Whereas LNP-sup-tRNAs alone produced only a modest, nonsignificant increase relative to untreated controls, the combination therapy made use of complementary rescue mechanisms: sup-tRNAs restored full-length CFTR protein synthesis, allowing Trikafta to support folding, trafficking, and/or channel activity of the restored protein. This finding showcased a promising complementary therapeutic approach and highlighted the importance of combining therapies to rescue complex CFTR genotypes.

Discussion

Sup-tRNAs offer a compelling RNA-level strategy for treating diseases caused by nonsense mutations by promoting PTC readthrough without altering the genome (71, 72). Unlike gene-editing approaches, sup-tRNAs are reversible and avoid permanent genomic changes, thereby reducing concerns related to unintended off-target editing or germline transmission, and they do not require gene-specific guide RNA (gRNA) optimization. Although mRNA-mediated protein replacement is mutation agnostic within a given gene, sup-tRNA therapy offers distinctive advantages, including restoration of endogenous gene expression, prolonged functional persistence, and broad applicability across diseases, while circumventing side effects from elevated protein levels. Notably, a single sup-tRNA can potentially target the same nonsense mutation across multiple disease-causing genes. For example, arginine-to-UGA nonsense mutations account for $\sim 24\%$ of all known pathogenic PTCs (1, 73), which suggests that a single arginine sup-tRNA could be applied to a wide range of genetic disorders. These features make sup-tRNAs particularly attractive when restoration of native, full-length protein from endogenous transcripts is desired.

In this study, we demonstrated that the site-specific chemical modification substantially improved the therapeutic and safety profiles of sup-tRNAs relative to unmodified sup-tRNAs. When delivered using a tailored, pulmonary-optimized LNP system, these modified sup-tRNAs restored CFTR expression and function across multiple CF disease models, supporting their use for therapeutic nonsense-mutation readthrough. Notably, in a patient-derived organoid model with a complex genotype, cotreatment with modified sup-tRNAs and Trikafta enabled functional rescue of CFTR. In this setting, sup-tRNAs suppressed the nonsense mutations to restore full-length CFTR synthesis, whereas Trikafta supported the folding, trafficking, and activity of CFTR. This complementarity is clinically relevant because CFTR modulators, including Trikafta, require modulator-responsive, full-length CFTR protein to act on, which limits their use for class I nonsense-dominated or complex genotypes. Notably, this study focused on a single CF participant, and it should thus be interpreted as a proof of principle; additional testing in patient-derived models with different genotypes will be needed to support the generalizability of this combination strategy. Nevertheless, these findings support the idea that modified sup-tRNAs could restore full-length CFTR expression for subsequent pharmacological modulation, highlighting the potential of genotype-informed combination therapies for patients underserved by current CFTR therapies. To enable tRNA production at scale, chemically modified sup-tRNAs can be accessed through solid-phase synthesis, enabling control over 5' termini and site-specific modifications. Other approaches, such as in vitro transcription followed by enzymatic modification (74), may further enhance scalability and cost-effectiveness. These manufacturing strategies could support scalable production of modified tRNAs and benefit the broader development of tRNA-based therapeutics.

Through systematic investigation of site-specific RNA modifications, this study offers mechanistic insights into how distinct modifications influence the therapeutic performance of sup-tRNAs. These findings highlight the importance of preserving the native tRNA structure and support structure-informed engineering as a guiding principle for sup-tRNA optimization $(75, 76)$ . Although RNA modifications are increasingly recognized as regulators of cellular, developmental, and disease processes (77, 78), their potential for therapeutic tRNAs has not been fully explored. A limitation of this study is that only a defined subset of modifications was tested. Ongoing investigation into additional RNA modifications, aided by advances in RNA-seq and chemical synthesis, should reveal other modification patterns that enhance efficacy and broaden the therapeutic scope of tRNA-based technologies (79, 80). Additionally, although some modifications may have broad utility across multiple tRNA scaffolds, optimal designs may depend on sequence context, amino acid identity, and disease setting. Clinical translation will also require efficient cell- and/or tissue-specific delivery, support for repeated dosing, and minimizing off-target exposure. Advances in both tRNA engineering and delivery may extend tRNA-based therapeutics beyond nonsense suppression to additional genetic alterations, including missense and frameshift mutations, as well as emerging applications in translational control and tRNA fragment-mediated regulatory pathways (81, 82), helping to lay the foundation for the next generation of tRNA therapeutics.

Materials and methods tRNA synthesis

Chemically modified sup-tRNAs were synthesized by GenScript using solid-phase RNA oligonucleotide synthesis, incorporating a 5' monophosphate end and specific RNA modifications as required, followed by RNase-free HPLC purification. Unmodified tRNAs were generated through in vitro transcription (IVT). Sequences are available in table S1 (14, 21). For IVT, DNA oligonucleotides encoding the desired tRNA sequences were purchased from IDT (Integrated DNA Technologies). These DNA templates were amplified using polymerase chain reaction (PCR) using Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, no. M0531S). Amplified DNA products served as templates for IVT performed with the HiScribe T7 RNA Synthesis Kit (NEB, no. E2040), with addition of guanosine monophosphate (GMP) to a final concentration of 1.8 mM to ensure a 5' monophosphate end. The IVT reaction was incubated at 37°C for 16 hours. IVT products were purified by gel extraction. Specifically, the RNA bands corresponding to the desired length were excised from 10% TBE-Urea gels (Bio-Rad, no. 4566033) with yeast tRNA (Invitrogen, no. 15401011) as a molecular size marker (fig. S1). The excised gel slices were incubated overnight at 37°C in a low-pH buffer (20 mM Tris, 200 mM sodium acetate, 5 mM EDTA, pH 5.0). After overnight incubation, RNA was precipitated by adding sodium acetate to a final concentration of 300 mM, followed by 2.5 volumes of ice-cold 100% ethanol. The samples were mixed thoroughly and stored at -80°C for 1 hour. RNA pellets were then collected by centrifugation, washed once with 70% ethanol, air-dried, and resuspended in ultrapure water. To properly fold the tRNAs, the samples were initially denatured at 80°C in a thermocycler and then gradually cooled to 65°C at a rate of 0.1°C/s. At 65°C, MgCl₂ was added to achieve a final concentration of 10 mM. Samples were gently mixed and allowed to cool slowly at the same controlled rate (0.1°C/s) in a thermocycler to room temperature, facilitating RNA folding.

NLuc_PTC reporter cell line construction

The opal stop codon TGA was introduced at amino acid position 160 of NanoLuc (NLuc) (14) within the pB-EF1a-Nluc-IRES-Puro plasmid (Addgene no. 130936), generating the pB-EF1a-Nluc V160X-IRES-Puro (PB_PTC_Nluc) construct. This construct was transformed into NEB 10-beta Competent Escherichia coli cells (NEB, no. C3019), and glycerol stocks were stored at $-80^{\circ}\mathrm{C}$ for future use. Plasmids used in subsequent experiments and mammalian assays were purified using the PureYield Plasmid Miniprep System (Promega, no. A1222), which includes an endotoxin removal step. Antibiotics required for plasmid maintenance and experimental selection were obtained from InvivoGen. To establish the reporter cell line, BEAS-2B cells were seeded into a 6-well plate at a density of $1\times 10^{6}$ cells per well. Cells were transfected using FuGENE 6 transfection reagent at a ratio of $3\mu l$ reagent per 1 $\mu$ g DNA, following the manufacturer's protocol. Each transfection contained 0.2 $\mu$ g of super PiggyBac transposase vector (System Biosciences) and 0.6 $\mu$ g of PB_PTC_Nluc plasmid DNA. Three days posttransfection, culture media were replaced with fresh media supplemented with 2 $\mu$ g/ml puromycin (InvivoGen, no. 58-58-2) to select for transfected cells. After a 24-hour incubation, cells were washed twice with PBS and provided with fresh culture media. The surviving puromycin-resistant cells were termed NLuc_PTC BEAS-2B reporter cells. To test tRNA-induced readthrough and in vitro kinetics study of sup-tRNA variants, these NLuc_PTC reporter cells were transfected using Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen, no. LMRNA008).

Cell culture

Human lung epithelial (BEAS-2B) cells and HBE (16HBE14o-) cells were a gift from J. Hu. CFF-16HBEge CFTR G542X and CFF-16HBEge CFTR R1162X cells were kindly provided by H. Valley and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics Lab. All epithelial cells were maintained in Eagle's minimum essential medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco). THP-1 Dual cells (human monocytes) were purchased from InvivoGen (no. thpd-nfis). THP-1 dual reporter cells were maintained in RPMI 1640 (Gibco), 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES, 10% heat-inactivated FBS (Gibco), 100 $\mu$ g/ml Normocin (InvivoGen, no. ant-nr-1), and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco). Cells were grown in a humidified incubator containing 5% CO $_{2}$ at 37°C. All cell lines included in this study were routinely monitored for mycoplasma contamination using mycoplasma PCR detection and consistently found negative.

Immunogenicity reporter assay

THP-1 dual-reporter cells were seeded into a U-bottom 96-well plate at a density of $1 \times 10^{5}$ cells per well. To evaluate the immunogenicity of tRNA variants, cells were treated with either LNP-encapsulated sup-tRNA or an empty LNP control. After 24 hours of incubation at $37^{\circ}\mathrm{C}$ , $20~\mu \mathrm{l}$ of cell supernatant was mixed with $180~\mu \mathrm{l}$ of QUANTI-Blue reagent (InvivoGen, no. rep-qbs) and incubated for 1 hour. The optical density (OD) at $630~\mathrm{nm}$ was measured using a Cytation 1 Cell Imaging Multimode Reader (BioTek) to quantify SEAP activity, indicative of NF- $\kappa$ B pathway activation. Simultaneously, another $20~\mu \mathrm{l}$ of the supernatant was combined with $50~\mu \mathrm{l}$ of QUANTI-Luc reagent (InvivoGen, no. rep-qlc1) in a white opaque plate, and luminescence was measured using the same Cytation 1 plate reader. Luminescence values were reported as relative luminescence units (RLUs) and correspond to IRF pathway activation.

Acid-urea polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for in vitro aminoacylation assay

Aminoacylation reactions using 2 $\mu$ g tRNA were performed with 100 mM Hepes (pH 7.5), 20 mM KCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM MgCl $_{2}$ , 1 mM adenosine 5'-triphosphate (ATP), and 2 $\mu$ M purified recombinant human GARS1. tRNAs were aminoacylated at 37°C for 30 min and samples were then mixed with 2× acidic RNA loading dye (8 M urea, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol FF, and 0.1 M NaOAc, pH 5). Charged and uncharged tRNA were separated by a 20 cm acidic denaturing PAGE [4% stacking and 6.5% running (19:1) acrylamide:bisacrylamide, 8 M urea, and 0.1 M NaOAc, pH 5] at 4°C. tRNAs were then visualized with SYBR Green II RNA Gel Stain (Invitrogen, no. S7564).

Radiolabeled aminoacylation assay

Samples containing 100 mM Hepes (pH 7.5), 20 mM KCl, 2 mM DTT, 10 mM MgCl $_{2}$ , 1 mM ATP, 20 $\mu$ M L-arginine, 5 $\mu$ M L-[3H] arginine and 5 $\mu$ M tRNA were initiated with 4 $\mu$ M purified recombinant human RARS1 and incubated at 37°C. Aliquots were removed at specified time points and quenched into filter plates containing 0.5 mg/ml sheared DNA and 100 mM EDTA in 300 mM NaOAc (pH 3). tRNA was then precipitated using 20% cold trichloroacetic acid and washed four times with a cold solution of 5% trichloroacetic acid and 100 mM L-Arginine. The filter plates were then dried after a rinse with 95% ethanol. Aminoacyl-tRNAs were hydrolyzed with 0.1 M NaOH to release radiolabeled amino acids, which were spun into white 96-well plates with OptiPhase HiSafe 3 (Revvity) for scintillation counting on a Hidex Sense Beta Plus Microplate Reader $(83)$ .

Kinetics study

For the in vitro kinetics study, reporter cells were seeded at a density of $2 \times 10^{4}$ cells per well in 96-well plates. After 24 hours (designated day 0), cells were transfected with 500 ng of either unmodified or chemically modified sup-tRNA using Lipofectamine MessengerMAX (Invitrogen, no. LMRNA008). Twenty-four hours after transfection, the medium in all wells was replaced with fresh culture medium to remove residual Lipofectamine reagent. At the indicated time points, luminescence was measured from four wells per condition using the Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega, no. N1120) on a Cytation 1 plate reader (BioTek). Luminescence values were normalized to untreated control wells at each time point.

For the in vivo kinetics studies, LumA-PTC mice ( $\sim$ 4 weeks old) were administered with SM-102 LNP-encapsulated unmodified or modified sup-tRNA via tail vein injection at a dose of 1.25 mg/kg. SM-102 LNPs were selected for their liver-targeting properties and were formulated with ionizable lipid/DSPC/cholesterol/PEG-lipid at a molar ratio of 50/10/38.5/1.5. At the indicated time points, mice were injected intraperitoneally with 0.2 ml D-luciferin solution (10 mg/ml in DPBS; PerkinElmer). For whole-body luminescence imaging, the same batch of mice (without sacrificing) were anesthetized with 2.5% isoflurane in oxygen and imaged 10 min after luciferin injection. Luminescence signals from the liver region were acquired and quantified using an in vivo imaging system (IVIS) (PerkinElmer).

tRNA-seq library preparation and analysis

tRNA-seq was performed on 16HBEge cells expressing CFTR R1162X under three conditions in three biological replicates: untreated, treated with modified sup-tRNA (tRM6), or treated with unmodified sup-tRNA (tRT6). Cells were seeded in 6-well plates at a density of $1.5 \times 10^{6}$ cells per well. Twenty-four hours after seeding (day 0), cells in the treatment groups received either tRM6 or tRT6 at $2\mu \mathrm{g}$ per well. Untreated cells harvested on day 1 served as the negative control. Samples were collected on days 1, 7, 14, 21, and 35 for the tRM6-treated group, and on days 1, 14, and 35 for the tRT6-treated group. For collections beyond day 14, cells were passaged from the original 6-well plates into $100\mathrm{-mm}$ Petri dishes to prevent overconfluence-associated cell death. At each designated time point, cells were washed with cold PBS twice, and total RNA was extracted using TRIzol reagent (Invitrogen, no. 15596026). Small RNA-seq libraries were generated following the protocol described by a previous study (84), with minor modifications. Total RNA was isolated from all samples as described above, using $1\mu \mathrm{g}$ of total RNA per sample as input. To preserve the aminoacylation state, RNA was maintained under acidic conditions throughout the preparation. Total RNA underwent a one-pot periodate oxidation and $\beta$ -elimination reaction to selectively remove the terminal $3^{\prime}$ nucleotide from uncharged tRNAs. This was followed by $3^{\prime}$ end repair using T4 polynucleotide kinase (NEB). Subsequently, barcoded, biotinylated capture hairpin oligonucleotides were ligated to RNA $3^{\prime}$ ends using T4 RNA ligase I (NEB). Samples were then pooled and immobilized on streptavidin-coated MyOne C1 Dynabeads (ThermoFisher). All downstream processing steps were carried out on-bead, including dephosphorylation, reverse transcription with SuperScript IV VILO (ThermoFisher) under extended incubation conditions, RNase H digestion (NEB), periodate oxidation to inactivate unligated adapters, and second adapter ligation. Libraries were amplified by PCR using Q5 high-fidelity DNA polymerase, followed by size selection using $10\%$

Tris-borate-EDTA PAGE (Invitrogen) to remove terminal transferase by-products. DNA was then purified via gel extraction and ethanol precipitation. Final libraries were sequenced on the Illumina NovaSeq X platform using paired-end sequencing by the Centre for Applied Genomics at the Hospital for Sick Children. Data analysis was performed as described in a previous study $(85)$ , with computational support from the Trillium high-performance computing cluster operated by the University of Toronto and Compute Canada. Briefly, paired-end reads were merged and aligned to human tRNA reference sequences using Bowtie2 $(86)$ . Reads at each nucleotide position were quantified using the pileup function in Samtools $(87)$ , and tRNA-level read counts were determined using Pysam as previously described $(85)$ . Differential expression analysis was conducted using DESeq2 $(88)$ . Modifications were called as the percentage of mismatches and terminations at the position of interest and were quantified from Samtools pileup files using RStudio. Aminoacylation levels were determined through counts of intact CCA over the first C, with reads quantified from Samtools pileup files. All computational analyses were performed on the Trillium high-performance computing cluster (University of Toronto, Compute Canada) or using RStudio.

Ionizable lipid library synthesis

A library of 1000 ionizable lipids was synthesized using the Ugi four-component reaction (Ugi-4CR) using amine headgroups $(-NH_{2})$ , aldehyde linkers (-CHO), carboxylic acid tails (-COOH), and isocyanide tails (-NC). All reagents were purchased from Tokyo Chemical Industry (TCI) or Sigma-Aldrich. The isocyanide tails were purified using gradient chromatography with ethyl acetate and hexane, and their structures were confirmed by proton nuclear magnetic resonance ( $^{1}$ H NMR) spectroscopy in CDCl $_{3}$ . For high-throughput combinatorial screening, reaction components were individually dissolved in methanol and combined at a 1:1:1:1 molar ratio (amine:aldehyde:carboxylic acid:isocyanide) in 96-well PCR plates. The reaction was carried out overnight at room temperature in plates while continuously shaking. The final TTP-3 ionizable lipid was purified with a gradient of MeOH and DCM; lipid purity and identity were validated by 1H NMR spectrometry [1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.24 (m, 4H), 4.01 (d, $J$ = 2.6 Hz, 2H), 3.68 (s, 1H), 3.39 (s, 1H), 3.23 (s, 1H), 3.04 (s, 1H), 2.73 (d, $J$ = 3.5 Hz, 2H), 2.45 (d, $J$ = 16.8 Hz, 1H), 2.34 - 2.13 (m, 11H), 2.01 (dd, $J$ = 7.0, 2.9 Hz, 4H), 1.65 - 1.20 (m, 45H), 1.00 (d, $J$ = 3.2 Hz, 6H), 0.84 (dtd, $J$ = 7.3, 4.3, 2.2 Hz, 9H)].

Preparation of LNPs

For high-throughput screening, LNPs were formulated using an automated OT-2 liquid handling system (Opentrons). The process involved mixing an aqueous phase containing sup-tRNA in 10 mM citrate buffer (pH 4.0, Fisher) with an organic lipid phase at a volume ratio of 3:1 and an ionizable lipid-to-RNA mass ratio of 10:1. The organic phase comprised synthesized ionizable lipids mixed with helper lipids: DOPE (Avanti, no. 850725P), cholesterol (Sigma-Aldrich, no. C8667), and C14-PEG2000 (Avanti, no. 880150P), dissolved in ethanol at a molar ratio of 35:16:46.5:2.5. For in vivo applications, LNPs were produced by mixing aqueous sup-tRNA solutions with the organic lipid phase using a T-junction device operated with syringe pumps at a minimum volume of 300 $\mu$ l. Subsequently, the LNP suspensions were dialyzed against PBS overnight at 4°C using 100 kDa MWCO dialysis cassettes (Spectra/Por, ThermoFisher, no. 132670). Postdialysis, LNPs were concentrated by centrifugation in 100 kDa MWCO Amicon Ultra-0.5 centrifugal filters (Millipore, no. UFC510096). For optimized TTP-3 LNP formulation, the organic phase was prepared by dissolving TTP-3 ionizable lipids with helper lipids: DOPE (Avanti, no. 850725P), $\beta$ -sitosterol (ApexBio, no. B6199), and C14-PEG2000 (Avanti, no. 880150P) in ethanol at a molar ratio of 60:10:27.5:2.5. The aqueous phase containing sup-tRNA in 10 mM citrate buffer (pH 4.0) was mixed with the organic phase at a 3:1 volume ratio, maintaining an ionizable lipid-to-tRNA mass ratio of 13.5:1. In the formulation optimization study, additional helper lipids evaluated included DSPC (Avanti, no. 850365P) and DOTAP (Avanti, no. 890890P). Sterol lipids tested comprised cholesterol (Sigma-Aldrich, no. C8667) and $\beta$ -sitosterol (ApexBio, no. B6199).

ALI culture

Preparation of ALI cultures using BEAS-2B cells followed the STEMCELL Technologies protocol. Briefly, BEAS-2B cells were first enzymatically detached using 0.05% trypsin-EDTA (Thermo Fisher Scientific) from the culture flask and seeded onto the apical side of PET Transwell inserts (0.4 $\mu$ m pore size, 6.5 mm diameter; Corning, no. 3470) in 24-well plates at a density of $2.0 \times 10^{4}$ cells/cm $^{2}$ . Initially, PneumaCult complete base medium (STEMCELL Technologies, no. 05001) was added at volumes of 0.2 ml to the apical compartment and 0.5 ml to the basal compartment. Upon reaching confluency, cultures were transitioned to ALI conditions by removing the apical medium and supplying PneumaCult maintenance medium (STEMCELL Technologies, no. 05001) exclusively to the basal compartment, with medium changes every 2 days. After 28 days under ALI conditions, cells were prepared for LNP transfection. 5 $\mu$ l of artificial sputum medium (Biochemazone, no. BZ316) was applied to the surface of differentiated cultures to mimic airway mucus before LNP transfection.

LNP formulation optimization

A DoE approach was used to optimize key formulation parameters known to affect LNP transfection efficiency, as measured by sup-tRNA readthrough activity. Seven independent variables were systematically evaluated: (i) ionizable lipid-to-tRNA mass ratio (7.5 to 20), (ii) ionizable lipid molar ratio (30 to 60%), (iii) helper lipid type (DSPC, DOPE, DOTAP), (iv) helper lipid molar ratio (10 to 30%), (v) sterol lipid type (cholesterol, β-sitosterol), (vi) sterol lipid molar ratio (7.5 to 59.5%), and (vii) PEGylated lipid molar ratio (0.5 to 2.5%). A total of 38 distinct formulations were generated by the JMP 17.0 software (SAS Institute), encompassing a diverse range of parameter combinations to enable robust statistical analysis. Each formulation was tested for sup-tRNA delivery efficiency, and the obtained results were subsequently input into JMP for further statistical modeling and analysis. This process identified the formulation exhibiting optimal performance based on statistically significant differences. Detailed formulations and analysis outcomes are summarized in table S2. All RNA doses used in the main experiments are summarized in table S3.

Animal experiments

All animal studies were reviewed, approved, and performed in accordance with guidelines established by the University Health Network Animal Resources Centre (ARC), under the approved animal use protocol AUP6856. C57BL/6 mice aged 4 to 8 weeks were purchased from the Jackson Laboratory. Breeding pairs of homozygous C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sor $^{em1Crx}$ /J (LumA-PTC) mice were obtained from the Jackson Laboratory (no. 038165), and colonies were maintained at ARC. Additionally, breeding pairs of heterozygous Cftrem9Cwr (human exon 12 replacement-R553X) mice were generously provided by C. A. Hodges from the Cystic Fibrosis Mouse Resource Center, Case Western Reserve University. These colonies were subsequently expanded and maintained at ARC.

Nebulization of LNPs

To evaluate the impact of nebulization on LNP-sup-tRNA formulations, an Aeroneb Lab Control Module with a laboratory nebulizer unit (Aerogen, no. NEB-0801) was used as previously described $(56, 57)$ . LNP solutions $(150 \mu l)$ , dialyzed against DPBS overnight at $4^{\circ}C$ using 100 kDa MWCO dialysis cassettes (Spectra/Por, Thermo Fisher, no. 132670), were subjected to nebulization. The generated aerosol was collected by condensation into 1.5 ml microcentrifuge tubes, allowing recovery of LNPs in liquid phase for downstream analysis. Collected nebulized LNPs were applied to BEAS-2B reporter cells under standard culture conditions. Pre- and postnebulized formulations were prepared using the same initial LNP composition. Total and encapsulated RNA concentrations were quantified using a RiboGreen assay. Briefly, total RNA was measured after disruption of LNPs with Triton X-100, and encapsulated RNA was determined from intact particles. These measurements were used to estimate RNA recovery and guide dosing in subsequent cell-based assays.

LNP characterization

Hydrodynamic diameter and polydispersity index (PDI) were measured by dynamic light scattering (DLS) and reported as the intensity-weighted Z-average diameter and PDI using a Malvern Zetasizer. Zeta potential measurements were conducted at 1 ng/μl LNP concentration in DPBS using Malvern Zetasizer. Encapsulation efficiency (EE) was assessed via a RiboGreen Assay as previously described (49). Briefly, LNP samples were either lysed with 10% Triton X-100 in TE buffer at 37°C for 30 min or diluted directly in TE buffer without lysis. Each sample (100 μl) was combined with an equal volume of RiboGreen reagent (1:200 dilution) in a 96-well plate and incubated for 5 min at room temperature in the dark. Fluorescence intensity (excitation/emission: 485/528 nm) was measured using a Cytation 1 plate reader (BioTek). Standard curves generated from known RNA concentrations in TE and TE/Triton-X100 buffers were used to quantify free and total RNA. Encapsulation efficiency was calculated as: EE% = (Conc. total RNA - Conc. free RNA)/Conc. total RNA × 100%.

LNP diffusivity assay

Microchannels of Ibidi $\mu$ -Slide VI 0.4 (Ibidi no. 80601) were filled with 40 $\mu$ l of artificial mucus, followed by the addition of DiI-labeled (Invitrogen, no. D282) LNPs encapsulating sup-tRNA. LNP diffusion within the mucus matrix was imaged after 1 hour using a Zeiss Axio Imager microscope. Diffusion across the channel was semiquantified by measuring fluorescence intensity along the microchannel.

Aptamer-incorporated tRNA

RNA Mango II aptamer (gaaggagaggagaggaagaggaga) without the clamping region was inserted into the variable loop of the sup-tRNA to build tRNA_Aptamer. The preservation of the tRNA structure despite the inserted aptamer and isotype-specific model scores were confirmed by tRNAscan-SE 2.0 (89, 90). The functional impact of aptamer insertion was assessed by measuring readthrough activity in NLuc_PTC reporter cells. Cell viability assays showed no increase in cytotoxicity associated with aptamer incorporation. Thus, the Mango II-modified sup-tRNA was used as a fluorescent tracking probe for in vivo biodistribution studies.

Single-cell suspension from mouse lungs

Mouse lungs (including the trachea) were harvested and placed in PBS containing 2% FBS. Lung tissues were minced into a homogeneous paste and transferred into 10 ml dissociation medium composed of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 300 U/ml collagenase IV and 100 U/ml deoxyribonuclease (DNase) I. Samples were incubated at $37^{\circ}$ C for 40 min on a shaking platform. After incubation, the tissue digest was passed through a 70 $\mu$ m nylon mesh strainer using the rubber end of a syringe plunger to create a single-cell suspension. The strainer was rinsed with an additional 10 ml of PBS with 2% FBS. Cells were then pelleted by centrifugation at 300g for 8 min. After aspirating the supernatant, the cell pellet was resuspended in 5 ml RBC lysis buffer (Invitrogen, no. 00433357) and incubated for 8 min at room temperature to lyse red blood cells. The reaction was quenched by adding 10 ml of PBS with 2% FBS, followed by centrifugation at 300g for 5 min. The resulting cell pellet, free of red blood cells, was resuspended in 5 ml of cell staining buffer and prepared for subsequent flow cytometry analysis.

Flow cytometry

Single-cell suspensions derived from mouse lungs were initially incubated with anti-CD16/32 antibody (BioLegend, no. 101302) for Fc receptor blocking. Subsequently, cells were stained on ice for 40 min with the following surface markers: Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326/Ep-CAM (BioLegend, no. 118210, 1:100), Brilliant Violet 421 anti-mouse CD45 (BioLegend, no. 147719, 1:150), PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 (BioLegend, no. 102524, 1:150), and Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend, no. 423106, 1:1000). After staining, cells were washed twice with PBS and fixed on ice for 50 min using Fix Buffer (BD Bioscience, no. 554714). Fixed cells were pelleted by centrifugation at 300g for 5 min and washed with Permeabilization Buffer (BD Bioscience, no. 554714). Cells designated for intracellular staining were incubated for 40 min with one of the following antibodies diluted in permeabilization buffer: acetylated alpha Tubulin antibody (6-11B-1) Alexa Fluor 647 (Santa Cruz, no. sc-23950, 1:150), CCSP antibody (B-6) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-390313, 1:150), or cytokeratin 5 antibody (RCK103) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-32721, 1:150), anti-mouse FOXI1 antibody Alexa Fluor 647 (Novus Biologicals, no. NBP2-70747). After incubation, cells were washed again with Permeabilization Buffer. Cells stained for cell-surface markers were resuspended in PKM buffer (10 mM sodium phosphate, 140 mM KCl, 1 mM MgCl₂) supplemented with TO3-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G959, 1:100). For intracellular marker analysis, cells were resuspended in PKM buffer containing either TO1-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G955, 1:100) or TO3-3PEG-Biotin, selected to avoid spectral overlap with the antibody fluorophore used in each panel. AF488-conjugated antibodies (CCSP and KRT5) were paired with TO3, whereas AF647-conjugated antibodies (acetylated α-tubulin and FOXI1) were paired with TO1: TO1-3PEG-Biotin with mango aptamer (ex/em: 510/535) and TO3-3PEG-Biotin with mango aptamer (ex/em: 615/658). Cells were incubated for 30 min, washed, and resuspended in PBS for flow cytometric analysis (91). Experiments were performed with appropriate compensation using single-color controls, and signals were collected using distinct detector settings on the flow cytometer. Data acquisition was performed on a CytoFlex S flow cytometer, and analyses were conducted using FlowJo 10.10.0 software. All antibodies used in this study are listed in table S4.

Immunofluorescence staining

Mouse lungs were washed with PBS, fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) for 24 hours, and dehydrated in 30% sucrose solution for 48 hours. The tissues were embedded in OCT, frozen, and sectioned at 10 $\mu$ m thickness using a Leica CM3050S cryostat. Sections were mounted on charged slides, washed with PBS, blocked, and permeabilized using blocking buffer [PBS containing 5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% Triton X-100] for 1 hour at room temperature. Sections were incubated overnight at 4°C with one of two antibody combinations: acetylated alpha Tubulin Antibody (6-11B-1) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-23950, 1:100) and CCSP antibody (B-6) Alexa Fluor 647 (Santa Cruz, no. sc-39031, 1:100), or CCSP antibody (B-6) Alexa Fluor 488 (Santa Cruz, no. sc-39031, 1:100) and cytokeratin 5 Antibody (RCK103) Alexa Fluor 594 (Santa Cruz, no. sc-32721, 1:100). After antibody staining, slides were washed three times with PBS and incubated with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Roche, no. 10236276001, 1:1000) for 20 min at room temperature. After another PBS wash, sections were incubated with PKM buffer (10 mM sodium phosphate, 140 mM KCl, 1 mM MgCl $_{2}$ ) containing either TO1-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G955, 1:100) or TO3-3PEG-Biotin (Applied Biological Materials, no. G959, 1:100) for 30 min at room temperature, followed by a final PBS wash. Upon binding to the Mango aptamer, TO1-3PEG-Biotin and TO3-3PEG-Biotin exhibited fluorescence with excitation/emission maxima of 510/535 nm and 615/658 nm, respectively. Slides were mounted with mounting medium (Epredia, no. 4I12) and imaged using a Leica Stellaris 5 Confocal microscope (AOMF, UHN).

Immunoblot

16HBEge cells, with different CFTR mutations or 16HBE14o-WT CFTR, were seeded in 6-well plates at density of $1.0 \times 10^{6}$ cells per well for sup-tRNA treatment with three dosages in total (1.25 $\mu$ g per well) administered every other day. One day after the last dosage, cells were washed with PBS and lysed using 1× RIPA buffer (Cell Signaling, no. 9806) supplemented with protease inhibitors (Roche, no. 04693159001) at 4°C for 30 min with gentle agitation. Lysates were clarified by centrifugation at 12,000g for 20 min at 4°C, and protein concentrations were determined using a Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, no. 23227). Normalized protein lysates, mixed 1:1 with 4× Laemmli sample buffer (Bio-Rad, no. 1610747), were separated on 4 to 15% Mini-PROTEAN TGX precast gels (Bio-Rad, no. 4561084) alongside a PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (10 to 250 kDa, Thermo Fisher Scientific, no. 26619). Proteins were transferred on nitrocellulose membranes using the Bio-Rad TransBlot Turbo system. Membranes were blocked overnight at 4°C with EveryBlot blocking buffer (Bio-Rad, no. 12010020) and incubated overnight at 4°C with monoclonal CFTR-NBD2 antibody (UNC, no. 596, 1:2000). After washing with TBS-T, membranes were incubated with HRP-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (BioLegend, no. 405306, 1:5000) for 45 min at room temperature. After additional washing, membranes were developed for imaging. Membranes were subsequently reprobed with anti-GAPDH antibody (BioLegend, no. 649202, 1:1000) for 1 hour at room temperature, followed by incubation with the same secondary antibody. Immunoblot signals were quantified using ImageJ software.

RNA-seq and analysis

RNA-seq was performed on three experimental groups: untreated 16HBEge cells expressing CFTR R1162X (untreated), 16HBEge cells expressing CFTR R1162X treated with tRM6 (treated), and WT CFTR 16HBE14o- cells (WT). Cells were seeded in 6-well plates at a density of $1.5 \times 10^{6}$ cells per well. The treated group received three doses of sup-tRNA (1.25 $\mu$ g per well), administered every other day. One day after the final treatment, cells were washed with PBS, and total RNA was extracted using TRIzol reagent (Invitrogen, no. 15596026), followed by isopropanol precipitation. Poly(A) $^{+}$ RNA was enriched from total RNA using the NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, no. E7490S) according to the manufacturer's instructions. RNA-seq libraries were constructed using the NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, no. E7770S), incorporating USER enzyme (NEB, no. M5505S) during adaptor ligation to open the hairpin-loop structure. Sequencing was performed at the Donnelly Sequencing Centre in Toronto on a Novaseq6000 SP 200c at >35 million reads per sample and 100 nucleotide (nt) read length. Data analysis was enabled by computational infrastructure provided by Compute Ontario, SciNet, and the Digital Research Alliance of Canada. In brief, reads were trimmed and quality controlled with Trimgalore, aligned against GRCh38 with STAR aligner (92), and differentially expressed mRNAs were determined with DESeq2 (88), version 1.38.3. Gene ontology (GO) analysis and molecular pathway enrichment were conducted using ShinyGO 0.82 (South Dakota State University) (93).

Ribosome profiling library preparation and analysis

Ribosome profiling libraries were prepared using the QEZ-seq kit (EzraBio, no. 2603001-6) according to the manufacturer's instructions (94). 16HBEge cells expressing CFTR R1162X were analyzed in two experimental groups: untreated or treated with modified sup-tRNA (tRM6), with three biological replicates per group. Cells were seeded in 6-well plates at a density of $1.5 \times 10^{6}$ cells per well. Twenty-four hours after seeding, cells in the treatment group received sup-tRNA dosing at $2\mu \mathrm{g}$ per well. Untreated and sup-tRNA-treated cells were harvested 24 hours after the treatment. At harvest, cells were rapidly cooled on ice and lysed in ice-cold ribosome-protected fragment (RPF) lysis buffer containing cycloheximide to stabilize translating ribosomes. Lysates were clarified by centrifugation, and ribosome-protected fragments were generated by nuclease digestion at 4°C according to the QEZ-seq workflow. After digestion, RNA was extracted using TRIzol LS reagent (Invitrogen) and ethanol precipitated. Ribosome-protected fragments were size selected by 15% denaturing PAGE, and fragments corresponding to monosomes (\~30 nt) were excised and purified. Size-selected RNA fragments were resuspended in nuclease-free water and quantified before library preparation. Library construction was performed using the QEZ-seq workflow. Briefly, RNA fragments were subjected to 3' adenylation followed by ligation of sequencing adapters. Adapter-ligated RNA was immobilized on streptavidin-coated magnetic beads and processed on-bead through reverse transcription using the supplied reverse transcription mixture under optimized incubation conditions. After cDNA synthesis, RNA was removed enzymatically, and libraries were amplified by PCR using barcoded primers provided in the kit. Amplified libraries were size selected (\~180 base pairs, corresponding to insert plus adapters) by 10% TBE-PAGE to remove by-products, followed by gel extraction and ethanol precipitation. Final libraries were sequenced on Illumina's NovaSeq X platform using paired-end sequencing at The Centre for Applied Genomics at the Hospital for Sick Children. Sequencing data were processed using a ribosome profiling analysis pipeline adapted from standard workflows (94). Paired-end reads were adapter-trimmed and filtered with Cutadapt (95) using parameters: -a AAAAAAAAA-AAAAAA and -g GGG for 3' and 5' trimming, respectively. A maximum error rate of 10% was allowed during adapter matching, and reads shorter than 15 nt were excluded from analysis. Trimmed reads were aligned to rRNA reference sequences using Bowtie2 (86) to remove rRNAs, and unmapped reads were retained for downstream analysis. The remaining reads were then aligned to the human genome (hg38) using STAR (92). Read distributions across 5'UTRs, coding sequences (CDS), and 3'UTRs were quantified using the RiboProfiling and RibosomeProfilingQC R packages (96). Canonical ribosome-protected fragment lengths (28 to 33 nt) were used for quality control analyses, including metagene coverage profiling to evaluate ribosome occupancy across transcript regions, with reads binned by 5'UTRs, CDS, and 3'UTRs. Additionally, strand bias, transcript region distribution, and periodicity were assessed. Gene-level read counts were quantified from aligned BAM files, and differential ribosome occupancy between conditions was assessed using DESeq2 (88). All computational analyses were performed on the Trillium high-performance computing cluster (University of Toronto, Compute Canada) or with RStudio.

Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR)

Total RNA was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen, no. 15596026), followed by precipitation with isopropanol. RNA was reverse transcribed using SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, no. 18090050) with 50 $\mu$ M random hexamer primers. qPCR was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, no. 4367659). Primers used for qPCR are listed in table S5. Data were analyzed using the $\Delta\Delta$ CT method. Each biological replicate was assayed in technical duplicates.

FLIPR membrane potential assay

Cells were seeded into black wall, clear bottom 96-well plates for three dosages (500 ng per well). Before the assay, cells were washed with PBS and then incubated with 0.5 mg/ml blue membrane potential dye (FLIPR Membrane Potential Assay Kit; Molecular Devices) dissolved in chloride-free buffer (10 mM glucose, 20 mM HEPES, 136 mM sodium gluconate, 3 mM potassium gluconate, pH 7.35, 300 mOsm) for 30 min at 37°C. Plates were subsequently transferred to a fluorescent microplate reader (SpectraMax i3X Multi-Mode Microplate Reader; Molecular Devices) maintained at 37°C. Baseline fluorescence (excitation 530 nm; emission 560 nm) was recorded, forskolin (10 μM, Sigma-Aldrich, no.

F6886) was then added, and fluorescence was monitored to determine the forskolin-stimulated response. CFTRinh-172 (10 $\mu$ M, Sigma-Aldrich, no. C2992) was then added to confirm CFTR-dependent signal. CFTR activity was quantified as the forskolin-induced change in fluorescence relative to baseline.

In vivo safety evaluation

C57BL/6J (6 weeks old) female mice from the Jackson Laboratory were used. For pulmonary safety assessment, mice were administered LNP-sup-tRNA via intratracheal instillation at doses of 1, 3, 5, or 10 mg/kg on day 0. PBS was used as a negative control, and lipopolysaccharide (LPS) (5 $\mu$ g per mouse) served as a positive inflammatory control. Samples were collected at multiple time points to evaluate both acute and subacute responses. BALF was collected at 4 hours, day 1 (D1), and day 14 (D14) postadministration, depending on the endpoint. Briefly, lungs were lavaged with sterile PBS, and recovered fluid was used for downstream analyses. Blood was collected via cardiac puncture, and serum was isolated by centrifugation. Cytokine levels in BALF and serum were quantified using a Luminex multiplex assay (Eve Technologies). Complement activation was assessed by measuring C5a and C3a levels in BALF at 4 hours postadministration using ELISA kits (C5a: RayBiotech, no. ELM-CCC5a-1; C3a: Invitrogen, no. EEL091). BALF cellular composition was analyzed at 24 hours after intratracheal administration of the LNP-sup-tRNA treatment. Lung tissues were harvested at D1 and D14, fixed in formalin, embedded in paraffin, sectioned, and stained with hematoxylin and eosin (H&E) for histopathological evaluation.

Intestinal organoid culture from isolated mouse intestinal crypts and treatment

Intestinal organoids were generated from R553X mice following established methods. Briefly, mice were euthanized, and $\sim$ 20 cm of small intestine proximal to the stomach was harvested, flushed with PBS, and cut open longitudinally. The intestinal segments were further sectioned into $\sim$ 2 mm pieces and washed thoroughly until the supernatant was clear. Tissue pieces were resuspended in 25 ml Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies, no. 100-0485) and incubated at room temperature on a rocking platform at 50 rpm for 15 min. After incubation, tissues were resuspended in 10 ml cold PBS containing 0.1% BSA, filtered through a 70 $\mu$ m cell strainer, and collected into four fractions. Fractions enriched in crypts (fractions 2 to 4) were identified microscopically, pelleted, and resuspended in a 1:1 mixture of Matrigel (Corning, no. 354234) and IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse) (STEMCELL Technologies, no. 06005). Approximately 50 $\mu$ l aliquots containing $\sim$ 1500 crypts were plated into the center of wells in prewarmed 24-well plates. After solidification at 37°C for 15 min, 750 $\mu$ l complete IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse) was added. Organoids were cultured at 37°C with 5% CO $_{2}$ , with medium changed every 2 days and organoids passaged every 7 days. Upon reaching $\sim$ 75% confluency, organoids were released from Matrigel, centrifuged, and enzymatically dissociated into single cells using Accutase (Gibco, no. A1110501). Digestion was halted by adding DMEM supplemented with 10% FBS. Single-cell suspensions (3 × 10 $^{4}$ cells per well) in IntestiCult Organoid Growth Medium (mouse) were seeded into Matrigel-coated 96-well plates and treated with LNP-sup-tRNA every other day at a dosage of 500 ng per well, for a total of three treatments. Cells were cultured for 4 to 5 days until fully formed organoids developed. To evaluate CFTR activity, a FIS assay was performed. Organoids were stained with Calcein AM (Invitrogen, no. C1430) at 37°C for 30 min. Brightfield and fluorescence images (excitation/emission: 494/517 nm) were captured using a Cytation 5 plate reader (BioTek) immediately before and 4 hours after the addition of forskolin (final concentration of 10 $\mu$ M). Organoid swelling at 4 hours after forskolin treatment was quantified, allowing comparison of CFTR activity between treated and untreated groups.

Patient-derived intestinal organoids treatment and Ussing chamber

This study was conducted at the Hospital for Sick Children (SickKids) in Toronto, Canada, following approved research protocol (REB no. 1000058992, SickKids Hospital, Toronto). The CFTR mutations in the patient were defined by clinical genetic testing: c.1397C>G (p.Ser466*), c.3209G>A (p.Arg1070Gln), c.1657C>T (p.Arg553*), and c.1584G>A. CF patient-derived intestinal organoids harboring complex CFTR mutations were isolated from rectal biopsies and cultured according to established culture protocols (97, 98). Three-dimensional organoids growing 7 to 10 days were enzymatically dissociated using TrypLE (Thermo Fisher Scientific), suspended in growth medium (IntestiCult Human OGM, STEMCELL Technologies, no. 06010) supplemented with Y-27632, and seeded onto 2% Matrigel (Corning, no. 356231) precoated Transwell inserts (Costar 3470, 6.5 mm diameter, 0.4 μm pore size; Corning) with 100 μl medium added to the apical side and 500 μl to the basal compartment (day 0). Organoid cultures were treated with either dimethyl sulfoxide (DMSO) control, G418 (Sigma-Aldrich, no. G8168, 200 μg/ml), Trikafta, LNP-sup-tRNA, or a combination of LNP-sup-tRNA and Trikafta, with three dosages (tRNA treatment: 1.25 μg per insert). Growth media were replaced daily, and Y-27632 was removed 1 day before Ussing chamber analyses, which were performed on days 6 to 7 postseeding. Trikafta consisted of VX-445 (elexacaftor; 3 μM, Selleckchem), VX-661 (tezacaftor; 3 μM, Selleckchem), and VX-770 (ivacaftor; 3 μM, Selleckchem). VX-770 was additionally added during the Ussing chamber experiments. Electrophysiological recordings were performed using a circulating Ussing chamber system (EM-CSYS-4; Physiologic Instruments) in open-circuit mode, using symmetrical chloride-bicarbonate buffers. CFTR activity was assessed by measuring changes in transepithelial current upon addition of forskolin (Fsk, 10 μM, basolateral), designated as ΔFsk-Ieq, and verified by subsequent inhibition with CFTRinh-172 (10 μM, apical). Experiments were conducted in the presence of amiloride (100 μM) to block epithelial sodium channel activity. Data acquisition and analysis were performed using a customized LabVIEW-based software (UCP4.4.1, 2015).

Statistical analyses

Statistical analyses were performed using GraphPad Prism software (version 10.4.1). Data are presented as individual data points with means ± standard deviations (SDs), unless otherwise specified. Exact sample sizes, replicate definitions, and statistical tests are indicated in the figure legends. For cell-culture assays, biological replicates represent independently prepared cultures; multiple wells derived from the same culture preparation were treated as technical replicates and averaged before statistical analysis. For animal studies, each animal was treated as one biological replicate. For patient-derived organoid experiments, biological replicates represent independently prepared organoid-derived monolayers or measurements generated from material from a single CF participant. Comparisons between two groups were performed using two-tailed unpaired Student's t tests unless otherwise indicated. For comparisons among three or more groups, one-way or two-way analysis of variance (ANOVA) was used followed by post hoc multiple-comparison testing as specified in the figure legends. Dunnett's test was used when multiple treatment groups were compared with a single control, and Tukey's test was used for all pairwise comparisons. P < 0.05 was considered statistically significant; for sequencing and enrichment analyses, adjusted P < 0.05 was considered significant unless otherwise indicated. No formal sample-size or power calculation was performed before experiments; sample sizes were guided by prior studies, model feasibility, and availability of animal or patient-derived material. No formal randomization or blinding procedures were used; treatment allocation was based on genotype, sample availability, and experimental feasibility. The patient-derived organoid experiment is an n-of-1 proof-of-principle study, as it used material from a single CF study participant.

REFERENCES AND NOTES

1. J. Coller, Z. Ignatova, tRNA therapeutics for genetic diseases. Nat. Rev. Drug Discov. 23, 108–125 (2024). doi: 10.1038/s41573-023-00829-9; pmid: 38049504

2. M. Mort, D. Ivanov, D. N. Cooper, N. A. Chuzhanova, A meta-analysis of nonsense mutations causing human genetic disease. Hum. Mutat. 29, 1037–1047 (2008). doi: 10.1002/humu.20763; pmid: 18454449

3. R. E. Stanley, T. M. Lowe, Z. Ignatova, The regulation, function and disease relevance of cytoplasmic tRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10.1038/s41580-026-00963-3 (2026). doi: 10.1038/s41580-026-00963-3; pmid: 42014620

4. M. Dabrowski, Z. Bukowy-Bieryllo, E. Zietkiewicz, Advances in therapeutic use of a drug-stimulated translational readthrough of premature termination codons. Mol. Med. 24, 25 (2018). doi: 10.1186/s10020-018-0024-7; pmid: 30134808

5. J. Hordeaux et al., Adeno-Associated Virus-Induced Dorsal Root Ganglion Pathology. Hum. Gene Ther. 31, 808–818 (2020). doi: 10.1089/hum.2020.167; pmid: 32845779

6. J. R. Mendell et al., Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol. Ther. 29, 464–488 (2021). doi: 10.1016/j.ymthe.2020.12.007; pmid: 33309881

7. T. Anastassiadis, C. Köhrer, Ushering in the era of tRNA medicines. J. Biol. Chem. 299, 105246 (2023). doi: 10.1016/j.jbc.2023.105246; pmid: 37703991

8. E. Dolgin, tRNA therapeutics burst onto startup scene. Nat. Biotechnol. 40, 283–286 (2022). doi: 10.1038/s41587-022-01252-y; pmid: 35210613

9. J. C. Chang, G. F. Temple, R. F. Trecartin, Y. W. Kan, Suppression of the nonsense mutation in homozygous $\beta^{0}$ thalassaemia. Nature 281, 602–603 (1979). doi: 10.1038/281602a0; pmid: 492326

10. G. F. Temple, A. M. Dozy, K. L. Roy, Y. W. Kan, Construction of a functional human suppressor tRNA gene: An approach to gene therapy for $\beta$ -thalassaemia. Nature 296, 537–540 (1982). doi: 10.1038/296537a0; pmid: 6803169

11. J. J. Porter, C. S. Heil, J. D. Lueck, Therapeutic promise of engineered nonsense suppressor tRNAs. WIREs RNA 12, e1641 (2021). doi: 10.1002/wrna.1641; pmid: 33567469

12. A. Weixlbaumer et al., Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science 322, 953–956 (2008). doi: 10.1126/science.1164840; pmid: 18988853

13. A. Korostelev et al., Crystal structure of a translation termination complex formed with release factor RF2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19684–19689 (2008). doi: 10.1073/pnas.0810953105; pmid: 19064930

14. J. D. Lueck et al., Engineered transfer RNAs for suppression of premature termination codons. Nat. Commun. 10, 822 (2019). doi: 10.1038/s41467-019-08329-4; pmid: 30778053

15. S. Albers et al., Repurposing tRNAs for nonsense suppression. Nat. Commun. 12, 3850 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-24076-x; pmid: 34158503

16. W. Ko, J. J. Porter, M. T. Sipple, K. M. Edwards, J. D. Lueck, Efficient suppression of endogenous CFTR nonsense mutations using anticodon-engineered transfer RNAs. Mol. Ther. Nucleic Acids 28, 685–701 (2022). doi: 10.1016/j.omtn.2022.04.033; pmid: 35664697

17. W. Ko et al., ACE-tRNAs are a platform technology for suppressing nonsense mutations that cause cystic fibrosis. Nucleic Acids Res. 53, gkaf675 (2025). doi: 10.1093/nar/gkaf675; pmid: 40650978

18. J. J. Porter et al., Anticodon-edited transfer RNAs (ACE-tRNAs) encoded as therapeutic nonviral minimal DNA vectors. Nucleic Acids Res. 54, gkag082 (2026). doi: 10.1093/nar/gkag082; pmid: 41641696

19. J. Wang et al., AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Nature 604, 343–348 (2022). doi: 10.1038/s41586-022-04533-3; pmid: 35322228

20. M. Xu et al., An engineered UGA suppressor tRNA gene for disease-agnostic AAV delivery. Nat. Biotechnol. 10.1038/s41587-025-02982-5 (2026). doi: 10.1038/s41587-025-02982-5; pmid: 41555020

21. S. Albers et al., Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo. Nature 618, 842–848 (2023). doi: 10.1038/s41586-023-06133-1; pmid: 37258671

22. J. M. Schrader, S. J. Chapman, O. C. Uhlenbeck, Tuning the affinity of aminoacyl-tRNA to elongation factor Tu for optimal decoding. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5215–5220 (2011). doi: 10.1073/pnas.1102128108; pmid: 21402928

23. O. C. Uhlenbeck, J. M. Schrader, Evolutionary tuning impacts the design of bacterial tRNAs for the incorporation of unnatural amino acids by ribosomes. Curr. Opin. Chem. Biol. 46, 138–145 (2018). doi: 10.1016/j.cbpa.2018.07.016; pmid: 30059836

24. N. Bharti et al., Translation velocity determines the efficacy of engineered suppressor tRNAs on pathogenic nonsense mutations. Nat. Commun. 15, 2957 (2024). doi: 10.1038/s41467-024-47258-9; pmid: 38580646

25. S. E. Pierce et al., Prime editing-installed suppressor tRNAs for disease-agnostic genome editing. Nature 648, 191–202 (2025). doi: 10.1038/s41586-025-09732-2; pmid: 41261131

26. J. J. Porter, W. Ko, E. G. Sorensen, J. D. Lueck, Optimization of ACE-tRNAs function in translation for suppression of nonsense mutations. Nucleic Acids Res. 52, 14112–14132 (2024). doi: 10.1093/nar/gkae1112; pmid: 39673265

27. V. de Crécy-Lagard et al., Matching tRNA modifications in humans to their known and predicted enzymes. Nucleic Acids Res. 47, 2143–2159 (2019). doi: 10.1093/nar/gkz011; pmid: 30698754

28. T. Suzuki, The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 375–392 (2021). doi: 10.1038/s41580-021-00342-0; pmid: 33658722

29. T. Pan, Modifications and functional genomics of human transfer RNA. Cell Res. 28, 395–404 (2018). doi: 10.1038/s41422-018-0013-y; pmid: 29463900

30. W. Zhang, M. Foo, A. M. Eren, T. Pan, tRNA modification dynamics from individual organisms to metaepitranscriptomics of microbiomes. Mol. Cell 82, 891–906 (2022). doi: 10.1016/j.molcel.2021.12.007; pmid: 35032425

31. I. Freund et al., 2'-O-methylation within prokaryotic and eukaryotic tRNA inhibits innate immune activation by endosomal Toll-like receptors but does not affect recognition of whole organisms. RNA 25, 869–880 (2019). doi: 10.1261/rna.070243.118; pmid: 31019095

32. L. Cui et al., RNA modifications: Importance in immune cell biology and related diseases. Signal Transduct. Target. Ther. 7, 334 (2022). doi: 10.1038/s41392-022-01175-9; pmid: 36138023

33. T. Ohira, T. Suzuki, Transfer RNA modifications and cellular thermotolerance. Mol. Cell 84, 94–106 (2024). doi: 10.1016/j.molcel.2023.11.041; pmid: 38181765

34. G. Ronzitti, D. A. Gross, F. Mingozzi, Human Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors. Front. Immunol. 11, 670 (2020). doi: 10.3389/fimmu.2020.00670; pmid: 32362898

35. E. Basner-Tschakarjan, E. Bijjiga, A. T. Martino, Pre-Clinical Assessment of Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors. Front. Immunol. 5, 28 (2014). doi: 10.3389/fimmu.2014.00028; pmid: 24570676

36. A. J. Barbier, A. Y. Jiang, P. Zhang, R. Wooster, D. G. Anderson, The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat. Biotechnol. 40, 840–854 (2022). doi: 10.1038/s41587-022-01294-2; pmid: 35534554

37. X. Hou, T. Zaks, R. Langer, Y. Dong, Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat. Rev. Mater. 6, 1078–1094 (2021). doi: 10.1038/s41578-021-00358-0; pmid: 34394960

38. K. A. Hajj, K. A. Whitehead, Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nat. Rev. Mater. 2, 17056 (2017). doi: 10.1038/natrevmats.2017.56

39. P. R. Burgel et al., Elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor in people with cystic fibrosis harbouring two CFTR Class I variants: Real-world data from the French compassionate programme. EClinicalMedicine 88, 103476 (2025). doi: 10.1016/j.eclinm.2025.103476; pmid: 40932846

40. D. Sordyl et al., MODOMICS: A database of RNA modifications and related information. 2025 update and 20th anniversary. Nucleic Acids Res. 54, D219–D225 (2026). doi: 10.1093/nar/gkaf1284; pmid: 41277531

41. N. Luo et al., Near-cognate tRNAs increase the efficiency and precision of pseudouridine-mediated readthrough of premature termination codons. Nat. Biotechnol. 43, 114–123 (2025). doi: 10.1038/s41587-024-02165-8; pmid: 38448662

42. S. Tijaro-Bulla, S. P. Nyandwi, H. Cui, Physiological and engineered tRNA aminoacylation. WIREs RNA 14, e1789 (2023). doi: 10.1002/wrna.1789; pmid: 37042417

43. X. Qin et al., Cocrystal structures of glycyl-tRNA synthetase in complex with tRNA suggest multiple conformational states in glycylation. J. Biol. Chem. 289, 20359–20369 (2014). doi: 10.1074/jbc.M114.557249; pmid: 24898252

44. N. Nameki, K. Tamura, H. Asahara, T. Hasegawa, Recognition of tRNA $^{Gly}$ by three widely diverged glycyl-tRNA synthetases. J. Mol. Biol. 268, 640–647 (1997). doi: 10.1006/jmbi.1997.0993; pmid: 9171287

45. R. Giegé, G. Eriani, The tRNA identity landscape for aminoacylation and beyond. Nucleic Acids Res. 51, 1528–1570 (2023). doi: 10.1093/nar/gkad007; pmid: 36744444

46. Y. Li et al., Crystal structures and insights into precursor tRNA 5'-end processing by prokaryotic minimal protein-only RNase P. Nat. Commun. 13, 2290 (2022). doi: 10.1038/s41467-022-30072-6; pmid: 35484139

47. S. Y. Yu et al., A luciferase reporter mouse model to optimize in vivo gene editing validated by lipid nanoparticle delivery of adenine base editors. Mol. Ther. 31, 1159–1166 (2023). doi: 10.1016/j.ymthe.2023.02.009; pmid: 36793209

48. X. Han et al., An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat. Commun. 12, 7233 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-27493-0; pmid: 34903741

49. B. Li et al., Combinatorial design of nanoparticles for pulmonary mRNA delivery and genome editing. Nat. Biotechnol. 41, 1410–1415 (2023). doi: 10.1038/s41587-023-01679-x; pmid: 36997680

50. J. Chen et al., Combinatorial design of ionizable lipid nanoparticles for muscle-selective mRNA delivery with minimized off-target effects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120, e2309472120 (2023). doi: 10.1073/pnas.2309472120; pmid: 38060560

51. Y. Xu et al., AGILE platform: A deep learning powered approach to accelerate LNP development for mRNA delivery. Nat. Commun. 15, 6305 (2024). doi: 10.1038/s41467-024-50619-z; pmid: 39060305

52. J. Renner et al., Synthesis of Ionizable Lipids for Gene Delivery to the Lung Using an Ugi Four Component Reaction. J. Am. Chem. Soc. 147, 17459–17467 (2025). doi: 10.1021/jacs.5c04123; pmid: 40338108

53. Y. Xu et al., LUMI-lab: A foundation model-driven autonomous platform enabling discovery of ionizable lipid designs for mRNA delivery. Cell 189, 1620–1635.e25 (2026). doi: 10.1016/j.cell.2026.01.012; pmid: 41742414

54. K. J. Kauffman et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs. Nano Lett. 15, 7300–7306 (2015). doi: 10.1021/acs.nanolett.5b02497; pmid: 26469188

55. H. H. Ly, S. Daniel, S. K. V. Soriano, Z. Kis, A. K. Blakney, Optimization of Lipid Nanoparticles for saRNA Expression and Cellular Activation Using a Design-of-Experiment Approach. Mol. Pharm. 19, 1892–1905 (2022). doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.2c00032; pmid: 35604765

56. A. Y. Jiang et al., Combinatorial development of nebulized mRNA delivery formulations for the lungs. Nat. Nanotechnol. 19, 364–375 (2024). doi: 10.1038/s41565-023-01548-3; pmid: 37985700

57. J. Kim et al., Engineering Lipid Nanoparticles for Enhanced Intracellular Delivery of mRNA through Inhalation. ACS Nano 16, 14792–14806 (2022). doi: 10.1021/acsnano.2c05647; pmid: 36038136

58. M. P. Lokugamage et al., Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat. Biomed. Eng. 5, 1059–1068 (2021). doi: 10.1038/s41551-021-00786-x; pmid: 34616046

59. X. Bai et al., Optimized inhaled LNP formulation for enhanced treatment of idiopathic pulmonary fibrosis via mRNA-mediated antibody therapy. Nat. Commun. 15, 6844 (2024). doi: 10.1038/s41467-024-51056-8; pmid: 39122711

60. A. Autour et al., Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nat. Commun. 9, 656 (2018). doi: 10.1038/s41467-018-02993-8; pmid: 29440634

61. A. D. Cawte, P. J. Unrau, D. S. Rueda, Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic Mango II arrays. Nat. Commun. 11, 1283 (2020). doi: 10.1038/s41467-020-14932-7; pmid: 32152311

62. Y. Sun et al., In vivo editing of lung stem cells for durable gene correction in mice. Science 384, 1196–1202 (2024). doi: 10.1126/science.adk9428; pmid: 38870301

63. S. Suzuki et al., Highly Efficient Gene Editing of Cystic Fibrosis Patient-Derived Airway Basal Cells Results in Functional CFTR Correction. Mol. Ther. 28, 1684–1695 (2020). doi: 10.1016/j.ymthe.2020.04.021; pmid: 32402246

64. J. R. Rock et al., Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771–12775 (2009). doi: 10.1073/pnas.0906850106; pmid: 19625615

65. X. Xue et al., Identification of the amino acids inserted during suppression of CFTR nonsense mutations and determination of their functional consequences. Hum. Mol. Genet. 26, 3116–3129 (2017). doi: 10.1093/hmg/ddx196; pmid: 28575328

66. S. Ahmadi et al., Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genom. Med. 2, 12 (2017). doi: 10.1038/s41525-017-0015-6; pmid: 28649446

67. J. X. Jiang et al., A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports 16, 2825–2837 (2021). doi: 10.1016/j.stemcr.2021.09.020; pmid: 34678210

68. C. Wu, B. Roy, F. He, K. Yan, A. Jacobson, Poly(A)-Binding Protein Regulates the Efficiency of Translation Termination. Cell Rep. 33, 108399 (2020). doi: 10.1016/j.celrep.2020.108399; pmid: 33207198

69. D. R. McHugh et al., A G542X cystic fibrosis mouse model for examining nonsense mutation directed therapies. PLOS ONE 13, e0199573 (2018). doi: 10.1371/journal.pone.0199573; pmid: 29924856

70. G. Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 13, 653–658 (2013). doi: 10.1016/j.stem.2013.11.002; pmid: 24315439

71. J. D. Lueck, Editing tRNA Genes to Broaden Nonsense Therapeutics. N. Engl. J. Med. 394, 1651–1654 (2026). doi: 10.1056/NEJMcibr2516957; pmid: 42019025

72. L. DeFrancesco, Genome editing's third act. Nat. Biotechnol. 44, 331–333 (2026). doi: 10.1038/s41587-026-03058-8; pmid: 41844972

73. M. J. Landrum et al., ClinVar: Improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46, D1062–D1067 (2018). doi: 10.1093/nar/gkx1153; pmid: 29165669

74. U. Varshney et al., Mycobacterium tuberculosis Rv2118c codes for a single-component homotetrameric m $^{1}$ A58 tRNA methyltransferase. Nucleic Acids Res. 32, 1018–1027 (2004). doi: 10.1093/nar/gkh207; pmid: 14960715

75. V. Y. Väre, E. R. Eruysal, A. Narendran, K. L. Sarachan, P. F. Agris, Chemical and Conformational Diversity of Modified Nucleosides Affects tRNA Structure and Function. Biomolecules 7, 29 (2017). doi: 10.3390/biom7010029; pmid: 28300792

76. A. Biela et al., The diverse structural modes of tRNA binding and recognition. J. Biol. Chem. 299, 104966 (2023). doi: 10.1016/j.jbc.2023.104966; pmid: 37380076

77. M. Frye, B. T. Harada, M. Behm, C. He, RNA modifications modulate gene expression during development. Science 361, 1346–1349 (2018). doi: 10.1126/science.aau1646; pmid: 30262497

78. S. Wang, D. Weissman, Y. Dong, RNA chemistry and therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 24, 828–851 (2025). doi: 10.1038/s41573-025-01237-x; pmid: 40659813

79. I. A. Roundtree, M. E. Evans, T. Pan, C. He, Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell 169, 1187–1200 (2017). doi: 10.1016/j.cell.2017.05.045; pmid: 28622506

80. R. Alarcon, D. Köster, S. Behrmann, Z. Ignatova, ADAM-tRNA-seq: An optimized approach for demultiplexing and enhanced hierarchical mapping in direct tRNA sequencing. Nucleic Acids Res. 54, gkag022 (2026). doi: 10.1093/nar/gkag022; pmid: 41574434

81. I. Barbieri, T. Kouzarides, Role of RNA modifications in cancer. Nat. Rev. Cancer 20, 303–322 (2020). doi: 10.1038/s41568-020-0253-2; pmid: 32300195

82. S. Delaunay, M. Helm, M. Frye, RNA modifications in physiology and disease: Towards clinical applications. Nat. Rev. Genet. 25, 104–122 (2024). doi: 10.1038/s41576-023-00645-2; pmid: 37714958

83. K. Beebe, W. Waas, Z. Druzina, M. Guo, P. Schimmel, A universal plate format for increased throughput of assays that monitor multiple aminoacyl transfer RNA synthetase activities. Anal. Biochem. 368, 111–121 (2007). doi: 10.1016/j.ab.2007.05.013; pmid: 17603003

84. C. P. Watkins, W. Zhang, A. C. Wylder, C. D. Katanski, T. Pan, A multiplex platform for small RNA sequencing elucidates multifaceted tRNA stress response and translational regulation. Nat. Commun. 13, 2491 (2022). doi: 10.1038/s41467-022-30261-3; pmid: 35513407

85. L. R. Frietze, T. Pan, Bioinformatics of simultaneous, quantitative measurements of full-length tRNA and tRNA fragments by MSR sequencing. Methods Enzymol. 711, 312–323 (2025). doi: 10.1016/bs.mie.2024.11.009; pmid: 39952712

86. B. Langmead, S. L. Salzberg, Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods 9, 357–359 (2012). doi: 10.1038/nmeth.1923; pmid: 22388286

87. H. Li et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078–2079 (2009). doi: 10.1093/bioinformatics/btp352; pmid: 19505943

88. M. I. Love, W. Huber, S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014). doi: 10.1186/s13059-014-0550-8; pmid: 25516281

89. T. M. Lowe, P. P. Chan, tRNAscan-SE On-line: Integrating search and context for analysis of transfer RNA genes. Nucleic Acids Res. 44, W54–W57 (2016). doi: 10.1093/nar/gkw413; pmid: 27174935

90. P. P. Chan, T. M. Lowe, in Gene Prediction: Methods and Protocols, M. Kollmar, Ed., vol. 1962 of Methods in Molecular Biology (Springer, 2019), pp. 1–14.

91. E. E. Bonacquisti et al., Fluorogenic RNA-based biomaterials for imaging and tracking the cargo of extracellular vesicles. J. Control. Release 374, 349–368 (2024). doi: 10.1016/j.jconrel.2024.07.043; pmid: 39111600

92. A. Dobin et al., STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15–21 (2013). doi: 10.1093/bioinformatics/bts635; pmid: 23104886

93. S. X. Ge, D. Jung, R. Yao, ShinyGO: A graphical gene-set enrichment tool for animals and plants. Bioinformatics 36, 2628–2629 (2020). doi: 10.1093/bioinformatics/btz931; pmid: 31882993

94. Y. Mao, L. Jia, L. Dong, X. E. Shu, S.-B. Qian, Start codon-associated ribosomal frameshifting mediates nutrient stress adaptation. Nat. Struct. Mol. Biol. 30, 1816–1825 (2023). doi: 10.1038/s41594-023-01119-z; pmid: 37957305

95. M. Martin, Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17, 10–12 (2011). doi: 10.14806/ej.17.1.200

96. L. Calviello et al., Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat. Methods 13, 165–170 (2016). doi: 10.1038/nmeth.3688; prmid: 26657557

97. L. Birimberg-Schwartz et al., Validating organoid-derived human intestinal monolayers for personalized therapy in cystic fibrosis. Life Sci. Alliance 6, e202201857 (2023). doi: 10.26508/Isa.202201857; pmid: 37024122

98. D. D. Zomer-van Ommen et al., Comparison of ex vivo and in vitro intestinal cystic fibrosis models to measure CFTR-dependent ion channel activity. J. Cyst. Fibros. 17, 316–324 (2018). doi: 10.1016/j.jcf.2018.02.007; pmid: 29544685

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are grateful to the participant with CF for the organoid study at the Hospital for Sick Children. We thank Z. Ignatova and S. Albers-Fomenko for project discussions and constructive input. We thank C. A. Hodges and the Cystic Fibrosis Mouse Resource Center (CFMRC) at Case Western Reserve University (CWRU) for sharing CF mouse breeders to establish our own colonies. We thank H. Valley and the Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Therapeutics Lab for providing cells and protocols. We thank P. J. Unrau for discussions on tRNA_Aptamer design. The authors acknowledge technical support from the Centre for Pharmaceutical Oncology for flow cytometry and imaging, the Princess Margaret Cancer Centre for access to NMR and animal facilities, the Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) at UHN for confocal microscopy, the Donnelly Sequencing Centre, and the Centre for Applied Genomics at the Hospital for Sick Children. Computational analyses were supported by the high-performance computing cluster operated by the University of Toronto and Compute Canada. J.C. acknowledges the doctoral-level graduate award from the NanoMedicines Innovation Network (NMIN) and the PRiME Fellowship from the University of Toronto and the Hospital for Sick Children (SickKids). C.M.M. acknowledges the support from NSERC CGS-M and CGRS-D. B.Y.S. acknowledges the support from the Ontario Graduate Scholarship. Illustration figures were created with Biorender.com. Funding: This work is supported by a GSK Chair Professorship (B.L.); the Leslie Dan Faculty of Pharmacy Startup Fund (B.L.); the Princess Margaret Cancer Centre Operating Fund (B.L.); Connaught Fund 523859 (B.L.); Canada Research Chairs Program CRC-2022-00575 (B.L.); Canadian Institutes of Health Research PJH-185722 and PJT-195669 (B.L.); Cystic Fibrosis Canada 1188219 (B.L.); New Frontiers in Research Fund NFRFE-2023-00203 (B.L.); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada RGPIN-2023-05124 (B.L.); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada RGPIN-2023-04305 (H.C.); National Institutes of Health grant 1R01HL174773 (B.L.); CFF grants LI23G0 and LI23I0 (B.L.); Harrington Discovery Institute HDI-BOWEN-UT_GA_44994 (B.L.); and PRiME, Next Generation Precision Medicine initiative PRMHSC2026-001 (J.C.). Author contributions: Conceptualization: J.C., H.C., B.L.; Funding acquisition: H.C., B.L.; Investigation: J.C., M.Z., S.D., F.G., R.T., B.Y.S., Z.R.C., Z.P.Z., J.P., Y.X., S.L., C.M.M., S.T.-B.; Methodology: J.C., T.G., J.H., H.C., B.L.; Project administration: J.C., H.C., B.L.; Supervision: H.C., B.L.; Visualization: J.C., M.Z., H.C., B.L.; Writing – original draft: J.C., H.C., B.L.; Writing – review & editing: J.C., H.C., B.L. Competing interests: J.C., H.C., and B.L. are inventors on an invention disclosure (no. 10004798) submitted by the University of Toronto that covers compositions, methods, and uses of the engineered and/or modified sup-tRNAs. J.C., M.Z., S.D., and B.L. are inventors on an invention disclosure (no. 10004799) submitted by the University of Toronto that covers the described ionizable lipids. The authors declare no other competing interests. Data, code, and materials availability: RNA-seq, ribosome profiling, and tRNA-seq data are deposited in the NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) under accession numbers GSE303837, GSE326898, and GSE326462, respectively. All other data are available in the main text or the supplementary materials. Requests for materials should be addressed to B.L. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aeb0054 Figs. S1 to S26; Tables S1 to S5; MDAR Reproducibility Checklist Submitted 28 July 2025; resubmitted 20 April 2026; accepted 2 July 2026

10.1126/science.aeb0054

OPTOELECTRONICS

High-efficiency, long-lived lead-free perovskite light-emitting diodes

Wenhao Bai $^{1,2}$ , Tongtong Xuan $^{1,3,4}$ , Guanhua Ren $^{1}$ , Kunjie Song $^{1}$ , Huili Li $^{5}$ , Chengkai Hu $^{6,7}$ , Fandi Mo $^{6,7}$ , Lixin Wang $^{6,7,}$ , Rong-Jun Xie $^{1,3,4*}$

Tin halide perovskite light-emitting diodes (PeLEDs) offer promise due to their solution processability and low toxicity, yet low efficiency and poor stability hinder practical use. We found that electroluminescence failure in $CsSnI_{3}$ is primarily driven by excessive hole injection-triggered electrochemical $Sn^{2+}$ oxidation and an irreversible phase transition to $Cs_{2}SnI_{6}$ . Through a dual-side optimization strategy combining formamidine doping with triphenylphosphine oxide modification to stabilize the perovskite lattice, suppress nonradiative recombination, and balance carrier transport, we demonstrate highly efficient near-infrared PeLEDs. These lead-free devices achieve a peak external quantum efficiency of 21.2% at 963 nanometers and a maximum radiance of 195.8 watts per steradian per square meter ( $W sr^{-1} m^{-2}$ ). Notably, the operating half-lifetime reaches 920.5 hours at 7.1 W $sr^{-1} m^{-2}$ , providing pathways for high-performance lead-free PeLEDs.

Near-infrared (NIR) tin-based perovskite light-emitting diodes (PeLEDs) are promising light sources for surveillance, light communication, night vision, data storage, and biomedical applications. These heavy metal-free devices offer low-temperature solution processability, good flexibility, and low cost (1–11). However, their electroluminescence (EL) performance lags far behind that of quantum dot LEDs (QLEDs) and lead-based PeLEDs, which is attributed to the ease of oxidation of $Sn^{2+}$ and uncontrollable crystallization in the preparation process that leads to severe nonradiative recombination (12–14). By incorporating reductant and organic additives, epitaxial heterodimensional Sn-based perovskites such as $(\mathrm{PEA}){2}\mathrm{FA}{0.9}\mathrm{Cs}{0.1}\mathrm{Sn}{2}\mathrm{I}{7}$ , where PEA is phenethylammonium and FA is formamidinium, with a photoluminescence quantum yield (PLQY) as high as 45% have been fabricated. These devices achieved a maximum external quantum efficiency (EQE) of 13.2% (2, 4, 15). However, the insulating characteristics of the organic composition in these perovskites impede charge injection and transport, which limits the radiance and operating lifetime despite their high EL efficiency (2, 7, 16, 17). Conversely, all-inorganic black orthorhombic cesium tin iodide perovskites (B-γ $CsSnI{3}$ ), characterized by high hole mobilities and relatively strong structural stability, enable the preparation of bright PeLEDs with a radiance of 241 watts per steradian per square meter (W $sr^{-1} m^{-2}$ ). However, they suffer from low efficiency (EQE 6.6%) because of severe nonradiative recombination, resulting in a PLQY of \~25%. (18) Although the efficiency of $CsSnI_{3}$ films has been greatly improved by defect passivation and oxidation suppression of $Sn^{2+}$ , state-of-the-art PeLEDs still exhibit poor efficiency (a peak EQE of 10.7%) and short half-lifetime ( $T_{50}$ of 23 hours at $\sim10~W~sr^{-1}~m^{-2}$ ) (19). Moreover, current research has primarily focused on the processing of perovskite films and less on their chemical structure and optical properties in operational PeLEDs (3–5, 7, 20, 21). A better understanding of the luminescence attenuation mechanism of $CsSnI_{3}$ perovskites under electric fields is needed to rationally construct highly efficient and reliable Sn-based NIR-emitting perovskites (22–25).

Here, we present the development of efficient, bright, and stable Sn-based NIR-PeLEDs created by strategically suppressing the perovskite phase transition in operating devices and minimizing the defect-assisted nonradiative recombination. We show that the EL failure of $CsSnI_{3}$ is primarily caused by the phase transition from NIR-emitting $CsSnI_{3}$ perovskites to undesirable orange-red $Cs_{2}SnI_{6}$ double perovskites (26) under applied electric fields. This transition is further accelerated by electrochemical oxidation reactions induced by excessive injection of hole carriers. Thus, these processes lead to an increase in vacancy defects and substantial nonradiative recombination losses. To address these issues, we modulated the composition of tin iodide perovskites to simultaneously suppress the phase transition under electric fields and improve their optical properties. Moreover, triphenylphosphine oxide (TPPO) was used to passivate undercoordinated surface defects, enhancing radiative recombination efficiency and improving charge carrier transport to further optimize the photoelectric properties of their PeLEDs. The efficient and stable lead-free perovskite films endow Sn-based NIR-PeLEDs with overall performances superior to those of reported solution-processed lead-free PeLEDs (fig. S1 and table S1).

Electrochemically induced perovskite phase transition

To investigate the origin of the poor EL performance of NIR-PeLEDs using $CsSnI_{3}$ as an emitter, we fabricated Sn-based NIR-PeLEDs with a device structure of indium tin oxide (ITO)/modified poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-poly(styrenesulfonate) (m-PEDOT:PSS)/ $CsSnI_{3}/2,2',2'-(1,3,5-benzinetriyl)$ -tris(1-phenyl-1-H-benzimidazole) (TPBi)/lithium fluoride (LiF)/aluminum (Al). The PeLEDs showed unsatisfactory EL performance (Fig. 1A and fig. S2), with a peak EQE of 5.44% at 3.8 W $sr^{-1}$ $m^{-2}$ (average peak EQE is 4.67%) and a $T_{50}$ of 0.87 hours at an initial radiance of 8.7 W $sr^{-1}$ $m^{-2}$ , which are similar to previously reported results (21, 27). We attributed the reason for the low efficiency and poor reliability of the PeLEDs not only to the relatively low PLQY (a maximum value of 24.8 ± 0.5%; Fig. 1B) of the $CsSnI_{3}$ perovskite films, but also to the luminescence attenuation of the perovskites under the electric fields in an environment free of water and oxygen.

By increasing the current density (Fig. 1C), both the EQE of the devices and the PLQY of the corresponding perovskite films exhibited similar decreasing trends, indicating that the decline in the EL performance of the device was mainly caused by the luminescence quenching of the perovskite films. In situ micro-area PL intensity imaging (Fig. 1D and fig. S3) further confirmed that the PL intensity of the $\mathrm{CsSnI}_3$ films sharply decreased because of the rapid proliferation of pinholes during device operation. We performed time-dependent x-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and x-ray diffraction (XRD) on the $\mathrm{CsSnI}_3$ films under the electric field in anhydrous and anaerobic conditions (fig. S4). Notably, the peak area ratio of $\mathrm{Sn}^{2+}$ to $\mathrm{Sn}^{4+}$ (Fig. 1E and fig. S5) decreased from 1.74 to 0.08 in $12\mathrm{min}$ , and the XRD patterns (Fig. 1F) showed that the B-γ $\mathrm{CsSnI}_3$ perovskite partially degraded into undesirable $\mathrm{Cs}_2\mathrm{SnI}_6$ . We also observed that the temperature increase in the device induced by Joule heat did not promote the perovskite phase transition (fig. S6). Furthermore, the hole carrier mobility (Fig. 1G and fig. S7) was much higher than that of the electron carriers in PeLEDs.

A

B

D

E

G

H

Fig. 1. Perovskite phase transition leading to inefficiency and poor stability of $CsSnI_{3}$ -based PeLEDs. (A) EQE-radiance curves and time-dependent radiance of $CsSnI_{3}$ -based PeLEDs. (B) Excitation optical power density-dependent PLQYs of the $CsSnI_{3}$ films. (C) EQEs of the PeLEDs based on $CsSnI_{3}$ , along with the PLQYs of the corresponding planar perovskite diodes with the structure ITO/perovskite/Al, measured as a function of current density. (D) In situ micro-area PL intensity imaging of $CsSnI_{3}$ films under a current density of 50 mA cm $^{-2}$ for different times. Scale bars, 5 $\mu$ m. (E) Time-dependent $Sn^{2+}/Sn^{4+}$ values of the $CsSnI_{3}$ films at 50 mA cm $^{-2}$ . (F) Time-dependent XRD patterns of the $CsSnI_{3}$ films at 50 mA cm $^{-2}$ . (G) Electric field-dependent charge carrier mobility of $CsSnI_{3}$ -based PeLEDs. (H) Schematic diagram of the perovskite transition from $CsSnI_{3}$ to $Cs_{2}SnI_{6}$ through undesired electrochemical reactions in operating PeLEDs, accompanied by abundant vacancies and pinholes.

On the basis of these results, we propose that $CsSnI_{3}$ -based PeLED emission failure that we observed was caused by unbalanced carrier injection inducing detrimental electrochemical reactions that led to unexpected perovskite phase transitions during operation (Fig. 1H). Specifically, the excessive accumulation of holes and p-type semiconductor properties of $CsSnI_{3}$ led to $Sn^{2+}$ oxidation ( $[SnI_{6}]^{4-}-2e\rightarrow[SnI_{6}]^{2-}$ ), whereas the reduction of $Sn^{2+}$ was negligible because there was insufficient electron injection (fig. S5). This irreversible electrochemical process aggravated the perovskite phase transition from $CsSnI_{3}$ to $Cs_{2}SnI_{6}$ , and this process was accompanied by the formation of abundant vacancies and pinholes, particularly concentrated at the cathode-side interface, where the hole-rich environment promoted oxidative decomposition. As a result, Shockley-Read-Hall (SRH) and Auger recombination were largely enhanced, ultimately leading to an increased hole carrier leakage. The pronounced luminescence quenching observed at high current densities, manifested macroscopically as the EQE roll-off in Fig. 1C, thus serves as direct experimental evidence of both carrier imbalance and electrochemical oxidation-driven degradation.

Optimizing perovskite structural stability by FA $^{+}$ doping

The composition of perovskites directly affects their chemical structure stability and optical properties (28). In high-throughput density functional theory (DFT) calculations, we observed that $FA^{+}$ doping increased both the formation energy ( $E_{f}$ ) of $CsSnI_{3}$ and the electron density around $Sn^{2+}$ ions. As shown in Fig. 2A, after $FA^{+}$ was doped into $CsSnI_{3}$ , the crystal formation energy of $Cs_{1-x}FA_{x}SnI_{3}$ increased (fig. S8), and the $E_{f}$ of $Cs_{0.8}FA_{0.2}SnI_{3}$ especially was enhanced by 0.024 eV/atom. In addition, the defect formation energy of the doped perovskites also increased (fig. S9). These findings suggested that $FA^{+}$ doping could improve the chemical structure stability and luminescence properties simultaneously (29, 30). Moreover, the calculated electron density (Fig. 2B and fig. S10) around the $Sn^{2+}$ ions greatly increased, implying strong electron localization of $Sn^{2+}$ after

A

B

D

E

C

Fig. 2. $\mathsf{FA}^+$ doping to suppress the $\mathrm{CsSnI}3$ perovskite phase transition. (A) Formation energy of $\mathrm{Cs{1 - x}FA_xSnI_3}$ (where $x = 0,0.05,0.1,0.15,0.2$ ) obtained from DFT calculations. (B) Differential electron density redistribution of $\mathrm{CsSnI}3$ and $\mathrm{Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ . (C) Atomic resolution TEM micrographs of $\mathrm{CsSnI}3$ and $\mathrm{Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ . (D) High-resolution XPS spectra of Sn 3d in $\mathrm{CsSnI}3$ and $\mathrm{Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films. (E) PL intensity curves of $\mathrm{CsSnI}3$ and $\mathrm{Cs{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ at $50\mathrm{mAcm}^{-2}$ versus time. The inset is the PL intensity mapping of $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ at $50\mathrm{mAcm}^{-2}$ for 0 and $40\mathrm{min}$ , respectively. Scale bars, $5\mu \mathrm{m}$ . (F) Time-dependent XRD pattern of the $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ film at $50\mathrm{mAcm}^{-2}$ for different times.

FA $^{+}$ doping, which would be beneficial for suppressing the perovskite phase transition (7, 31, 32).

To verify the theoretical predictions, we synthesized a series of $Cs_{1-x}FA_{x}SnI_{3}$ perovskite films and found that the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ films presented the best chemical structure stability and photoelectric properties simultaneously. The effect of $FA^{+}$ doping on the morphology of the perovskite films was confirmed by scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), and micro-area PL intensity imaging (fig. S11). Compared with dendritic crystals and continuous films of $CsSnI_{3}$ , isolated nanoscale and discontinuous $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ crystals not only showed increased PL intensity, but also increased the light extraction efficiency of the device (33–35). The atomic-resolution unfiltered scanning transmission electron microscopy–high-angle annular dark field images (Fig. 2C) illustrated that the average lattice spacing of orthorhombic $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ was 6.39 Å, which is larger than that of $CsSnI_{3}$ (6.37 Å). This uniform lattice expansion provides direct evidence that $FA^{+}$ cations are incorporated substitutionally at the A-site of the perovskite lattice rather than segregating to the surface.

We further obtained Sn 3d XPS spectra to study the effect of $FA^{+}$ doping on the oxidation of $Sn^{2+}$ ions. As shown in Fig. 2D, the peak area ratio of $Sn^{2+}$ to $Sn^{4+}$ increased from 1.74 for the $CsSnI_{3}$ film to 3.86 for the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film. Thus, $FA^{+}$ doping effectively suppressed the oxidation of $Sn^{2+}$ . Moreover, compared with that of the pure $CsSnI_{3}$ film, the PL stability of the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film improved under the electric field (Fig. 2E and fig. S12). The pure $CsSnI_{3}$ film had no obvious luminescence signals in <5 min, whereas the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ maintained its initial PL intensity and had no obvious pinholes even after 40 min. We ascribed these results to the chemical structure stability that prevented the perovskite phase transition from $CsSnI_{3}$ to $Cs_{2}SnI_{6}$ under a bias voltage. The structural stability was further confirmed by the time-dependent XRD patterns of the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film under the electric field (Fig. 2F).

Improved photoelectric properties of perovskite films

$\mathrm{FA^{+}}$ doping also enhanced the luminescence properties of $\mathrm{CsSnI_3}$ . The PL spectrum (Fig. 3A) of the $\mathrm{CsSnI_3}$ film exhibited a broadband emission band centered at $\sim 929~\mathrm{nm}$ with a full width at half maximum of $83~\mathrm{nm}$ . By comparison, the $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ film exhibited an evident redshift in the PL peak that was consistent with the bandgap calculation results (fig. S13) and also larger and more uniform crystalline domains (fig. S11) (5). The morphology and optical properties of perovskite films were also influenced by the vapor generated from the precursor solution (such as $N,N$ -dimethylformamide or dimethyl sulfoxide) within the glove box (fig. S14 and table S2).

To reveal the mechanism of the enhanced PL, we obtained time-resolved PL spectra and femtosecond transient absorption spectra to investigate the exciton recombination dynamics of these perovskite films. The $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film displayed single-exponential time-resolved PL decay dynamics with a lifetime of 2.24 ns (Fig. 3B), implying reduced nonradiative recombination and well-controlled decay dynamics of the band-edge excitons (36, 37). By contrast, the $CsSnI_{3}$ film exhibited biexponential time-resolved PL decay with rapid components of 1.14 and 1.40 ns (table S3).

Furthermore, ground-state bleaching signals at $\sim890$ nm were observed (Fig. 3C). The transient absorption signals of perovskites at band-edge wavelengths were indicative of carrier decay dynamics (38–40). The $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film exhibited a slower kinetic bleaching decay in both the subpicosecond region and the picosecond-to-nanosecond range, indicating that a higher proportion of carriers remained at the band edge rather than being trapped in bulk or surface defect states (Fig. 3D and fig. S15). The increased retention of carriers at the band edge in $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ was further confirmed by temperature-dependent PL spectra. As the temperature increased, there was a minor reduction in the PL intensity of $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ , which demonstrated that a process driven by nonradiative recombination could be effectively suppressed in $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ compared with $CsSnI_{3}$ (fig. S16).

A

B

D

E

C

F

Fig. 3. Efficient and stable NIR $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ -TPPO films. (A) PL spectra of $\mathrm{CsSnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films. (B) Time-resolved PL decay curves of $\mathrm{CsSnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films. (C) Pseudocolor maps of femtosecond-transient absorption spectra of $\mathrm{CsSnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films. (D) Kinetic traces at a probing wavelength of $890\mathrm{nm}$ for $\mathrm{CsSnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films in the picosecond-to-nanosecond range. (E) The fitted curves of the integrated PL intensity as a function of $1/T$ for the $\mathrm{CsSnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ films. (F) Excitation optical power density-dependent PLQY values of $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ and $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ -TPPO films.

The exciton binding energy $(E_{\mathrm{b}})$ (Fig. 3E and table S4) of the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film (128 meV) was 2.6 times greater than that of the $CsSnI_{3}$ film (49 meV). This difference implies that a higher energy threshold was required for exciton dissociation and greatly facilitated radiative recombination in the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film (2, 41, 42). Therefore, the enhanced PL performance, along with the narrowed and redshifted emission spectrum of the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film, could be attributed to $FA^{+}$ doping, which not only decreased the bandgap but also suppressed shallow defect formation and reduced trap-assisted nonradiative recombination (5). Consequently, the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film exhibited an enhanced PLQY, reaching a maximum of $31.1 \pm 0.4\%$ (Fig. 3F). This modification in defect physics rebalanced the macroscopic carrier transport (fig. S17), which subsequently suppressed the electrochemically driven $Sn^{2+}$ oxidation and associated phase transition during device operation (fig. S18). As a result, the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ -based PeLEDs showed a maximal EQE of up to 18.1% at $27.0 W sr^{-1} m^{-2}$ and a peak radiance of up to $160.2 W sr^{-1} m^{-2}$ (figs. S19 to S21).

Although $FA^{+}$ doping modulated the bulk defect properties, uncoordinated surface defects persisted and impeded both interfacial charge transport and radiative recombination efficiency. To selectively passivate these surface trap states, TPPO was introduced through coordination between its P=O group and undercoordinated $Sn^{2+}$ ions on the perovskite surface (fig. S22) (43). This strategy increased the PLQY of $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ to the highest value of $46.4 \pm 1.0\%$ (figs. S23 and S24, table S5, and Fig. 3F). The addition of TPPO also obviously improved the electronic mobility of $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ , which thus promises well-balanced charge injection (figs. S25 and S26). This ultimately resulted in the suppression of the perovskite phase transition and a reduction of the carrier leakage.

Efficient and stable lead-free NIR PeLEDs

We fabricated PeLEDs with a device architecture of ITO/m-PEDOT:PSS/ $\mathrm{Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_3}$ -TPPO/TPBi/LiF/Al (Fig. 4A). Cross-sectional TEM images (Fig. 4B) of the device showed that the perovskite emissive layer had a nano-island structure with a thickness of $\sim 75$ nm, thereby boosting its light extraction efficiency. Compared with the CsSnI $3$ -based PeLEDs, the Cs ${0.9}$ FA ${0.1}$ SnI $_3$ -TPPO-based PeLEDs exhibited a clear redshift in the EL spectrum to $963~\mathrm{nm}$ (Fig. 4C). As the driving voltage increased, the Cs ${0.9}$ FA $_{0.1}$ SnI $_3$ -TPPO-based PeLEDs showed a stable shape but continuously increased the intensity of the EL spectra.

Figure 4D presents the current density–voltage–radiance curves of the representative PeLEDs. The PeLEDs had a maximum radiance of $195.8 \, W sr^{-1} m^{-2}$ , which is much greater than that of $25.0 \, W sr^{-1} m^{-2}$ for $CsSnI_{3}$ -based PeLEDs (fig. S2B). The EQE was as high as 21.2% at a radiance of $43.7 \, W sr^{-1} m^{-2}$ (Fig. 4E), with a third-party certified EQE of 20.6% provided by the Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute (fig. S27). In the NIR region, the champion PeLEDs were superior to previously reported lead-free PeLEDs, organic LEDs (OLEDs), and QLEDs in terms of both EQE and radiance (Fig. 4F, table S6, and fig. S1). Efficiency roll-off was also attenuated in our devices. In particular, an EQE exceeding 18% was retained at a high radiance level of up to $100 \, W sr^{-1} m^{-2}$ . Furthermore, the PeLEDs also showed good reproducibility. The histograms of 40 devices showed an average peak EQE of $20.2 \pm 0.5\%$ and an average peak radiance of $168.7 \pm 29.5 \, W sr^{-1} m^{-2}$ (Fig. 4G and table S7).

To evaluate the operational lifetime of the PeLEDs, accelerated measurements were performed by changing the current density (Fig. 4H). The PeLEDs showed a $T_{50}$ of 127.0 hours at a current density of 25 mA cm $^{-2}$ ( $\sim$ 19.0 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ ) and a $T_{50}$ of 920.5 hours at a current density of 11 mA cm $^{-2}$ ( $\sim$ 7.1 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ ). The $T_{50}$ lifetime was further evaluated at various current densities ranging from 50 mA cm $^{-2}$ ( $\sim$ 41.5 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ ) to 233 mA cm $^{-2}$ ( $\sim$ 134.5 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ ) (Fig. 4H, fig. S28, and table S8). An empirical accelerated lifetime equation (16, 44–47), where $R_0^n T_{50} = \text{constant}$ ( $n$ is the acceleration factor), was used to model the degradation behavior of our devices, demonstrating an acceleration factor ( $n$ ) of 1.74 (Fig. 4I). Thus, the $T_{50}$ of the devices at 1.8 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ is estimated to be 7668 hours ( $\sim$ 320 days), and that at 0.18 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ could reach 421,367 hours ( $\sim$ 48 years). For reference, the PEA ${2}$ (FAPbBr ${3}$ ) ${2}$ PbBr ${4}$ -based PeLEDs with a luminance of 100 cd m $^{-2}$ correspond to a radiance of 0.18 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ (fig. S29). The operational $T_{50}$ appears to represent an improvement over previously reported stability metrics for lead-free PeLEDs (fig. S30 and table S1). We also successfully demonstrated diversified applications of efficient, bright, and stable lead-free NIR-PeLEDs in intelligent driving (fig. S31), night vision and facial recognition (fig. S32), and vascular imaging (fig. S33).

A
B

D

F

G

I

Fig. 4. Efficient, bright, and stable lead-free NIR-PeLEDs. (A) Schematics of energy diagram of the champion PeLEDs. (B) Cross-sectional TEM images of the champion PeLEDs. (C) The EL spectra of the champion PeLEDs with different operating voltages. (D) Current density–voltage–radiance characteristics of the champion PeLEDs. (E) EQE-radiance curves of the champion PeLEDs. (F) The peak EQE and EL peak wavelength of the reported NIR-LEDs, as summarized in table S6. (G) Peak EQE (left) and peak radiance (right) histograms of 40 devices. (H) Operational stability of the PeLEDs at current densities of 25 and 11 mA cm $^{-2}$ , respectively. (I) The $T_{50}$ lifetimes as a function of initial radiance ( $R_{0}$ ). The dotted line fits curves of the $T_{50}$ data in (H) to equation $R_{0}^{n} \times T_{50} = constant$ , in which n is the acceleration factor (n = 1.74). The solid circles represent completed $T_{50}$ measurements. The open circles indicate the extrapolated $T_{50}$ lifetimes at medium and low current densities, which are anticipated to be finalized after extended periods.

Discussion

We have identified excessive hole injection as the primary driver of EL degradation in $CsSnI_{3}$ , which initiates the electrochemical oxidation of $Sn^{2+}$ and triggers an irreversible phase transition to $Cs_{2}SnI_{6}$ . Guided by this mechanistic understanding, we demonstrated that $FA^{+}$ doping effectively suppresses both the detrimental $CsSnI_{3} \rightarrow Cs_{2}SnI_{6}$ phase transition under operational bias and defect-mediated nonradiative recombination, enabling efficient and stable NIR emission. The optical properties and electronic structure of the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ film can be further improved by the introduction of TPPO. As a result, the $Cs_{0.9}FA_{0.1}SnI_{3}$ -TPPO-based PeLEDs showed an EQE as high as 21.2% and a long operating $T_{50}$ of 920.5 hours at 7.1 W sr $^{-1}$ m $^{-2}$ . These findings indicate that the development of lead-free Sn-based NIR-PeLEDs represents a major step forward in the field of light-emitting technologies, offering both environmental benefits and enhanced performance metrics, thus making them highly suitable for a variety of cutting-edge applications.

REFERENCES AND NOTES

1. H. Wang, A. Treglia, M. D. Albaqami, F. Gao, A. Petrozza, ACS Energy Lett. 9, 2500–2507 (2024).

2. D. Han et al., Nature 622, 493–498 (2023).

3. H. Min et al., Nat. Photonics 17, 755–760 (2023).

4. H. Min et al., Nat. Nanotechnol. 19, 632–637 (2024).

5. F. Yuan et al., Nat. Photonics 18, 170–176 (2024).

6. X.-K. Liu et al., Nat. Mater. 20, 10–21 (2021).

7. W. Bai et al., Angew. Chem. Int. Ed. 62, e202312728 (2023).

8. M. Vasilopoulou et al., Nat. Photonics 15, 656–669 (2021).

RESEARCH ARTICLES

COMPUTER ENGINEERING

Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging

Liheng Bian*†, Qinghao Meng†, Lianjie Li, Zhen Wang, Yibo Feng, Xuan Peng, Jiajun Zhao, Jingyi Wang, Zhu Yang, Jun Zhang*

In this work, we tackled the long-standing challenge of the massive computation for hyperspectral imaging that is required to reconstruct and process large-volume spatial-spectral data cubes. Specifically, we designed a hardware accelerator, fabricated as a neural processing unit (NPU) capable of 9.3 tera operations per second at 16-bit integer (INT16), alongside a topology-aware structured pruning strategy for a lightweight reconstruction network. Through integration with our HyperspecI sensor, we demonstrate a fully standalone visible–near-infrared hyperspectral microsystem (\~950 grams) that requires neither external power nor computing resources. The microsystem achieved real-time hyperspectral imaging at 32.9 frames per second (512×512, 61 channels) or 24.6 frames per second (1024×1024, 16 channels) and consumed only \~25.3 watts (367 giga–operations per second per watt). Application demonstrations in intelligent driving and air-to-ground monitoring highlight its practical potential advancing computational hyperspectral imaging from offline processing to integrated online perception.

Hyperspectral imaging (1, 2) captures spatiotemporal information of the physical world and simultaneously acquires a detailed spectral fingerprint for each pixel across hundreds of spectral bands. Compared with conventional red-green-blue (RGB) imaging, hyperspectral imaging leverages its high-dimensional information to transcend the limitations of human vision and achieve intrinsic material identification. With these advantages, hyperspectral imaging has been widely applied in various fields such as food inspection (3), surgical navigation (4), and precision agriculture (5). With advancements in spectral encoding and compressive sensing techniques (6, 7), existing methods can compress the spatial-spectral data cube into a single-exposure frame. Examples include the computed tomography imaging spectrometer (CTIS) (8) and coded aperture snapshot spectral imaging (CASSI) (9), which have successfully demonstrated real-time acquisition of dynamic scenes, overcoming the speed limitations of traditional mechanical push-scan imaging. In the past decade, nanofabricated metasurface (10–13), photonic crystal slab arrays (14), quantum dots (15), Fabry-Perot filters (16), scattering media (17, 18), and other innovative devices have driven the shift from bulky optical configurations to chip-scale integration through finely tunable spectral filtering capabilities and miniaturized integration designs. Despite the advances of various hardware architectures, the inherent compressive acquisition principle relies on high-complexity neural networks (19) to reconstruct large-volume spatial-spectral data from a single frame, as well as subsequent hyperspectral computation for semantic inference. Even when these computations are performed on high-performance computing clusters, the per-frame processing latency remains high, making it difficult to align with the real-time requirements of front-end data acquisition (12, 13, 20).

The field programmable gate array (FPGA)-based hardware acceleration technique has markedly improved computation efficiency by mapping computation-intensive algorithms to dedicated hardware logic circuits. Its core advantages lie in inherent parallelism at the hardware level, deeply pipelined architectures, and customized memory hierarchies, enabling low-latency and high-throughput data processing for specific algorithms. Mainstream neural network models, including convolutional neural network (CNN), recurrent neural network (RNN), generative adversarial network (GAN), and self-attention architecture (Transformer), have been rapidly deployed and validated on FPGA accelerators, with broad applications in unmanned systems, autonomous driving, and biomedical fields (21–26). However, a gap persists between existing neural network accelerator design paradigms and the requirements of real-time hyperspectral decoupling. First, mainstream research primarily focuses on general-purpose accelerators for universal neural networks (21), without conducting in-depth optimization for multidimensional feature extraction and spectral attention mechanisms in reconstruction tasks, and it lacks the design of heterogeneous operators for cross-modal fusion (27, 28). Second, the existing universal accelerators adopt a fixed algorithm design mode, failing to lighten the neural network architecture driven in reverse by hardware computing logic, which restricts the potential of software-hardware co-optimization (29, 30). Third, existing acceleration solutions mostly remain at the FPGA prototype verification stage, with their architectural designs yet to be validated for compatibility with application-specific integrated circuit (ASIC) manufacturing processes through tape-out. Such an order-of-magnitude gap between the theoretical energy efficiency ratio and the throughput requirements of industrial-grade dynamic scenarios makes it difficult to realize online video-rate hyperspectral imaging. A comprehensive performance comparison of different systems is detailed in supplementary materials (SM) sections 1 and 2.

In this work, we present an on-chip hyperspectral computing technique with hardware-software codesign to tackle the long-standing challenge of the requirement of massive computation for hyperspectral imaging. The technique is based on a new dataflow spatial computing principle derived from the data locality theory (31, 32), which differs from the traditional von Neumann control-flow time-division multiplexing (33) and achieves a transformation from discrete instruction granularity stacking of general-purpose units to continuous operator granularity scheduling of dedicated dataflow. Following the principle, we designed a dual double-buffer accelerator (D²BA) at the hardware level that incorporates a pipelined, nested double-buffer parallel architecture. This architecture uses a three-dimensional pipeline nesting scheme across spatial, channel, and temporal dimensions, achieving fully overlapped zero-bubble execution of loading, computation, and storage operations. It thereby extends traditional single-temporal-dimension double-buffering into a multilayered concurrent and multidimensional acceleration framework. The hardware operator computational dataflow was further optimized for Transformer-CNN hybrid hyperspectral reconstruction networks, achieving a single-frame processing latency below 220 ms at half-precision 16-bit floating point (FP16) in FPGA prototype verification, with a throughput of 210 giga-floating-point operations (GFLOPs) per second at 200 MHz. With the D²BA accelerator, we taped out an ASIC-processed high-performance neural processing unit (NPU) chip termed HyperN, delivering a peak computing performance of 9.3 tera operations per second (TOPS) at 16-bit integer (INT16) that enabled real-time hyperspectral reconstruction. At the software level, we propose a computational graph topology-depth optimization (CGT-DO) approach, a structured pruning strategy driven by hardware computational logic. Although deep networks enhance the abstraction capability of spectral features, their repetitive cascaded computations lead to a pipeline cycle in hardware. The CGT-DO strategy uses sensitivity-driven structured pruning to compress network topology depth and simultaneously reduces parameter counts and heterogeneous operator invocation frequency, yielding a lightweight hyperspectral reconstruction network (Lite-SRNet) optimized for embedded hyperspectral imaging.

Results

Further, as for the system-level validation of the computing architecture, we integrated the HyperN chip together with the hyperspectral acquisition sensor (HyperspecI) (1), developing a visible-near-infrared (400 to 1000 nm) online video-rate hyperspectral computing microsystem, termed Hypervision. The HyperspecI sensor uses broadband spectral modulation materials with varying spatial distributions, achieving nonuniform compressive encoding in the spatial-spectral domain and maintaining 74.8% optical throughput. Coupled with the efficient computing capability of HyperN, the Hypervision microsystem realized real-time hyperspectral imaging in 61 wavelength channels with 512×512 pixels at 32.9 frames per second (fps) or 16 wavelength channels with 1024×1024 pixels at 24.6 fps. The microsystem is highly integrated without an external power supply or additional bulky computing platform, weighing only \~950 g with one-order-lower power consumption (\~25.3 W), delivering an energy efficiency ratio of 367 giga-operations per second (GOPS)/W that is comparable to on-board space-grade chips and edge artificial intelligence (AI) computing devices. With the online real-time capability, the Hypervision microsystem holds great potential for time-sensitive applications. To demonstrate, we conducted intelligent driving and air-to-ground monitoring applications. In the intelligent-driving scenario, Hypervision enabled dynamic target spectral analysis, road obstacle material identification, and ground-state characterization. In air-to-ground monitoring, we integrated Hypervision into a self-assembled compact quadcopter unmanned aerial vehicle (UAV), successfully achieving real-time hyperspectral reconstruction on board. These applications demonstrated Hypervision's breakthrough advantages in high signal-to-noise ratio, dynamic spectral acquisition, real-time decoupling reconstruction, and low power consumption, which provide potential for the next generation of integrated, online, and video-rate hyperspectral cameras and systems.

HyperspecI sensor and the HyperN chip (Fig. 1A). The HyperspecI sensor dynamically encodes the target scene in the spectral domain, compressing high-dimensional spectral information into a single-frame acquisition. The acquired encoded image is transmitted to the HyperN computing chip. By using the lightweight hybrid neural network Lite-SRNet, the chip performs frame-by-frame reconstruction of

Hyperspectral imaging performance of Hypervision

The Hypervision microsystem consists of two hardware components: the hyperspectral images, producing real-time visualization of dynamic scenes. This closed-loop workflow integrates optical encoding, data acquisition, real-time decoupling, and visual output into a complete microsystem that transitions from traditional acquisition equipment plus a graphics processing unit (GPU) to an all-in-one near-sensor computing solution.

B
C

D

Fig. 1. Working performance of Hypervision for online video-rate hyperspectral imaging. (A) The Hypervision microsystem consists of the Hyperspecl sensor and the HyperN chip. Light emitted from the target scene is modulated and acquired by the Hyperspecl sensor. The collected raw data are fed into the HyperN computing chip, where the Lite-SRNet decouples hyperspectral images in real time. (B) Schematic diagram of the Hypervision microsystem, highlighting its all-in-one integrated design with no external power or computing requirements. Performance comparison of the custom computing chip HyperN against mainstream snapshot hyperspectral imaging system. MVoxel indicates million voxel, which describes the data volume of hyperspectral images. (C) The left panel shows aerial views from the UAV-borne Hypervision system during real-time cruising. The middle panel compares the raw data and synthesized RGB images. The right panel shows the spectral curves of the locations P1 to P4 yellow stars, validating real-time analysis capability in an open environment. (D) The left panel presents the experimental configuration for capturing a flame gun's ignition process using Hypervision. The middle panel shows the reconstruction results in the synthesized RGB format. The right panel illustrates the corresponding spectral curves at the same location throughout the dynamic ignition process (P1 to P5 yellow stars); the shaded regions indicate the dynamic spectral curve changes of the flame.

We further integrated the Hypervision microsystem into a complete device, with self-contained functions of power supply, real-time hyperspectral imaging, and display (Fig. 1B). The device used a carbon-fiber housing and incorporated a customized 15,000 mA·hour power module and a 5-inch (1 inch = 2.54 cm) display. With overall dimensions of only 92 mm by 96 mm by 112 mm and a mass of 950 g, the device featured a highly compact and lightweight design. A single charge supported up to 6 hours of continuous operation. To meet the concurrent demands for multidimensional information acquisition and processing efficiency in dynamic scenarios, Hypervision supported flexible switching between operating modes, enabling online videorate hyperspectral imaging in either 61 wavelength channels with $512 \times 512$ pixels at 32.9 fps or 16 wavelength channels with $1024 \times 1024$ pixels at 24.6 fps. This device achieved high-performance in situ hyperspectral reconstruction and sensing within an extremely compact form and low-power framework.

To validate the imaging performance and scene generalization capability of Hypervision, we conducted hyperspectral imaging experiments under three representative illumination conditions, including indoor controlled lighting (halogen: 400 to 1000 nm), single-source indoor lighting [light-emitting diode (LED): 400 to 700 nm], and dynamic outdoor lighting (sunlight: 400 to 1000 nm). The peak signal-to-noise ratio (PSNR) of the hyperspectral images reached as high as 42.97 dB. The average spectral fidelity is 99.815% (more details are presented in SM section 6.1). The hyperspectral imaging results of the Hypervision microsystem were obtained in both outdoor and indoor dynamic scenarios. The outdoor experiment used a self-developed UAV platform, and both the raw data and the synthesized RGB reconstruction from the real-time cruising mission were obtained with corresponding spectral profiles (Fig. 1C). Figure 1D presents the reconstructed hyperspectral data of a flame gun's ignition process in synthesized RGB format, along with the extracted spectra at a selected location. These results collectively validated that the Hypervision microsystem could not only precisely capture spatial-spectral information in controlled transient scenes but also maintain robust dynamic hyperspectral imaging capabilities in complex, open environments, demonstrating its adaptability across diverse application platforms. A comprehensive performance experiment of Hypervision is detailed in SM section 6.

Working principle and performance of HyperN

HyperN performs the computing task in the Hypervision microsystem. Its innovation lies in an innovative dataflow spatial computing principle derived from the data locality theory (31, 32), which differs from the traditional von Neumann control-flow time-division multiplexing principle (33). It unfolds the computation graph in physical space, allowing data to flow continuously through spatially distributed operators without being cut by instruction boundaries. Such spatial dataflow eliminated pipeline bubbles, kept computing units fully saturated, and maximized throughput under tight power budgets. The architecture is generalized and reconfigurable, not hardwired for any specific network, making it applicable to any image reconstruction and processing tasks using the supported operators.

For hardware operators, we designed the differentiated hardware optimization strategy tailored to the heterogeneous computing characteristics of the network (fig. S2A and SM section 3.2). Figure 2A presents quantitative experiment results of the hardware operators optimization strategies, with look-up table (LUT) utilization and single-inference latency as key performance metrics. For standard convolution (kernel size $3 \times 3$ , $1 \times 256 \times 256$ to $32 \times 256 \times 256$ ), the $\mathrm{D}^2\mathrm{BA}$ architecture increased LUT occupation by 18% but achieved a 55% latency reduction (2.25× acceleration) compared with a traditional double-buffering implementation. In the downsample operation (kernel size 4×4, 32×256×256 to 32×128×128) with four high-performance (HP) interface parallelization, it produced a 27% LUT overhead but achieved a 60% latency improvement (2.62× acceleration). Although maintaining equivalent LUT resource utilization, the parameters' dimensional reduction strategy for pointwise convolution (32×256×256) realized 17% (1.21× acceleration) latency reduction, and the dynamic trigger-based parameter loading strategy for depthwise convolution (32×256×256) realized 34% (1.52× acceleration) latency reduction. In addition, our 64-term series approximation for Softmax computation (4×32×32) reduced resource usage to 31% (3.19× optimization) with maintained inference latency, achieving as low as 0.49% root mean square error.

Further, we report the D²BA hardware accelerator for the Transformer-CNN hybrid hyperspectral reconstruction network. Figure 2B illustrates the architecture of the accelerator, which uses off-chip DDR4 memory to manage network weights, biases, and intermediate feature maps. The processing system side, powered by ARM cores, handles global logic control and data flow scheduling. The high-throughput data exchange with the programmable logic side was achieved through four Advanced eXtensible Interface 4 (AXI4) HP interfaces. The compute unit consisted of a parallelized processing engine (PE) array, where each PE is logically composed of a buffer module, data stream module, and compute module to enable efficient computation.

The buffer module dynamically activated input-output buffers at the current timestep via dual-ported block random access memory (RAM), and the data stream module used a dual double-buffering architecture that pioneered a three-dimensional pipeline overlay across spatial, channel, and temporal domains. This design enabled zero-bubble execution of loading, computation, and storage, extending traditional single-temporal-dimension double-buffering into a multilevel concurrent and multidimensional acceleration framework (a comparison between $D^{2}BA$ and traditional double-buffering is detailed in SM section 3.1 and fig. S1). At the spatial dimension, the outer loop pipelines block computation and block storage using coarse-grained double-buffering. Within each block, the channel dimension is further decomposed into tile-level units, where an inner dual-buffered pipeline concurrently executes tile loading and tile computation, thus overlapping memory and compute across input-output channels. Finally, within each tile core, a fine-grained temporal pipeline ensures stall-free execution through operator-level scheduling. This three-dimensional coordination across spatial, channel, and temporal pipelines enabled the data stream module to act as a multilevel concurrent engine, systematically hiding latency at all granularities and surpassing the efficiency of conventional single-level buffering. The computing module mapped the underlying arithmetic logic through a multilevel multiplier-additive array and executed computation in strict adherence to the intellectual property (IP) core operators design paradigm. The accelerator was functionally validated on a heterogeneous FPGA of Xilinx Zynq AXU15EG, producing an end-to-end latency of less than 220 ms for single-frame hyperspectral reconstruction with FP16 precision. More details on the energy and resource analysis of $D^{2}BA$ can be found in SM section 3.3.

For ASIC implementation, the $D^{2}BA$ accelerator was designed at the register-transfer level and packaged as a synthesizable NPU IP core with an instruction-set architecture and AXI4 interfaces, enabling standardized integration into a system on chip (SoC). The SoC used a hierarchical AXI4 bus to interconnect four functional modules (Fig. 2C). The intelligent computing module integrated two NPU processors with multilevel clock gating for power efficiency. Each NPU occupied 27.8 mm $^{2}$ , consumed 12 W, and supported multiple data types for real-time inference. The central processing unit (CPU) module, based on dual quad-core ARMv8 processors [1.2 GHz, 2.3 Dhrystone million instructions per second (DMIPS)/MHz], handled system control, task scheduling, and postprocessing. The memory module incorporated four DDR4 controllers [3200 megatransfers (MT)/s] for NPU data caching, and the interface module provided a peripheral component interconnect express (PCIe; four-lane, 8.0 GT/s) for display connectivity and low-speed peripherals [universal asynchronous receiver-transmitter (UART), serial peripheral interface (SPI), general purpose input-output (GPIO)]. The final chip layout (Fig. 2C) used modular partitioning and multi-power domain codesign, with DDR4 controllers placed at the periphery for optimized signal routing. The fabricated HyperN NPU (Fig. 1A) had a die area of $279.1\mathrm{mm}^2$ and was packaged in 4.3-cm-by-4.3-cm Flip-Chip ceramic column grid array (CCGA). Operating at 1 GHz with a core voltage of $-0.3$ to $+1.1\mathrm{V}$ , the chip-only power was

A

B
C

D
E

Fig. 2. Working principle and performance of HyperN. (A) Hardware operator optimizations are quantified and evaluated by LUT usage utilization (orange) and inference latency (blue). $e^{x}$ , exponential operation. (B) The $D^{2}BA$ hardware accelerator uses off-chip DDR4 memory to manage network parameters and feature data, with the processing system side handling global control and communicating with the programmable logic side via four AXI4 HP interfaces. The compute unit consists of a parallel PE array, where each PE includes buffer module (BM), data stream module (DSM), and compute module (CM), supporting a dual double-buffered pipelined architecture that orchestrates concurrent execution across spatial, channel, and temporal dimensions. (C) The HyperN SoC architecture integrates intelligent computing modules, CPU modules, memory modules, and interface modules, using multilayer AXI4 buses for efficient data transfer, and the chip layout uses a modular partitioning strategy to optimize power and timing. (D) Sensitivity-guided channel-pruning analysis, visualizing the S-value distribution of different intragroup convolutional kernels in Lite-SRNet modules. (E) Performance comparison of the baseline SRNet, Lite-SRNet (pruning rate: 20%), channel-pruned Lite-SRNet (pruning rate: 50%), and L1-norm channel-pruned Lite-SRNet (pruning rate: 30%) in terms of network information (table), single-frame inference latency (orange), LUT resource usage (blue), and PSNR (red line). The insets show the synthesized RGB images reconstructed by different methods.

25.3 W under peak operating conditions and delivered 9.3 TOPS (INT16) peak performance, providing a high-efficiency chip-level solution for real-time hyperspectral computing. More details of the HyperN chip can be found in SM section 4.

For the reconstruction algorithm, we used the CGT-DO strategy (fig. S8) to construct a lightweight network through module pruning (pruning rate 20%), termed Lite-SRNet (network details are referred to in SM section 5.2). Compared with the baseline SRNet model (1), the single-frame inference latency was reduced from 309 to 220 ms, and the LUT resource usage decreased from 329.6 thousand to 243.2 thousand and maintained a high reconstruction PSNR of 42.97 dB (Fig. 2E). To further compress model parameters, we performed channel pruning on

Lite-SRNet. Figure 2D illustrates the S-value distribution of different convolution kernels in different groups. Based on this analysis, we applied structured pruning with a rate of 50%, reducing the network parameters to 0.457 million and computational cost to 16.2 GFLOPs. Compared with the conventional L1-norm pruning (34), our method achieved a PSNR of 41.09 dB under a higher pruning rate (Fig. 2E), notably outperforming the L1-pruned model (31.41 dB).

Application for intelligent driving

In intelligent driving systems, the integration of spectral information can substantially enhance multidimensional environmental perception capabilities. By leveraging dynamic spectral feature extraction, the sensing boundaries of conventional vision systems can be transcended, offering cross-modal perception capabilities for autonomous driving decision-making. Figure 3 presents the validation experiment of the Hypervision in an intelligent driving demonstration. We mounted the Hypervision microsystem onto a vehicle using a suction-cup device (Fig. 3A). The vehicle moved in a straight line at a speed of 20 km/hour, and the microsystem realized real-time perception in multiple conditions including surface identification, material identification, and road identification (Fig. 3A). Condition 1 compared wet and dry road surfaces to validate Hypervision's ability to analyze road conditions in low-contrast environments. Condition 2 involved artificial and natural stone obstacles to test material authenticity discrimination based on spectral reflectance features. Condition 3 selected typical road targets (buildings and trees) to validate the system's capability for real-time spectral reconstruction and analysis.

Figure 3B presents the raw measurement images, real-time reconstructed synthesized RGB images, and fused results after real-time semantic segmentation of hyperspectral images using the RepViT algorithm (35), across six dynamic frames during driving. The targets, such as roads, trees, and buildings, were successfully segmented at the pixel level, demonstrating the microsystem's real-time perception capability in outdoor environments. Figure 3C shows the reconstructed spectra of wet and dry road surfaces collected in the first condition. By analyzing the spectral differences in the 550- to 900-nm wavelength

A

B

C

D
E

Fig. 3. Outdoor validation experiment for intelligent driving. (A) Shown on the left is Hypervision mounted on a vehicle by a suction-cup device. Shown on the right are three dynamic scenes captured during straight-line driving at 20 km/hour. Condition 1 compares wet and dry road surfaces. Condition 2 compares artificial and natural stone obstacles. Condition 3 includes typical road targets (buildings and trees). (B) Six dynamic frames showing raw measurements, real-time reconstructed RGB images, and real-time semantic segmentation results (RepViT), achieving pixel-level segmentation of roads, trees, and buildings. (C) Reconstructed spectra of wet and dry road surfaces (550 to 900 nm), demonstrating accurate low-contrast surface-state inference. GT, ground truth; RS, reconstruction. (D) Reconstructed spectra of artificial and natural stones (700 to 900 nm), showing marked spectral differences for dynamic material identification. (E) Reconstructed spectra of trees and buildings (400 to 1000 nm), validating real-time hyperspectral imaging and target spectral information extraction under dynamic conditions. The average spectral fidelity is 99.849%.

range, Hypervision was able to accurately infer the road surface state in low-contrast environments. Figure 3D presents the reconstructed spectra of artificial and natural stone samples collected in the second condition. In the 700- to 900-nm wavelength range, the two samples exhibited pronounced spectral differences. Hypervision achieved dynamic material identification, providing critical material information for autonomous obstacle avoidance in intelligent driving. Figure 3E shows the reconstructed spectra of trees and buildings beside the road.

Throughout the full spectral range of 400 to $1000\mathrm{nm}$ , the spectral features of the two were distinctly different, further validating Hypervision's capability for real-time hyperspectral imaging and extraction of target spectral information under dynamic conditions. The ground-truth hyperspectral images of the same scene were acquired using the FigSpec-23 push-scan hyperspectral camera, and the comparison with the reconstruction of Hypervision yielded an average spectral fidelity of $99.849\%$ .

Application for air-to-ground monitoring

For air-to-ground monitoring applications, integrating real-time hyperspectral imaging and analysis onto lightweight mobile platforms such as drones faces persistent systemic challenges. Traditional push-scan hyperspectral imaging is too bulky, heavy, and power-hungry for small UAV. Even if integrated, their line-scanning mechanism is prone to substantial motion artifacts and geometric distortions during platform movement, leading to spectral and spatial information distortion and failing to meet dynamic monitoring needs. Although snapshot hyperspectral cameras can capture images instantly, their typical architecture, which separates capture, storage, and offline processing, suffers from high data throughput and processing delay. This makes it difficult to support tasks requiring real-time feedback of hyperspectral information.

To comprehensively evaluate the practical advantages of the Hypervision device, we integrated it into a self-assembled compact quadcopter UAV, successfully achieving real-time hyperspectral reconstruction for an air-to-ground monitoring application. The UAV features a lightweight and compact design, with overall dimensions of 620 mm by 640 mm by 860 mm, a maximum wheelbase of 680 mm, a net mass of 2.5 kg, and a with the HyperspecI sensor (1) to develop an integrated computational microsystem termed Hypervision, enabling online video-rate hyperspectral imaging in the visible -near-infrared range for dynamic scenes. Compared with existing systems (tables S3 and S4), Hypervision maintained a compact volume of $92\mathrm{mm}$ by $96\mathrm{mm}$ by $112\mathrm{mm}$ , had a mass of $950\mathrm{g}$ , and operated continuously for 6 hours without external power or bulky computing platforms, consuming only $25.3\mathrm{W}$ , which is an order of magnitude lower than a common GPU. We validated its effectiveness and distinctiveness by real-time recognition of road targets for intelligent driving and air-to-ground monitoring.

In principle, the existing hyperspectral imaging systems (7) follow the von Neumann architecture, in which arithmetic operations and data movement are serialized through a shared set of general-purpose computing units. Each operation requires explicit instruction dispatch and frequent configuration switching at every clock cycle, incurring considerable instruction overhead. Intermediate results are repeatedly written back to off-chip memory and reloaded for subsequent instructions, fragmenting the dataflow and degrading memory locality. This disjoint scheduling precludes meaningful overlap between computation and data transfer, thereby exacerbating the memory-wall bottleneck.

it can sustain a flight endurance of up to 10 min. After integration, field experiments were conducted at a cruising altitude of $\sim$ 100 m, during which the Hypervision device operated independently without drawing power from the UAV. Figure 4A clearly illustrates the mounting configuration of the microsystem on the UAV, as well as the take-off and high-altitude cruising states. Figure 4B presents exemplar six frames of acquired raw data and corresponding synthesized RGB images. Figure 4C displays the reconstructed spectra of snow, trees, bushes, and ground scenes captured during UAV cruising. We used the Ocean Optics USB 2000+ spectrometer to acquire ground-truth spectra of snow, trees, bushes, and ground surfaces. A comparison with Hypervision's reconstruction yielded an average spectral fidelity of 99.629%. The experiment fully demonstrated the system-level advantages of the Hypervision microsystem in terms of lightweight design, low power consumption, and real-time processing, providing an efficient and reliable solution for airborne hyperspectral remote sensing.

B

C

Conclusions and discussion

In this work, we report an on-chip hyperspectral computing framework with a hardware-software codesign paradigm that achieves online hyperspectral imaging reconstruction. At the hardware level, we designed a $D^{2}BA$ hardware accelerator, which was prototyped on a FPGA and then fabricated into a high-performance NPU termed HyperN. At the software level, we introduced a CGT-DO structural pruning strategy, which deeply optimized the network topology through hardware computation logic-driven reverse engineering, resulting in a lightweight hyperspectral reconstruction network termed Lite-SRNet. Further, we embedded the HyperN chip together

Fig. 4. Validation experiment of Hypervision for air-to-ground monitoring. (A) Experiments of the Hypervision microsystem integrated into a small self-assembled UAV platform for high-altitude real-time hyperspectral reconstruction. (B) Six sets of dynamic frame-measurement raw data acquired during high-altitude flight and their corresponding synthesized RGB images. (C) Spectral curves captured during the cruise for typical scenes: trees, snow, bushes, and ground. The average spectral fidelity is 99.629%.

Consequently, computing resources remain persistently underused, and both power consumption and latency scale linearly with computing demand. By contrast, Hypervision follows the dataflow spatial computing principle derived from the data locality theory, which schedules dedicated dataflow at the continuous operator granularity and achieves near-sensor computing by embedding computation directly at the acquisition end. Specifically, we scheduled dedicated data paths at the operator granularity, effectively unfolding the computational graph into physical space. The neural network operators were realized as configurable logic blocks, and data flows continuously through spatially distributed processing units when loaded into on-chip buffers, completing the full operator chain before being written back, thereby enabling deep on-chip data reuse. Three-dimensional dataflow scheduling across spatial, spectral, and temporal dimensions enabled seamless overlap of computing and data movement, eliminating pipeline stalls. This continuous execution kept computing units fully saturated, achieving high throughput under a stringent power budget. This paradigm shift from control-flow time-division multiplexing to dataflow spatial computing enabled Hypervision to overcome the mismatch between reconstruction latency and real-time acquisition requirements.

The present implementation still leaves room for further enhancement. First, the inherent trade-off among spatial resolution, spectral channels, and frame rate can be further mitigated by advanced process nodes and Chiplet-based heterogeneous packaging to improve integration density, throughput, and energy efficiency (36). Second, to further improve generalization and robustness for domain-shift reconstruction, the model can be trained with a more diverse dataset with different scenes and different illuminations. The transfer-learning strategies, such as domain generalization, can also be introduced to improve the model's ability to process out-of-distribution data (37). Overall, we believe this work provides an approach for a new generation of all-in-one online-processing cameras, and we envision that the reported technique can be further applied in multiple fields, such as biomedicine (e.g., intraoperative navigation) (38), remote sensing on micronano spaceborne platforms (39), and wearable sensing (40).

REFERENCES AND NOTES

1. L. Bian et al., Nature 635, 73–81 (2024).

2. D. Li, J. Wu, J. Zhao, H. Xu, L. Bian, Nat. Commun. 15, 9459 (2024).

3. D. W. Sun, H. Pu, J. Yu, Nat. Rev. Electr. Eng. 1, 251–263 (2024).

4. J. Yoon et al., Nat. Commun. 10, 1902 (2019).

5. B. G. Ram, P. Oduor, C. Igathinathane, K. Howatt, X. Sun, Comput. Electron. Agric. 222, 109037 (2024).

6. X. Yuan, D. J. Brady, A. K. Katsaggelos, IEEE Signal Process. Mag. 38, 65–88 (2021).

7. Y. Xu, L. Lu, V. Saragadam, K. F. Kelly, Nat. Commun. 15, 1456 (2024).

8. M. Descour, E. Dereniak, Appl. Opt. 34, 4817–4826 (1995).

9. A. Wagadarikar, R. John, R. Willett, D. Brady, Appl. Opt. 47, B44–B51 (2008).

10. F. Yesilkoy et al., Nat. Photonics 13, 390–396 (2019).

11. C.-H. Lin, S.-H. Huang, T.-H. Lin, P. C. Wu, Nat. Commun. 14, 6979 (2023).

12. J. Xiong et al., Optica 9, 461–468 (2022).

13. H. He et al., Adv. Mater. 36, e2313357 (2024).

14. Z. Wang et al., Nat. Commun. 10, 1020 (2019).

15. S. Liu et al., Nat. Photonics 18, 967–974 (2024).

16. M. Yako et al., Nat. Photonics 17, 218–223 (2023).

17. X. He et al., Nat. Electron. 7, 694–704 (2024).

18. D. S. Jeon et al., ACM Trans. Graph. 38, 1–13 (2019).

19. W. Zhang et al., Light Sci. Appl. 10, 108 (2021).

20. X. Du et al., Nat. Electron. 7, 984–990 (2024).

21. T. Wang et al., IEEE Trans. Comput. Aided Des. Integr. Circ. Syst. 41, 4088–4099 (2022).

22. Z. Li et al., in Proceedings of the 32nd International Conference on Field-Programmable Logic and Applications (IEEE, 2022), pp. 109–116.

23. Z. Luo, L. Lu, Y. Jin, L. Jia, Y. Liang, in Proceedings of the 33rd International Conference on Field-Programmable Logic and Applications (IEEE, 2023), pp. 242–247.

24. W. Ye, X. Zhou, J. Zhou, C. Chen, K. Li, ACM Trans. Embed. Comput. Syst. 22, 1–22 (2023).

25. D. Parikh et al., in 2024 IEEE 32nd Annual International Symposium on Field-Programmable Custom Computing Machines (IEEE, 2024), pp. 78–89.

26. H. You et al., in 2023 IEEE International Symposium on High-Performance Computer Architecture (IEEE, 2023), pp. 273–286.

27. Y. Fu, T. Zhang, L. Wang, H. Huang, IEEE Trans. Pattern Anal. Mach. Intell. 44, 3404–3420 (2022).

28. X. Hu et al., in Proceedings of the 2022 IEEE/CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (IEEE, 2022), pp. 17521–17530.

29. R. Sarkar, H. Liang, Z. Fan, Z. Wang, C. Hao, in 2023 IEEE/ACM International Conference on Computer Aided Design (IEEE, 2023), pp. 1–9.

30. Z. Zhao et al., IEEE Trans. Circuits Syst. II Express Briefs 70, 281–285 (2023).

31. H. Chavan, R. Alghamdi, M. F. Mokbel, in 2016 IEEE 32nd International Conference on Data Engineering Workshops (IEEE, 2016), pp. 135–142.

32. M. Budiu, G. Venkataramani, T. Chelcea, S. C. Goldstein, in Proceedings of the 11th International Conference on Architectural Support for Programming Languages and Operating Systems (ACM, 2004), pp. 14–26.

33. J. von Neumann, IEEE Ann. Hist. Comput. 15, 27–75 (1993).

34. H. Li, A. Kadav, I. Durdanovic, H. Samet, H. P. Graf, in Proceedings of the 5th International Conference on Learning Representations (2017).

35. A. Wang, H. Chen, Z. Lin, J. Han, G. Ding, in Proceedings of the IEEE/CVF conference on computer vision and pattern recognition (IEEE, 2024), pp. 15909–15920.

36. W. Tang et al., IEEE J. Solid-State Circuits 59, 1235–1245 (2023).

37. K. Zhou, Z. Liu, Y. Qiao, T. Xiang, C. C. Loy, IEEE Trans. Pattern Anal. Mach. Intell. 45, 4396–4415 (2023).

38. G. Lu, B. Fei, J. Biomed. Opt. 19, 10901 (2014).

39. A. F. Goetz, G. Vane, J. E. Solomon, B. N. Rock, Science 228, 1147–1153 (1985).

40. Q. Jiang et al., Sci. Adv. 11, eadw7279 (2025).

41. L. Bian, The dataset for the network in the paper titled Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging. Science Data Bank (2026); https://doi.org/10.57760/sciencedb.41690.

42. L. Bian, The data underlying the main figures of the paper titled Hypervision: An on-chip hyperspectral microsystem for online video-rate computational imaging. Science Data Bank (2026); https://doi.org/10.57760/sciencedb.41693.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Y. Liu from the Department of Automation, Tsinghua University, and B. Wang from the School of Chemistry and Chemical Engineering, Beijing Institute of Technology, for their inspiring discussions during revision. We thank the Analysis and Testing Center at the Beijing Institute of Technology for assistance in material preparation and testing. Funding: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (61827901, 62322502, and 62131003), the Scientific Research Innovation Capability Support Project for Young Faculty (ZYGXQNJSKYCXNLZCXM- I4), and the Beijing Natural Science Foundation (JQ25017). Author contributions: L.B., Q.M., and Ju.Z. conceived the idea. L.L. and Z.W. performed the design and integration of the HyperspecI sensor. Q.M. and X.P. designed and tested the computing chip. Q.M. and Ji.Z. completed the design and optimization of the reconstruction algorithm. Z.Y. completed the tape-out of the computing chip. Q.M., Z.W., J.W., Y.F., and L.L. implemented the applications. L.B., Q.M., L.L., X.P., Z.W., and Ji.Z. prepared the figures and wrote the paper with input from all the authors. L.B. and Ju.Z. supervised the project. Competing interests: L.B., Q.M., and Ju.Z. hold patents on technologies related to this work (China patent nos. ZL202410781451.7, ZL 202210764166.5, and ZL 202210764141.5) and have submitted the related patent applications. Data, code, and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the supplementary materials. The dataset for the network and the data underlying the main figures are available on Science Data Bank (41,42). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aef8268

Materials and Methods; Figs. S1 to S12; Tables S1 to S5; References (43–100); Movies S1 to S3

Submitted 27 January 2026; resubmitted 11 May 2026; accepted 1 July 2026

10.1126/science.aef8268

METABOLISM

SGLT2 inhibitors activate pantothenate kinase in the human heart

Nicholas Forelli $^{1\dagger}$ , Trace Thome $^{1\dagger}$ , Deborah M. Eaton $^{1}$ , Kollin Schultz $^{1}$ , Jiten Patel $^{1}$ , Caitlyn E. Bowman $^{1}$ , Ryo Kawakami $^{1}$ , Jae Woo Jung $^{1}$ , Ivan A. Kuznetsov $^{1}$ , Kristina Li $^{1}$ , Jialiu A. Liang $^{1}$ , Kirsten Branch $^{1}$ , Claire Brady $^{1}$ , Kenneth C. Bedi Jr. $^{1}$ , Yijun Yang $^{1}$ , Kaustubh Koya $^{1}$ , Nesrine Bouhrira $^{1}$ , Emily Megill $^{2}$ , Daniel S. Kantner $^{2}$ , Louis G. Smith $^{3}$ , Cristin F. MacIntosh $^{3}$ , Kushol Gupta $^{3}$ , Gregory R. Bowman $^{3}$ , Nathaniel W. Snyder $^{2}$ , Jonathan Edwards $^{4}$ , Kenneth B. Margulies $^{1}$ , Zoltan Arany $^{1,5*}$

Sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors (SGLT2i) reduce mortality in heart failure, but their pharmacological target remains unclear. In this study, we showed that SGLT2i directly activate pantothenate kinase 1 (PANK1), the rate-limiting enzyme in coenzyme A (CoA) synthesis. Using stable isotope infusions, we established that SGLT2i activate CoA synthesis and broadly stimulate fuel use in human cardiac tissue. We also demonstrated that SGLT2i bind PANK1 at physiological concentrations, directly inducing conformational changes and increasing enzymatic activity. In silico modeling identified the site of SGLT2i binding on PANK1, which was confirmed by amino acid mutagenesis. Finally, we showed that SGLT2i-mediated PANK activation is necessary and sufficient to increase contractility of human cardiomyocytes. In summary, we demonstrate off-target activation of PANK1 and promotion of CoA synthesis by SGLT2i, which may explain their marked clinical benefits.

Sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors (SGLT2i) are oral antihyperglycemics that have become a foundational part of guideline-directed medical therapy for patients with heart failure (HF) (1). SGLT2i were originally developed to promote urinary loss of glucose in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) by inhibiting SGLT2-mediated reabsorption of glucose in the renal proximal tubules. In phase 3 trials in patients with T2DM, SGLT2i reduced major adverse cardiovascular events, largely through strong protection against HF, independent of T2DM severity (2). Subsequent trials revealed that treatment with SGLT2i reduces rates of death and HF rehospitalization equivalently in HF patients with or without diabetes (3–7). SGLT2i are now first-line agents in the treatment of HF. However, the side effects of SGLT2i are non-negligible, including on-target side effects of genital mycotic and urinary tract infections (UTIs), over-diuresis, and potentially ketoacidosis, all presumed to be caused by glycosuria. Additionally, SGLT2i and other oral antihyperglycemics are often halted upon hospital admission when insulin treatment is initiated, thereby potentially mitigating their cardiovascular benefits in patients hospitalized with HF exacerbations.

The mechanism by which SGLT2i achieve cardioprotection remains unclear. An off-target mechanism of action is highly likely because (i) SGLT2 is not expressed in the heart, but several studies have shown direct effects of SGLT2i on isolated cardiomyocytes or hearts; and (ii) treatment with SGLT2i in mice reduces infarct size after ischemia-reperfusion and partially improves function after transaortic constriction-myocardial infarction equivalently in animals genetically lacking SGLT2 and control animals (8–11). The identity of this non-SGLT2 pharmacological target of SGLT2i remains elusive. Here we show that SGLT2i have a direct effect on metabolism and contractile function in human hearts, and we identify the enzyme pantothenate kinase (PANK1) as a target of SGLT2i that explains these benefits.

SGLT2i directly promote human cardiac metabolism

There is ongoing debate about whether SGLT2i benefit HF by directly affecting the heart or through systemic metabolic reprogramming, but data in humans are lacking (12–14). Therefore, we first sought to test whether SGLT2i directly affect metabolism in human myocardium. We developed a method to perfuse cardiac tissue blocks ex vivo (average: 7 g), taken from the interventricular septum (IVS) of hearts from transplant recipients or organ donors (table S1). Tissue blocks were perfused with a recirculating Krebs-Henseleit buffer containing cardiac fuels at physiological concentrations, several of which were labeled with stable heavy isotopes ([6,6- $^{2}$ H]-glucose, [1- $^{13}$ C]-glutamine, [3- $^{13}$ C]-lactate, [U- $^{13}$ C]-valine, and [U- $^{13}$ C]-3-hydroxybutyrate), and treated with 700 nM of the SGLT2i empagliflozin (EMPA) or vehicle control (Fig. 1A). The chosen EMPA dose reflects plasma concentrations achieved in patients (15–17). Multiple IVS blocks from each heart were perfused in parallel such that every heart served as its own control. We first tested the impact of EMPA on cardiac fuel consumption by measuring the disappearance of labeled nutrients from the recirculating perfusate. Treatment with EMPA increased uptake of most fuels in failing human myocardium, indicating broad activation of metabolic activity by EMPA (Fig. 1B and fig. S1A). Consistent with this, the tissue levels of these fuels were elevated in the cardiac blocks treated with EMPA (Fig. 1C). Similar increases were seen in hearts of rats in Langendorff preparations treated with EMPA (fig. S1B).

The presence of isotopically labeled substrates in the perfusate allowed us to next trace the incorporation of fuel-derived carbons into the tricarboxylic acid cycle (TCA), an indirect measure of fuel oxidation. The fractional enrichment of labeled TCA carbons was markedly increased in cardiac blocks treated with EMPA (Fig. 1D), reflecting increased incorporation of labeled carbons from lactate and 3-hydroxybutyrate through acetyl-coenzyme A (AcCoA) and from valine through propionyl-CoA and succinyl-CoA. Although the perfusate contained no labeled fatty acids, elevated acylcarnitines in EMPA-treated cardiac blocks suggested that fatty acid oxidation was also increased by EMPA treatment (Fig. 1E). Similar findings were seen in vivo in intact mice after gavage with EMPA (fig. S1C). These changes in the human blocks in response to EMPA occurred in the absence of altered expression of key metabolic enzymes and transporters (fig. S1D). Finally, consistent with a broad activation of metabolic activity, EMPA treatment increased adenosine triphosphate (ATP) and decreased adenosine monophosphate, thus enhancing the energy charge in these cardiac tissues (Fig. 1F). We conclude that EMPA directly and broadly promotes oxidative metabolism in human hearts, thereby rescuing the well-established energetic defect seen in failing hearts (18–20).

SGLT2i activate CoA synthesis to promote cardiac metabolism

To probe how SGLT2i so broadly affect cardiac metabolism, we performed untargeted global metabolomics on perfused cardiac blocks treated with EMPA versus vehicle (fig. S2A and table S2). Among several altered metabolites, we noted that pantothenate (vitamin B5), precursor to CoA synthesis, had a greater than twofold depletion (Fig. 2, A and B). CoA is an obligate cofactor for nearly all pathways

B Perfusate

D

C Tissues

E

F

Fig. 1. SGLT2i directly promote human cardiac metabolism in failing hearts. (A) Experimental design. HRMS, high-resolution mass spectrometry; LAD, left anterior descending artery. (B) Uptake of indicated substrates from the perfusate after 90 min. (C) Normalized abundance of indicated substrates after 90 min of perfusion. (D) Fractional $^{13}\mathrm{C}$ enrichment of the indicated intermediate metabolites after 90 min of perfusion. HIB, hydroxyisobutyryl-CoA. (E) Normalized abundance of acylcarnitines in tissues after 90 min of perfusion. (F) Relative tissue levels of energy metabolites after 90 min of perfusion. ADP, adenosine diphosphate; AMP, adenosine monophosphate. $P$ values were calculated by paired two-sided Student's t test. Error bars are $\pm$ SE.

A

B

D

E

G

C

Neonatal Rat Cardiomyocytes

F

Adult Rat Cardiomyocytes

H

Fig. 2. SGLT2i activate CoA synthesis to promote cardiac metabolism. (A) Diagram of CoA synthesis from pantothenate. BCAA, branched-chain amino acid; KG, ketoglutarate; Pi, inorganic phosphate. (B) (Left) Depletion of pantothenate in perfused failing human cardiac tissue with EMPA treatment. (Right) Increase in phosphopantothenate/pantothenate ratio. (C) (Left) Increase in fractional uptake of labeled pantothenate by perfused failing human cardiac blocks and (right) increase in labeling of tissue AcCoA from labeled pantothenate precursor, in response to EMPA treatment. (D) Decreased abundance of CoA species in posttransplant human HF samples, compared with nonfailing (NF) donor controls. (E and F) Fractional enrichment of AcCoA from labeled pantothenate (E) and succinyl-CoA from $^{13}\mathrm{C}$ -labeled cocktail (F) in NRVMs treated with vehicle, EMPA, or EMPA plus the PPCS inhibitor HOPA. (G) Oxygen consumption $(J_{\mathrm{O_2}})$ in permeabilized ARVMs in response to EMPA, the pan-PANK activator PZ-2891, and HOPA. CI, complex; Cyt C, cytochrome C; OC, octanoylcarnitine; PM, pyruvate and malate; Succ, succinate. (H) EMPA increases cytosolic and mitochondrial acetyl-CoA concentrations, akin to that achieved by PZ-2891 and inhibitable by HOPA. $P$ values were calculated by paired [(B) and (C)] or unpaired [(E) to (G)] two-sided Student's $t$ test or by two-way analysis of variance (H). Error bars are $\pm$ SE.

of cellular fuel use, including degradation of carbohydrates, fats, and amino acids (21). Pathway analysis of the global metabolomics highlighted CoA synthesis as highly affected by EMPA treatment (fig. S2A, right panel). The five-step process of CoA synthesis from pantothenate (Fig. 2A) begins with the rate-limiting phosphorylation of pantothenate by PANK, and EMPA increased the ratio of phosphopantothenate to pantothenate in the perfused cardiac blocks (Fig. 2B, right panel). Cysteine, required for the subsequent step in CoA synthesis, was depleted in EMPA-treated cardiac blocks and EMPA-treated rat hearts in Langendorff preparations (fig. S2B), consistent with activation of CoA biosynthesis. To formally test the consumption of pantothenate, we supplemented the perfusate with $\left[{ }^{13} \mathrm{C}_{3}{}^{15} \mathrm{~N}\right]$ -pantothenate. Treatment with EMPA more than doubled the fractional uptake of pantothenate by the human hearts and markedly increased incorporation of isotopically labeled pantothenate into acetyl-CoA (Fig. 2C). Pantothenate was similarly depleted, with concurrent increases in acetyl-CoA, in rat hearts in Langendorff preparations treated with EMPA (fig. S2C). In intact mice, gavage of EMPA led to increased cardiac levels of nearly all tested CoA species, including free CoA (CoASH) (fig. S2D). Thus, the data suggest the possibility that EMPA promotes CoA synthesis, rescuing insufficient CoA abundance in failing hearts, thereby explaining the broad salutary effects observed with EMPA treatment. Consistent with this notion, the abundance of various acyl-CoAs, and most importantly CoASH, is markedly decreased in failing human hearts compared with nonfailing donors (Fig. 2D).

To test whether activation of CoA synthesis by SGLT2i mediates the effects of SGLT2i on the TCA, we used cultured cardiomyocytes and hopantenate (HOPA), which blocks CoA synthesis by inhibiting phosphopantothenoylcysteine synthetase (PPCS), the second enzyme in the CoA synthesis pathway (Fig. 2A). Treatment of neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) with EMPA increased the incorporation of isotopically labeled pantothenate into AcCoA and CoASH (Fig. 2E) and increased the total levels of AcCoA and CoASH, akin to a previously described pan-PANK activator (PZ-2891) that also enhances CoA synthesis (fig. S2E), and this process was prevented by HOPA (Fig. 2E) (22). Treating NRVMs with EMPA promoted incorporation of fuel-derived carbons into the TCA cycle (Fig. 2F), demonstrating that these effects are direct, independent of blood flow, vasculature, or other cells. The addition of HOPA prevented the EMPA-mediated increase in TCA labeling (Fig. 2F). Consistent with enhanced TCA activity, EMPA increased mitochondrial respiration in adult rat ventricular myocytes (ARVMs), as did PZ-2891, and was inhibited by HOPA (Fig. 2G). Live-cell biosensors also demonstrated that EMPA treatment increased intracellular abundance of acetyl-CoA, in both cytosol and mitochondria (but not the nucleus), as did PZ-2891, and was inhibited by HOPA (Fig. 2H and fig. S2F) (23). We conclude that the activation of CoA synthesis by EMPA is required for the enhancing effects of EMPA on intracellular CoA content, TCA activity, and mitochondrial respiration.

SGLT2i activate PANK1

We next sought to identify the enzyme target of SGLT2i that mediates the observed increase in CoA synthesis. As noted above, CoA synthesis begins with the rate-limiting phosphorylation of pantothenate by PANK. Three genes encode PANKs, of which PANK1 is the most highly expressed in cardiomyocytes (21). Expression of PANK1 and PANK2 is suppressed in failing human hearts (Fig. 3A and fig. S3A), whereas there were no significant changes in PANK1 protein and pantothenate levels (Fig. 3A and fig. S3B). Therefore, we hypothesized that SGLT2i activate PANK1 to promote CoA synthesis. Consistent with this notion, EMPA increased the ratio of phosphopantothenate to pantothenate in perfused cardiac blocks (Fig. 2B). To test directly whether EMPA reaches and binds to PANK1, we first used a cellular thermal shift assay (CETSA) (24). Human embryonic kidney 293T (HEK293T) or HEPG2 cells, which express PANK1, were treated with EMPA or vehicle control and subjected to incremental increases in ambient temperature, followed by Western blotting for PANK1. The addition of EMPA strongly increased the thermal stability of PANK1 (Fig. 3B and fig. S3C), similar to that achieved by PZ-2891 (fig. S3D), demonstrating efficient entry of EMPA into cells and ligand-induced thermal stabilization (22). To test for binding of EMPA to PANK1, we immobilized EMPA on beads and precipitated associated proteins from HEK293T cellular extracts. EMPA-loaded beads, but not control beads, efficiently bound PANK1 from these extracts (Fig. 3C), demonstrating binding. Unbiased proteomic analyses of proteins bound to the beads identified several other potentially EMPA-bound proteins (table S3). In an orthogonal approach, immunoprecipitation of PANK1 from HEK293T cells coprecipitated EMPA, as detected by mass spectrometry (Fig. 3D). We therefore concluded that EMPA associates with PANK1.

We next pursued direct evidence of physical interaction between PANK1 and EMPA. PANK1 normally acts as a homodimer and is product-inhibited by acylated CoA species (mostly acetyl-CoA) (25). We used ion exchange chromatography to remove acetyl-CoA from PANK1 purified from bacterial expression (apo-PANK1; fig. S3E). Mass photometry and sedimentation velocity analytical ultracentrifugation (SV-AUC) confirmed that purified PANK1 existed as a homodimer in solution across the nanomolar to micromolar range (fig. S3F). To probe the structural properties of PANK1, we next used size-exclusion chromatography in-line with synchrotron small-angle x-ray scattering and multiangle light scattering (SEC-SAXS-MALS) and singular value decomposition with evolving factor analysis (SVD-EFA). We tested apo-PANK1 alone or with the addition of EMPA, acetyl-CoA, or both; this testing revealed no changes in oligomerization, indicating that EMPA does not change the oligomeric state of PANK1 (fig. S3E). Dimensionless Kratky analyses allow for qualitative comparison of flexibility and disorder: Compact proteins typically show a distinct bell-shaped peak, whereas unfolded or flexible proteins show elevated intensity values at higher $qR_{g}$ , a dimensionless scaled parameter combining the scattering vector magnitude (q) and the protein's radius of gyration ( $R_{g}$ ), which represents protein folding, compactness, and flexibility in solution. (26). Addition of EMPA to apo-PANK1 promoted compaction, akin to that achieved by addition of AcCoA (Fig. 3E). Structural modeling with DENSS (density from solution scattering) and CORAL (complexes with random loops), which generate the ab initio electron density at low resolution and perform hybrid atomistic modeling, respectively (27), demonstrated substantial PANK1 conformational differences induced by EMPA (fig. S3G). Although the apo enzyme revealed a wing-like spread-out conformation, both EMPA and acetyl-CoA promoted compaction of this structure, and the changes conferred by EMPA were distinct from AcCoA, folding the conformation to a V shape (Fig. 3F). We conclude that EMPA binds directly to PANK1 in its native homodimer state and introduces substantial conformational changes.

We next tested the direct effects of EMPA on PANK1 enzymatic activity using purified PANK1 and two different kinase activity assays (28, 29). Treatment with EMPA activated PANK activity to a similar extent as PZ-2891 (Fig. 3G and fig. S3H). Activation was achieved with a median effective concentration $(\mathrm{EC}_{50})$ of $13\mathrm{nM}$ (Fig. 3G), well below plasma concentrations achieved with EMPA therapy in humans (peak: 500 to $1500\mathrm{nM}$ ) and comparable to those achieved with PZ-2891. PANK1 activity was similarly increased by canagliflozin and dapagliflozin, two other clinically used SGLT2i (fig. S4A), both of which also increased intracellular concentrations of acetyl-CoA measured by biosensors (fig. S4B), demonstrating that activation of PANK1 by SGLT2i is a class effect (15-17). We conclude that SGLT2i, at physiologically relevant concentrations, bind to and activate the enzymatic activity of PANK1.

To probe how SGLT2i activate PANK1, we applied PopShift, an in silico modeling method (30), to analyze what poses of EMPA and acyl-CoA were compatible with PANK1 conformations sampled from 5 ms of aggregate molecular dynamics, which we collected with Folding@home. These poses predicted that EMPA binds to PANK1 within an allosteric pocket that can also be occupied by acyl-CoA species (Fig. 3H). When EMPA occupies this allosteric pocket, it does not reach into the enzymatic active site and is thus not predicted to hinder enzymatic activity. EMPA is predicted to bind similarly to PANK2 and PANK3 (fig. S4C). To test the accuracy of this predicted model, we identified amino acid residues in PANK1 predicted to interact with EMPA, but not acetyl-CoA or ATP, and to not affect the enzymatic pocket (fig. S4D), and we mutated two of these, T203 and V244, to K, A, or D (T, Thr; V, Val; K, Lys; A, Ala; D, Asp). In all six cases, baseline enzymatic activity was preserved, as evidenced by increased intracellular acetyl-CoA with PANK1 overexpression (Fig. 3I and fig. S4E). All three T203 variants, however, became insensitive to stimulation by EMPA, demonstrating functional interaction at this predicted residue. Finally, we considered the possibility that EMPA activates PANK1, at least in part, by displacement of inhibitory acyl-CoA species. Consistent with this notion, increasing concentrations of acetyl-CoA fully neutralized the activation of PANK1 by EMPA (fig. S5A). The converse, however, was not true:

A

B

C

D

E

F

G

Fig. 3. SGLT2i activate PANK1. (A) mRNA expression of PANK1 (left) and pantothenate content (right) in human failing and nonfailing hearts. (B) CETSA assay for PANK1. GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. (C) Binding of PANK1 to EMPA-immobilized beads. (D) Coimmunoprecipitation (Co-IP) of EMPA with PANK1. AUC, area under the curve; IgG, immunoglobulin G. (E) Normalized Kratky plots (left) and shape distribution function (left) calculated from SAXS data. Pr/I₀, pair-distance distribution function normalized by I₀ to allow direct comparison of particle shape across samples. (F) DENSS (top) and CORAL (bottom) analyses of SAXS data. (G) PANK1 enzymatic activity in response to increasing doses of PANK1 activator (PZ-2891) or EMPA. (H) In silico modeling shows EMPA binding in the same allosteric pocket within PANK1 as bound by acetyl-CoA. (Top) Ribbon model of PANK1 dimer. (Bottom left) Zoom-in of pantothenate binding to PANK1. (Bottom right) Superimposed binding of AcCoA, showing extension into the PANK1 enzymatic pocket. (I) Changes in cytosolic concentrations of acetyl-CoA in the presence of wild-type PANK1 or the indicated mutants, in response to treatment with EMPA. P values were calculated by unpaired two-sided Student's t test; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; NS, not significant. Error bars are ±SE. NTC, no-template control.

In the presence of 1 $\mu$ M acetyl-CoA, sufficient to inhibit PANK1 activity by 60%, increasing concentrations of EMPA did not disinhibit the enzyme (fig. S5B). EMPA also did not affect the activity of several other enzymes from isolated human mitochondria that are modulated by acyl-CoA species, including pyruvate dehydrogenase, oxoglutarate dehydrogenase, and branched-chain $\alpha$ -ketoacid dehydrogenase (fig. S5C) (31–33). More complex allosteric mechanisms therefore mediate activation of PANK1 by EMPA, consistent with the intricate model of activation by PZ compounds and the complex structural changes observed above (22).

PANK1 activation by SGLT2i is required for functional benefits of SGLT2i

To test whether SGLT2i directly improve human cardiomyocyte function, we isolated adult human cardiomyocytes from failing hearts and quantified measures of contractility and relaxation, as previously described (Fig. 4A) (34). The addition of EMPA to the cells increased the fractional shortening and peak height of contraction, markers of contractility (Fig. 4, B and C). EMPA also increased relaxation velocity and decreased time to return to 90% baseline, indicating improvements in relaxation, an energetically demanding process that requires the rapid reuptake of calcium into the sarcoplasmic reticulum (Fig. 4, B and C, and fig. S6A). Similar, although less pronounced, effects were observed with treatment of ARVMs, perhaps reflecting their nonfailing status (fig. S6B). We conclude that SGLT2i directly improve many markers of human cardiomyocyte contractility and relaxation, independently of systemic effects, hormonal context, or input from the vasculature.

B

C

D

Fig. 4. PANK1 activation by SGLT2i is required for functional benefits of SGLT2i. (A) Experimental outline. (B and C) Sample contractility and relaxation curves (B) and quantification of parameters (C) from single failing human adult cardiomyocytes treated with the indicated agents. (D) Increase in failing human cardiac mitochondrial respiration after treatment with EMPA. FAO, fatty acid oxidation; LV, left ventricular; Pyr/Mal, pyruvate/malate. P values were calculated by paired t test. Error bars are ±SE.

We next tested the role of PANK1 activation by EMPA in its effects on cardiomyocyte contractile function. The addition of PZ-2891 to human cardiomyocytes mimicked the effects of EMPA on peak height, fractional shortening, and relaxation velocity (Fig. 4, B and C), demonstrating that PANK1 activation is sufficient to promote cardiomyocyte function. Conversely, the addition of HOPA to EMPA-treated cells nearly completely reversed the beneficial effects of EMPA (Fig. 4, B and C, and fig. S6A). Again, similar but less pronounced effects were seen with ARVMs (fig. S6B). Finally, we tested the direct effect of EMPA on purified mitochondria freshly isolated from failing human hearts and found a small but highly reproducible increase in adenosine diphosphate-dependent respiration in mitochondria treated with EMPA (Fig. 4D). We conclude that PANK1 activation by SGLT2i is both necessary and sufficient for the functional improvements in contractility and relaxation conferred by SGLT2i on human cardiomyocytes, perhaps in part mediated by enhancing mitochondrial respiration capacity.

Discussion

We demonstrate here a critical off-target effect of SGLT2i: direct activation of PANK1, resulting in acute stimulation of CoA synthesis. We also demonstrate that activation of PANK1 by SGLT2i directly promotes human cardiac metabolism and contractility, independent of kidney function, metabolic and hormonal milieu, and input from the vasculature. These observations provide a potential explanation for the marked clinical benefits achieved by treating HF patients with SGLT2i, a benefit unlikely to be mediated by inhibition of SGLT2 itself because these benefits are also seen in rodents genetically lacking SGLT2 (8, 9, 11). Activation of PANK1 by SGLT2i may also explain the notably rapid benefits of SGLT2i, often seen within days of treatment initiation. The identification of PANK1 as a relevant off-target of SGLT2i opens the possibility of developing agents that more potently or specifically target PANK1, potentially both increasing efficacy and avoiding on-target side effects of SGLT2i, including euglycemic diabetic ketoacidosis, over-diuresis, and UTIs.

Our work implicates CoA biology in HF pathogenesis. CoA synthesis is central to oxidative metabolism, a process on which the heart primarily depends. We and others have shown here and elsewhere that CoA species are strongly reduced in human failing hearts, suggesting that CoA abundance may be limiting (35). Our findings that PANK1 activation promotes human cardiomyocyte metabolism and contractility strongly support this notion. Altered CoA metabolism may also perturb redox homeostasis, epigenetic changes, and posttranslational protein modification by CoA-lation. Mice lacking cardiac PANK1 develop cardiomyopathy in response to hemodynamic challenges, underscoring the critical role of PANK1 in cardiac function. Similarly, homozygous or compound heterozygous mutations in PPCS, the second enzyme in the CoA biosynthesis pathway, cause dilated cardiomyopathy in humans, demonstrating the key role of CoA synthesis in human cardiac function (36, 37).

The systemic benefits of SGLT2i may also reflect actions on PANK1 outside the heart. PANK1 is expressed in hepatocytes, renal tubular cells, gut epithelium, and neurons (38). SGLT2i have shown benefits in non-alcoholic fatty liver disease and chronic kidney disease, likely independent of cardiac effects (39, 40). Activation of PANK1 in these tissues may thus in part explain the clinical benefits of SGLT2i. SGLT2i may also modulate other isoforms of PANK. PANK1 accounts for $>70\%$ of PANK activity in the heart, but both PANK2 and PANK3 are also present, and activating these isoforms may further extend the extracardiac benefits of SGLT2i.

Our study has limitations. Studies on human cardiac tissue are limited by tissue availability and are prone to variability. The use of paired samples from each procurement was important to address this limitation. Genetic models, such as mice lacking cardiac PANK isoforms, will be of great future interest but were beyond the scope of this work. Finally, it is possible that SGLT2i also affect the function of other proteins or enzymes beyond PANK.

In summary, we identified PANK1 as a direct target of SGLT2i and demonstrated that stimulation of PANK1 and CoA synthesis by SGLT2i improves human cardiac metabolic and contractile activities. These results may explain the notable benefits of SGLT2i in patients with HF and provide an opportunity to design compounds with potentially higher efficacy and fewer SGLT2-mediated side effects.

REFERENCES AND NOTES

1. P. A. Heidenreich et al., Circulation 145, e895–e1032 (2022).

2. B. Zinman et al., N. Engl. J. Med. 373, 2117–2128 (2015).

3. S. D. Anker et al., N. Engl. J. Med. 385, 1451–1461 (2021).

4. K. B. Margulies, N. Engl. J. Med. 387, 1138–1140 (2022).

5. M. Packer et al., N. Engl. J. Med. 383, 1413–1424 (2020).

6. J. J. V. McMurray et al., N. Engl. J. Med. 381, 1995–2008 (2019).

7. S. D. Solomon et al., N. Engl. J. Med. 387, 1089–1098 (2022).

8. J. H. Berger et al., bioRxiv 2024.04.29.591665 [Preprint] (2024); https://doi.org/10.1101/2024.04.29.591665.

9. S. Chen et al., Metabolism 178, 156568 (2026).

10. J. H. Amesz et al., Cardiovasc. Drugs Ther. 38, 659–666 (2024).

11. S. Chen et al., Circulation 147, 276–279 (2023).

12. M. Packer, Nat. Rev. Cardiol. 20, 443–462 (2023).

13. M. J. Hundertmark et al., Circulation 147, 1654–1669 (2023).

14. R. Thirumathyam et al., Cardiovasc. Diabetol. 23, 13 (2024).

15. D. Kim et al., Clin. Transl. Sci. 16, 1469–1478 (2023).

16. A. J. Scheen, Clin. Pharmacokinet. 54, 691–708 (2015).

17. A. J. Scheen, Clin. Pharmacokinet. 53, 213–225 (2014).

18. E. Flam et al., Nat. Cardiovasc. Res. 1, 817–829 (2022).

19. S. Neubauer, N. Engl. J. Med. 356, 1140–1151 (2007).

20. D. Murashige et al., Science 370, 364–368 (2020).

21. R. Leonardi, Y. M. Zhang, C. O. Rock, S. Jackowski, Prog. Lipid Res. 44, 125–153 (2005).

22. J. J. Smith et al., Cell Chem. Biol. 32, 325–337.e10 (2025).

23. L. K. Sharma et al., Nat. Commun. 9, 4399 (2018).

24. D. Martinez Molina et al., Science 341, 84–87 (2013).

25. C. Subramanian et al., J. Biol. Chem. 291, 22302–22314 (2016).

26. R. P. Rambo, J. A. Tainer, Biopolymers 95, 559–571 (2011).

27. T. D. Grant, Nat. Methods 15, 191–193 (2018).

28. L. K. Sharma et al., J. Med. Chem. 58, 1563–1568 (2015).

29. M. Kumar, R. G. Lowery, SLAS Discov. 22, 915–922 (2017).

30. L. G. Smith, B. Novak, M. Osato, D. L. Mobley, G. R. Bowman, J. Chem. Theory Comput. 20, 1036–1050 (2024).

31. R. J. Budde, T. K. Fang, D. D. Randall, J. A. Miernyk, Plant Physiol. 95, 131–136 (1991).

32. R. R. Russell III, H. Taegtmeyer, J. Clin. Invest. 89, 968–973 (1992).

33. F. H. Pettit, S. J. Yeaman, L. J. Reed, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 4881–4885 (1978).

34. A. Vite et al., JACC Basic Transl. Sci. 9, 1–15 (2023).

35. K. C. Bedi Jr et al., Circulation 133, 706–716 (2016).

36. A. Iuso et al., Am. J. Hum. Genet. 102, 1018–1030 (2018).

37. T. N. Audam et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 321, H784–H797 (2021).

38. M. Karlsson et al., Sci. Adv. 7, eabh2169 (2021).

39. A. J. Scheen, Diabetes Metab. 45, 213–223 (2019).

40. K. Yau, A. Dharia, I. Alrowiyti, D. Z. I. Cherney, Kidney Int. Rep. 7, 1463–1476 (2022).

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Johnson Foundation Biophysical and Structural Biology Core Facility (University Children's Hospital of Pennsylvania, Philadelphia, PA) and the Advanced Light Source (ALS) at the SIBYLS beamline, a national user facility operated by Lawrence Berkeley National Laboratory on behalf of the Department of Energy (DOE), Office of Basic Energy Sciences, through the Integrated Diffraction Analysis Technologies (IDAT) program, supported by DOE Office of Biological and Environmental Research, for assistance with the SV-AUC,

size-exclusion chromatography with multiangle light scattering, and mass photometry. We also thank the Gift of Life Donor Program of Philadelphia and the families of donors for enabling the procurement of human hearts from deceased organ donors. Funding: This work was supported in part by a DreamTeam grant from the Penn Cardiovascular Institute and the Children's Hospital of Philadelphia Frontier Program. N.F. was supported by the Sarnoff Foundation. Z.A. was supported by the National Institutes of Health (NIH) (HL152446). J.E. was supported by the NIH (K08 HL159311). T.T. was supported by the NIH (T32HL0078). D.M.E. was supported by the NIH (T32 HL007843). K.G. was supported by the Johnson Research Foundation, an NIH Shared Instrumentation Grant (S10-OD018483), and NIH project ALS-ENABLE (P30 GM124169). The procurement of human heart tissue was enabled by grants from the NIH (R01 HL149891) and the Leducq Foundation to K.B.M. Author contributions: N.F. established the hypothesis and inception of the presented work; led the research team; developed human myocardial block perfusion methodology for tracing studies and subsequent metabolomics by high-resolution mass spectrometry and analysis; developed CETSA for PANK1, EMPA-resin studies, and pull-down experiments; developed PANK1 kinase assays with EMPA or PZ-2891 treatment; performed initial in silico modeling of protein-ligand interactions between EMPA and PANK1; performed isolated human cardiomyocyte contractility experiments; performed NRVM metabolic tracing studies; performed invivo mouse experiments for metabolomics with EMPA treatment; developed the rat Langendorff method for studying metabolic changes in EMPA-treated hearts; and performed rat cardiomyocyte contractility experiments. T.T. led and took primary responsibility for revisions; performed isolated human and rat mitochondria experiments; performed AcCoA biosensor experiments to test CoA concentrations intracellularly with EMPA treatment; further developed PANK1 kinase assays for testing other SGLT2i; performed RNA sequencing analysis of transporters in human myocardium after EMPA treatment; tested alternative kinases modulated by AcCoA; developed and tested PANK1 mutants; and performed invivo mouse experiments for CoA metabolomics with EMPA treatment. D.M.E. developed human myocardial block perfusion methodology for tracing studies; assisted with the development of isolated human cardiomyocyte contractility experiments; developed rat Langendorff preparations for metabolomics; and performed isolation of rat cardiomyocytes for contractility experiments. K.S. performed isolation and purification of recombinant PANK1 protein for kinase assays. J.P. assisted with rat Langendorff preparations; cared for and prepared murine models; and assisted with protein isolation and Western blot experiments and preparation of samples for high-resolution mass spectrometry. C.E.B. developed high-resolution mass spectrometry methods for metabolomics. R.K. assisted with cellular-thermal shift assay experiments and EMPA-resin experiments. J.W.J. developed high-resolution mass spectrometry methods for the analysis of serine, cysteine, and related compounds. I.A.K. assisted with molecular biology experiments, including Western blotting. K.L. assisted with molecular biology experiments, including Western blotting. J.A.L. assisted with preparation of PANK1 mutants. K.B. assisted with mitochondrial isolation and redox experiments. C.B. assisted with human heart isolations from transplant patients. K.C.B.

A tripartite genetic conflict system controls hybrid sterility in rice

Xiaodong He $^{1\dagger}$ , Zhigang Zhao $^{1\dagger}$ , Kun Shao $^{1\dagger}$ , Xiaowen Yu $^{1\dagger}$ , Ying Zhu $^{3\dagger}$ , Jintao Tang $^{4\dagger}$ , Jing Li $^{5}$ , Yunhui Zhang $^{1}$ , Keyu Zhao $^{1}$ , Xiaoming Zheng $^{2}$ , Hongru Wang $^{6}$ , Chao Li $^{1}$ , Xiangchao Gan $^{1}$ , Xiaoou Dong $^{1}$ , Yulong Ren $^{2}$ , Yehui Xiong $^{2}$ , Jian Wang $^{2}$ , Yang Hu $^{1}$ , Siqi Cheng $^{1}$ , Bowen Yao $^{1}$ , Yulu Ye $^{6}$ , Song Guo $^{1}$ , Yuantao Zhu $^{1}$ , Ling He $^{1}$ , Tiaofeng Shan $^{1}$ , Chen Xu $^{1}$ , Jinxuan Xu $^{1}$ , Jiayu Lu $^{1}$ , Dekun Lei $^{1}$ , Anqi Jian $^{1}$ , Junwen Gao $^{1}$ , Song Cui $^{1}$ , Gencheng Xu $^{1}$ , Xiuping Guo $^{2}$ , Xi Liu $^{1}$ , Yunlu Tian $^{1}$ , Shijia Liu $^{1}$ , Ling Jiang $^{1}$ , Xianneng Deng $^{5}$ , Jiawu Zhou $^{5}$ , Dayun Tao $^{5}$ , Yonglun Zeng $^{3,7}$ , Letian Chen $^{4}$ , Chuanyin Wu $^{2}$ , Haiyang Wang $^{2}$ , Chaolong Wang $^{1,2}$ , Jianmin Wan $^{1,2*}$

Interspecific Asian–African hybrid rice could substantially boost yield but is limited by severe hybrid sterility. We identify RHS3 as a major quantitative trait locus controlling this trait. RHS3 encodes a tripartite toxin–antidote system composed of MAO, DUN, and JIA, in which MAO acts as a toxin that aborts gametes by disrupting mitochondrial function, whereas DUN and JIA function as antidotes that neutralize MAO toxicity, conferring a transmission advantage to the African allele. We demonstrate that detoxification relies on selective autophagy through formation of a tripartite JIA–DUN–MAO protein complex. We infer the de novo origin of RHS3 in the AA-genome rice lineage, illustrating a role for genetic conflict in speciation and suggesting strategies to harness heterosis between Asian and African rice.

Rice (Oryza sativa) is the staple food for more than half of the world's population and is central to global food security (1, 2). Only two rice species have been domesticated: Asian rice (O. sativa L.), derived from O. rufipogon in Asia, and African rice (O. glaberrima Steud.), derived from O. barthii in West Africa (3–6). Asian rice is characterized by high yield and grain quality, whereas African rice possesses strong tolerance to biotic and abiotic stresses (7, 8). Consequently, interspecific Asian-African hybrid rice can outperform conventional rice varieties by 30 to 60%, offering substantial potential to increase rice productivity (9, 10). However, severe postzygotic reproductive isolation, particularly hybrid sterility, limits the effective exploitation of this interspecific heterosis (11). Despite extensive efforts to elucidate the genetic basis of hybrid sterility between the two species, only one locus, S1, has been cloned, and its underlying molecular mechanism remains unresolved (12, 13). Thus, how hybrid sterility loci establish reproductive isolation between rice species remains largely unknown, posing a major barrier to the utilization of the interspecific heterosis between Asian and African rice.

Hybrid sterility is often caused by incompatible allelic interactions at specific loci, many of which encode toxin–antidote systems (also known as meiotic drivers or segregation distorters) in diverse plant and animal species (14–17). Well-known examples include the PK3 locus in Arabidopsis (18), the S5, qHMS7, and RHS12 loci in rice (19–21), the sup-35/pha-1 elements in nematodes (22), and the t-complex in mice (23). In hybrids, incompatible allelic interactions at these loci provoke genetic conflict, conferring a transmission advantage on carrier alleles over noncarriers and thereby distorting Mendelian inheritance. Such transmission advantages can promote the spread of carrier alleles within natural populations, contributing to speciation and maintenance of species boundaries (24–26). Despite the prevalence of hybrid sterility loci across diverse taxa, their evolutionary origins and molecular mechanisms remain poorly understood, limiting our understanding of the forces that drive speciation.

Here, we identified and cloned RHS3, a major locus underlying hybrid sterility between Asian and African cultivated rice. Functional and evolutionary analyses revealed a noncanonical tripartite toxin-antidote system and uncovered a direct mechanistic link between selective autophagy and reproductive isolation. These findings provide insights into the evolution of interspecific genetic conflict and offer a genetic framework for overcoming reproductive barriers and exploiting interspecific heterosis between Asian and African rice.

RHS3 controls interspecific hybrid sterility

Hybrids between Asian and African cultivated rice displayed severe hybrid sterility, with markedly reduced pollen and spikelet fertility (Fig. 1A). Quantitative trait loci mapping in a BC ${1}$ F ${1}$ population derived from DJY1 (Dianjingyou1, a japonica variety of Asian cultivated rice, genotype jj) and IRGC 102295 (an African cultivated rice accession, genotype gg) identified two rice hybrid sterility (“RHS”) loci on chromosomes 3 and 7, designated RHS3 and RHS7 (fig. S1A and data S3). Because RHS3 colocalized with the previously reported S19/S64 region associated with interspecific hybrid sterility (27, 28), we prioritized it for further analysis.

A near-isogenic line (NIL) carrying the IRGC 102295 allele at RHS3 (NIL-RHS3) was developed in the DJY1 background (fig. S1B). DJY1 (RHS3-jj), NIL-RHS3 (RHS3-gg), and their $\mathrm{F_1}$ hybrids ( $\mathrm{F_1}$ -RHS3, RHS3-gj) developed normally and showed high spikelet fertility (Fig. 1A and fig. S1C). By contrast, $\mathrm{F_1}$ -RHS3 plants displayed pollen semisterility, whereas both parental lines exhibited $>95\%$ pollen fertility (Fig. 1A). Cytological analyses revealed no obvious defects during tapetum degeneration or early microspore development, but nearly half of the pollen grains showed delayed development at the polarized microspore stage and were arrested at the bicellular stage, exhibiting reduced starch accumulation and defective pollen wall formation (fig. S1, D and E).

Reciprocal crosses revealed that RHS3-gj and RHS3-jj progeny segregated at a 1:1 ratio when $F_{1}$ -RHS3 served as the female parent and DJY1 as the male parent, whereas only RHS3-gj progeny were recovered when $F_{1}$ -RHS3 was used as the pollen donor (Fig. 1B), indicating normal female fertility and transmission failure of RHS3-j pollen. Consistent with this observation, $F_{1}$ -RHS3 plants displayed pollen semisterility irrespective of cytoplasmic background, and the $F_{2}$ population segregated 1:1 into fertile (RHS3-gg) and semisterile (RHS3-gj) plants (fig. S2). Together, these results establish RHS3 as a single nuclear gamete-killer locus that selectively eliminates RHS3-j pollen.

To identify the gene(s) underlying RHS3, we compared the corresponding genomic intervals in DJY1 and IRGC 102295. The RHS3 locus spans 53.8 kb in DJY1 and 142.7 kb in IRGC 102295, largely owing to a $\sim$ 94.3-kb structural variant (SV) in the latter. Seventeen open reading frames (ORFs) were predicted within the aligned interval, including nine shared genes, one DJY1-specific gene, and seven IRGC 102295-specific genes (Fig. 1C and data S4).

A
B

C

Fig. 1. Genetic analysis and cloning of RHS3. (A) Representative plant morphology (top), with spikelet fertility shown as insets, and pollen viability (bottom) of Asian rice DJY1, African rice IRGC 102295, near-isogenic line NIL-RHS3, and their F₁ hybrids (DJY1 × IRGC 102295; DJY1 × NIL-RHS3, named F₁-RHS3) (n = 5 independent florets or panicles). Red arrowheads indicate aborted pollen grains. Scales bars: 20 cm (plant), 5 cm (panicle), 100 μm (pollen). (B) Genotypic distribution of RHS3-gj or RHS3-jj alleles in progeny from reciprocal crosses between DJY1 and F₁-RHS3. Percentages and total plant numbers are shown for each cross direction. Asterisks indicate statistically significant differences (χ² test, ***P < 0.001). (C) Genomic organization of the RHS3 locus. A total of 17 ORFs are annotated within the mapped interval. ORF4 encodes JIA, gORF10 encodes MAO, and gORF16 encodes DUN.

MAO-DUN encodes a toxin-antidote system

The selective elimination of RHS3-j pollen in $F_{1}$ -RHS3 plants suggest that the RHS3-g region from African cultivated rice harbors a toxin-antidote system. Individual disruption of the 16 predicted genes within this region in $F_{1}$ -RHS3 plants revealed that pollen viability was restored only by knocking out gORF10 (Fig. 2A and data S5). Consistent with this, genotypic segregation at RHS3 in $T_{1}$ progeny reverted to the expected Mendelian 1:2:1 ratio (jj:gj:gg) (Fig. 2B and fig. S3, A and B), demonstrating that gORF10 functions as the toxin that eliminates RHS3-j pollen. We therefore named this gene MAO, meaning “spear” in Chinese.

By contrast, repeated attempts failed to disrupt gORF16 in $F_{1}$ -RHS3-derived calli, suggesting that it functions as an antidote in pollen as well as somatic cells. Using green fluorescent protein (GFP) as a proxy for cell viability, we found that MAO expression abolished GFP signal in rice calli, whereas coexpression of gORF16 restored the signal (fig. S3, C and D). Consistent with this, knocking out gORF16 in the MAO mutant background generated MAO/gORF16 double mutants with normal pollen and spikelet fertility (fig. S3, E to G). Moreover, introduction of a genomic copy of gORF16 into F ${1}$ -RHS3 plants increased pollen viability to approximately 75% in T ${0}$ transformants (Fig. 2C), and segregation at both the RHS3 and transgene loci in T $_{1}$ progeny followed the expected 1:3:2 ratio (RHS3, jj:gj:gg; transgene, -:t-:tt) (Fig. 2D and fig. S4, A to C). Together, these findings suggest that gORF16 acts as the antidote that restores fertility to RHS3-j pollen. We therefore named this gene DUN, meaning “shield” in Chinese.

Introduction of linked MAO and DUN transgenes into DJY1 recapitulated the $F_{1}$ -RHS3 phenotype, causing pollen semisterility without affecting spikelet fertility (fig. S4, D to F). The transgene likewise segregated in a 0:1:1 ratio ( $-:t-:tt$ ) in $T_{1}$ progeny (fig. S4, G and H), indicating selective elimination of transgene-free male gametes. These results establish MAO and DUN as a toxin-antidote pair underlying RHS3-mediated pollen semisterility.

A
B

C

D

E

F

G

H

|

J

Fig. 2. MAO and DUN act as a toxin–antidote system mediating pollen semisterility. (A) Knockout of gORF10 restores pollen fertility in F ${1}$ -RHS3 plants. Data are means ± SD (n = 5 independent florets). Scale bars, 100 μm. (B) Segregation of RHS3 genotypes in progeny (T ${1}$ ) from selfed gORF10 knockout F ${1}$ -RHS3 plants follows a 1:2:1 ratio. Asterisks indicate statistically significant differences ( $\chi^{2}$ test, ***P < 0.001). (C) Introduction of a single-copy gORF16 transgene partially rescues pollen fertility in F ${1}$ -RHS3. Data shown as means ± SD (n = 5 independent florets). Red arrowheads indicate aborted pollen grains. Scale bars, 100 μm. (D) Insertion of a single-copy gORF16 transgene into F ${1}$ -RHS3 restores the RHS3 genotypic segregation ratio to 1:3:2 (jj:gj:gg) in T ${1}$ progeny. Asterisks indicate statistically significant differences ( $\chi^{2}$ test, ***P < 0.001). (E) Subcellular localization of MAO–GFP and DUN–mCherry in protoplasts. MAO–GFP and DUN–mCherry colocalize with IDH1-V, a mitochondrial marker; DUN–mCherry also colocalizes with AtATPC1, a chloroplast marker. Scale bars, 5 μm. (F) Yeast two-hybrid (Y2H) assay shows an interaction between MAO and OsGCD1. MAOΔ represents a truncated version lacking the mitochondrial targeting signal. (G) Coimmunoprecipitation (Co-IP) assay confirms interaction between MAO and OsGCD1 in rice protoplasts. OsGCD1–FLAG is coprecipitated by MAO–GFP. (H) Y2H assay shows an interaction between MAO and DUN. DUNΔ represents a truncated version lacking the mitochondrial targeting signal. (I) Co-IP assay confirms interaction between MAO and DUN in rice protoplasts. DUN–FLAG is coprecipitated by MAO–GFP. (J) Co-IP assay demonstrates that DUN–FLAG disrupts the interaction between MAO–GFP and OsGCD1–HA.

DUN binds to MAO to protect mitochondria

To investigate how the MAO–DUN element regulates hybrid sterility, we first examined the expression patterns of MAO and DUN. Both genes were weakly expressed in vegetative tissues. MAO accumulated mainly in developing anthers and pistils, whereas DUN was most abundant in anthers (fig. S5, A and B). Consistent with predicted targeting sequences, MAO localized exclusively to mitochondria, whereas DUN localized to both mitochondria and chloroplasts (Fig. 2E, and fig. S5, C and D).

A yeast two-hybrid (Y2H) screen identified seven candidate MAO-interacting proteins (fig. S5E), among which OsGCD1 was of particular interest because of its essential role in gamete development (29, 30). Consistent with previous reports, homozygous Osgcd1 mutants were not recovered. Heterozygous plants (OsGCD1-He) showed pollen and spikelet semisterility together with defective embryo sac development (fig. S6, A to F). Reciprocal crosses between OsGCD1-He and wild-type (WT)

DJY1 yielded exclusively WT progeny, indicating complete failure of Osgcd1 transmission through both male and female gametes (fig. S6G). OsGCD1 protein self-interacted in coimmunoprecipitation (co-IP) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, indicating that it forms homo-oligomers (fig. S6, H and I). OsGCD1 colocalized and interacted with MAO in mitochondria, as demonstrated by Y2H, BiFC, and co-IP assays (Fig. 2, F and G, and fig. S7, A and B). MAO disrupted OsGCD1 homo-oligomerization (fig. S7C), suggesting that it induces mitochondrial toxicity by impairing OsGCD1 function.

DUN directly interacted with MAO, as demonstrated by Y2H, BiFC, and co-IP assays (Fig. 2, H and I, and fig. S7D), and these two proteins colocalized in mitochondria (fig. S7E). Although DUN did not affect the mitochondrial colocalization of MAO and OsGCD1, it competed with OsGCD1 for MAO binding (Fig. 2J and fig. S7E), thereby relieving MAO-mediated inhibition of OsGCD1 function. These findings suggest that DUN neutralizes MAO toxicity by sequestering MAO and preserving OsGCD1 function.

JIA specifically protects female gametes

Most so far characterized rice hybrid sterility loci affect either pollen or embryo sac fertility (17, 31). Unexpectedly, knocking out gORF4 in F ${1}$ -RHS3 plants reduced spikelet fertility to approximately 50% without affecting pollen fertility (Fig. 3, A and B, and fig. S8A), suggesting a role in female gamete transmission. Because the RHS3-j allele contains ORF4 (Fig. 1C), disruption of jORF4 in the same background produced a phenotype indistinguishable from that of gORF4 mutants (Fig. 3, A and B, and fig. S8A). Genotyping of T ${1}$ progeny derived from selfed T $_{0}$ ORF4 knockout plants revealed that nearly all progeny carried only the RHS3-gg allele when jORF4 was knocked out, whereas progeny from gORF4 knockout plants were almost exclusively heterozygous (RHS3-gj) (Fig. 3C and fig. S8, B and C), indicating that female gametes lacking functional jORF4 or gORF4 were not transmitted. Together, these findings suggest that both gORF4 and jORF4 function as female gamete-specific antidotes. We therefore designated ORF4 as JIA, meaning “armor” in Chinese.

To validate the antidote function of JIA, we generated heterozygous gJIA/gjia and homozygous gjia/gjia mutants in the NIL-RHS3 background. The gJIA/gjia and gjia/gjia plants showed spikelet semisterility and near-complete sterility, respectively, while retaining normal pollen fertility (Fig. 3, D and E, and fig. S8D). At anthesis, mature embryo sacs of gjia/gjia plants were completely devoid of nuclei, in contrast to the characteristic eight-nucleate structure of WT embryo sacs (fig. S8E). Only gJIA/gJIA and gJIA/gjia genotypes were recovered among T₁ progeny from selfed gJIA/gjia plants, segregating at an approximately 1:1 ratio (Fig. 3F and fig. S8F), indicating that female gametes lacking functional gJIA were not transmitted. Moreover, simultaneous knocking out of MAO and gJIA in the NIL-RHS3 background restored spikelet fertility to near WT levels (Fig. 3, E and F). Collectively, these results demonstrate that MAO exerts cytotoxic effects on both pollen and female gametes, whereas JIA protects female gametes by neutralizing MAO toxicity.

Because DUN protects pollen from MAO toxicity, we further investigated whether it also protects female gametes. Heterozygous DUN/dun plants generated by gene editing in the NIL-RHS3 background showed semisterility in both pollen and spikelets (fig. S8, G to I, and data S6). Consistent with this, approximately 50% of the embryo sacs were aborted (fig. S8, J and K). In the genotyped T $_{1}$ progeny, no dun/dun homozygotes were detected (fig. S8, L and M), indicating that DUN protects both male and female gametes from MAO toxicity, whereas JIA provides an additional, female-specific protective role.

JIA cooperates with DUN to detoxify MAO

We next investigated how JIA specifically protects female gametes. In $F_{1}$ -RHS3 plants, JIA expression was highest in developing anthers, followed by developing pistils (fig. S9A). The gJIA and jJIA alleles were expressed at comparable levels (fig. S9B). The encoded proteins differ by only eight amino acid substitutions and both contain a predicted chloroplast transit peptide and an anthranilate phosphoribosyltransferase domain (fig. S10, A and B). Both gJIA and jJIA showed a dual localization to chloroplasts and autophagosomes (Fig. 4, A and B, and fig. S10, C to J). Immunogold labeling in DJY1 root tip cells further confirmed the localization of jJIA to plastids and autophagosomes (fig. S11). These observations suggest that JIA may detoxify MAO by targeting it for autophagic degradation.

We next performed interaction assays and found that both gJIA and jJIA interacted with DUN, but not with MAO (figs. S12 and S13, A and B). However, both MAO-FLAG and DUN-FLAG were coimmunoprecipitated with JIA-GFP (fig. S13, C and D), indicative of the formation of a JIA-DUN-MAO tripartite complex. Coexpression of JIA and DUN in protoplasts redirected DUN-GFP from mitochondria and chloroplasts to autophagosomes (Fig. 4C and fig. S14, A and B). Likewise, coexpression of MAO with JIA and DUN redirected MAO-GFP to autophagosomes (Fig. 4D and fig. S14, C and D). These findings suggest that JIA uses DUN as a molecular bridge to recruit MAO into a JIA-DUN-MAO complex and target it to autophagosomes for degradation.

Selective autophagy receptors recruit cargo proteins to autophagosomes by interacting with ATG8 through ATG8-interacting motifs (AIMs) (32). Because the rice genome encodes seven ATG8 isoforms (33), we tested whether JIA interacts with any of them. Both gJIA and jJIA interacted specifically with OsATG8e in yeast, which was further validated by co-IP and BiFC assays (fig. S15). In silico analysis identified seven putative AIMs (AIM1–7) in JIA. To determine which motif mediates OsATG8e binding, we individually mutated each AIM and reassessed the interaction. Disruption of AIM3 alone abolished the JIA–OsATG8e interaction in yeast (fig. S16, A and B). Notably, loss of this interaction disrupted the autophagosomal localization of JIA while retaining its chloroplast localization in protoplasts (fig. S16, C and D).

To test the in vivo function of AIM3, we mutated this motif in the NIL-RHS3 background. Heterozygous AIM3/aim3 plants showed normal pollen fertility but approximately 50% spikelet fertility, and AIM3/AIM3 and AIM3/aim3 genotypes segregated at a 1:1 ratio in the T $_{1}$ generation (fig. S16, E to G), indicating selective elimination of female gametes carrying the aim3 allele. We further performed a semi-in vivo degradation assay by incubating purified MBP-MAO with total protein extracts from young panicles. MAO was degraded by extracts from NIL-RHS3 plants harboring functional gJIA, but not by extracts from gJIA knockout plants, and this degradation was blocked by the autophagy inhibitor Bafilomycin A1 (Fig. 4E). Together, these findings establish JIA as a selective autophagy receptor that recruits the JIA-DUN-MAO complex to autophagosomes for degradation.

Evolutionary trajectory of RHS3

BLAST analysis showed that JIA is restricted to a subset of Poaceae species (fig. S17A), whereas MAO and DUN are restricted to the genus Oryza. JIA proteins from multiple Oryza species, including AA- and BB-genome wild rice and AA-genome cultivated rice, retained an intact AIM3 motif and interacted with OsATG8e in yeast (fig. S17B). By contrast, JIA homologs from Triticum aestivum, Sorghum bicolor, and Zea mays failed to interact with OsATG8e as a result of the replacement of the conserved AIM3 Ile residue with Val or Lys (fig. S17, A and B), indicating that the protective function of JIA is restricted to Oryza.

To investigate the origin of the 94.3-kb SV encompassing MAO and DUN, we analyzed chromosome-level genome assemblies from five AA-genome wild species (O. meridionalis, O. longistaminata, O. glumaepatula, O. barthii, and O. rufipogon), one BB-genome species (O. punctata), and two CC-genome species (O. officinalis and O. eichingeri). Synteny analysis showed that MAO and DUN are present exclusively in AA-genome species and absent from BB- and CC-genome wild rice (Fig. 4F and data S7), indicating an origin within

A

B

C

D

E
F

Fig. 3. JIA protects female gametes by detoxifying MAO. (A) Knockout of either gORF4 or jORF4 in F₁-RHS3 plants leads to spikelet semisterility. Red arrowheads indicate shriveled grains. Data shown as means ± SD (n = 5 independent panicles). Scale bars, 10 cm. (B) Quantification of spikelet fertility in F₁-RHS3, gORF4-knockout, and jORF4-knockout lines. Data shown as means ± SD (n = 5 independent panicles). Asterisks indicate statistically significant differences (Student's t-test, **P < 0.01). (C) Genotypic segregation of RHS3 following gORF4 and jORF4 knockout in F₁-RHS3. A 0:1:0 (jj:gj:gg) ratio is observed for gORF4 knockout, and a 0:0:1 (jj:gj:gg) ratio for jORF4 knockout. (D) Knocking out of gJIA almost abolishes spikelet fertility in the NIL-RHS3 background but the reduced fertility is largely restored when MAO is knocked out. Red arrowheads indicate shriveled grains. Data shown as means ± SD (n = 5 independent panicles). Scale bars, 10 cm. (E) Quantification of spikelet fertility in control, heterozygotes and homozygous gJIA mutants, and gJIA/MAO double-knockout lines. Data shown as means ± SD (n = 5 independent panicles). Asterisks indicate statistically significant differences (Student's t-test, **P < 0.01). (F) Genotypic segregation of gJIA in selfed progeny of heterozygous mutant shows a 1:1:0 (++:±:--) ratio.

the AA-genome lineage. Using the conserved flanking genes ORF9 and ORF17, we extracted the ORF9–17 interval for comparative analysis. Only O. barthii, the wild progenitor of O. glaberrima, contains an intact 94.3-kb SV, whereas other wild species either lack it or harbor only partial segments. The SV could be resolved into a 48.7-kb left segment (L-SV; gORF10–13) and a 45.6-kb right segment (R-SV; gORF14–16). The L-SV and R-SV show highest homology to the corresponding regions in O. glumaepatula and O. meridionalis, respectively (Fig. 4G), suggesting that the 94.3-kb SV in O. barthii has a composite origin involving these two species. O. rufipogon contains three SV types in this region, likely derived from multiple ancestral lineages, including O. longistaminata, O. meridionalis, and O. glumaepatula (fig. S17C).

To assess MAO and DUN diversity, we analyzed 591 accessions of O. barthii, O. rufipogon, and cultivated rice from Africa and Asia (data S7). Three MAO allele types were identified: functional MAO, $MAO^{T/S}$ (alleles carrying premature stop codons or amino acid substitutions predicted to abolish function in the absence of DUN), and $MAO^{U}$ (alleles of unknown function). DUN alleles were similarly classified into functional DUN, $DUN^{T}$ (alleles carrying premature stop codons), and

Fig. 4. JIA-mediated detoxification and evolutionary trajectory of the RHS3 locus. (A) Subcellular localization of gJIA–GFP in protoplasts shows colocalization with AtATPC1, a chloroplast marker. Scale bars, 5 $\mu$ m. (B) gJIA–GFP colocalizes with mCherry–AtATG8i, an autophagosome marker. Scale bars, 5 $\mu$ m. (C) DUN colocalizes with gJIA–GFP in autophagosomes upon coexpression. Scale bars, 5 $\mu$ m. (D) Coexpression of gJIA–CFP and DUN–FLAG redistributes MAO–GFP to autophagosomes. Scale bars, 5 $\mu$ m. (E) Semi-in vivo degradation assay of MAO. Purified MBP–MAO is incubated with total protein extracts from young panicles of NIL-RHS3 or gJIA knockout plants. Bafilomycin A1 (BFA) is an inhibitor of autophagic flux. (F) Synteny analysis of the RHS3 locus across representative Oryza species arranged according to previously reported whole-genome phylogenetic relationships (corresponding accessions are listed below). JIA is evolutionarily conserved across the Oryza genus, while MAO and DUN likely originated de novo in O. glumaepatula and O. meridionalis, respectively. (G) Structural variations at the RHS3 locus spanning ORF9 to ORF17 among representative AA-genome rice species, including O. meridionalis, O. glumaepatula, and O. barthii. Colored boxes above indicate the predicted ORFs. Colored segments show the Identity by Descent regions through recombination. The lower panel shows nucleotide sequences at the recombination breakpoint (indicated by red dashed line). Accession identifiers for each species are shown below the corresponding species names. L-SV, left fragment of the SV; R-SV, right fragment of the SV.

A

B

$DUN^{S}$ (alleles carrying conserved amino acid substitutions) (data S8 and S9). To assess the functionality of $DUN^{S}$ , we introduced a recombinant $DUN^{S}$ allele carrying four conserved amino acid substitutions, driven by the native $DUN$ promoter, into F ${1}$ -RHS3 plants. T ${0}$ transformants showed pollen semisterility, and RHS3 genotypes ( $jj:gj:gg$ ) segregated in a 0:1:1 ratio in selfed progeny (fig. S18, A and B), indicating that $DUN^{S}$ is nonfunctional. On the basis of the presence and functional status of $MAO$ and $DUN$ , $MAO-DUN$ haplotypes were grouped into seven types: Type I lacks both genes (e.g., DJY1), whereas Type VII carries functional $MAO$ and $DUN$ (e.g., IRGC 102295). Type II and Type III contain only nonfunctional $DUN$ or $MAO$ , respectively, while

Type IV contains nonfunctional alleles of both genes. Type VI carries functional DUN, whereas the functional status of MAO remains undetermined. Notably, Type V harbors functional DUN but nonfunctional MAO (data S10), suggesting a potential wide-compatibility type. This speculation was validated by genetic analyses (fig. S18, C and D).

We next surveyed MAO–DUN haplotypes in 672 accessions of AA-, BB- and CC-genome wild rice species. All nine O. longistaminata accessions carried Type I. Among 32 O. meridionalis accessions, 25 harbored Type I and seven Type II. In O. glumaepatula, 11 out of 29 accessions harbored Type I and 18 carried Type III. O. rufipogon displayed greater diversity, with Type I predominating (101/158 of accessions), followed by Type II (49/158) and Type III (8/158). In O. barthii, four haplotypes were detected: Type IV (37/101), Type V (2/101), Type VI (3/101) and Type VII (59/101) (fig. S18E). Comparative sequence and phylogenetic analyses suggest that nonfunctional MAO-like and DUN-like sequences originated de novo in O. glumaepatula and O. meridionalis, respectively, and were subsequently brought together through introgression or recombination in an unknown intermediate ancestor to form a complete but nonfunctional MAO–DUN element. In O. barthii, multiple coding sequence mutations rendered both MAO and DUN functional, a process that accompanied the emergence of reproductive isolation between Asian and African rice lineages. All surveyed O. rufipogon and Asian cultivated rice accessions carried nonfunctional RHS3 haplotypes, whereas functional RHS3 occurred in 58% of O. barthii and 97% of African cultivated rice accessions (fig. S18E), identifying RHS3 as a major reproductive barrier between Asian and African rice lineages.

Discussion

Here we show that RHS3 encodes a noncanonical tripartite toxin-antidote system in which MAO acts sporophytically to kill both male and female gametes by impairing OsGCD1, whereas DUN functions gametophytically to rescue DUN-carrying male gametes by disrupting the MAO-OsGCD1 interaction (fig. S19). Unlike previously characterized two-component toxin-antidote systems underlying hybrid sterility in rice (17, 31), RHS3 contains a third component, JIA, which acts as a female gamete-specific protector. Mechanistically, JIA interacts with DUN to form a JIA-DUN-MAO complex and binds ATG8e through its AIM3 motif, thereby targeting MAO for autophagic degradation (fig. S19B). These findings identify JIA as a plant-specific selective autophagy receptor that mediates autophagic degradation of MAO, thereby revealing a previously unrecognized mechanism of reproductive isolation in plants.

JIA exerts its protective function only in the presence of the MAO-DUN element, suggesting that it represents a cryptic genetic component of the hybrid sterility system. This observation raises the possibility that similar hidden components could be widespread yet remain undetected in conventional genetic analyses, particularly when shared by both parental lineages. The recruitment of JIA may also confer evolutionary advantages to the RHS3 locus. By coopting JIA, a gene conserved across Oryza species, RHS3 may circumvent the need to evolve a dedicated antidote. Moreover, although MAO impairs both male and female gametes, the conserved function of JIA and its female gamete-specific protective activity may allow RHS3 to increase its transmission without compromising spikelet fertility.

Meeting future rice demand will require sustained increase in productivity under growing population pressure and climate change $(34, 35)$ . Interspecific heterosis between Asian and African cultivated rice, exemplified by the successful development of New Rice for Africa (NERICA) varieties, offers considerable potential for further yield improvement $(9, 10, 36)$ . We identified wide-compatibility types of RHS3 carrying a nonfunctional MAO but functional antidote components, which restore fertility when crossed with either Asian or African cultivated rice. These variations provide valuable genetic resources for overcoming interspecific hybrid sterility and advancing Asian–African hybrid rice breeding.

REFERENCES AND NOTES

1. H. U. A. Rezvi et al., Food Energy Secur. 12, e430 (2023).

2. K. De Vos et al., Nat. Food 4, 518–527 (2023).

3. D. Guo et al., Nature 642, 662–671 (2025).

4. C. Y. Jing et al., Nat. Plants 9, 1221–1235 (2023).

5. M. Wang et al., Nat. Genet. 46, 982–988 (2014).

6. J. Y. Choi et al., PLOS Genet. 15, e1007414 (2019).

7. D. Zeng et al., Nat. Plants 3, 17031 (2017).

8. P. W. Wambugu, M. N. Ndjiondjop, R. Henry, Plants 8, 376 (2019).

9. M. P. Jones, M. Dingkuhn, G. K. Aluko, M. Semon, Euphytica 92, 237–246 (1997).

10. Y. Sun et al., Crop Sci. 60, 2343–2353 (2020).

11. J. Li et al., Sci. Rep. 13, 23057 (2023).

12. Y. Koide et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E1955–E1962 (2018).

13. Y. Xie et al., Nat. Commun. 10, 2501 (2019).

14. M. A. Bravo Núñez, N. L. Nuckolls, S. E. Zanders, Trends Genet. 34, 424–433 (2018).

15. A. Burga, E. Ben-David, L. Kruglyak, Annu. Rev. Genet. 54, 387–415 (2020).

16. A. L. Sweigart, Y. Brandvain, L. Fishman, Trends Genet. 35, 245–252 (2019).

17. C. Wang, X. Yu, J. Wang, Z. Zhao, J. Wan, J. Genet. Genomics 51, 583–593 (2024).

18. A. Ricou et al., PLOS Genet. 21, e1011451 (2025).

19. J. Yang et al., Science 337, 1336–1340 (2012).

20. X. Yu et al., Science 360, 1130–1132 (2018).

21. C. Wang et al., Cell 186, 3577–3592.e18 (2023).

22. E. Ben-David, A. Burga, L. Kruglyak, Science 356, 1051–1055 (2017).

23. B. G. Herrmann, B. Koschorz, K. Wertz, K. J. McLaughlin, A. Kispert, Nature 402, 141–146 (1999).

24. J. H. Werren, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 10863–10870 (2011).

25. S. Maheshwari, D. A. Barbash, Annu. Rev. Genet. 45, 331–355 (2011).

26. M. E. Frayer, N. V. Robles, M. J. Rodríguez-Barrera, J. M. Coughlan, M. Schumer, Trends Genet. 41, 1068–1095 (2025).

27. Y. Zhang et al., Mol. Breed. 28, 323–334 (2011).

28. Y. Yang et al., Rice (N. Y.) 18, 43 (2025).

29. X. Huang, X. Peng, M. X. Sun, New Phytol. 215, 1039–1058 (2017).

30. J. J. Wu et al., Dev. Cell 23, 1043–1058 (2012).

31. Y. Ouyang, Q. Zhang, Annu. Rev. Plant Biol. 64, 111–135 (2013).

32. V. V. Rogov et al., Autophagy Rep. 2, 2188523 (2023).

33. K. Xia et al., DNA Res. 18, 363–377 (2011).

34. X. Guo, W. Luo, K. Chong, Sci. Bull. 70, 1364–1367 (2025).

35. J. Y. Li, C. Yang, J. Xu, H. P. Lu, J. X. Liu, Plant Cell Environ. 46, 1087–1103 (2023).

36. O. F. Linares, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16360–16365 (2002).

37. K. Zhao, Code for: A tripartite genetic conflict system controls hybrid sterility in rice, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20579119.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank X. Wei, L. Zhang, L. Zhou, X. Yang, and T. Yu for assistance with rice field management and hybridization; Q. Yang and Y. Cheng for providing wild rice accessions; X. Ma for sharing rice landrace resources; and K. Olsen for critical reading of the manuscript and valuable discussions. Funding: This study was supported by the Scientific Research Innovation Capability Support Project for Young Faculty (ZYGXQNJSKYCXNLZCXM-A7), the National Key Research and Development Program of China (2022YFD1200801 and 2022YFF1003503), the National Natural Science Foundation of China (32422067), the Jiangsu Province Natural Science Foundation (BK20240089), and the Key Project for Zhongshan Biological Breeding Laboratory (ZSBBL-KY2023-04 and ZSBBL-KY2023-07). C.Wang acknowledges support from the 2024 DAMO Academy Young Fellow Award. Additional support was provided by the Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of Japonica Rice in the Mid-lower Yangtze River and the Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production. Author contributions: X.H. and K.S. performed most of the experiments and analyzed the data. YingZhu and Y.Zeng performed subcellular location and immunogold labeling assays. Y.X. performed protein purification assays. JingLi, Y.Zhang, C.L., X. Dong, Y.R., J.Wang, Y.H., S.Cheng, B.Y., T.S., J.X., JiayuLu, D.L., A.J., J.G., S.Cui, G.X., X.L., Y.T., S.L., X. Deng, J.Z., D.T., J.T., and L.C. developed materials and performed genetic analysis. K.Z., X.Z., Hongru Wang, X. Gan, Y.Y., S.G., YuantaoZhu, L.H. and C.X. performed the evolutionary analysis. X. Guo and L.J. performed the genetic transformation. J.T., LetianChen and X.Y. discussed the manuscript. C.Wang, Haiyang Wang, C.Wu, Z.Z. and J.Wan wrote the manuscript. J.Wan conceived and supervised the project. Competing interests: J.Wan, X.H., C.Wang, K.S., Z.Z., L.J., X.Y., X.L., S.L., Y.T. and Liangming Chen are inventors on a pending patent (202410734804.8) in China related to this work. The other authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: The sequences of MAO, DUN, gJIA and jJIA have been deposited in GenBank under accession numbers PV833341–PV833344. The raw sequencing data, including transcriptome data from IRGC 102295 young panicles at the meiosis stage and its whole-genome sequence, have been deposited in the NCBI Sequence Read Archive under BioProject accession PRJNA1426876. All other data needed to evaluate the conclusions in the paper are available in the main text, supplementary material or data S1 to S11. Original uncropped gel blot images are provided in data S1 and S2. The custom code used for the genomic and phylogenetic analyses of the RHS3 locus has been deposited at Zenodo (37). All materials generated in this manuscript will be made available upon request to J. Wan under a material transfer agreement. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/content/page/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aec5252

Materials and Methods; Figs. S1 to S19; References (38–44); MDAR Reproducibility Checklist; Data S1 to S11

Submitted 23 September 2025; resubmitted 1 May 2026; accepted 3 July 2026

10.1126/science.aec5252

ORGANIC CHEMISTRY

Iron-catalyzed [1+1+1] cyclopropanation by sequential coupling of an ester to two carbenes

Lingran Kong $^{1\dagger}$ , Kevin Zong $^{1,2\dagger}$ , Marcus Hopfengärtner $^{3}$ , Brandon J. Orzolek $^{4}$ , Ryan Shenvi $^{1*}$

Traditional precious metal catalysis benefits from well-characterized inner-sphere elementary steps in which a single complex binds and unites substrates at the metal center. By contrast, base metal catalysts have recently demonstrated competence in cross-coupling transformations through iterative outer-sphere reactions in which product bond formation occurs by serial additions to the ligand, not the metal. Despite the emerging diversity of two-component outer-sphere reactions, comparable multicomponent outer-sphere couplings remain rare. In this study, we describe an iron-catalyzed $[1+1+1]$ synthesis of cyclopropanols through iterative outer-sphere reactions between two carbenes and an ester. This reaction initially generates silyl enol ethers stereo-, regio-, and chemoselectively through a traceless, directed olefination that can be further exploited to enable transformations unavailable to prior methods.

Cyclopropanols serve as versatile synthons owing to their ring strain (28 kcal·mol $^{-1}$ ), which dramatically amplifies the reactivity of the hydroxyl group, enabling ring opening to reactive intermediates, such as metal homoenolates, $\beta$ -keto radicals, and allylic cations, that are hard to access from conventional alcohols (Fig. 1A) (1–3). The strained ring can also be preserved through functional group interconversion—most notably, through deoxygenative pathways—enabling facile access to substituted cyclopropanes (4, 5). Beyond synthetic utility, cyclopropanol subunits are featured in structurally diverse compounds of interest, including the antimicrobial valgamicin C (6), the hepatitis C therapeutic grazoprevir (7), and the morphine analog (−)-bremazocine (8).

For decades, the synthesis of cyclopropanols has been dominated by $[2+1]$ retrosynthetic paradigms (9) with little innovation to address the inherent limitations in functional group compatibility as well as stereo- and regiocontrol (Fig. 1B). For example, the widely applied Kulinkovich reaction engages a carboxylate with a titanacyclopropane to deliver a 1,2-disubstituted cyclopropanol, predominantly as the trans isomer (10). Despite its utility, this reaction suffers from limited functional group tolerance owing to its use of highly reactive organotitanium intermediates, which are generated from stoichiometric Grignard reagents or strong reductants (11). An orthogonal approach uses a preformed silyl enol ether as the two-carbon component and a metal carbenoid as its partner to deliver the corresponding siloxycyclopropanol (12, 13). This strategy, however, requires selective access to silyl enol ethers, substrates that are often nontrivial to prepare, as conventional enolizations of pseudosymmetric ketones typically afford mixtures of regio- and stereoisomers (Fig. 1C, top) (14, 15). Together, these limitations constrain both the modularity and selectivity of existing $[2+1]$ approaches.

A multicomponent strategy that assembles cyclopropanols directly from simple building blocks would thus represent a major advance, especially if rendered catalytic (Fig. 1B, bottom). Rather than relying on a preformed two-carbon component, a modular $[1+1+1]$ approach would broaden substrate scope while simultaneously addressing the chemo-, regio-, and stereoselectivity challenges inherent to existing methods. Central to this design is the in situ generation of a silyl enol ether intermediate as a single stereo- and regioisomer, ideally under conditions compatible with subsequent carbenoid cyclopropanation (16), a transformation that, if realized, would collapse a multistep sequence into a single catalytic operation.

Our inspiration for this transformation comes from prior work in our group that identified oxy-cobalt carbenes as key intermediates that undergo addition to thioesters under mildly reducing conditions, affording bis-siloxy alkenes with high chemo- and stereoselectivity (Fig. 1C, bottom) (17). We reasoned that an analogous reaction between carboxylates and alkyl carbenes could deliver the desired silyl enol ether products with high selectivity and thereby circumvent the constraints of pseudosymmetric ketone silylation (cf. Fig. 1B). This strategy is bolstered by reports from several groups demonstrating that alkyl carbenes can be accessed from readily available precursors, such as aldehydes, diazo esters, $\alpha$ -oxy carboxylates, and gem-dihalides using iron porphyrin catalysts under similarly reducing conditions (16, 18–25).

However, iron porphyrin carbenes typically behave as electrophilic or metalloradical species (26, 27), seemingly at odds with the two-electron nucleophilic addition to a carbonyl required for carboxylate-carbene coupling. To realize our goals, we reversed this native electrophilicity through ylide transfer (28–31) and leveraged a 2-pyridyl ester to capture the iron carbene, which then undergoes intramolecular addition to the ester carbonyl (Fig. 1D, top). Notably, the resulting α-pyridone then departs through an iron-mediated reductive cleavage to generate a silyl enol ether stereoselectively, effectively utilizing the embedded pyridine as a traceless directing group. In this sequence of events, the pyridyl ester appears only to engage the iron in outer-sphere reactions (32) with its aldehyde-derived carbene ligand rather than the iron center itself.

From this reactivity, we have realized several multicomponent sequences (Fig. 1D, bottom), including a $[1+1+1]$ cis-selective cyclopropanol synthesis from three simple one-carbon components using a single iron catalyst. Each component of the cyclopropanol is readily accessible: (i) the pyridyl ester in one step from a carboxylic acid, (ii) the carbene precursor in one step from the corresponding aldehyde, and (iii) dichloromethane ( $CH_{2}Cl_{2}$ or $CD_{2}Cl_{2}$ ), a common and inexpensive solvent. Other transformations disclosed herein benefit from the chemo-, stereo- and regioselectivity of silyl enol ether formation.

Optimization and scope

Investigations began with the use of aryl carboxylates and $\alpha$ -benzoylbromides, highly reactive precursors to iron carbenes identified by Nagib and coworkers (Fig. 2A) (33). Although the simple esters and thioesters (e.g., 1 and 2) exhibited low reactivity, the more electrophilic 3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl thioester that we used in our previous work provided the desired silyl enol ether as a first hit, albeit in trace yield. A subsequent additive screen uncovered electron-rich, unhindered pyridines as reagents that increased these yields significantly (58%, >20:1 Z:E). We formulated three hypotheses that might explain the effect of pyridine: (i) Lewis base catalysis, (ii) metal coordination, or (iii) carbene delivery. The first hypothesis involves the potentially reversible addition of pyridine to the thioester to accelerate the overall reaction. We were able to eliminate this option, as we observed that incorporation of the pyridine into the carboxylate as the corresponding 2-pyridyl ester resulted in highly effective coupling, affording the enol ether in 56% yield. Distinguishing between the remaining two hypotheses—metal coordination and carbene delivery—required further investigation. Furthermore, tetrabutylammonium bromide (TBAB) was identified as a beneficial additive, boosting the yield from 56 to 66% potentially by modulating the reduction potential of manganese powder (34) or generating triethylsilyl bromide in situ as a more reactive silylating agent.

Fig. 1. Challenges in cyclopropanol synthesis and design of a modular iron-catalyzed $[1+1+1]$ assembly. (A) Cyclopropanols are prevalent motifs in both chemical and biological settings. (B) Access to cyclopropanols is restricted by either harsh conditions or by the need to selectively access preassembled intermediates, such as silyl enol ethers, inspiring the need for a modular $[1+1+1]$ design. (C) Conventional enol ether synthesis from ketones often results in a mixture of diastereomers and regioisomers. Carboxylate-carbene cross-coupling would provide mild access to silyl enol ethers but requires nucleophilic carbene reactivity. (D) Pyridine-mediated carbene polarity reversal through ylide transfer yields silyl enol ethers and enables access to structurally diverse three-carbon products via a single iron catalyst.

Notably, when dichloromethane was introduced as a third reaction component, the corresponding siloxycyclopropanol 7a was obtained selectively (Fig. 2B). With these findings, we developed a set of conditions: Condition A, in which the cross-coupling was performed first, followed by addition of dichloromethane and heating to $70^{\circ}$ C, and Condition B, in which all components were combined concurrently. The selectivity of this one-pot reaction described in Condition B likely reflected the faster rate of carbene formation from $\alpha$ -benzoylbromides relative to dichloroalkanes, enabling sequential carbene generation from a single catalyst. Both conditions were operationally convenient and delivered the siloxycyclopropanol with high cis selectivity (>20:1 diastereomeric ratio), complementing the trans selectivity of the Kulinkovich reaction.

Variation of the pyridyl ester component (Fig. 2C) uncovered a broad array of electronically and sterically varied aryl carboxylates as competent coupling partners; electron-rich, -neutral, and -poor substituents all furnished the 1,2-disubstituted siloxycyclopropanol in modest to good yields (7a to 7i). Alkyl esters performed equally as well as the aryl carboxylates, and functional groups typically incompatible with the strongly reducing conditions of the Kulinkovich reaction (e.g., halides, methyl esters, nitriles, and ketones) were well tolerated (7j to 7v).

Fig. 2. Optimization and scope of tri-component $[1+1+1]$ reaction. (A) Model reaction for silyl enol ether synthesis with substrate variation and additive screening. (B) One-pot siloxycyclopropanol synthesis. Reported yields are isolated. (C) Scope of tricomponent $[1+1+1]$ reaction. $\dagger$ Reactions run using Condition A unless otherwise noted. $\ddagger$ Reaction run without the addition of TBAB. $\S$ Reaction run with 10 equiv. Mn and 15 equiv. $CH_{2}Cl_{2}$ . #Reaction run with 10 equiv. Mn and 15 equiv. $CH_{2}Cl_{2}$ and without the addition of TBAB. All reported yields are isolated unless otherwise denoted. **Gas chromatography yield.

Notably, this scope demonstrated that the electrophilicity of the carbonyl did not impact the efficiency of initial silyl enol ether formation, seemingly incompatible with the hypothetical role of pyridine or pyridyl ester binding the metal center to render the carbene nucleophilic. The reaction scaled well to 4 mmol without significant erosion in yield (cf. 7l), and $d_{2}$ -cyclopropanols were accessed with no variation in procedure aside from the use of $CD_{2}Cl_{2}$ (35, 36), providing isotopically labeled products 7r' and 7v'.

We next examined the scope of available $\alpha$ -benzoylbromides, finding that coupling partners bearing halides, strained rings, nitrogenous heterocycles, and nonpyridyl esters were competent (7w to 7z). However, as the steric bulk of the environment surrounding the $\alpha$ -benzoylbromide increased, poor conversion of the silyl enol ether to the siloxycyclopropanol was observed (see the supplementary materials for additional scope entries), suggesting that steric bulk was tolerated in the carboxylate-carbene cross-coupling step but poorly accommodated in the subsequent cyclopropanation. Taken together, the ester and $\alpha$ -benzoylbromide scope established the $[1 + 1 + 1]$ cyclopropanation as a broadly applicable method for the synthesis of 1,2-disubstituted siloxycyclopropanols from simple, readily available starting materials.

Extension to dichloromethane oligomerization

Uyeda and coworkers demonstrated that dichloromethane could be used as a carbene synthon in their seminal work on both the catalytic cyclopropanation of alkenes and the cyclooligomerization of enones to yield cyclopentanes via sequential insertions (37, 38). An analogous oligomerization to form three-membered rings had not been reported, motivating our investigation. Notably, this reactivity was not immediately accessible from pyridyl esters by iron catalysis alone (see the supplementary materials), likely owing to high background rates of unsubstituted carbene dimerization resulting in the unwanted production of ethylene. By analogy to Uyeda's conditions, we found that nickel complexes were effective to promote oligomerization but only in the presence of the iron porphyrin cocatalyst (Fig. 3). We suspect that these conditions either suppressed high concentrations of iron carbene by sequestration into a mixed organometallic carbenoid (39) or diverted the pyridyl ester into a carbonyl insertion pathway to silyl enol ether formation (40, 41). A high-throughput ligand screen (see the supplementary materials) identified distinct optimal precatalysts and ligands for $\mathfrak{sp}^2$ and $\mathfrak{sp}^3$ ester substrates: $\mathrm{NiBr_2\cdot dme}$ with L1 was effective for conjugated esters, whereas $\mathrm{Ni(oct)_2\cdot H_2O}$ with L2 allowed access to alkyl esters. The reaction afforded monosubstituted cyclopropanols in modest to good yield across both substrate classes and surpassed prior methods in its chemoselectivity. Furthermore, the method enables the use of $\mathrm{CD}_2\mathrm{Cl}_2$ for streamlined access of $\mathrm{d}_4$ -cyclopropanols, bypassing the need for $\mathrm{d}_5$ -EtMgBr (42), a harsh, non-commercial organometallic.

Additional applications of carboxylate-carbene cross-coupling

Beyond cyclopropanation, the silyl enol ether synthesis presented an opportunity to leverage its very high regio-, stereo-, and chemoselectivity, i.e., its distinctive attributes of enolate formation, in multiple additional sequences. Conventional base-mediated enolization of pseudosymmetric ketones would produce mixtures of up to four regio- and stereoisomers (Fig. 4A), whereas the pyridyl esters used here generated a single silyl enol ether isomer by carbene cross-coupling. This selectivity enabled $\alpha$ -bromination, $\alpha$ -hydroxylation, Mukaiyama aldol reaction, and oxidative coupling, delivering a single regioisomer in each case. Such control would be difficult to achieve from the corresponding ketone, particularly in substrates bearing structurally similar functional groups. The practical value of this selectivity was demonstrated in the synthesis of 14 (a building block en route to the antibiotic alaremycin) for which multiple enolizable protons rendered selective enol ether formation challenging by conventional means, as reflected in previous routes to this intermediate (43). By contrast, the iron-catalyzed silyl enol ether synthesis reported in this work directly delivered a single regioisomeric intermediate, after which $\mathrm{CuBr_2}$ -mediated bromination proceeded without ambiguity.

Chemoselectivity proved equally enabling for intramolecular cyclization strategies not accessible by conventional base-mediated enolization (Fig. 4B). For example, standard enolization would not distinguish between the four acidic protons of a 1,4-dicarbonyl substrate and would generate a mixture of silyl enol ethers, complicating downstream reactivity and purification. By contrast, carbene cross-coupling selectively engaged only with pyridyl esters in the presence of pendent ketones and $\alpha$ , $\beta$ -unsaturated esters, leaving them as handles for subsequent cyclization. Using this strategy, [3.2.1]- and [2.2.1]-bridged bicyclic scaffolds (15, 16) and functionalized cyclohexenone 17 and cyclohexanone 18 were obtained in good yields over two steps. The enol ether synthesis also provided facile access to Diels-Alder precursors, where treatment of the resulting triene with $\mathrm{Cu(OTf)_2}$ and $\mathrm{Cu_2O}$ promoted a formal $[4 + 2]$ cyclization to deliver tricyclic product 19 in $42\%$ yield over two steps with high diastereoselectivity. Lastly, we explored intramolecular variants of the carbene cross-coupling (Fig. 4C). Because of the limited stability of $\alpha$ -benzoyl bromides, $\alpha$ -dichloro

Fig. 3. Scope of ester cyclooligomerization reaction. †Reaction conditions: 0.1 mmol aryl and vinyl pyridyl ester, 5 equiv. Mn, 3 equiv. TESCI, 5 mol % NiBr₂·dme, 8 mol % L1, 5 mol % FeTPPCI, and DMA (0.1M) at 23°C for 16 hours. ‡Reaction conditions: 0.1 mmol alkyl pyridyl ester, 6 equiv. Mn, 3 equiv. TESCI, 5 mol % Ni(oct)₂·H₂O, 8 mol % L2, 5 mol % FeTPPCI, and DMA (0.1M) at 60°C for 16 hours unless otherwise noted. §After 16 hours, 3 equiv. Mn and 6 equiv. CH₂Cl₂ were added, and the reaction was stirred at 60°C for an additional 8 hours.

Fig. 4. Applications of selective enol ether synthesis. (A) Regioselective access to silyl enol ethers enables selective functionalization of a pseudosymmetric ketone. (B) Chemoselective access to silyl enol ethers enables subsequent intramolecular cyclization with pendant functional groups. (C) Intramolecular silyl enol ether formation and application to macrocyclization.

substrates were used as carbene precursors, affording the silyl enol ether of indanone in 45% yield (21). Extension of this reactivity to long-tether substrates afforded metacyclophane 23, which could be crystallized as its tosylhydrazone, unambiguously confirming the macrocyclic structure. Although the yield remained modest, this result was notable in its delivery of a macrocyclic ketone, representative of a high-value target class that lacks easy access by conventional means (44). The ability to construct a macrocyclic ketone directly from a simple linear precursor by carboxylate-carbene cross-coupling signals a compelling avenue for future development.

Mechanistic insights and expansion of reactivity

We have demonstrated that the presence of a pyridine nitrogen is necessary for productive catalysis, whether embedded in the substrate (e.g., 2-pyridyl esters) or as an exogenous additive (e.g., addition of 2-methoxypyridine). For this, we considered two possible explanations: (i) coordination of pyridine to the axial position of the iron porphyrin to increase the nucleophilicity of the carbene carbon (inner sphere) (18, 23, 45, 46) or (ii) addition to the iron carbene carbon to effectively reverse its polarity through formation of the pyridinium ylide (outer sphere) (29–31). 2-Pyridyl esters bearing an additional C6 methyl (e.g., 27) prevented product formation, an outcome anticipated by both hypotheses, as steric congestion at the coordinating nitrogen would be expected to impede both metal coordination and ylide formation (Fig. 5A). To distinguish between the two competing hypotheses, we added 2-methoxypyridine to two different productive 2-pyridyl ester substrates and observed a decrease in yield in both cases (56 to 27% and 65 to 34%). These outcomes were inconsistent with inner-sphere coordination as a means of enhancing carbene nucleophilicity, as we hypothesized that a higher pyridine•iron concentration would increase the productive pathway rate. By contrast, these data are consistent with outer-sphere pyridinium ylide formation whereby competitive additions to the carbene carbon would obstruct product formation. Notably, the same additive had no detrimental effect on reactivity with 2-pyridyl thioester 28 as the substrate likely owing to the superior leaving group that renders both intra- and intermolecular ylide attacks productive (cf. Fig. 5C, bottom). Consistent with the outer-sphere mechanism, we also observed that when

Fig. 5. Mechanistic interrogation. (A) Leaving group identity and nitrogen accessibility govern reactivity of the carboxylates, and synthetic analogs of the proposed intermediates undergo productive cross-coupling. (B) Variation in carbene precursors and electrophile yield similar product scaffolds. (C) Proposed mechanism for carbene polarity reversal through intramolecular and intermolecular ylide transfer.

2-siloxypyridine reacted with a carbene precursor under standard conditions, a retro-Brook rearrangement of the ylide occurred to yield compound 30. However, this pathway did not compete efficiently with normal product formation (see the supplementary materials), demonstrating that although ylide transfer was accessible, the intramolecular retro-Brook pathway may be outcompeted by a highly electrophilic carboxylate substrate.

Although the proposed outer-sphere mechanism takes inspiration from precedent with rhodium carbenes derived from diazo precursors (31), analogous reactivity in iron-catalyzed reactions has not been reported. Additionally, this proposed mechanism did not account for the unusual $\alpha$ -pyridone or $\alpha$ -pyridinium ketone intermediate that would be required to convert to the final product (cf. Fig. 5C). We could not find any precedent for iron porphyrin-mediated scission of this C–N bond, thus motivating experiments to probe pyridone 31 and pyridinium 33 as potential reactive intermediates. When synthesized independently and subjected to the reaction conditions, we found that the heterocycles were in fact cleaved to afford the silyl enol ether in high yield and diastereoselectivity. Notably, reactivity proved inefficient with manganese and silyl chloride alone (fig. S20), suggesting that the iron porphyrin itself mediated the C–N bond cleavage by an additional outer-sphere pathway en route to product.

Variation of the carbene precursor and electrophile both informed the mechanistic hypothesis and pointed toward opportunities for new reaction development (Fig. 5B). Replacement of the $\alpha$ -benzoylbromide with three equivalents of the corresponding gem-dichloride afforded silyl enol ether 6 in $77\%$ yield, establishing that the ylide-transfer mechanism extends beyond $\alpha$ -bromobenzoate-derived iron carbenes, though these conditions proved incompatible with the $[1 + 1 + 1]$ cyclopropanation (fig. S8). Direct employment of an aldehyde also gave $10\%$ yield of silyl enol ether 36, with the diminished yield reflecting the lower intrinsic reactivity of this nonreactivated precursor. Lastly, replacement of TESCl with AcCl afforded enol acetate 37 in $14\%$ yield, indicating that the proposed intermediates could be intercepted by other electrophiles, albeit with reduced efficiency.

For 2-pyridyl ester substrates, these data suggested a mechanism of outer-sphere ylide transfer (Fig. 5C, top), ester addition, reductive C–N bond cleavage, and silylation to arrive at the silyl enol ether stereo-, regio- and chemoselectively. This mechanism avoided coordination and insertion steps of the nucleophile or electrophile pair and united the reactants intramolecularly, pointing to a breadth of applications beyond those described in this work. By contrast, an intermolecular attack occurred when using exogenous pyridine reagents in combination with reactive carboxylates, such as the 3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl thioester (Fig. 5C, bottom). When additional carbene precursors were present, these initial steps were followed by additional outer-sphere reactions: alkene addition to the iron carbene and intramolecular $S_{H}2$ reaction, ultimately enabling a $[1+1+1]$ multicomponent assembly of cyclopropanols from three simple one-carbon building blocks using the iron catalyst. The distinctive selectivity of silyl enol ether formation could also be leveraged in multiple downstream sequences where traditional base-mediated enolizations would fail to deliver the desired products with comparable control. More broadly, this work demonstrated that base metal catalysts could mediate multicomponent reactions through a combination of inner- and outer-sphere pathways with selectivity and functional group tolerance not easily achieved by existing methods. The ability to access diverse scaffolds from modular one-carbon building blocks under mild, catalytic conditions points toward further opportunities in the design of multi-component reactions.

REFERENCES AND NOTES

1. O. G. Kulinkovich, Chem. Rev. 103, 2597–2632 (2003).

2. T. R. McDonald, L. R. Mills, M. S. West, S. A. L. Rousseaux, Chem. Rev. 121, 3–79 (2021).

3. M. Laktsevich-Iskryk, A. Hurski, M. Ošeka, D. Kananovich, Org. Biomol. Chem. 23, 992–1015 (2025).

4. L. R. Mills, J. J. Monteith, G. Dos Passos Gomes, A. Aspuru-Guzik, S. A. L. Rousseaux, J. Am. Chem. Soc. 142, 13246–13254 (2020).

5. J. J. Monteith, J. W. Pearson, S. A. L. Rousseaux, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202402912 (2024).

6. H. Hashizume et al., J. Antibiot. (Tokyo) 71, 129–134 (2018).

7. S. Harper et al., ACS Med. Chem. Lett. 3, 332–336 (2012).

8. D. Römer et al., Life Sci. 27, 971–978 (1980).

9. Q. Liu, B. You, G. Xie, X. Wang, Org. Biomol. Chem. 18, 191–204 (2020).

10. J. K. Cha, O. G. Kulinkovich, in Organic Reactions, vol. 77 (Wiley, 2012), pp. 1–160.

11. J. Ni, X. Xia, W.-F. Zheng, Z. Wang, J. Am. Chem. Soc. 144, 7889–7900 (2022).

12. J. M. Conia, in Organic Synthesis, A. Bruylants, L. Ghosez, H. G. Viehe, Eds. (Butterworth-Heinemann, 1975), pp. 317–326.

13. J. H. G. Teye-Kau, M. Pauze, S. P. Pitre, JACS Au 6, 3356–3362 (2026).

14. P. L. Hall, J. H. Gilchrist, D. B. Collum, J. Am. Chem. Soc. 113, 9571–9574 (1991).

15. P. Cazeau, F. Duboudin, F. Moulines, O. Babot, J. Dunogues, Tetrahedron 43, 2075–2088 (1987).

16. K. N. M. Nguyen et al., Science 389, 183–189 (2025).

17. L. Kong, K. Zong, J. Guo, R. Shenvi, Nat. Chem. 18, 741–748 (2026).

18. L. K. Baumann, H. M. Mbuvi, G. Du, L. K. Woo, Organometallics 26, 3995–4002 (2007).

19. B. T. Boyle, N. W. Dow, C. B. Kelly, M. C. Bryan, D. W. C. MacMillan, Nature 631, 789–795 (2024).

20. D. T. Ngo, J. J. A. Garwood, D. A. Nagib, J. Am. Chem. Soc. 146, 24009–24015 (2024).

21. R.-B. Liang, C. Yang, W. Xia, L. Guo, J. Am. Chem. Soc. 147, 36781–36792 (2025).

22. E. Ertürk, M. Ulutürk, ACS Catal. 15, 20149–20156 (2025).

23. X. Lin, H. Shen, Z. Wang, ACS Catal. 15, 19030–19039 (2025).

24. Y.-T. Zheng et al., J. Am. Chem. Soc. 147, 43254–43260 (2025).

25. P. S. Pedersen et al., J. Am. Chem. Soc. 148, 18703–18714 (2026).

26. V. F. Batista, D. C. G. A. Pinto, A. M. S. Silva, ACS Catal. 10, 10096–10116 (2020).

27. W.-C. C. Lee, X. P. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202320243 (2024).

28. G. Cheng, G. A. Mirafzal, L. K. Woo, Organometallics 22, 1468–1474 (2003).

29. I. Aviv, Z. Gross, Chemistry 14, 3995–4005 (2008).

30. C.-R. Liu et al., Chem. Commun. 47, 1342–1344 (2011).

31. G. Xu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 58, 1980–1984 (2019).

32. L. Kong, X.-C. Gan, V. A. van der Puyl Lovett, R. A. Shenvi, J. Am. Chem. Soc. 146, 2351–2357 (2024).

33. L. Zhang, B. M. DeMuynck, A. N. Paneque, J. E. Rutherford, D. A. Nagib, Science 377, 649–654 (2022).

34. Z. M. Su, R. Deng, S. S. Stahl, Nat. Chem. 16, 2036–2043 (2024).

35. M. Liu, N. Le, C. Uyeda, Angew. Chem. Int. Ed. 62, e202308913 (2023).

36. I. K. Rana, K. N. M. Nguyen, D. T. Ngo, D. A. Nagib, Org. Lett. 28, 1750–1754 (2026).

37. Y.-Y. Zhou, C. Uyeda, Angew. Chem. Int. Ed. 55, 3171–3175 (2016).

38. C. M. Farley, Y.-Y. Zhou, N. Banka, C. Uyeda, J. Am. Chem. Soc. 140, 12710–12714 (2018).

39. Y.-H. Tee, L. Bachas, D. Bhattacharyya, J. Phys. Chem. C Nanomater. Interfaces 113, 9454–9464 (2009).

40. M. Onaka, Y. Matsuoka, T. Mukaiyama, Chem. Lett. 10, 531–534 (1981).

41. Z. Huang, M. E. Akana, K. M. Sanders, D. J. Weix, Science 385, 1331–1337 (2024).

42. K. Tsukiji, A. Matsumoto, K. Kanemoto, N. Yoshikai, Angew. Chem. Int. Ed. 63, e202412456 (2024).

43. Y.-G. Wang, M. Wachi, Y. Kobayashi, Synlett 2006, 481–483 (2006).

44. J. R. Donald, W. P. Unsworth, Chemistry 23, 8780–8799 (2017).

45. C. E. Castro, G. M. Hathaway, R. Havlin, J. Am. Chem. Soc. 99, 8032–8039 (1977).

46. K. M. Kadish, L. A. Bottomley, Inorg. Chem. 19, 832–836 (1980).

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Q. N. Wong, J. Lee, and the Scripps Automated Synthesis Facility (ASF) for analysis and glovebox provision; L. Pasternack and G. J. Kroon for assistance with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy; M. Gembicky, S. Yang, and the entire UCSD Crystallography Facility for x-ray crystallographic analysis; the Baran and Yu labs for provision of gas chromatography–flame ionization detector and gas chromatography–mass spectrometry; and J. Luo for assistance in substrate preparation and HTE screening. Funding: National Institutes of Health (GM122606); National Science Foundation (CHE 2400341); Postdoctoral Exchange Fellowship Program by the Office of China Postdoctoral Council (L.K.). Author contributions: Conceptualization: L.K., K.Z., R.S.; Methodology: L.K., K.Z., B.J.O.; Investigation: L.K., K.Z., M.H.; Visualization: L.K., K.Z., B.J.O.; Funding acquisition: R.S.; Project administration: R.S.; Supervision: R.S.; Writing – original draft: L.K., K.Z.; Writing – review & editing: L.K., K.Z., B.J.O., M.H., R.S. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials availability: X-ray crystallography data for compound 24 are available free of charge from the Cambridge Crystallographic Data Centre under CCDC 2531661. All other data are available in the supplementary materials, including experimental procedures to prepare and characterize all reported compounds and copies of NMR spectra. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aej0194 Materials and Methods; Figs. S1 to S46; Tables S1 to S3; NMR Spectra; References (47–67) Submitted 19 May 2026; accepted 7 July 2026

10.1126/science.aej0194

DEVICE TECHNOLOGY

Tunnel field-effect transistors exhibiting performance beyond the Boltzmann thermionic limit

Zehan Wu $^{1}$ , Ke Yang $^{1}$ , Wanqing Meng $^{2}$ , Weizhen Wang $^{1}$ , Yifei Zhao $^{1}$ , Fumei Yang $^{1}$ , Ran Ding $^{1}$ , Hui Li $^{3}$ , Yudong Peng $^{1}$ , Zongmeng Yang $^{4,5}$ , Yee Sin Ang $^{5}$ , Songhua Cai $^{1}$ , Ming Yang $^{1}$ , Jiannong Wang $^{3}$ , Lain-Jong Li $^{2}$ , Jianhua Hao $^{1}$

The International Roadmap for Devices and Systems (IRDS) has identified the tunnel field-effect transistor (TFET) as the most promising next-generation logic device that enables sustainable downscaling in driving voltage and power consumption. Demonstrating an acceptable sub-Boltzmann-limit ON current (namely $I_{60}$ , the current level when a TFET switches to a subthreshold swing level of 60 millivolts per decade) and current-switching ratio has presented a formidable challenge. We report a TFET based on a bismuth/indium selenide (Bi/InSe) heterostructure that exhibits an $I_{60}$ of up to \~10 microamperes per micrometer and a current-switching ratio of $>10^{7}$ . We attribute such promising TFETs to precise material design, clean interfaces fabricated under vacuum, and band engineering based on subthreshold swing physics. Our results demonstrate a high-performance basic building block that meets the IRDS requirements for next-generation integrated circuits.

The performance advancement of complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) transistors has been driven in part by the continuous lowering of driving voltage and power consumption. The Boltzmann barrier in a CMOS channel dictates a minimum gate voltage of 60 mV to change the output current by an order of magnitude [that is, a minimum subthreshold swing (SS) of 60 mV decade $^{-1}$ at room temperature], which fundamentally hampers further downscaling of voltages and power consumption for efficient current control in future transistors (1, 2). To surmount this obstacle, various “beyond CMOS” architectures have been proposed. Among these, tunnel field-effect transistors (TFETs) have been highlighted by the latest International Roadmap for Devices and Systems (IRDS) as the most promising alternative to CMOS transistors in logic circuits with suppressed leakage current and reduced power consumption (3–5).

Despite years of development, TFETs have yet to gain widespread adoption in mainstream electronics because their device performance is still inferior to that of metal oxide semiconductor field-effect transistors (MOSFETs) (6–10). Specifically, the most studied TFETs based on three-dimensional (3D) junctions (for example, Si homojunctions or InAs-related heterojunctions) failed to show acceptable current-switching capability (10–14), whereas those based on emerging 2D materials (such as Si/InSe mixed-dimensional heterojunctions, $SnSe_{2}/WSe_{2}$ all-2D heterojunctions, or other all-2D homojunctions) were unable to provide satisfactory output current (15–19).

To overcome these challenges, researchers have identified two key directions to drive enhancements in TFET performance: (i) designing materials and implementing band engineering based on SS physics to increase the carrier-tunneling probability (20–23) and (ii) developing reliable fabrication processes to obtain high-quality tunnel junctions (4, 20, 24). Three critical metrics need to be achieved simultaneously for a high-performance TFET. First, the transistor must demonstrate an adequate $I_{60}$ , which is defined as the characteristic current level when a TFET switches to the actual SS level of 60 mV decade $^{-1}$ (5–8). Specifically, achieving an $I_{60}$ of $>1 \mu A \mu m^{-1}$ is a minimum line for TFETs to be compatible with current CMOS integrated circuits, but achieving this $I_{60}$ has remained a major challenge in reported studies. Second, the operating transistor needs to maintain an average SS value well below the Boltzmann limit against switching current variations of at least four orders of magnitude (SS ${\sim4dec}$ ≪ 60 mV decade $^{-1}$ ) (4, 7) for driving voltage to be downscaled without excessive leakage current. Third, the low-power devices and systems, currently the target application areas of TFETs, require a current-switching ratio of $>10^{6}$ (3, 4, 10), which also creates higher requirements for the $I{60}$ characteristic of TFETs. Nevertheless, any effort to improve the characteristics of $I_{60}$ should not come at the expense of SS $_{\sim4dec}$ and the current-switching ratio.

We demonstrate a promising TFET based on a 2D p-n heterojunction consisting of p-type 2D bismuth (Bi) and n-type 2D indium selenide (InSe) that has a clean interface, ascendant electrostatic control, considerable carrier-tunneling probability, a steep average SS with an attractive current-switching ratio, and a high $I_{60}$ . We show that 2D Bi can be an ideal 2D material for constructing the source end for the TFET architecture because of its ultranarrow bandgap ( $E_g$ ) of $\sim 0.2$ eV and ultrasmall effective carrier mass ( $m^*$ ) of $\sim 0.04m_0$ for electrons (Fig. 1A) (25). We selected 2D InSe as the channel material because of its favorable bandgap to suppress OFF-current levels and strong electrostatic integrity for efficient energy-band engineering (26, 27). In addition, we developed a continuous high-vacuum in situ deposition process to fabricate centimeter-scale Bi/InSe heterostructures from the bottom up, which provides clean interfaces free of interfacial layers. As a result, the Bi/InSe TFETs achieved an $I_{60}$ of up to $\sim 10$ $\mu$ A $\mu$ m $^{-1}$ (a factor of 10 greater than the minimum needed) as well as a promising current-switching ratio of around $10^7$ , setting the crucial stage for the continuous down-scaling progress of transistors in the future information industry.

Material and band design of the Bi/InSe tunnel junction

In-depth theoretical investigations have been performed on the SS physics of TFETs (see supplementary text, note S1) for the material and band design of emerging tunnel junctions (4, 22). As noted above, Bi has a small $m^{}$ (Fig. 1A), and the low effective carrier tunneling mass ( $m_{T}^{}$ ) of $0.04m_{0}$ obtained for a Bi/InSe tunnel junction is sufficient to achieve a high tunnel current (fig. S1 and supplementary text, note S2). The 2D nature of layered Bi allows design flexibility for the van der Waals (vdW) heterogeneous tunnel junctions to achieve competitive current switching (18, 28, 29).

We performed transfer characteristic simulations on the proposed Bi/InSe tunnel junction, compared against three other architectures previously reported (Fig. 1B and fig. S2). Specifically, an InAs/GaSb tunnel junction had a small $m_T^$ of $0.05m_0$ that led to an acceptable ON current but failed to provide a competitive OFF current ( $I_{\text{OFF}}$ ) and current-switching ability. These obstacles can be optimized by applying 2D material-based tunnel junctions because they exhibit a higher degree of freedom in the design of materials and bands (30). Unfortunately, current findings are limited by excessive $m_T^$ (for example, $0.18m_0$ for Si/InSe and $0.15m_0$ for bulk-to-monolayer black phosphorus). By contrast, Bi/InSe TFETs can provide a high $I_{60}$ accompanied by an attractive current-switching ratio.

Density functional theory (DFT) calculations, nonequilibrium Green's function (NEGF) simulations, and photoemission investigations were photoelectron spectroscopy (XPS) and ultraviolet photoelectron spectroscopy (UPS) investigations (figs. S5 and S6 and supplementary text, note S4). The gate voltage applied to the InSe side can modulate the switching of the window, which we verified by scanning kelvin probe microscopy (SKPM) measurements (fig. S7), thereby providing the basis for an efficient TFET.

E

C

D

Fig. 1. Materials and band design for the Bi/InSe tunnel junction. (A) Effective carrier mass and energy bandgap of various constituent materials that were used in reported TFET architectures. The red stars represent Bi and InSe used in this study (23–25). BP, black phosphorus; BP-ML, BP-monolayer. (B) Simulation results of physics-model-derived tunneling currents plotted against modulating gate voltage, crossing the Bi/InSe and three reported state-of-the-art tunnel junctions (InAs/GaSb, monolayer-to-bulk BP, and Si/InSe). (C) Band structure of free-standing Bi and InSe and the projected band structure of the Bi/InSe heterostructure. The emerald and magenta components represent the InSe and Bi layers, respectively. The insets present the calculated band edge alignment of the Bi and InSe components before and after contact, respectively. (D and E) Charge density difference in Bi/InSe heterostructures, indicating the charge transfer behavior at the interface (D), resulting in band bending and tunnel-window opening for carriers (E). a.u., arbitrary units; $E_{F}$ , Fermi level. In (D), the yellow and azure patterns in the heterostructure interface represent the electron accumulation and dissipation, respectively. The red curve demonstrates the planar-averaged charge density difference along the z direction.

The fabrication process can greatly affect the performance of TFETs. Most previous efforts for constructing 2D heterostructures were restricted to transfer approaches that often suffered from interfacial issues, such as extra oxide layers, which can degrade the tunneling current (15, 16). Additionally, these preparation methods were difficult to control for mass production. In this study, we propose a sequential pulsed laser deposition (PLD) process for the bottom-up fabrication of continuous and ultrathin InSe and Bi films layer by layer, with clean interfaces, on centimeter-scale silicon wafers (Fig. 2A; see details in materials and methods). Specifically, the considerable difference between growth temperatures of InSe and Bi ensures the high-quality growth of each material, and the ultrahigh-vacuum deposition environment generally produces clean interfaces (33). We verified the longitudinal interlaminar structure using cross-sectional transmission electron microscopy (CS-TEM) (Fig. 2B and fig. S8) as well as the longitudinal element distribution characteristics through an energy-dispersive spectrometer (fig. S9).

Construction of the Bi/InSe tunnel junction

conducted to determine the detailed band characteristics of the 2D Bi/InSe heterojunction. The projected band structures obtained from the DFT study (Fig. 1C) elucidated the electronic features of the freestanding lattice of both Bi and InSe as well as the heterojunction constructed after contact. Although bulk Bi is conventionally considered to be a semimetal, the layered structure of 2D Bi leads to bandgap opening in an ultrathin layer and creates a narrow bandgap p-type semiconductor (fig. S3), which was confirmed by Hall-effect transport measurements (fig. S4 and table S1) (31, 32).

Direct evidence on a macroscopic scale of the growth was obtained from $\theta$ -2 $\theta$ x-ray diffraction (XRD), where $\theta$ is the Bragg angle. We could assign all patterns to either InSe or Bi, which both grew along the c axis with highly preferred orientations, and no substantial impurities were found, such as bismuth oxide or selenide (Fig. 2C) (26, 34). Furthermore, the sharp

Band alignment in the heterojunction can lead to effective band-to-band carrier tunneling and allow carriers to directly inject from the Bi valence band to the InSe conduction band, driven by applied bias and controlled by gate voltage (Fig. 1, D and E; fig. S3; and supplementary text, note S3). We obtained consistent results from x-ray separated peaks positioned at $\sim21.32^{\circ}$ and $\sim22.36^{\circ}$ , corresponding to the InSe-(006) and Bi-(003) planes, respectively, indicate the vdW-like stacking nature between the top Bi layer and bottom InSe layer.

The ultrathin nature of the as-grown sample enabled XPS measurements to verify the bismuth element singularity and interfacial purity. The XPS spectra (Fig. 2D) of Bi 4f contained two evident peaks at $\sim$ 156.28 and $\sim$ 161.48 eV, corresponding to the binding states of elemental bismuth (Bi $^{0}$ ) 4f ${7/2}$ and 4f ${5/2}$ , respectively (34). Sharp peaks with low full width at half maximum (FWHM) values and a recognizable spin-orbit split separation of $\sim$ 5.2 eV indicate that binding states of Bi compounds, such as oxides or selenides, were not present (34) and a clean interface had formed. Moreover, the controllable PLD process should allow the preparation of centimeter-scale samples (33). Additional characterizations, including XPS depth profiling, electron the channel material, Bi is the source-end material of the tunnel diode, and heavily doped Si acts as the gate to modulate the channel through the $\sim$ 100-nm $SiO_{2}$ dielectric (Fig. 3A, inset). Driven by a drain voltage ( $V_{DS}$ ) of +0.6 V, the Bi/InSe TFETs demonstrated efficient current switching spanning more than seven orders of magnitude in a gate voltage ( $V_{g}$ ) range of only 160 mV (Fig. 3B). For comparison, $V_{g}$ is $\sim$ 800 mV for advanced MOSFETs (4, 35).

B

Fig. 2. Bottom-up growth and material characterizations of the Bi/InSe heterostructure. (A) Schematic of the bottom-up fabrication process of InSe layers on a $\mathrm{SiO}_2 / \mathrm{Si}$ substrate and Bi layers on the InSe platform through a sequential in situ PLD approach. The growth chamber was kept in a high-vacuum state throughout the process, largely avoiding the generation of undesired contamination. RT, room temperature. (B and C) CS-TEM image (B) and XRD patterns (C) of the as-grown Bi/InSe sample, demonstrating the 2D heterostructure nature from a local perspective and at the general level, respectively. The interlayer vacuum layer of the 2D structure and the interlayer spacing can be seen in the inset of (B). Three typical layer-to-layer thicknesses are extracted, which are similar to the reported values. (D) XPS spectrum of an $\sim 10$ -layer Bi film on top of a previously grown InSe substrate. Both peaks had a low FWHM value of $\sim 0.8$ eV.

Millimeter-scale TFET arrays on the centimeter-scale silicon-substrate platform exhibited reliable sub-Boltzmann-limit performance. As shown in Fig. 3C, Bi/InSe TFETs maintain SS values well below $60\mathrm{mV}$ decade $^{-1}$ over six decades of current-switching scale. Thus, the transistors continuously operated under a dominant mechanism of carrier cold-charge injection over a considerable current-switching range (4, 6). When the SS approached the Boltzmann limit $(60\mathrm{mV}$ decade $^{-1}$ —that is, just before the thermionic emission-dominated carrier injection—the output current reached a desirable level of several microamperes per micrometer (normalized by the perimeter of the tunneling region), successfully meeting the IRDS requirements (3). We argue that the clean heterostructure interface obtained from the controlled and uninterrupted PLD process without breaking vacuum as well as the design of the Bi/ InSe heterojunction system were critical for achieving sub-Boltzmann-limit electrical performance. By contrast, the electrical characteristics of MOSFETs based on an InSe channel (without a Bi layer) are demonstrated in Fig. 3, B and C.

We performed electrical characterization on the transistors at varying temperatures (Fig. 3D) to study the influence of thermodynamic conditions on the device performance and to further understand the role of the band-to-band tunneling (BTBT) mechanism in the integrated carrier injection process. As the device working temperature decreased, slight variations occurred in the transfer characteristic curve of the transistor (Fig. 3E), which suggests the presence of thermodynamic barriers in the working device (16, 19, 24). The contact barrier between the semiconduc-

backscatter diffraction (EBSD) mapping, Raman identification, XRD $2\theta-\omega$ and in-plane $\varphi$ scans, atomic force microscopy (AFM) studies, and plane-view TEM, were performed to further confirm the quality and uniformity of the PLD-grown Bi/InSe samples at large scale (figs. S10 to S13 and table S2).

Sub-Boltzmann-limit electrical performance

Our bottom-up vapor deposition process fabricated a Bi/InSe heterostructure in a large-scale, ultrathin, and stable state on a universal silicon-based platform (see more details in the materials and methods and fig. S14). In the proposed TFET constructed on a silicon wafer, InSe is tor and electrode could increase with lowered temperature, which would suppress the current level of the device to some extent. However, the influence of this factor on the performance of our TFETs was limited. The lowered temperature also led to lower gate switching voltages and SS values for our devices because the conduction band minimum of InSe shifted toward a position relatively closer to the aligned Fermi level, allowing the tunnel junction to be turned off more easily. Although our TFETs performed better at low temperatures, they demonstrated high performance at room temperature.

The hysteresis response of transistors, as determined from the dual-sweep transfer characteristic curves (fig. S15), showed a small

F

|

Fig. 3. Sub-Boltzmann-limit electrical performance in Bi/InSe TFETs. (A) Source-drain current and voltage $(|I_{\mathrm{DS}}| - V_{\mathrm{DS}})$ output characteristic of a Bi/InSe TFET. The observation of the NDR region confirmed the BTBT mechanism in the transistor. (Inset) Schematic of a single TFET architecture based on a Bi/InSe heterojunction fabricated on a silicon wafer (with a $100\mathrm{-nm}$ oxide layer). (B and C) Logarithmic-scale transfer characteristics $(I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{g}})$ (B) and SS variation trend during transistor switching $(\mathrm{SS - I_{DS}})$ (C) of Bi/ InSe TFETs and InSe MOSFETs constructed on the same InSe platform. (D) Temperature-dependent $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{g}}$ showing the current-switching regions, where the TFET is efficiently switching on or off. (E) SS- $I_{\mathrm{DS}}$ of TFETs at various temperatures. The extracted SS- $\sim 4\mathrm{dec}$ characteristics are shown in the inset of (E). (F) $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{g}}$ of Bi/InSe TFETs with various channel lengths. (G) SS- $I_{\mathrm{DS}}$ of TFETs with various channel lengths. The extracted SS- $\sim 4\mathrm{dec}$ and $I_{60}$ characteristics are shown in the inset of (G). (H and I) $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{g}}$ (H) and SS- $I_{\mathrm{DS}}$ (I) of several $100\mathrm{-nm}$ -channel TFETs, exhibiting the most appreciated electrical performance.

hysteresis window ( $\Delta V_{g}$ ) of $\sim20$ mV at room temperature. The window increased slightly with lower temperature down to 60 K. Such hysteresis mostly originated from the oxide traps at the dielectric-to-channel interface (19, 36). Additionally, the hysteresis window remained approximately the same under different biases. Overall, the dominant BTBT carrier transport mechanism in our devices was confirmed by the maintenance of SS levels well below the Boltzmann limit spanning a large region of switching current in both forward and reverse transfer characteristic curves. Moreover, the negative differential resistance (NDR) was observed in the source-to-drain current-voltage curve (Fig. 3A) (14, 37). In addition, we investigated the effects of dimensional scaling on the performance of the devices (Fig. 3, F and G, and fig. S16). The transfer characteristics of transistors with shorter channels showed slight shifts to lower gate switching voltages together with more preferable SS characteristics and $I_{60}$ levels. We attributed these phenomena to the steeper band-bending slope of InSe in shorter channels, which increased the tunneling probability (23, 38).

Although further aggressive scaling of device dimensions may encounter negative impacts on TFETs from short-channel effects, our architecture could enable more flexible optimization processes (38, 39), such as developing top-gate structures on the channel to suppress the drain-induced barrier lowering effect or using high dielectric materials to enhance the gate electrostatic control capability. Regarding the latter, we conducted an integrated transfer process to reconstruct TFETs on an $\mathrm{HfO}2$ dielectric platform and observed similar transfer characteristics with a reduced gate switching voltage (fig. S17A). This result demonstrated that our device has the potential to further reduce the gate control voltage. By contrast, transistors formed by the heterojunctions based on nonlayered 3D Bi and 2D InSe did not exhibit tunneling characteristics and showed transfer characteristics similar to those of an InSe MOSFET (fig. S17, B to D). Notably, we fabricated multiple TFETs with $\sim 100$ -nm channels and obtained desirably high $I{60}$ up to $\sim 10~\mu \mathrm{A}~\mu \mathrm{m}^{-1}$ (Fig. 3, H and I). In general, the performance of our TFET architecture can achieve effective functional downscaling while achieving continuous dimensional downscaling.

A

C

Fig. 4. Benchmarking of the sub–Boltzmann-limit performance of Bi/InSe TFETs against previously reported architectures. We benchmarked our results against previously reported studies (12–16, 19, 23, 40–48). (A) Comparison of the SS characteristics of InSe/Bi TFETs in this work and several other representative TFETs in previous studies. (B and C) $I_{60}$ versus $I_{60}/I_{OFF}$ (B) as well as $I_{60}$ versus the channel thickness (C), comparing the performance of our Bi/InSe TFETs against other typical TFET families, showing a record-high value of both $I_{60}$ and $I_{60}/I_{OFF}$ in this work. Preferred corners for optimum performance are indicated in red in these two panels. (D) Comparison of two critical metrics in TFET performance—SS\~4dec and $I_{60}$ —based on various junction materials and systems. The Bi/InSe TFET reported in this study meets the IRDS requirements for the sub–Boltzmann-limit performance of practical transistors.

Sub-Boltzmann-limit performance benchmarking on TFETs

To be competitive with MOSFETs, future transistors must exhibit more attractive sub-Boltzmann-limit characteristics; key parameters include $I_{60}$ , $I_{60}/I_{\mathrm{OFF}}$ , and SS\~4dec. We compared our Bi/InSe TFET with other representative devices, as illustrated in Fig. 4 and table S3. The SS versus $I_{\mathrm{DS}}$ characteristic curves extracted from each device are illustrated in Fig. 4A, and the key parameters mentioned above are further extracted and compared in Fig. 4, B to D (12-16, 19, 23, 40-48). In general, TFETs can work reliably at low voltages and exhibit small SS values well below the Boltzmann limit. Nevertheless, TFETs are required to further demonstrate sufficiently high output-current levels in the sub-Boltzmann-limit region—that is, an $I_{60}$ of at least a few microamperes per micrometer, which is needed to ensure low delay and high fan-out performance. Moreover, a common and longstanding challenge for any logic device is to achieve a combination of high output currents and high current-switching ratio. This requirement is reflected in the TFETs by achieving an $I_{60}/I_{\mathrm{OFF}}$ value of $>10^{6}$ or an SS\~4dec well below 60 mV decade $^{-1}$ .

To the best of our knowledge, all previously reported TFETs have not yet been able to fully meet the requirements of IRDS. The conventional all-3D TFETs have achieved a nearly acceptable $I_{60}$ with device dimensions of tens of nanometers. However, the drain material design is limited by the stringent requirements for 3D epitaxy, which prevents the device from achieving the high switching ratio that is important for low-power transistors. Although 3D-2D mixed-dimensional heterojunctions offer a potential new platform, it has been difficult to find source materials for achieving performance breakthroughs. Notably, although dimension scaling may further enhance device performance, the efficient tunnel junction based on 2D Bi proposed in this work provides a promising solution from the fundamental perspective of device physics for high-performance TFETs. It simultaneously satisfies the key factors, including a source material with a narrowed bandgap and small $m^{*}$ , a channel material with ascendant electrostatic controllability, and a clean junction interface that results from the 2D nature of the structure and successful in situ fabrication techniques. Our PLD-grown Bi/InSe-based TFETs also exhibit considerable current-switching capability for low-power information applications in the future (fig. S18).

Conclusions

We have demonstrated promising TFETs based on a Bi/InSe heterojunction, exhibiting attractive sub-Boltzmann-limit electrical performance. This includes a boosted $I_{60}$ up to 10 $\mu$ A $\mu$ m $^{-1}$ , a considerable $I_{60}/I_{\text{OFF}}$ ratio of around 10 $^{7}$ , and a desirable small SS maintained over six decades of switching current. We implemented materials and band design based on SS physics and identified 2D Bi as the most promising source-end material and the Bi/InSe heterostructure as the preferred tunnel junction for constructing high-performance TFETs. In addition, we developed an in situ bottom-up deposition approach with high controllability and reliability for the systematic preparation of scalable InSe and Bi layers on conventional $SiO_{2}/Si$ substrates. This process forms 2D heterostructures with generally clean interfaces, facilitating ideal BTBT performance. Our Bi/InSe TFETs, with channel lengths down to 60 nm, are notably ahead of the competition with other existing TFET architectures and are able to meet the IRDS requirements for practical applications. It is worth noting that PLD, as a controllable large-scale fabrication approach with high yield, is highly expected to lead the development of integrating 2D-material transistors into conventional silicon-based circuits.

REFERENCES AND NOTES

1. S. Datta, W. Chakraborty, M. Radosavljevic, Science 378, 733–740 (2022).

2. W. Cao et al., Nature 620, 501–515 (2023).

3. IEEE, IRDS: International Roadmap for Devices and Systems, 2023 Update (2023); https://irds.ieee.org/irds2023/.

4. A. M. Ionescu, H. Riel, Nature 479, 329–337 (2011).

5. H. Lu, A. Seabaugh, IEEE J. Electron Devices Soc. 2, 44–49 (2014).

6. X. Li et al., in Beyond-CMOS Technologies for Next Generation Computer Design, R. O. Topaloglu, H.-S. P. Wong, Eds. (Springer, 2019), pp. 195–230.

7. D. E. Nikonov, I. A. Young, Proc. IEEE 101, 2498–2533 (2013).

8. A. Seabaugh et al., "Steep slope transistors: Tunnel FETs and beyond" in 2016 46th European Solid-State Device Research Conference (ESSDERC) (IEEE, 2016), pp. 349–351.

9. W. G. Vandenberghe et al., Appl. Phys. Lett. 102, 013510 (2013).

10. M. Saravanan, E. Parthasarathy, Microelectronics J. 114, 105102 (2021).

11. K. Tomioka, M. Yoshimura, T. Fukui, Steep-slope tunnel field-effect transistors using III–V nanowire/Si heterojunction in 2012 Symposium on VLSI Technology (VLSIT) (IEEE, 2012), pp. 47–48.

12. R. Gandhi, Z. Chen, N. Singh, K. Banerjee, S. Lee, IEEE Electron Device Lett. 32, 437–439 (2011).

13. C. Convertino et al., Nat. Electron. 4, 162–170 (2021).

14. Y. Shao et al., Nat. Electron. 8, 157–167 (2025).

15. D. Sarkar et al., Nature 526, 91–95 (2015).

16. J. Miao et al., Nat. Electron. 5, 744–751 (2022).

17. L. Britnell et al., Science 335, 947–950 (2012).

18. W. Cao et al., "Designing band-to-band tunneling field-effect transistors with 2D semiconductors for next-generation low-power VLSI" in 2015 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM) (IEEE, 2015), pp. 12.3.1–12.3.4.

19. S. Kim et al., Nat. Nanotechnol. 15, 203–206 (2020).

20. K. R. N. Karthik, C. K. Pandey, Silicon 15, 1–23 (2022).

21. A. S. Verhulst, W. G. Vandenberghe, K. Maex, G. Groeseneken, J. Appl. Phys. 104, 064514 (2008).

22. W. Cao, D. Sarkar, Y. Khatami, J. Kang, K. Banerjee, AIP Adv. 4, 067141 (2014).

23. S. Kanungo, G. Ahmad, P. Sahatiya, A. Mukhopadhyay, S. Chattopadhyay, npj 2D Mater. Appl. 6, 83 (2022).

24. G. Fiori et al., Nat. Nanotechnol. 9, 768–779 (2014).

25. A. Szabo et al., IEEE Trans. Electron Dev. 65, 4180–4187 (2018).

26. Z. Yang et al., ACS Nano 11, 4225–4236 (2017).

27. J. Jiang, L. Xu, C. Qiu, L. M. Peng, Nature 616, 470–475 (2023).

28. G. Iannaccone, F. Bonaccorso, L. Colombo, G. Fiori, Nat. Nanotechnol. 13, 183–191 (2018).

29. Z. Wu et al., Nat. Mater. 20, 1203–1209 (2021).

30. A. D. Franklin, Science 349, aab2750 (2015).

31. S. Zhang et al., Chem. Soc. Rev. 47, 982–1021 (2018).

32. C. A. Hoffman et al., Phys. Rev. B 48, 11431–11434 (1993).

33. Y. Liu, Y. Huang, X. Duan, Nature 567, 323–333 (2019).

34. Z. Yang, Z. Wu, Y. Lyu, J. Hao, InfoMat 1, 98–107 (2019).

35. S. Natarajan et al., "A 14nm logic technology featuring $2^{\text{nd}}$ -generation FinFET, air-gapped interconnects, self-aligned double patterning and a $0.0588 \mu \mathrm{m}^2$ SRAM cell size" in 2014 IEEE International Electron Devices Meeting (IEEE, 2014), pp. 3.7.1-3.7.3.

36. F. S. Neves et al., ECS Trans. 66, 179 (2015).

37. Q. Lv et al., Adv. Funct. Mater. 30, 1910713 (2020).

38. L. Liu, D. Mohata, S. Datta, IEEE Trans. Electron Dev. 59, 902–908 (2012).

39. N. D. Chien, C.-H. Shih, Microelectron. Reliab. 55, 31–37 (2015).

40. S. Kamaei et al., Nat. Electron. 6, 658–668 (2023).

41. T. Krishnamohan, D. Kim, S. Raghunathan, K. Saraswat, "Double-Gate Strained-Ge Heterostructure Tunneling FET (TFET) With record high drive currents and $<<60\mathrm{mV/dec}$ subthreshold slope" in 2008 IEEE International Electron Devices Meeting (IEEE, 2008), pp. 1-3.

42. N. Oliva et al., npj 2D Mater. Appl. 4, 5 (2020).

43. S. Kamaei et al., npj 2D Mater. Appl. 5, 76 (2021).

44. N. T. Duong et al., Nano Today 40, 101263 (2021).

45. A. Villalon et al., "Strained tunnel FETs with record ION: First demonstration of ETSOI TFETs with SiGe channel and RSD" in 2012 Symposium on VLSI Technology (VLSIT) (IEEE, 2012), pp. 49–50.

46. X. Zhao, A. Vardi, J. A. del Alamo, IEEE Electron Device Lett. 38, 855–858 (2017).

47. G. Dewey et al., "Fabrication, characterization, and physics of III–V heterojunction tunneling Field Effect Transistors (H-TFET) for steep sub-threshold swing" in 2011 International Electron Devices Meeting (IEEE, 2011), pp. 33.6.1–33.6.4.

48. K. Jeon et al., "Si tunnel transistors with a novel silicided source and 46mV/dec swing" in 2010 Symposium on VLSI Technology (IEEE, 2010), pp. 121–122.

49. Z. Wu, Tunnel field-effect transistors exhibiting performance beyond the Boltzmann thermionic limit, version V1, PolyU Research Data Repository (2026).

ACKNOWLEDGMENTS

Funding: This work was supported by the Research Grants Council of Hong Kong (GRF nos. 15304224 and 15307124, PolyU SRFS2122-5S02, and AoE/P-701/20), the PolyU Project (RCNN 1-CEOH), the MOST National Key R&D Program (grant no. 2022YFA1203804), the Ministry of Education Singapore (grant no. A-8004854-00-00), and a National Research Foundation Singapore (NRF) Professorship (NRF-P2025-002). Author contributions: Z.W., L.-J.L., and J.H. conceived the research and supervised the project. Z.W. and Y.Z. developed synthesis techniques and fabricated samples. K.Y. and M.Y. performed DFT calculations, and Z.Y. and Y.S.A. carried out NEGF simulations. W.W. and S.C. conducted TEM and EDS experiments. Z.W., W.M., and Y.P. fabricated TFET devices and investigated the electrical properties. Z.W., F.Y., R.D., H.L., and J.W. performed other material characterizations, including XRD, XPS, UPS, scanning electron microscopy, EBSD, AFM, SKPM, Raman spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, and physical property measurement system measurements. Z.W., K.Y., W.M., Y.S.A., L.-J.L., and J.H. worked together on data analysis and discussion. Z.W., L.-J.L., and J.H. cowrote the paper, and all authors commented on it. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials availability: All data as well as all details of materials synthesis needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the supplementary materials (49). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.adx6059

References (50–69)

Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S18; Tables S1 to S3;

Submitted 20 March 2025; resubmitted 26 April 2026; accepted 8 July 2026

Thermal cycling-induced nitriding increases energy-storage density in titanate ferroelectric films

Jiaojiao Yi $^{1}$ , Kangyu Zhong $^{1,2}$ , Chen Shen $^{3}$ , Yining Zhai $^{1}$ , Lu Sun $^{1}$ , Hongbin Zhang $^{3}$ , Zizheng Song $^{4}$ , Zibin Chen $^{4}$ , Dragan Damjanovic $^{5}$ , Jing-Feng Li $^{6}$ , Shujun Zhang $^{7,8,}$ , Lisha Liu $^{2,}$

Enhancing dielectric energy-storage density ( $U_{e}$ ) requires maximizing the difference between maximum and remanent polarizations ( $\Delta P$ ). Improving $\Delta P$ remains fundamentally challenging, as existing strategies rarely achieve simultaneous high maximum polarization and low remanent polarization. We introduce a postsynthesis treatment method, cryogenic thermal cycling, in which liquid nitrogen infiltrates the film and then is rapidly cycled to 100°C. This process markedly increases $\Delta P$ to 105 microcoulombs per square centimeter in oxide ferroelectric titanate films through oxygen vacancy–mediated nitrogen hybridization. Using this approach, we increased $U_{e}$ to 261 joules per cubic centimeter with an efficiency approaching 80%. This approach is broadly applicable to diverse film materials with thicknesses spanning the nano- to microscale, offering a facile and cost-effective route to overcoming the critical bottleneck in $\Delta P$ and $U_{e}$ .

Electrostatic capacitors based on dielectric films have become essential components in modern high-power electronics, especially for miniaturized devices, owing to their rapid charge-discharge capabilities, ultrahigh power density, and excellent reliability. However, their energy-storage densities are typically much lower than those of electrochemical energy-storage technologies. Therefore, improvements are urgently needed to overcome the limitations hindering their practical applications. The recoverable energy-storage density, $U_{e}$ , and the energy-storage efficiency, $\eta$ , of dielectrics are normally described by $U_{e} = \int_{P_{r}}^{P_{m}} EdP$ and $\eta = \int_{P_{r}}^{P_{m}} EdP / \int_{0}^{P_{m}} EdP$ , where $P_{m}$ and $P_{r}$ represent the maximum and remanent polarizations, and E is the electric field applied to the dielectric material. At a given electric field, optimal $U_{e}$ and $\eta$ performance are achieved through an enhanced $P_{m}$ and suppressed $P_{r}$ , that is, through large, reversible polarization $\Delta P = P_{m} - P_{r}$ .

Highly polarizable dielectric films are promising candidates for dielectric energy storage because of their large $P_{m}$ and small $P_{r}$ . To date, enhancing $\Delta P$ of these films has relied predominantly on chemical engineering by forming solid solutions (1–6), elemental doping (7, 8), or increased systemic configurational entropy (9, 10). The current state-of-the-art $\Delta P$ achieved through such approaches reaches $\sim75\ \mu C\ cm^{-2}$ (Fig. 1A). These enhancements arise from increased chemical heterogeneity, which induces local polar anisotropy and typically results in suppressed hysteresis (low $P_{r}$ ) through domain size reduction to polar clusters comprising only a few unit cells.

In most cases, the improvements of $\Delta P$ by chemical engineering are accompanied by weakened maximum polarization ( $P_{m}$ ), likely because of reduced domain size that decreases the polar proportion. Pan et. al. previously reported that the polar nanoregions occupied only 15% of the volume in a superparaelectric Sm-doped $BiFeO_{3}-BaTiO_{3}$ film (3), providing a representative model that explains the reduction in $P_{m}$ , and consequently $\Delta P$ , through chemical heterogeneity. The reduction in $P_{m}$ can also be related to the inverse relationship between the breakdown strength ( $E_{b}$ ) and polarizability [ $E_{b} = \varepsilon^{-0.65}$ , where $\varepsilon$ is the dielectric constant reflecting polarizability (11)]. Increased chemical heterogeneity enhances $E_{b}$ through intensified electron scattering but also lowers the polarizability, thereby reducing $P_{m}$ for the same applied electric field. Therefore, despite the advances made so far, the enhancement of $\Delta P$ by chemical heterogeneity seems to face unavoidable trade-offs (12) (Fig. 1A).

Recently, there have been elegant attempts to design high $\Delta P$ by structural engineering, for instance, construction of artificial $\mathrm{MoS}_2 / \mathrm{BaTiO}_3/$ $\mathrm{MoS}_2$ heterostructures (13), $\mathrm{BiFeO_3 / SrTiO_3}$ multilayers (14), (Ba, Sr) $\mathrm{TiO_3 / Ba(Zr,Ti)O_3}$ multilayers (15), or (Hf, Zr) $\mathrm{O}_2 / \mathrm{Al}_2\mathrm{O}_3$ superlattice (16) (Fig. 1A). This approach leads to a $\Delta P$ up to $52~\mu \mathrm{Ccm}^{-2}$ . Although promising, such approaches involve complicated fabrication processes that limit their scalability. Another notable methodology to tune polarization is through postsynthesis treatment methods, including mechanical treatment (17) and ion bombardment (18, 19). The latter achieves a high $\Delta P$ of up to $80~\mu \mathrm{Ccm}^{-2}$ , benefitting from defects introduced in $\mathrm{Pb(Mg,Nb)O_3 - PbTiO_3}$ films by ion bombardment (Fig. 1A). This method has also been used to enhance the ferroelectricity of (Hf, Zr) $\mathrm{O}_2$ films (20). However, ion bombardment is generally less efficient and surface-sensitive, presenting challenges for widespread applications.

We introduce a different strategy, cryogenic thermal cycling (CTC), to enhance $P_{m}$ , $\Delta P$ , and $U_{e}$ by up to $\sim50\%$ in dielectric films. CTC alternates cryogenic cooling and rapid heating by immersing the material in liquid nitrogen ( $LN_{2}$ ) and a hot liquid over multiple cycles (Fig. 1A and fig. S1). This recently developed method has been used to tune structural heterogeneity and energy states in metallic glasses to improve plasticity (21, 22). Here, we extend CTC to oxide films, where its effects are distinct from those observed in metals. Combined theoretical and experimental work reveals that the enhanced $P_{m}$ , $\Delta P$ , and $U_{e}$ originate from tailored hybridization between specific B-site cations and nitrogen introduced during CTC, resulting in reinforced cation off-center displacement. This process is particularly mediated by preexisting oxygen vacancies ( $V_{O}^{\bullet\bullet}$ ) in oxide films, which serve as active sites for nitrogen incorporation. As a cost-effective and easily implementable approach, CTC was validated across six distinct film systems with thicknesses spanning from the nano- to microscale, grown on various substrates, including silicon, mica, and $SrTiO_{3}:Nb$ (NSTO). These findings establish CTC as a general postsynthesis route for boosting polarizability and energy-storage performance, potentially reshaping the design landscape of next-generation dielectrics.

Enhanced polarization via CTC treatment

We introduced a CTC strategy to overcome the $\Delta P$ bottleneck, increasing it to up to $105~\mu \mathrm{Ccm}^{-2}$ (Fig. 1A), surpassing state-of-the-art values achieved through chemical engineering (1-3, 5, 6, 9, 10), superlattice construction (13-16), mechanical tailoring (17), and ion bombardment (18, 19). This large $\Delta P$ was achieved in $\sim 220$ -nm-thick $0.7\mathrm{Bi(Mg,Ti)}$ $\mathrm{O_3 - 0.3(Sr,Bi)TiO_3}$ films with Ti excess (BMT-SBT-Ti; see materials and methods for compositional details), produced by chemical solution deposition (CSD) on Pt/Si substrates. The parent perovskite Bi(Mg,Ti) $\mathrm{O_3 - SrTiO_3}$ (BMT-ST) and Bi(Mg,Ti) $\mathrm{O_3 - (Sr,Bi)TiO_3}$ (BMT-SBT) at their morphotropic phase boundaries have been reported to exhibit a high $\Delta P$ beyond 60 $\mu$ C cm $^{-2}$ (1, 23), placing them among the state-of-the-art systems promising for CTC investigations.

D

Fig.1. Cryogenic thermal cycling (CTC) method for polarization enhancement. (A) Strategies to enhance $\Delta P$ in dielectric films, including previously reported chemical engineering, superlattice construction, and ion bombardment, as well as the CTC method proposed in this work. BF, BiFeO ${3}$ ; BT, BaTiO ${3}$ ; ST, SrTiO ${3}$ ; BMT, Bi(Mg, Ti)O ${3}$ ; SBT, (Sr, Bi)TiO ${3}$ ; HZO, HfO ${2}$ -ZrO ${2}$ ; BZT, Ba(Zr, Ti)O ${3}$ ; BST, (Ba, Sr)TiO ${3}$ ; PZ, PbZrO ${3}$ ; PZT, Pb(Zr, Ti)O ${3}$ ; PMN-PT, Pb(Mg, Nb)O ${3}$ -PbTiO ${3}$ . All $\Delta P$ values are shown at their respective $E{b}$ . (B) $\Delta P$ of BMT-SBT-Ti films under varied CTC conditions. Cycles involve immersion in LN ${2}$ at -196°C, followed by immersion in hot liquid with peak temperatures of 50°, 100°, 150°, and 200°C, while the dwell time at each peak temperature ranged from 5 to 20 s. The number of cycles was fixed at five. (C) $P{m}$ and $P_{r}$ of BMT-SBT-Ti films as a function of CTC treatment cycles under fixed conditions: -196° to 100°C temperature span and 10-s dwell time. (D) Unipolar P-E loops of the exemplified BMT-SBT-Ti films at respective $E_{b}$ for the pristine, CTC5, and CTC30 films. The number after “CTC” corresponds to cooling-heating cycles, with a temperature span from -196° to 100°C and a 10-s dwell time. CTC30 is just an example demonstrating polarization decline beyond five CTC cycles, while P-E loops for samples with other cycle numbers can be found in fig. S5. The micrographs on the right show surface SEM images of the pristine, CTC5, and CTC30 films. The green circles highlight micropores generated after 30 repetitive CTC cycles. Scale bars, 500 nm.

The Ti excess in the studied films was intentionally introduced to suppress the leakage current and enhance $E_{b}$ , an approach adopted in several prior studies (1, 24, 25). This improvement has been attributed to the formation of ultrafine domains confined by dense dislocations or subgrain boundaries within small grains, which are further isolated by surrounding amorphous regions (1). These microstructural features, which arose from and accommodated substantial Ti excess, were confirmed by x-ray diffraction (XRD) and scanning transmission electron microscopy (STEM) analysis (fig. S2). Together, these features inhibit long-range charge carrier migration and current transport, mitigate nonuniform electric field distribution, and thereby enhance $E_{b}$ and raise $P_{m}$ at larger $E_{b}$ in BMT-SBT-Ti (1, 24). Although BMT-SBT-Ti already had compositional complexity, our focus here was primarily on the microstructural modifications induced by CTC relative to the pristine state, with the role of Ti excess elucidated in the mechanistic discussion. The broader applicability of the CTC method for enhancing $\Delta P$ and $P_{m}$ in simpler compositions will be discussed below.

We investigated the impact of a broad range of CTC parameters, including the temperature differential, the cycle number, and the dwell time of cycles, on polarization of BMT-SBT-Ti. To exclude artificial charge accumulation at electrodes induced by CTC, the samples were first subjected to the CTC treatment and then patterned with $\sim$ 100-nm-thick Au circular top electrodes, which were fabricated using a 100- $\mu$ m mask and calibrated for each batch of measurements (materials and methods and fig. S3). This electrode size minimized the likelihood of parasitic capacitance and reduced the risk of premature device failure, making it favorable for studying intrinsic properties.

The effects of varying temperature span from $LN_{2}$ ( $-196^{\circ}C$ ) to different hot liquids and dwell time were examined for a five-cycle CTC (Fig. 1B and fig. S4). The enhancement in $\Delta P$ was most pronounced when hot water, with a peak temperature of $\sim100^{\circ}C$ , was used, and the optimal dwell time was 10 s (Fig. 1B). Peak temperatures $>100^{\circ}C$ could be obtained with silicon oil, but this medium led to a reduced $\Delta P$ enhancement (Fig. 1B). This is likely because of its high viscosity, which may have impeded stable subsequent $LN_{2}$ contact with the film, as discussed further in the mechanistic section. The effect of cycle number was evaluated under a fixed temperature span from $-196^{\circ}$ to $100^{\circ}C$ and dwell time of 10 s (Fig. 1C and fig. S5). The $P_{m}$ value reaches a maximum at five cycles, as validated by >20 experimental repeats for BMT-SBT-Ti. When the number of CTC cycles exceeded 5, $P_{m}$ showed no further enhancement and instead declined to a level comparable to, or even lower than, that of the pristine films, as indicated by the horizontal red dashed line in Fig. 1C. By contrast, $P_{r}$ , although also being affected, remained low regardless of cycle number, resulting in a peak $\Delta P$ at five CTC cycles. To directly visualize the polarization behavior, one quadrant of the polarization-electric field (P-E) loop for the pristine, CTC5 (5 cycles), and CTC30 (30 cycles) films is shown in Fig. 1D. Here, CTC30 is included simply as a representative example to illustrate the polarization response beyond the optimum of five CTC cycles. After optimal CTC treatment, $P_{m}$ increased from 75 to up to $\sim115\ \mu C\ cm^{-2}$ at a $E_{b}$ of $\sim6.4\ MV\ cm^{-1}$ , whereas $P_{r}$ rose slightly from 7.5 to $\sim10.1\ \mu C\ cm^{-2}$ . These changes resulted in a substantial increase in $\Delta P$ from 68 to $105\ \mu C\ cm^{-2}$ .

We investigated how the CTC conditions affected polarization enhancement. The decline in $P_{m}$ beyond five cycles may primarily arise from macroscopic film degradation caused by repeated cooling-heating cycles. The microscopic modifications responsible for the polarization enhancement in CTC5 were also present in films subjected to higher cycle numbers (CTC30, as an example, is shown in the final section). Specifically, the increased cycle number in CTC30 generates a higher density of “breathing micropores,” as evidenced by surface scanning electron microscopy (SEM) morphology (Fig. 1D, right) and STEM imaging (fig. S6). These micropores slightly reduced the breakdown strength of CTC30 (Fig. 1D) and, moreover, lowered its dielectric constant ( $\varepsilon_{r}$ ), as revealed by the frequency- and temperature-dependent dielectric spectra (fig. S7). We attributed these reductions to the contribution from an increasing concentration of breathing micropores to the permittivity after repeated cooling-heating cycles. By contrast, the marked enhanced polarizability of CTC5 was accompanied by a substantial increase in $\varepsilon_{r}$ . The dielectric spectra also confirmed the disordered characteristic of polarization in BMT-SBT-Ti films, which aligned with the observed slim P-E loops and reinforcing their suitability for energy-storage applications.

A

B

E

G

F

Energy-storage performance

The observed optimal $\sim 50\%$ increase in both $P_{\mathrm{m}}$ and $\Delta P$ of CTC5 film relative to the films' pristine states at identical $E_{\mathrm{b}}$ indicated a substantial enhancement in the energy-storage performance. Field-dependent $P - E$ loops were measured up to the $E_{\mathrm{b}}$ for both pristine and CTC5 BMT-ST-Ti films (fig. S8). The $U_{\mathrm{e}}$ and $\eta$ , calculated from the $P - E$ loops as a function of electric field, showed that the CTC5 film exhibited much better performance compared to the nontreated as-prepared film and achieved a maximum $U_{\mathrm{e}}$ of $\sim 261~\mathrm{Jcm}^{-3}$ at identical $E_{\mathrm{b}}$ of $6.4\mathrm{MVcm}^{-1}$ , an increase of $53\%$ over the nontreated pristine states (Fig. 2, A and B). Notably, a high efficiency ( $\sim 79\%$ ) was roughly retained, as the $P - E$ loops remain similarly slim after the CTC treatment. These $U_{\mathrm{e}}$ and $\eta$ values corresponded to figure-of-merit $U_{\mathrm{F}} = U_{\mathrm{e}} / (1 - \eta)$ of 1240 for the CTC-treated films, representing a $44\%$ improvement over the pristine value of $\sim 860$ (Fig. 2, A and B). The $U_{\mathrm{e}}$ surpassed reported values for state-of-the-art dielectric films, along with superior $U_{\mathrm{F}}$ and $P_{\mathrm{m}}$ values (Fig. 2C and fig. S9) (1-4, 9, 10, 13, 16-18, 26, 27).

Notably, $E_{b}$ remained roughly identical in pristine and CTC5 films. To obtain a more comprehensive evaluation, we conducted a statistical analysis of $E_{b}$ across 10 film batches using Weibull distribution fitting. The pristine and CTC5 films exhibited comparable Weibull moduli ( $\beta = 40$ and 42, Fig. 2D), indicating similar breakdown characteristics. This similarity is ascribed to their nearly identical resistance, on the order of $10^{10}$ Ω, under a direct current electric field up to $E = 3$ MV cm $^{-1}$ (Fig. 2E).

C

H

Fig.2. Exceptional energy-storage properties of CTC5 BMT-ST-Ti films ( $-196^{\circ}$ to $100^{\circ}C$ temperature span, five cycles, and 10-s dwell time) relative to its pristine state. The $U_{e}$ values of films subjected to other CTC treatment conditions can be found in figs. S4 and S5. (A) $U_{e}$ and $\eta$ with respect to applied electric fields up to $E_{b}$ of these films. The measured group of films exhibits identical $E_{b}$ before and after CTC treatment. (B) Comparison of $P_{m}, U_{e}, U_{F}$ , and $\eta$ of the nontreated pristine and CTC-treated films at the same $E_{b} = 6.4 MV cm^{-1}$ . (C) Comparison of the energy-storage performance of the CTC-treated BMT-SBT-Ti films with that of state-of-the-art films, including those through chemical modification, superlattice construction, ion bombardment, and mechanical treatment. (D) Two-parameter Weibull distribution analysis of $E_{b}$ across 1 multiple sample positions, suggesting negligible statistical change in the breakdown behavior of the films after CTC treatment. (E) Resistance as a function of the applied electric field. (F) Discharge energy density as a function of time and the extracted discharge rate time with a load resistor of $10 k\Omega$ . (G) Energy-storage performance of the studied films at an electric field of $1.8 MV cm^{-1}$ with respect to charging-discharging cycling numbers. The pristine films can withstand $10^{6}$ cycles, whereas CTC-treated films endure up to $10^{7}$ cycles. (H) Temperature-dependent energy storage performance of the studied films at an electric field of $1.8 MV cm^{-1}$ .

We also measured the overdamped discharge using a 10 kΩ load resistor (Fig. 2F). This intermediate-size resistor was used in thin-film measurements to limit the discharge current to the milliampere range to protect the device from damage, and set the discharge time constant ( $\tau$ ) in the microsecond regime, which enabled reliable time-resolved integration of the stored energy (28). The CTC5 films exhibited a discharge energy density ( $W_{D}$ ) of $\sim150~J~cm^{-3}$ , which represented a 48% enhancement with respect to that of its pristine state. Both pristine and CTC5 films exhibited a similar and fast discharge rate ( $\tau_{0.9}$ ) of $\sim3~\mu s$ , revealing good charging-discharging performance and making them promising candidates for pulsed-power applications.

The reliability and stability of the energy-storage performance were also evaluated through an accelerated charging-and-discharging test at an electric field of $1.8 \, MV cm^{-1}$ , which fell within the range typically relevant for practical applications. We observed that the pristine films experienced breakdown after $10^{6}$ cycles, whereas CTC5 films exhibited an order-of-magnitude improvement of $10^{7}$ cycles (Fig. 2G and fig. S10). We also investigated films' thermal stability across a temperature range from $25^{\circ}$ to $150^{\circ}C$ (Fig. 2H and fig. S11). The CTC5 films showed variation of $\sim6\%$ in $U_{e}$ and $\sim0.5\%$ in $\eta$ , considerably better than 15% and 3% for the nontreated films, respectively. This superior temperature stability enables the films to function efficiently even under high-temperature conditions. These results revealed that CTC5 films consistently exhibit an enhanced energy-storage density, regardless of the measurement methodology used.

Application of the CTC strategy to other materials

We tested the broad applicability of the CTC method for effectively enhancing the polarization or energy-storage density across a wide range of ferroelectric films, with varying thicknesses (from submicrometer to micrometer scale) and substrate types (Si, Mica, and NSTO). The optimal number of CTC cycles with a fixed dwell time of 10 s varied between 3 and 10 and depended on material systems and thicknesses. First, ferroelectric thin films with slim P-E loops were fabricated by the CSD method, including BMT, BMT-SBT, (Bi, La)FeO ${3}$ -PbTiO ${3}$ (BLF-PT), and BMT-SBT-Ti. All systems exhibited enhancement in $U_{e}$ after CTC treatment, with improvements ranging from 37 to 53% (Fig. 3A and fig. S12).

We examined the influence of substrate constraint and thermal expansion mismatch by depositing BMT-SBT-Ti and BLF-PT films, with thicknesses between 150 and $310~\mathrm{nm}$ , on different substrates, including Pt/Si, [001] $\mathrm{LaNiO_3 / mica}$ , and [001] NSTO (Fig. 3B and figs. S13 to S17). Mica was selected because it can be thinned to $10~{\mu\mathrm{m}}$ as the supporting substrate, whereas NSTO and Si were $0.5\mathrm{mm}$ thick. NSTO was chosen because of its larger thermal expansion coefficient compared with those of other typical perovskites, whereas Si and mica had smaller values (see details in materials and methods and fig. S18).

After CTC treatment, BMT-SBT-Ti films exhibited $U_{e}$ enhancement of 38% on NSTO, 53% on Si, and 44% on mica (Fig. 3B). Notably, the enhancement ratio was not further increased by substrate unclamping on mica or by larger thermal expansion of NSTO, suggesting that the CTC mechanism was largely insensitive to these macroscopic substrate effects. We extended the CTC method to conventional ferroelectric films, including Pb(Zr,Ti)O ${3}$ (PZT) and PT, deposited on Si or [001] LaNiO ${3}$ /mica substrates, with film thicknesses increased to $\sim800$ nm (fig. S19). These films also exhibited enhancement in $P_{m}$ after CTC treatment, with the improvement ratio reaching as high as 51% (figs. S20 and S21). However, as expected, PZT and PT were unsuitable for energy storage because of their large $P_{r}$ .

Mechanistic considerations

The combination of these results enables the systematic exclusion of unlikely mechanisms for performance enhancement. First, they rule out chemical heterogeneity as the dominant factor responsible for the CTC-induced $P_{m}$ enhancement. For instance, conventional ferroelectrics such as PT can exhibit $P_{m}$ enhancement up to 51%, despite differing markedly from highly polarizable disordered BMT-BT-Ti films in grain size and domain size, as well as A- and B-site cation configurations. Although the magnitude of the enhancement may vary across different material systems, it showed no necessary correlation to compositional complexity. Nevertheless, chemical disorder suppressed $P_{r}$ but enabled large polarizability (i.e., high $P_{m}$ ), which is advantageous for energy storage. Second, thermal stress effect was excluded as a major contributor. Minimal differences in the property improvement were observed across structurally and chemically diverse systems on various substrates, despite substantial in situ thermal stresses within the film or at the film-substrate interface that could occur during cyclic thermal expansion and contraction. This conclusion was further supported by the nearly unchanged peak positions in the XRD patterns after CTC treatment (fig. S22) that indicated negligible residual stress levels.

Additionally, $\Delta T$ alone, in the absence of direct contact with $LN_{2}$ and hot water, cannot account for the polarization enhancement. BMT-SBT-Ti films subjected to CTC treatment but wrapped with either 20- $\mu$ m Pt foil or Teflon tape to isolate the effect of $\Delta T$ alone, showed no change in $P_{m}$ (Fig. 3C), except for minor sample-to-sample variations. To exclude possible thermal-lag effects introduced by the barrier layer, we extended the dwell times, although the heat-transfer delay was expected to be only on the microsecond timescale. The unchanged $P_{m}$ excluded microstructure modification induced by thermal cycles alone (if any) as the primary origin. The mechanism is therefore closely associated with the direct contact with $LN_{2}$ and hot liquid. To further identify their respective roles, we performed two additional comparative studies: (i) Using a 100°C hot plate instead of hot water failed to induce $P_{m}$ enhancement under the CTC scheme (fig. S23); and (ii) although the high viscosity of silicone oil leads to unstable effectiveness as discussed above, a larger set of measurements still revealed increases of 32 to 37% in $P_{m}$ and 33 to 48% in $U_{e}$ after CTC between $LN_{2}$ to 100°C silicone oil (fig. S24), roughly comparable to those achieved using hot water. These results indicate that a hot liquid is indispensable, irrespective of its type; it functions primarily as a physical barrier that suppresses the escape of $N_{2}$ gas from micropores rather than participating in any chemical process. Meanwhile, recent studies have shown that nitrogen incorporation can enhance polarization in oxide ferroelectrics, i.e., $BaTiO_{3-\delta}N_{\delta}$ , where partial substitution of oxygen with nitrogen (29) led to enhanced polarization ascribed to stronger Ti-N bonding (relative to Ti-O) and the consequent reinforcement of Ti displacements. This raises the key question: How does nitrogen contribute to increasing polarization under the CTC scheme.

To investigate the role of nitrogen in CTC-induced polarization enhancement, we first examined the film microstructure to assess $LN_{2}$ and water infiltration. An increased concentration of “breathing micropores” observed on the film surface and within the film bulk after repetitive CTC treatment (Fig. 1D and fig. S6) suggested $LN_{2}$ and water infiltration into the CSD-deposited films. The infiltration pathways likely consisted of micropores, microcracks, amorphous regions, grain or subgrain boundaries, dislocations, and domain walls as deduced from the two-dimensional projected STEM images (fig. S6) and schematically illustrated in fig. S25. We validated liquid infiltration using a tracking solution containing heavy ions, specifically $\mathrm{Pb(NO_{3}){2}}$ . Figure 3D and its inset display $Pb^{2+}$ ions tracked in the film bulk after immersing the sample into $\mathrm{Pb(NO{3}){2}}$ (see details in materials and methods and fig. S26), confirming that ionic species can penetrate the film. Notably, infiltration must dominate the uptake of $N{2}$ molecules during the cryogenic dwell, because diffusion at such temperatures is strongly suppressed. Precise experimental quantification of the relative density $(\rho_{\mathrm{r}})$ of the studied films, including BMT, BMT-SBT, BMT-SBT-Ti, PZT, and PT, is challenging, particularly given their thicknesses exceeding 100 nm and surface roughness above tens of nanometers. Nevertheless, the observed polarization enhancement across these distinct systems (sometimes with identical enhancement, as shown above) indicate that $LN_{2}$ infiltration into these films is a robust and reliable process, even though $\rho_{r}$ may vary depending on different fractions of (sub)grain boundaries, microcracks, dislocations, or amorphous regions. Supporting this notion, a recent study also indicated penetration of thiourea solution into 80-nm pulsed laser-deposited epitaxial $BiFeO_{3}$ films (30), most likely through microcracks or domain walls. Notably, thermal shocks accompanying the CTC process may also generate microcracks for solution infiltration. Collectively, these results suggest that solution infiltration is unlikely to be a limiting factor in the CTC process, once a threshold is reached, as $\rho_{r} < 100\%$ for all materials always implies the presence of accessible infiltration pathways.

D Cryogenic dwell: $\mathrm{LN}_2$ infiltration

B Substrates

C $\Delta T$ only

E Hot-liquid dwell: Ti-N hybridization

G Ti-N hybridization: $V_{0}^{\bullet\bullet}$ presence

F Ti-N hybridization: $V_{0}^{\bullet\bullet}$ absence

H

Fig. 3. Broad applicability of the CTC strategy and nitrogen hybridization underlying polarization enhancement. (A) $U_{\mathrm{e}}$ of BMT, BMT-SBT, BLF-PT, and BMT-SBT-Ti films before and after CTC treatment. (B) $U_{\mathrm{e}}$ enhancement of CTC-treated BMT-SBT-Ti films grown on silicon, mica, and NSTO substrates. (C) $P / P_0$ of BMT-SBT-Ti films, where $P$ and $P_0$ denote the maximum polarization after CTC treatment and that of the pristine state, respectively. CTC was performed with either a $20 - \mu \mathrm{m}$ Pt foil or Teflon tape barrier. Different marker types for Al foil wrapping denote different experimental batches under identical conditions. (D) Elemental analysis of $\mathrm{Pb}^{2+}$ infiltration into pristine BMT-SBT-Ti film interior after immersion in $\mathrm{Pb(NO_3)2}$ tracking solution. Green denotes Pb signals permeating throughout the film bulk. (E) EPR spectra of pristine BMT-SBT-Ti film. (Inset) Schematic of coordination between $\mathrm{Ti}^{3+}$ and $\mathbf{N}_2$ via $\sigma$ donation and $\pi$ backdonation. (F and G) DFT-calculated $E{\mathrm{a}}$ for Ti-N hybridization in the absence and presence of preexisting $V_0^{\bullet \bullet}$ as active reaction sites. Insets show fully relaxed BMT structures in the initial and final states. (H) $(P - P_0) / P_0$ of the modeled BMT unit cell, where $P$ and $P_0$ are the calculated polarizations with and without Ti-N hybridization, respectively. Each colored dot represents the polarization of a distinct structure from the 32 one-Ti-N or 28 two-Ti-N configurations (see materials and methods and fig. S26 for details). Solid black and dashed white lines denote the median and mean values, respectively. Red and blue shaded boxes indicate the middle $50\%$ of the data.

Next, we considered the chemical interaction between infiltrated species and the film matrix. The presence of $Ti^{3+}$ in the pristine films, which may be associated with substantial Ti excess, as suggested by previous studies (25, 31), played a crucial role. Electron paramagnetic resonance (EPR, Fig. 3E) confirmed the presence of $Ti^{3+}$ (with partially occupied d orbitals), together with the typically associated $V_{O}^{\bullet\bullet}$ in titanates, in the as-prepared BMT-SBT-Ti films. Transition-metal centers with partially occupied d orbitals, such as $Fe^{2+}$ , $Ti^{3+}$ , $Mn^{2+}$ , and $Mo^{3+}$ , can coordinate $N\equiv N$ under ambient conditions through synergistic $\sigma$ donation and $\pi$ backdonation (32, 33). Specifically, $Ti^{3+}$ can coordinate with $N_{2}$ through $\sigma$ donation from the $N_{2}$ 2p orbital to available $Ti^{3+}$ 3d orbitals, accompanied by $\pi$ backdonation from partially occupied $Ti^{3+}$ 3d into the $N_{2}$ antibonding orbitals (Fig. 3E, inset). A chemical study by Shima et al. experimentally demonstrated that multi-Ti sites within trinuclear titanium polyhydride complex can successfully dissociate $N_{2}$ under ambient temperature and pressure (34). Thus, the $Ti^{3+}$ sites on internal surfaces in our films may serve as coordination centers for infiltrated nitrogen species. Such catalyst-like coordination is expected to facilitate $N_{2}$ activation and thereby promote subsequent Ti-N hybridization, as supported by the experimental evidence presented in the final section. Critically, the thermal dwell step was indispensable for this chemical reaction. A comparative study in which BMT-SBT-Ti films were immersed in $LN_{2}$ for up to 2 hours, without subsequent dwell in hot water, resulted in negligible change in polarization (fig. S27), confirming that cryogenic exposure alone was insufficient for driving such chemical reaction.

Density functional theory (DFT), combined with the climbing-image nudged elastic band (CI-NEB) method, was further performed to validate Ti-N hybridization sites, particularly those associated with coexisting $Ti^{3+}$ and $V_{O}^{\bullet\bullet}$ . For structural simplicity, the simulations were performed using a 30-atom R-phase BMT unit cell, which did not compromise the validity of the conclusions. We show below that the CTC process itself did not generate additional $V_{O}^{\bullet\bullet}$ ; however, preexisting $V_{O}^{\bullet\bullet}$ play a key role in promoting Ti-N hybridization within the modeled structure. The CI-NEB results revealed that the activation barrier ( $E_{a}$ ) for Ti-N hybridization dropped sharply from 4.60 eV (Fig. 3F) to 1.47 eV (Fig. 3G) when preexisting $V_{O}^{\bullet\bullet}$ serves as the reaction site. Notably, in the $V_{O}^{\bullet\bullet}$ -free model, the final state is higher in energy than the initial state, indicating that Ti-N hybridization was energetically unfavorable under such conditions (Fig. 3F). All modeled structures were first energy-minimized and then fully relaxed (materials and methods), with the initial nitrogen species being molecular $N_{2}$ .

Although the thermodynamic bond dissociation energy of free N≡N may reach ∼9.75 eV (35), N₂ activation during the CTC process is fundamentally different from the cleavage of isolated N₂. In addition to the defect-assisted pathway revealed by CI-NEB calculations, N₂ activation may be further promoted by the Ti³⁺-N₂ coordination discussed above (34), as well as by thermal shock-related effects, including local N₂ pressurization and mechanical energy concentrated at internal surfaces. Similar mechanically assisted nitrogen activation has been reported for the formation of TiO₀.₅N during mechanical milling (36). These catalyst-like coordination and thermal shock effects facilitate the reaction by providing the energy required to overcome the activation barrier, thereby enabling Ti-N hybridization at 100°C within tens of seconds. We further examined alternative nitrogen-based media as low-temperature agents, including NH₃•H₂O and aqueous urea solution (fig. S28). No effective enhancement in Pₘ was observed, which may be attributed to their different coordination characteristics with transition-metal centers and their much weaker thermal shock effect, limited by their respective freezing points of −49°C and −11°C (see fig. S28 for more details). These results further support the view that Ti-N₂ coordination and strong thermal shock, including local N₂ pressurization and mechanical energy arising from volume changes of micropores and pathways during thermal expansion, are also critical for activating Ti-N hybridization during the CTC process.

DFT calculations were then used to assess the impact of Ti-N hybridization on polarization. Multiple crystallographic configurations with different relative energies, with inequivalent nitrogen (i.e., $V_{O}^{\bullet\bullet}$ ) sites were examined (materials and methods and fig. S29). As shown in Fig. 3H, two Ti-N hybridization in a 30-atom BMT unit cell, mediated by preexisting $V_{O}^{\bullet\bullet}$ and corresponding to a theoretical nitrogen uptake of $\sim1.7$ atomic % (at %), resulted in a $\sim50\%$ median increase in calculated polarization. This enhancement arose from greater asymmetry in electron localization and the resulting strengthening of local dipoles (fig. S29). Notably, reducing the nitrogen hybridization to one Ti-N per unit cell (0.8 at % nitrogen level in the film) led to a similar increase (Fig. 3H), suggesting that even a limited amount of Ti-N hybridization, comparable to or below typical $V_{O}^{\bullet\bullet}$ concentrations (37, 38), can effectively increase the overall polarization in titanates.

Evidence of bulk-level nitrogen hybridization

To experimentally validate nitrogen hybridization within the oxide film bulk, we first performed depth-resolved x-ray photoelectron spectroscopy (XPS) (Fig. 4A, inset). The profiles in Fig. 4A showed the evolution of N 1s from the surface into the film bulk, acquired with $\sim$ 20-nm-thickness steps, thus providing both surface- and bulk-representative information. Measurements were performed on pristine, CTC5, and CTC30 BMT-SBT-Ti films for comparison. A nitridation effect was observed after CTC treatment, evidenced by the emergence of a distinct N 1s peak (Fig. 4A). Three key observations were that (i) on the film surface, the N 1s peak centered at $\sim$ 399.5 eV was assigned to chemisorbed molecular N ${2}$ ; (ii) beneath the surface, N 1s peak shifts to $\sim$ 397.5 eV, indicative of chemically bonded nitrogen, whereas the negligible intensity above $\sim$ 399 eV suggested that chemisorbed N ${2}$ was absent (or minimal) in the film interior (29, 39–43); and (iii) the pronounced N 1s signals in both the CTC5 and CTC30 films indicated that the polarization decline beyond CTC5 was not attributable to differences in the Ti-N reaction, consistent with the macroscopic results shown earlier.

Using the previously reported sensitivity factor method (44), the nitrogen concentration within the film bulk after CTC treatment was estimated to be $\sim 0.6$ at $\%$ from XPS data (fig. S30). This nitrogen level corresponded roughly to one Ti-N bond per unit cell, comparable to that validated in our DFT calculations. Notably, a prior study on N substitution at O sites in $\mathrm{BaTiO_{3 - \delta}N_{\delta}}$ reported a $167\%$ increase in polarization with $\sim 7\%$ N substitution, and a $\sim 43\%$ increase with $< 1\%$ N substitution (estimated from their reported XPS) (29). The low-substitution regime agreed well with our findings on the magnitude of polarization enhancement.

Depth-resolved time-of-flight secondary-ion mass spectrometry (TOF-SIMS) further confirmed uniform Ti-N hybridization within the film bulk. In sharp contrast to the pristine film, where intense $TiO_{x}^{-}$ and negligible $TiN_{x}^{-}$ signals were observed, both $TiO_{x}^{-}$ and $TiN_{x}^{-}$ chemical fragments were detected throughout the bulk of the CTC5 and CTC30 films (Fig. 4B). This result unambiguously revealed chemical bonding between nitrogen and titanium. The normalized intensities of Ti-containing fragments, including $TiO_{x}^{-}$ , $TiO_{2}^{-}$ , $TiN_{x}^{-}$ , and $TiN_{2}^{-}$ , are compared in Fig. 4C. The intensity ratio between O-based and N-based Ti fragments ( $I_{TiO_{x}^{-}} / I_{TiN_{x}^{-}}$ ) was 38 and 32 for CTC5 and CTC30 films, respectively. Given that a hexagonal BMT-SBT-Ti unit cell contained 36 B-X bonds, this ratio corresponds approximately to one Ti-N bond per unit cell, in good agreement with the XPS-based quantification and the DFT prediction. The $TiN_{2}^{-}$ chemical fragment was not observed in any film (Fig. 4C), likely because of its low yield. However, together with the absence of an $\sim399$ eV N 1s peak in the film interior by XPS, these results suggest that molecular $N_{2}$ was not present in the film interior. Notably, the other B-site cation, Mg, with 2s orbitals, was not expected to interact with nitrogen, as validated by the trace $MgN_{x}^{-}$ signal (see normalized intensity of all other chemical fragments in fig. S31 for TOF-SIMS measurements).

We next experimentally investigate where Ti-N hybridization occurred within the film, with particular emphasis on its correlation with coexisting $Ti^{3+}$ and $V_{O}^{\bullet\bullet}$ , which DFT calculations identify as crucial. Direct visualization of nitrogen and $V_{O}^{\bullet\bullet}$ at the atomic level is challenging. Nitrogen is particularly difficult to distinguish from oxygen by electron-imaging techniques such as STEM, and its expected nonperiodic incorporation into our samples further complicates direct identification. We therefore infer the process through bulk-sensitive STEM electron energy loss spectroscopy (STEM-EELS) conducted on cross-sectional BMT-SBT-Ti lamellae grown on NSTO and Si substrates (Fig. 4D). Because Bi, Sr, and Mg in BMT-SBT-Ti remain largely stable in valence, our analyses focus on Ti (which is multivalent) and the anion sublattice. At both the Ti $L_{2}$ and $L_{3}$ edges, the peaks split into lower-energy $t_{2g}$ and higher-energy $e_{g}$ components, corresponding to Ti 2p transition to unoccupied 3d_ $t_{2g}$ and 3d_ $e_{g}$ states, respectively (Fig. 4D, left). $Ti^{3+}$ , which carried an extra 3d $^{1}$ electron, preferentially occupies the lower-energy $t_{2g}$ state and thus suppressed the $t_{2g}$ intensity.

Accordingly, the increased $t_{2g}$ peak intensity after CTC treatment, reflecting a greater number of unoccupied $t_{2g}$ states, indicates a lower

B

C

D

Fig. 4. Experimental evidence of nitrogen hybridization in BMT-SBT-Ti oxide films. (A) Depth-resolved XPS spectra showing nitrogen signals in the pristine, CTC5, and CTC30 films. The CTC treatment was conducted over a $-196^{\circ}$ to $100^{\circ}\mathrm{C}$ temperature span with a 10-s dwell time for 5 and 30 cycles. (B) Depth-resolved TOF-SIMS spectra detecting different chemical fragments for the pristine, CTC5, and CTC30 films. (C) Normalized intensity of Ti-based chemical fragments of TOF-SIMS spectra. (D) STEM-EELS line profiles of titanium L and oxygen K edges for the pristine, CTC5, and CTC30 films, grown on Si and NSTO substrates. (E) Quantification of the peak intensity ratios for titanium $t_{2g} / e_g$ and oxygen $a / b$ . (F) Intensity of $g \sim 2.003$ peak as extracted from EPR spectra for BMT-SBT-Ti films after different postsynthesis treatments. Inset shows the corresponding EPR curves, with the same color code.

Ti $^{3+}$ concentration and an increase in the average Ti valence toward Ti $^{4+}$ in the films (45), as shown in Fig. 4E (top). This oxidation toward Ti $^{4+}$ implies a more complete octahedral coordination around Ti, which in our case is most plausibly achieved through Ti-N bonding rather than oxygen refilling, consistent with the Ti-N signatures observed in XPS and TOF-SIMS. We thus infer that nitrogen, with a size comparable to that of oxygen, occupies preexisting $V_{O}^{\bullet\bullet}$ , with $N_{2}$ anchoring near these vacancies in an energetically favorable manner. This finding also rationalized the relatively limited concentration ( $\sim0.6$ at %) of Ti-N hybridization in these films. Nonetheless, these Ti-N hybridizations enhanced the localized Ti off-centering displacement as observed in the STEM-HAADF (high-angle annular dark-field) images (fig. S32), consistent with our DFT results.

Turning to the oxygen K-edge, the EELS line profile revealed no measurable increase in $V_{O}^{\bullet\bullet}$ concentration after CTC treatment relative to the pristine state, which was concluded from the pre-edge doublet peaks a ( $\sim534$ eV) and b ( $\sim538$ eV), which correspond to O 1s transitions to unoccupied O 2p-Ti 3d_ $t_{2g}$ and O 2p-Ti 3d_ $e_{g}$ hybridized orbitals, respectively (Fig. 4D, right). On the basis of prior reports (20, 46, 47), an increased intensity of a-peak relative to b-peak would reflect a reduced $V_{O}^{\bullet\bullet}$ concentration. However, we statistically observed no appreciable change in the a/b ratio across more than five independent EELS line profiles for each sample (Fig. 4E, bottom), indicating stable oxygen states, with negligible additional $V_{O}^{\bullet\bullet}$ introduced by CTC treatment. This result supports the conclusion that the topological removal of $V_{O}^{\bullet\bullet}$ in our samples (associated with $Ti^{4+}$ concentration increase) did not occur through oxygen refilling.

This inference was further supported by EPR spectra, which show a comparable intensity of the $g \sim 2.003$ signal in pristine and CTC-treated samples (Fig. 4F). Notably, both $V_{O}^{\bullet\bullet}$ formation ( $O_{O}^{\times} \rightarrow V_{O}^{\bullet\bullet} + 1/2O_{2} + 2e^{\prime}$ ) and nitrogen incorporation on $V_{O}^{\bullet\bullet}$ site ( $N_{2} + 2V_{O}^{\bullet\bullet} + 4e^{\prime} \rightarrow 2N'{O} + 2h^{\prime}$ ) can generate paramagnetic centers that contribute to a similar EPR signature. Therefore, the unchanged $g \sim 2.003$ intensity supported the hypothesis that CTC did not appreciably increase the overall $V{O}^{\bullet\bullet}$ population, and that instead, nitrogen preferentially occupies preexisting vacancy sites. By contrast, annealing the films in $N_{2}$ and $O_{2}$ at $400^{\circ}C$ for 20 min noticeably changed the $g \sim 2.003$ intensity (Fig. 4F), reflecting a corresponding increase and decrease in $V_{O}^{\bullet\bullet}$ concentration, respectively. With defects modulated by atmosphere annealing, two further observations were made. First, there was only a limited impact on polarization from the defect level alone, with $P_{m}$ varying by $<6\%$ (fig. S33), confirming that the CTC-induced enhancement was not simply a result of defects manipulation but rather arose from the specific formation of Ti-N hybridization. Second, subsequent CTC treatment of films with tuned vacancy concentrations led to changes in the observed polarization-enhancement ratio (fig. S34), corroborating an oxygen vacancy-mediated nitridation process during CTC.

The combined theoretical and experimental evidence collectively leads to several key conclusions. First, the beneficial chemical reaction saturated after a sufficient number of CTC cycles. Consequently, the peak performance observed at CTC5 and the subsequent decline at higher cycle numbers were likely a consequence of macroscopic film degradation caused by repetitive cooling-heating cycles. Second, CTC offers a pathway distinct from those of conventional approaches to synthesize nitrogen-substituted ferroelectric oxides (oxynitrides) with high polarizations. Although polar oxynitrides were predicted early to exhibit high polarization, such materials remain scarce because traditional synthesis typically relies on atmosphere control during annealing (e.g., $N_{2}$ or $NH_{3}$ ) (29, 48–52): $N_{2}$ is often ineffective owing to its high stability, whereas $NH_{3}$ can introduce hydrogen and degrades ferroelectric properties (48), making high-performance polar oxynitrides challenging to realize. By contrast, the CTC method provides a new and more straightforward alternative for oxide nitridation. Third, the CTC-induced nitrogen hybridization is mediated and therefore governed by the preexisting $V_{O}^{\bullet\bullet}$ concentration in oxides. This process thus relies on the efficient utilization of available $V_{O}^{\bullet\bullet}$ during the reaction. Nonetheless, it involves only a small absolute extent of nitrogen hybridization, reaching as high as $\sim0.6$ at % in this study, yet can yield a pronounced enhancement in polarization by reinforcing cation off-center displacement, as observed both in a prior report (29) and in the current study.

Conclusions and outlook

We propose a postsynthesis treatment approach, i.e., CTC, to enhance polarization and thereby improve dielectric energy storage performance by up to $\sim50\%$ relative to pristine counterparts. In particular, BMT-SBT-Ti films achieve a maximized $\Delta P$ of $105\ \mu C\ cm^{-2}$ and a $U_{e}$ of up to $261\ J\ cm^{-3}$ . Mechanistic investigations attribute this enhancement to oxygen vacancy-mediated nitrogen hybridization during CTC, which strengthens the electron-localization asymmetry and local dipoles, thereby boosting $P_{m}$ . Identifying nitrogen hybridization as the key driver also opens a pathway for the targeted exploration of oxynitride ferroelectrics, enabling scalable manipulation of polarization and related functionalities. Unlike conventional high-temperature nitridation using $N_{2}$ or $NH_{3}$ , CTC provides a relatively mild route for oxides nitridation.

This approach offers several notable advantages: It is easily implementable and cost-effective; it is broadly applicable and scalable across multiple material systems, particularly transition metal-containing oxides; and unlike surface-limited techniques such as ion irradiation, it uniformly modifies the entire film volume. Its broad applicability, demonstrated across diverse compositions, including both classical and disordered ferroelectrics; a wide thickness range from the nanoscale to the microscale; and multiple substrates such as silicon, mica, and NSTO, establish CTC as a good paradigm for advancing next-generation high-performance dielectric films. Further investigations are warranted to fully unlock the potential of this method and to extend its future applications beyond the material systems explored here.

REFERENCES AND NOTES

1. L. Shu et al., Science 385, 204–209 (2024).

2. H. Pan et al., Science 365, 578–582 (2019).

3. H. Pan et al., Science 374, 100–104 (2021).

4. H. Pan et al., Nat. Commun. 9, 1813 (2018).

5. J. Qian et al., Nano Energy 135, 110651 (2025).

6. R. Yuan et al., Nano Lett. 23, 4807–4814 (2023).

7. J. Fu et al., Nat. Commun. 15, 7338 (2024).

8. L. Yang et al., Prog. Mater. Sci. 102, 72–108 (2019).

9. B. Yang et al., Nat. Mater. 21, 1074–1080 (2022).

10. B. Yang et al., Nat. Energy 8, 956–964 (2023).

11. J. W. McPherson, J. Kim, A. Shanware, H. Mogul, J. Rodriguez, IEEE Trans. Electron Dev. 50, 1771–1778 (2003).

12. L. Liu, J. Zhang, Y. Wang, Innov. Mater. 2, 100103 (2024).

13. S. Han et al., Science 384, 312–317 (2024).

14. X. Zhang et al., Nano Energy 121, 109271 (2024).

15. M. D. Nguyen et al., Adv. Mater. 36, e2402070 (2024).

16. S. S. Cheema et al., Nature 629, 803–809 (2024).

17. M. Peddigari et al., Adv. Mater. 35, e2302554 (2023).

18. J. Kim et al., Science 369, 81–84 (2020).

19. Y. Luo et al., Appl. Phys. Rev. 10, 011403 (2023).

20. S. Kang et al., Science 376, 731–738 (2022).

21. S. V. Ketov et al., Nature 524, 200–203 (2015).

22. T. C. Hufnagel, Nat. Mater. 14, 867–868 (2015).

23. C. Bin et al., Chem. Eng. J. 445, 136728 (2022).

24. J. Xie et al., J. Mater. Chem. C Mater. Opt. Electron. Devices 7, 13632–13639 (2019).

25. S. Stemmer, S. K. Streiffer, N. D. Browning, A. I. Kingon, Appl. Phys. Lett. 74, 2432–2434 (1999).

26. Y. Sun et al., Adv. Sci. (Weinh.) 9, e2203926 (2022).

27. Y. Liu et al., Science 388, 211–216 (2025).

28. W. S. Mada Sanjaya, D. Anggraeni, A. Sambas, R. Denya, J. Phys. Conf. Ser. 1090, 012015 (2018).

29. T. Wang et al., Sci. Adv. 11, eads8830 (2025).

30. G. Xi et al., Nat. Commun. 16, 3526 (2025).

31. S. Stemmer et al., Appl. Phys. Lett. 79, 3149–3151 (2001).

32. L. S. Yamout et al., J. Am. Chem. Soc. 143, 9744–9757 (2021).

33. F. Hasanayn, P. L. Holland, A. S. Goldman, A. J. M. Miller, J. Am. Chem. Soc. 145, 4326–4342 (2023).

34. T. Shima et al., Science 340, 1549–1552 (2013).

35. P. Wang, S. Gong, Y. Li, Y. Mo, J. Chem. Phys. 160, 014304 (2024).

36. H. Yang, P. G. McCormick, J. Mater. Sci. 28, 5663–5667 (1993).

37. F. Gunkel, D. V. Christensen, Y. Z. Chen, N. Pryds, Appl. Phys. Lett. 116, 120505 (2020).

38. G. Zhuang, Y. Chen, Z. Zhuang, Y. Yu, J. Yu, Sci. China Mater. 63, 2089–2118 (2020).

39. R. Asahi, T. Morikawa, T. Ohwaki, K. Aoki, Y. Taga, Science 293, 269–271 (2001).

40. C. D. Valentin et al., Chem. Phys. 339, 44–56 (2007).

41. J. M. Polfus, T. Norby, R. Haugsrud, J. Solid State Chem. 198, 65–76 (2013).

42. A. Panepinto et al., J. Phys. Chem. C Nanomater. Interfaces 124, 17401–17412 (2020).

43. S. Shimizu et al., Chem. Sci. 15, 10350–10358 (2024).

44. C. D. Wagner et al., Surf. Interface Anal. 3, 211–225 (1981).

45. G. Z. Zhu, G. Radtke, G. A. Botton, Nature 490, 384–387 (2012).

46. D. Liu et al., Small 21, e07943 (2025).

47. K. Xu, Y. Gu, C. Song, X. Zhong, J. Zhu, Nanoscale 13, 6066–6075 (2021).

48. S. Aggarwal et al., Appl. Phys. Lett. 73, 1973–1975 (1998).

49. S. G. Ebbinghaus et al., Prog. Solid State Chem. 37, 173–205 (2009).

50. I. Marozau et al., Appl. Surf. Sci. 255, 5252–5255 (2009).

51. A. Fuertes, J. Mater. Chem. 22, 3293–3299 (2012).

52. R. Vadapoo et al., Phys. Rev. B 95, 214120 (2017).

53. J. Yi et al., (2026). Thermal-cycling-induced nitriding increases energy storage density in titanate ferroelectric films [Data set], Zenodo; https://doi.org/10.5281/zenodo.20576546.

ACKNOWLEDGMENTS

We acknowledge J. Daniels (UNSW Sydney) for valuable input on mechanistic and chemical discussions, and for assistance with manuscript revisions. Funding: Zhongwu Research and Innovation Team Project of Jiangsu University of Technology, 202101001 (J.Y.). The Fundamental Research Funds for the Central Universities 30921011217 (L.L.). The CityUHK Start-Up Grant 9380184 (S.Z.) Author contributions: Conceptualization: J.Y., L.L. Experiments: J.Y., K.Z., Y.Z., L.S., Z.S., Z.C. Analysis: J.Y., D.D., S.Z., L.L. DFT calculation: C.S., H.Z. Funding acquisition: J.Y., L.L. Writing – original draft: J.Y., L.L., S.Z. Writing – review & editing: J.Y., Z.S., Z.C., D.D., J.-F.L., S.Z., LL. Competing interests: A patent application covering the CTC approach for enhancing polarizations has been submitted for examination in July 2026; inventors J.Y. et al. Data, code, and materials availability: All data and details of materials synthesis are available in the main text or the supplementary materials. All data and descriptions needed to evaluate the conclusions in this paper are present in the main text, the supplementary file, and in dataset (53). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aeb5274

Materials and Methods; Figs. S1 to S34; References (54–64)

Submitted 21 August 2025; resubmitted 23 March 2026; accepted 1 July 2026

10.1126/science.aeb5274

De novo design of RNA pseudoknots with deep learning

Jill Townley $^{1,2\dagger}$ , Wipapat Kladwang $^{3,4\dagger}$ , David Baker $^{5,6}$ , Hamish M. Blair $^{7}$ , Christian A. Choe $^{8}$ , Gina El Nesr $^{9}$ , Andrew Favor $^{5}$ , Eli Fisker $^{1}$ , Daniel B. Haack $^{10,11}$ , Shujun He $^{12}$ , Jason Hingey $^{11}$ , Po-Ssu Huang $^{8,9}$ , Rui Huang $^{3}$ , Chaitanya K. Joshi $^{13}\ddagger$ , Thomas Karagianes $^{1,2,3}$ , Andrew Kubaney $^{5}$ , Pietro Liò $^{13}$ , Adamo Mancino $^{14}$ , Jonathan Romano $^{1,2,4}$ , Boris Rudolfs $^{10}$ , Nicholas Spellmon $^{14}$ , Navtej Toor $^{10}$ , Jigyasa Verma $^{3}$ , Vivian Wu $^{3,4}$ , Zhiheng Yu $^{14}$ , Eterna Participants $^{1\S}$ , Rhiju Das $^{3,4,9*}$

RNA design has been hindered by the limited accuracy of three-dimensional (3D) structure prediction. In this study, we show that intricate RNA structures can be generated with current deep learning tools through accurate de novo design of pseudoknot secondary structures. In an Eterna competition involving 57 pseudoknots, generative artificial intelligence (AI) methods matched experienced human designers in solving most blind challenges, evaluated by single nucleotide-resolution chemical mapping, compensatory mutagenesis, and cryo-electron microscopy. AI-generated molecules with accurate secondary structures formed well-ordered 3D folds stabilized by noncanonical tertiary interactions not modeled during design. Success was guided by an RNet foundation model trained on prior chemical mapping data, suggesting that some difficult RNA design tasks may be tractable without first solving RNA 3D structure prediction.

Complex RNA structures underlie fundamental biological processes, including translation and viral replication as well as emerging biotechnologies and medicines. Building on pioneering efforts in design by human experts (1), recent years have seen steady improvements in the ability to design RNA structures ranging from mRNA vaccines (2) to ribozymes (3, 4) to elaborate RNA origami (5), but these efforts have remained limited to design of simple RNA secondary structures, redesign of previously known RNA structures, or the assembly of a limited repertoire of well-characterized tertiary motifs. Deep learning-based design has been successful in designing RNA molecules with structures related to previously characterized RNA but with highly distinct sequences (6–8). However, de novo design of previously unknown structures, although routine for proteins (9, 10), has not been achieved for RNA. Progress in RNA design has been limited by the poor accuracy of RNA secondary and tertiary structure prediction methods, particularly for synthetic molecules (11–13), for which sequences and structures of evolutionarily related molecules are unavailable.

Pseudoknots are complex secondary structures in which nucleotides in the loops of stems form base pairs with loops outside their stems (14). An increasing number of natural pseudoknots have been shown to function as ribozymes, riboswitches, and ribosomal frameshifting signals through the formation of complex three-dimensional (3D) topologies with well-defined stems (15, 16). However, new pseudoknots have only been automatically designed for a special class of

RNA origami molecules (5, 17) and have not been achieved with general tertiary motif assembly (18). In 2024, human participants of the OpenKnot challenges on Eterna (19) began to achieve accurate design of novel pseudoknots, as assessed and refined through experiments on millions of RNA molecules whose secondary structures were evaluated by their nucleotide-by-nucleotide reactivity to selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) (20–22). At the same time, de novo RNA design algorithms based on deep learning were proposed but remained experimentally untested in their application to previously unseen secondary and tertiary structures (23, 24). These developments motivated the extension of the OpenKnot challenge to explicitly compare the design performance of these new AI algorithms to experienced Eterna participants (tables S1 and S2).

Benchmarking AI design against experienced humans

Round 1 of the extended OpenKnot challenge invited six AI methods to submit designs for SHAPE experiments, in which single-stranded and conformationally flexible nucleotides are preferentially acylated at their 2'-hydroxyl groups and base-paired nucleotides are typically protected and exhibit low reactivity (Fig. 1, A to E). The 17 Round 1 secondary structures were drawn from 11 RNAs whose experimental 3D structures had been deposited in the Protein Databank (PDB) as well as six synthetic pseudoknots proposed by Eterna participants based on earlier partially successful attempts at design (tables S3 to S4 and fig. S1A). For several of the 11 PDB-derived targets, the natural sequences were known to form alternative states. For example, in the Round 1 target W03, a long stem in an RNA sensing cyclic diguanosine monophosphate in Clostridium acetobutylicum [c-di-GMP-II riboswitch (25)] appeared mostly unformed in the absence of the small-molecule ligand, as assessed by SHAPE (Fig. 1D). Therefore, even for cases with natural sequences, the challenge was to discover sequences that might stabilize the target pseudoknot for the RNA in solution without stabilizing partners. Up to 20 submissions were accepted from each AI method as well as from each Eterna participant; some methods that required input 3D backbones (table S2) were unable to make designs for the six targets without PDB structures. Designs throughout the OpenKnot challenge were probed in the absence of small-molecule ligands so that pseudoknot formation would reflect the design rather than ligand stabilization; subsequent SHAPE measurements with ligands supported this choice (fig. S2 and supplementary text).

We observed a wide range of performance, with many Eterna designs achieving experimental SHAPE profiles with the patterns of high and low reactivity matching the target profile of unpaired and paired nucleotides (Fig. 1, B and E). The agreement of each design's experimental SHAPE profile with its target secondary structure was quantified using the OpenKnot score, which computes the percentage of nucleotides whose SHAPE reactivity matches expectation (materials and methods); scores range from 0 to 100. A cluster of Eterna designs surpassed a cutoff of success of 90% (Fig. 1, F and G; fig. S3A; and data S1); this cutoff was set on the basis of the inherent experimental uncertainty in the measurements (19) and an error rate of $\sim$ 10% of SHAPE methods in assigning secondary structure in RNAs with known structures (26, 27). Eterna participants responsible for these high-scoring designs used a combination of in-game tools, intuition, and diverse design strategies (supplementary text). Most AI methods (Rosetta, Rosetta-LoRes, 3DRNA, gRNAde, MPNN-RFdiff; table S2) did not pass the score cutoff and underperformed Eterna participants in Round 1 (Fig. 1, E to H, and supplementary text). One exception was MPNN-fixbb, a message-passing neural network that designs sequences for a fixed-input backbone [analogous to ProteinMPNN (28, 29)], which improved on average over the W03 starting sequence (Fig. 1, C and G). Many of the top MPNN-fixbb designs, as well as some top-scoring Eterna designs, were quite different from the starting sequence (sequence identity $<50\%$ ; see Fig. 1F). In addition, all designs with $>90\%$ sequence identity to the starting sequence scored under $80\%$ , suggesting the importance of shifting away from the natural sequence.

B

G
|

H

J

AI
Fig. 1. Performance on 17 starting targets. (A to D) Target secondary structure for W03 (c-di-GMP-II riboswitch), with coloring by ideal SHAPE data (A) and experimental SHAPE data for top designs from (B) Eterna human participants, (C) MPNN-fixbb, and (D) wild-type RNA (natural c-di-GMP-II riboswitch aptamer). The red label in (D) marks the P3 stem where SHAPE reactivity indicates flexibility of the RNA backbone, inconsistent with the target structure. (E) SHAPE reactivity of sequences tested for target W03 in Round 1, demonstrating a wide range of agreement with the ideal target profile (top), as parameterized by the SHAPE-based OpenKnot score (bars, far right). (F) Designs with low (<50%) sequence identity to the starting sequence achieved good agreement with target SHAPE profile (OpenKnot score >90). (G to J) Performance summaries across design methods for [(G and I)] W03 OpenKnot scores and [(H and J)] percentage of targets W01 to W17 for which success (defined here as OpenKnot scores >90) was achieved. In (H) and (J), error bars reflect standard errors, and solid and light-colored bars show success rates over all 17 targets and only on targets on which designs were submitted, respectively. Performance increases were apparent from [(G and H)] Round 1 to [(I and J)] Round 2.

At the completion of Round 1, a neural network RNet, trained on chemical mapping of 1 million previous RNAs (21), was observed to give SHAPE profiles that gave simulated scores largely reproducing experimental scores, especially for poorly performing designs (fig. S4). This observation suggested that RNet modeling might allow for prospective filtering of designs. The 17 Round 1 targets were then posed again to all designers in a Round 2. Eterna designers—who were given access to RNet in the interactive interface—and AI design methods that were updated to take into account RNet (gRNAde, MPNN-RFdiff, MPNN-fixbb, and the new codesign-RFdiff; materials and methods) did notably better in this round, e.g., on the W03 c-di-GMP-II riboswitch target (Fig. 1I and fig. S3B). Over all 17 targets, all the tested AI methods and Eterna human participants were able to achieve scores above 90 on at least 80% of the targets that they designed (light colored bars, Fig. 1J), and there was no significant difference between methods. For both Rounds 1 and 2, an alternative Z-score-based assessment modeled on procedures used in the Critical Assessment of Structure Prediction (12, 13) gave similar rankings (fig. S5, A and B).

Generalization to previously unseen pseudoknot targets

The results above indicated that AI designers and Eterna participants could learn from explorations in prior designs to improve from

A

Fig. 2. Performance on 40 new target pseudoknots. (A and B) Designs with highest OpenKnot score for (A) P20 (Kissing Multiloops) and (B) P16 (AK_PK100-3) from Eterna and AI design methods (MPNN-fixbb and Struct2SeQ-SHAPE, respectively). The Struct2SeQ-SHAPE design in (B) is more consistent with an alternative secondary structure (see also figs. S6 and S7). (C) Performance summary across 20 targets of Round 3, with lengths up to 100 nt. (D and E) Designs with highest OpenKnot score for larger Round 4 targets (D) Q08 (Rous Sarcoma Virus) and (E) Q20 (SV_i) from Eterna and AI design methods (gRNAde and MPNN-RFdiff, respectively). (F) Performance summary across 20 targets of Round 4, with lengths between 117 and 240 nt; hatched bars mark methods whose submissions were characterized in an experiment that followed release of initial Round 4 results. In (A), (B), (D), and (E), secondary structures and coloring are for the target designs and experimental SHAPE profiles, respectively. In (C) and (F), solid-colored bars show rates of achieving OpenKnot score >90, after filtering designs for accurate RNet-predicted secondary structures; light-colored bars show rates without the secondary structure filter; and error bars reflect standard errors.

Round 1 to Round 2, on the same set of 17 targets. As a test of the generalization of the resulting methods, we carried out a Round 3 with 20 new pseudoknots as target secondary structures (Fig. 2, A to C; fig. S1C; and table S5). Compared with Rounds 1 and 2, fewer targets (5 versus 11) were drawn from RNAs with experimental 3D structures in the PDB, to mitigate any effects of training set memorization for the AI methods. An additional five target secondary structures were drawn from Pseudobase, an expert-curated database of natural pseudoknots (30). The remaining 10 were curated from secondary structures proposed by Eterna participants (materials and methods). As an additional test of generality, we posed 20 additional targets with longer lengths, up to 240 nucleotides (nts), drawn from similarly diverse sources, in a parallel Round 4 (Fig. 2, D to F; fig. S1C; and table S5). To enable all methods to make designs for targets that were not associated with PDB structures, modeled 3D structures were provided for targets missing experimental structures (materials and methods and table S5).

SHAPE characterization showed strong support for the performance of AI methods and Eterna participants. Each individual deep learning design method outperformed the starting sequences, whose OpenKnot scores were particularly low for the longer targets in Round 4. When grouped together, both AI methods and Eterna methods achieved OpenKnot scores of 90 in 19/20 targets in Round 3 (Fig. 2C) and in Round 4 (Fig. 2F; see also Fig. 2, C and D). Z-score analysis also supported these conclusions (fig. S5, C and D). Only one target was not designable with OpenKnot score >90 by any method or Eterna participant (P16, AK_PK100-3; Fig. 2B and supplementary text).

Besides the P16 target, successes included a wide variety of elaborate pseudoknots proposed by Eterna participants (e.g., Kissing Multiloops,

Fig. 2A, and SV_i, Fig. 2E) as well as a pseudoknot proposed for a natural RNA with unknown 3D structure (Rous Sarcoma Virus frameshift signal; Fig. 2D). The success of the design methods was particularly notable for the targets with long length in Round 4, for which the starting sequences were successful in only 4 of 20 targets (the starting sequence in Fig. 2F). The leading AI methods included a new variant of graph neural network gRNAde that did not take 3D input, as well as a method new to the challenge called Struct2SeQ, a deep Q reinforcement learning method that was trained and guided purely by the RNet model (3I) (table S2 and materials and methods). In both Rounds 3 and 4, the differences between the best method from the MPNN, gRNAde, and Struct2Seq were generally not significant ( $P > 0.05$ ; exact paired binomial test on discordant pairs, one-sided). The exception was Struct2SeQ-SHAPE, which significantly outperformed the other AI methods in Round 4; this method's designs were submitted after release of initial results, however, allowing additional development time (materials and methods).

Compensatory mutagenesis confirms designed base pairs

The results of Rounds 3 and 4 suggested that both experienced human designers as well as AI methods had improved to the point that they could design natural and non-natural pseudoknots without progressive refinement. However, the evaluation of these designs was based on a predetermined but arbitrary cutoff of 90 for the OpenKnot score and the assumption that SHAPE measurements accurately monitor base pairing status. Caveats for SHAPE interpretation have been described (26, 27, 32, 33), and it is possible that nucleotides whose protection from SHAPE appeared consistent with the target secondary structure were instead forming alternative pairings. To test this possibility, we brought to bear an independent approach based on comparative mutagenesis, called mutate-map-rescue readout by high throughput sequencing (M2R-seq) (33, 34), illustrated for a gRNAde design of P20 (Kissing Multiloops) from Round 3 in Fig. 3, A to F. If two nucleotides form a base pair in a putative RNA structure, mutation of either nucleotide should disrupt the pair and produce SHAPE perturbations near the site of mutation (Fig. 3, A to C; fig. S6 shows detailed data for representative designs); reactivity changes at the unmutated partner can also occur but are not always evident because the unmutated nucleotide may remain stacked or form alternative interactions (33, 35, 36). However, if the two nucleotides are mutated at the same time so as to flip the original base pair (e.g., C-G to G-C), the RNA's structure should be "rescued" and the SHAPE profile should return to that of the unmutated RNA (compare Fig. 3D to Fig. 3A, and bottom and top rows of Fig. 3E).

E

F

D

G

Fig. 3. Compensatory mutagenesis (mutate-map-rescue, M2R-seq) tests accuracy of individual base pairs. (A) SHAPE data for gRNAde design with highest OpenKnot Score for Round 3 target P20 (Kissing Multiloops), colored onto target pseudoknot secondary structure. (B to D) SHAPE profiles for single mutants (B) G38C and (C) C61G showed disruptions near sites of mutations (outlined circles) that were rescued in (D) the compensatory double mutant, which restored a G38-C61 base pair as a C38-G61 base pair. In (A) to (D), to aid visualization, depicted secondary structures are those modeled for the sequences by RNet-SS. (E) Same SHAPE profiles as in (A) to (D) stacked on each other to aid visual comparison of profile restoration upon compensatory mutagenesis. (F) Experimental rescue factor values for all target base pairs for the design in (A). Black rectangles in (E) and (F) outline bases 38 and 61 and 38-61 base pair mutated in (B) to (D). (G) Performance summaries across all design methods, based on the fraction of the 20 Round 3 targets in which M2R-seq verified the formation of at least 80% of target stems.

Fig. 4. Cryo-EM of AI-designed pseudoknotted RNA. (A) Secondary structure of Kissing Multiloops (target P20 in Round 3), colored by stem. (B) AlphaFold 3 3D-informed secondary structure and predicted model, colored by stem. (C to E) For the tested designs from (C) Struct2SeQ-SHAPE, (D) MPNN-fixbb, and (E) gRNAde, cryo-EM-derived secondary structures (top) show high accuracy in recovering the target pseudoknot secondary structure (A), while cryo-EM maps (unsharpened) and fitted coordinates, colored by stem, (bottom) highlight distinct 3D topologies from AlphaFold 3 prediction and noncanonical interactions [insets under (D) and (E)].

Figure 3F summarizes “rescue factors” (33) for every target base pair in this P20 design. The data showed strong evidence for each stem being formed (conversely, fig. S7 shows a negative example, target P16). M2R-seq data were acquired across all 20 Round 3 targets for the top design from Eterna and each AI method (more than 10,000 sequences, single and double mutants); and we evaluated stem-wise recovery [materials and methods and (32, 33)]. Across 17 of 20 targets, at least one design achieved 100% recovery of all target stems by our M2R-seq rescue-factor criterion. For 19 of 20 targets, there was at least one AI or Eterna design with at least 80% M2R-seq stem-wise recovery (data S1). With this criterion, AI methods were again competitive with Eterna (Fig. 3G; 90 and 75% designs successful, respectively; difference not significant). The differences between AI methods were not significant, except that each of the deep learning methods significantly outperformed Rosetta (P < 0.05; exact paired binomial test on discordant pairs, one-sided). Overall, the results from compensatory mutagenesis analysis supported the picture from the OpenKnot score analysis based on SHAPE data: Like experienced human RNA designers, AI methods were able to design complex pseudoknot secondary structures, including novel targets, with consistently high accuracy.

Cryo-EM reveals new 3D folds and noncanonical interactions

To learn whether these previously unseen pseudoknots might correspond to new 3D structures, we subjected several designs to cryo-electron microscopy (cryo-EM). Out of the non-natural secondary structures in Round 3, we prioritized designs for the Eterna-proposed target P20 (Kissing Multiloops; Fig. 2A; Fig. 3, A to F; and Fig. 4A) owing to the short lengths of single-stranded linkers, which we reasoned would restrict the RNA's 3D conformations sufficiently to enable their structural characterization through cryo-EM. Modeling in AlphaFold 3, trRosettaRNA, and other RNA 3D structure prediction algorithms also suggested that the P20 designs would form well-defined folds, although 3D modeling confidence was poor (Fig. 4B). To increase the visibility of the designs in cryo-EM micrographs and to break any pseudosymmetry that might preclude high-resolution refinement, we embedded the top P20 designs inside a recently developed circularly permuted group II intron scaffold (37).

Four designs (the starting sequence, Rosetta, Eterna, and Struct2SeQ) appeared aggregated or unfolded by size-exclusion chromatography during purification and were therefore not subjected to microscopy. These were also the designs that exhibited M2R-seq stem-wise recoveries $<80\%$ , suggesting that base-pairing stability was important for retaining folded samples. The remaining four were imaged successfully (Fig. 4, C to E; figs. S8 to S11; table S6; and movies S1 and S2). The MPNN-RFdiff design, which gave an M2R-seq stem-wise recovery of 80%, formed a dimer under conditions used for cryo-EM (materials and methods); all seven target stems were present but P4 base pairs were formed between molecules rather than within each molecule (figs. S8 to S11, movie S2, and supplementary text).

The other three designs, from Struct2Seq-SHAPE, MPNN-fixbb, and gRNAde, had M2R-seq stem-wise recoveries of 100%. All three resolved as monomers in cryo-EM, with map resolutions of 5.2, 4.8, and 3.6 Å, respectively, which improved after map masking and sharpening to 4.8, 4.0, and 2.9 Å, respectively. In all three maps, stems P1 to P7 and interconnecting linkers were clearly visible before sharpening (Fig. 4, C to E). These maps enabled the modeling of all coordinates, initially by unbiased manual tracing that was blind to the molecular sequence. The coordinate building confirmed that all designs formed all seven stems of the target secondary structure with high base-pair level accuracy ( $F_{1}=0.89$ , 0.95, and 0.95, respectively) and that the three folds were not homologous to prior RNA structures and did not match the AlphaFold 3 models. Detailed inspection of the two highest-resolution designs revealed additional noncanonical pairs, base triplets, and tertiary interactions (Fig. 4, D and E, insets), which did not appear to be explicitly designed by the AI methods (supplementary text).

RNA design without 3D structure prediction

Reliable de novo design of complex RNA pseudoknots is now achievable through deep learning. In the OpenKnot AI challenge, automatic AI methods became competitive with experienced human designers from Eterna in less than 1 year, with both kinds of approaches solving over 95% of 57 pseudoknot design targets, as tested by SHAPE mapping and compensatory rescue experiments involving \~50,000 sequences. Progress in the analogous problem of de novo protein design has been driven by the use of accurate computational methods for 3D protein structure prediction (9, 10, 38), but such tools remain unavailable for RNA (11–13). Instead of relying on 3D structure prediction tools, the MPNN, gRNAde, and Struct2Seq frameworks here leveraged a model RNet trained on prior Eterna chemical mapping data that were mainly sensitive to secondary structure. Aside from this shared use of RNet, these three AI frameworks used different variants of deep learning (table S2), and our results were unable to discriminate with statistical confidence which of these AI methods was better than others. Instead, these three frameworks may be best deployed in combination because sequence-space analysis shows that AI methods sample tight, mutually disjoint regions, providing complementary coverage of design space (fig. S14). Further experimental tests of these and other emerging methods (7, 39–41) will be needed to clarify which frameworks will be most appropriate for these and future RNA design tasks.

The AI-generated molecules probed here by cryo-EM displayed intricate noncanonical tertiary interactions, which are critical for sophisticated functions in natural RNA molecules (42–44) but were not predicted a priori. Predictive modeling and design of such high-resolution details will be important for designing RNA catalysts and aptamers and therefore remains an important challenge. Nevertheless, the appearance of noncanonical interactions without explicit design suggests that other problems, such as redesign of machines like the ribosome and RNA polymerase ribozymes (45, 46) or discovery of nonredundant folds to augment RNA structure databases (47), might be immediately accelerated through computational design guided by accurate secondary structure prediction, without also requiring high accuracy in prospectively modeling 3D interactions in atomic detail.

REFERENCES AND NOTES

1. L. Jaeger, A. Chworos, Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 531–543 (2006).

2. H. Zhang et al., Nature 621, 396–403 (2023).

3. R. Yamagami, M. Kayedkhordeh, D. H. Mathews, P. C. Bevilacqua, Nucleic Acids Res. 47, 29–42 (2019).

4. D. Szokoli, N. E. Nwosu, L. M. Glatt, H. Mutschler, Chembiochem 26, e202500356 (2025).

5. C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen, Nat. Chem. 13, 549–558 (2021).

6. S. Sumi, M. Hamada, H. Saito, Nat. Methods 21, 435–443 (2024).

7. F. Wong et al., Nat. Comput. Sci. 4, 829–839 (2024).

8. A. T. Merchant, S. H. King, E. Nguyen, B. L. Hie, Nature 649, 1–10 (2025).

9. D. Listov, C. A. Goverde, B. E. Correia, S. J. Fleishman, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 25, 639–653 (2024).

10. C. Armer et al., Proteins 93, 2005–2014 (2025).

11. W. Wang et al., Nat. Commun. 14, 7266 (2023).

12. R. Das et al., Proteins 91, 1747–1770 (2023).

13. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 192–217 (2026).

14. E. Westhof, L. Jaeger, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 327–333 (1992).

15. J. Aruda, S. L. Grote, S. Rouskin, Curr. Opin. Struct. Biol. 88, 102912 (2024).

16. Y. Chen et al., Nat. Chem. Biol. 17, 601–607 (2021).

17. E. K. S. McRae et al., Nat. Nanotechnol. 18, 808–817 (2023).

18. J. D. Yesselman et al., Nat. Nanotechnol. 14, 866–873 (2019).

19. J. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 2122–2127 (2014).

20. T. Marinus, A. B. Fessler, C. A. Ogle, D. Incarnato, Nucleic Acids Res. 49, e34 (2021).

21. S. He et al., Ribonanza: deep learning of RNA structure through dual crowdsourcing, bioRxiv 2024.02.24.581671 [Preprint] (2024). https://doi.org/10.1101/2024.02.24.581671.

22. K. E. Deigan, T. W. Li, D. H. Mathews, K. M. Weeks, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 97–102 (2009).

23. C. K. Joshi et al., gRNAde: Geometric Deep Learning for 3D RNA inverse design (2024); https://openreview.net/forum?id=lvw3UgeVxS.

24. A. Favor et al., De novo design of RNA and nucleoprotein complexes, bioRxiv 2025.10.01.679929 [Preprint] (2025). https://doi.org/10.1101/2025.10.01.679929.

25. K. D. Smith, C. A. Shanahan, E. L. Moore, A. C. Simon, S. A. Strobel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7757–7762 (2011).

26. C. W. Leonard et al., Biochemistry 52, 588–595 (2013).

27. W. Kladwang, C. C. VanLang, P. Cordero, R. Das, Biochemistry 50, 8049–8056 (2011).

28. A. Kubaney et al., RNA sequence design and protein-DNA specificity prediction with NA-MPNN, bioRxiv 2025.10.03.679414 [Preprint] (2025). https://doi.org/10.1101/2025.10.03.679414.

29. J. Dauparas et al., Science 378, 49–56 (2022).

30. F. H. van Batenburg, A. P. Gultyaev, C. W. Pleij, J. Ng, J. Oliehoek, Nucleic Acids Res. 28, 201–204 (2000).

31. S. He, Q. Sun, Struct2SeQ: RNA inverse folding with Deep Q-Learning. bioRxiv 2026.01.16.700031 [Preprint]. (2026). https://doi.org/10.64898/2026.01.16.700031.

32. E. B. Arnold et al., Nucleic Acids Res. 53, gkaf290 (2025).

33. S. Tian, P. Cordero, W. Kladwang, R. Das, RNA 20, 1815–1826 (2014).

34. S. Tian, W. Kladwang, R. Das, eLife 7, e29602 (2018).

35. W. Kladwang, C. C. VanLang, P. Cordero, R. Das, Nat. Chem. 3, 954–962 (2011).

36. W. Kladwang, P. Cordero, R. Das, RNA 17, 522–534 (2011).

37. D. B. Haack et al., Nat. Commun. 16, 880 (2025).

38. B. Kuhlman et al., Science 302, 1364–1368 (2003).

39. R. Anand et al., arXiv [q-bio.BM] (2025).

40. N. S. C. Merleau, M. Smerlak, BMC Bioinformatics 23, 335 (2022).

41. S. Najeh, K. Zandi, N. Kharma, J. Perreault, RNA 29, 764–776 (2023).

42. Q. Vicens, J. S. Kieft, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119, e2112677119 (2022).

43. R. C. Kretsch et al., Proteins 94, 51–78 (2026).

44. J. H. Cate et al., Science 273, 1678–1685 (1996).

45. Y. Shulgina et al., Nat. Commun. 15, 10627 (2024).

46. C. K. Joshi et al., Generative inverse design of RNA structure and function with gRNAde. bioRxiv 2025.11.29.691298 [Preprint] (2025). https://doi.org/10.1101/2025.11.29.691298.

47. W. Wang, B. Su, Z. Peng, J. Yang, Nat. Biotechnol. 44, 205–214 (2026).

48. R. Das, eternagame/OpenKnotAIDesignData: v4.5.2 — M2 Single-Mutant SHAPE Data, Zenodo, (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20101887.

49. A. Favor, OpenKnot RNA Pseudoknots – RFDpoly 3D Structures, version v1, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.18666308.

50. J. Townley et al., OpenKnotAI: Code for RNA library design, SHAPE data processing, OpenKnot scoring, and RNA design methods, version v1, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20649966.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank C. Geary (Heidelberg) for advice on design targets, J. Nicol (Eterna) for advice on padding designs for chemical mapping, R. C. Kretsch (Stanford) for advice on target selection for cryo-EM, A. Espeleta for assisting development of 3DRNA, J. Shendure (U. Washington) and lab for sharing primer sequences for library preparation, G. Meissner (Janelia) for project coordination, the AI@HHMI initiative for support, and Nvidia DGX Cloud and NSF NAIRR Pilot (allocation NAIRR240281) for engineering support for Struct2SeQ in Round 4. Claude was used during preparation of the revised manuscript for editorial assistance with text and figure captions and with computational analyses supporting figs. S2, S6, and S14; all AI-assisted output was reviewed and verified by the authors. Funding: This work was supported by NIH grant R35GM122579 (R.D.), NIH grant R35GM141706 (N.T.), NIH grant R01AI165433 (S.H.), NIH grant R01GM147893 (P.-S.H.), NIH grant U19AI181881 (A.K.), the Howard Hughes Medical Institute (R.D., D.B.), NSF grant 2330652 (R.D.), NSF grant 255097 (N.T.), the W. M. Keck Foundation (N.T.), the A*STAR Singapore National Science Scholarship (C.K.J.), the Qualcomm Innovation Fellowship (C.K.J.), a University of Cambridge Dawn HPC Pioneer Project grant (C.K.J.), a Texas A&M X grant (S.H.), and the Merck Research Laboratories (MRL) Scientific Engagement and Emerging Discovery Science (SEEDS) Program (P.-S.H.). Author contributions: J.T., E.F., and R.D. designed Eterna OpenKnot targets, and J.T., J.R., and T.K. coordinated target deployment, design collection, and scoring on Eterna. C.K.J., P.L., A.F., A.K., G.E.N., S.H., D.B., P.-S.H., C.A.C., and Eterna Participants submitted sequences. W.K., H.M.B., V.W., R.H., J.V., and R.D. designed, collected, and analyzed SHAPE experiments. D.B.H., J.H., B.R., N.T., N.S., A.M., and Z.Y. designed and carried out cryo-EM measurements and modeling. R.D. drafted the manuscript with input from all authors. All authors other than J.T., W.K., Eterna Participants, and R.D. are listed in the byline alphabetically. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials availability: SHAPE profiles and modeled 3D structures for Rounds 1-4, M2, and M2R experiments are publicly available (48,49) and at the RNA Mapping Database (https://rmdb.stanford.edu) under the following accession IDs: OK45LIB_2A3_0000 (Round 1), OK6LIB_2A3_0000 (Round 2), OK7ALIB_2A3_0000 (Round 3), and OK7BLIB_2A3_0000 and OK7BLIB_2A3_0001 (Round 4). Cryo-EM structures for designs of P20 (Kissing Multiloops) are available in the PDB under accession IDs 10ZT (gRNAde design, Mol9), 10ZU (MPNN-fixbb design, Mol14), 11EH (Struct2Seq-SHAPE, Mol13), and 11AG (MPNN-RFdiff dimer, Mol11). Cryo-EM maps are available at EMDB under accession IDs EMD-75574 (gRNAde design, Mol9), EMD-75575 (MPNN-fixbb design, Mol14), EMD-75648 (Struct2Seq-SHAPE, Mol13), and EMD-75584 (MPNN-RFdiff dimer, Mol11). Cryo-EM images are available at EMPIAR under accession IDs EMPIAR-13759 (gRNAde design, Mol9), EMPIAR-13762 (MPNN-fixbb design, Mol14), EMPIAR-13765 (Struct2Seq-SHAPE, Mol13), and EMPIAR-13766 (MPNN-RFdiff dimer, Mol11). Codes are available at (50). Materials are available upon request. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse. This article is subject to HHMI's Open Access to Publications policy. HHMI lab heads have previously granted a nonexclusive CC BY 4.0 license to the public and a sublicensable license to HHMI in their research articles. Pursuant to those licenses, the Author Accepted Manuscript (AAM) of this article can be made freely available under a CC BY 4.0 license immediately upon publication.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aeg6829 Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S14; Tables S1 to S8; References (51–58); Movies S1 and S2; Data S1; MDAR Reproducibility Checklist

Submitted 23 February 2026; accepted 30 June 2026

2D SEMICONDUCTORS

Direct evaporation of single-crystal metal contacts for 2D semiconductors

Ying Zhang $^{1,2\dagger}$ , Chang Liu $^{1,3†}$ , Huiting Wang $^{1,2}$ , Guichen Teng $^{1,2}$ , Yilu Qin $^{4}$ , Wencheng Niu $^{3}$ , Shuimei Ding $^{3}$ , Binmin Wu $^{1}$ , Shuaiqin Wu $^{1,2}$ , Yan Chen $^{4}$ , Ni Yang $^{5}$ , Tie Lin $^{1,2,6}$ , Hong Shen $^{1,2,6}$ , Xiangjian Meng $^{1,2,6}$ , Yuan Liu $^{3}$ , Xuming Zou $^{3}$ , Xudong Wang $^{1,2,6}$ , Lei Liao $^{3}$ , Junhao Chu $^{1,2,4}$ , Lain-Jong Li $^{5}$ , Jianlu Wang $^{1,4,7*}$

Metal contacts remain one of the key bottlenecks in two-dimensional (2D) semiconductor electronics. We developed an atomic-scale step-by-step evaporation method to directly grow single-crystal metals on monolayer semiconductors with clean interfaces. This method accesses a distinct growth-kinetic window that suppresses secondary nucleation and promotes lateral coalescence, enabling van der Waals epitaxy of diverse metals—including bismuth, silver, indium, gold, and palladium—on molybdenum disulfide (MoS $_2$ ) and tungsten diselenide (WSe $_2$ ). The single-crystal metals support ultrathin conduction, provide spatially uniform work functions, and exhibit improved thermal robustness. As contacts, they show minimal Fermi-level pinning, approaching the Schottky–Mott limit. With bismuth and palladium contacts, monolayer MoS $_2$ and WSe $_2$ transistors achieved ultralow n- and p-type contact resistances of 36 and 145 ohm-micrometers, respectively, and short-channel currents both above 1.1 milliampere per micrometer.

Two-dimensional (2D) semiconductors are widely recognized as promising channel materials for extending transistor scaling beyond the limits of silicon, owing to their atomically thin bodies and excellent electrostatics for extreme device miniaturization $(1-5)$ . Yet their practical adoption is limited by the absence of a scalable and reliable contact technology. At conventional metal-2D interfaces, strong Fermi-level pinning (FLP) produces large Schottky barriers and high contact resistance $(6-14)$ . Transferred-metal contacts can mitigate FLP by avoiding deposition-induced damage $(11, 15-19)$ , but the resulting van der Waals (vdW) gap introduces a tunneling barrier that prevents low-resistance interfaces. Semimetal contacts such as bismuth (Bi) and antimony (Sb) have achieved record-low n-type resistances by suppressing metal-induced gap states $(12, 20)$ , but their poor thermal stability retards their integration into complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) processes. Atomic-layer bonding approaches—for example, gold-molybdenum-sulfur (Au-Mo-S) interface reconstruction—offer improved thermal robustness $(21)$ yet involve substantial process complexity, and their suitability for p-type contacts remains unverified. Meanwhile, scalable p-type contact solutions continue to lag behind $(5, 22-24)$ . Thus, developing a scalable, low-resistance, CMOS-compatible contact technology remains a central challenge for 2D electronics.

In principle, directly forming single-crystal metals (sc-metals) on 2D semiconductors provides a viable route to overcoming these contact limitations. Single-crystal metals—without grain boundaries, defect sites, and uncontrolled surface states inherent to polycrystalline films—exhibit cleaner interfaces, well-defined electronic structures, and spatially uniform work functions, which makes them a promising platform for low-resistance contacts. Their ordered structures could further support ultrathin yet conductive metal electrodes and potentially improve thermal stability. However, progress in sc-metal contacts has been limited because existing crystal-growth strategies are largely derived from epitaxy on bulk 3D substrates, in which lattice matching dictates nucleation and orientation (25–29). These principles are not easily workable on 2D semiconductors because the weak surfaces of 2D semiconductors are easily damaged by high-energy metal deposition, whereas their dangling bond-free nature provides limited lattice-registry guidance for crystal growth (10, 15). Therefore, there is an urgent need to develop new growth mechanisms and strategies for a simple, CMOS-compatible approach to prepare sc-metals on 2D semiconductors.

In this work, we report the direct, in situ growth of sc-metals on monolayer 2D semiconductors by using a step-by-step evaporation method. This stepwise evaporation process (Step-Eva), consisting of an atomic-scale deposition dose followed by a long stabilization pause, suppresses disordered secondary nucleation and growth, promotes lateral domain coalescence, and thereby creates a distinct kinetic window for vdW epitaxy. This method is broadly applicable to the growth of diverse sc-metals—including Bi, silver (Ag), indium (In), Au, and palladium (Pd)—on different 2D semiconductors—including molybdenum disulfide (MoS $_2$ ) and tungsten diselenide (WSe $_2$ )—while preserving clean and low-damage metal-semiconductor (M-S) interfaces. The resulting sc-metals support ultrathin conduction, provide well-defined and spatially uniform work functions, and show enhanced thermal stability. As contacts to 2D semiconductors, these sc-metals exhibit strongly suppressed FLP and closely follow Schottky–Mott behavior. The combination of clean, low-damage M-S interfaces, suppressed FLP, and spatially uniform metal work functions leads to substantially improved contact performance. MoS $_2$ transistors with sc-Bi contacts achieved a negligible Schottky barrier, an n-type contact resistance of 36 ohm·μm, a high on/off ratio above $10^{10}$ , and a short-channel current of 1.3 mA μm $^{-1}$ . WSe $_2$ transistors with sc-Pd contacts achieved a p-type contact resistance of 145 ohm·μm, a high on/off ratio above $10^{10}$ , and a short-channel current of 1.1 mA μm $^{-1}$ .

Atomic-scale stepwise evaporation

Typically, metal evaporation on 2D materials is performed continuously until the desired film thickness is reached. However, this continuous evaporation method (Cont-Eva) continuously increases the metal vapor flux in the chamber, causing heat buildup and raising both temperature and pressure (Fig. 1A and fig. S1A). The unstable chamber environment and high atomic flux hinder stable nucleation and migration, leading to polycrystalline or nanocrystalline growth with numerous small grains, boundaries, and defects (Fig. 1B) (30). Additionally, the continuous bombardment of high-energy evaporated atoms introduces substantial energy and local heat accumulation, which damages the 2D lattice, resulting in a disordered M-S interface (10, 15). We used plan-view scanning transmission electron microscopy (STEM) to track the deposition process of Cont-Eva Bi. From 2 to $20\mathrm{nm}$ , the metal consistently exhibited disordered nucleation, secondary nucleation, uncontrolled lateral growth, and random crystallographic orientations (Fig. 1C). Selected-area electron diffraction (SAED) further confirmed the polycrystalline nature of the deposited metal (Fig. 1D).

A

B

C
E

F

D

G

|
J

K

Fig. 1. Atomic-scale stepwise evaporation. (A) Schematic showing thickness evolution and temperature and pressure fluctuations during Cont-Eva. (B) Schematic of Cont-Eva metal growth on monolayer 2D semiconductors, where continuous thermal shocks and heat accumulation damage the 2D lattice, resulting in pc-metals and disordered interfaces. (C) Plan-view STEM images of Cont-Eva Bi showing the dynamic growth evolution from 2 to $20\mathrm{nm}$ , with disordered nucleation, secondary nucleation, grains, and gaps. (D) SAED pattern of Cont-Eva Bi showing polycrystalline growth. (E) Schematic showing thickness evolution and temperature and pressure relaxation during Step-Eva. (F) Schematic of Step-Eva metal growth on monolayer 2D semiconductors. The atomic-scale deposition steps with pauses promote vdW epitaxy, lateral coalescence, and long-range order. (G) Plan-view STEM images of Step-Eva Bi showing the dynamic growth evolution from 2 to $20\mathrm{nm}$ , with more uniform nucleation, lateral epitaxial growth, and continuous film formation. (H) SAED pattern of Step-Eva Bi confirming single-crystal growth. (I) Kinetic Monte Carlo (KMC) simulations showing the coverage evolution of Cont-Eva and Step-Eva Bi during 4-nm deposition. (J) Extracted nucleation density and (K) diffusion length as functions of thickness from the KMC simulations. $P$ , pressure; $T$ , temperature; Sec. nuc., secondary nucleation.

To overcome these limitations, we developed a Step-Eva method that combines atomic-scale deposition doses of 0.5 nm per step with stabilization pauses of 5 min, guided by the kinetic principles of vdW epitaxy (Fig. 1, E and F, and fig. S1B). This method provides three key advantages. First, the step-by-step evaporation stabilizes the chamber pressure and temperature, providing a steady baseline environment for metal growth. Second, the atomic-scale step thickness and long pause time enable more precise control over nucleation, adatom diffusion, and domain coalescence, suppressing disordered grain formation and promoting vdW epitaxy. Third, the discrete evaporation-relaxation cycles minimize heat accumulation and lattice damage, enabling clean and low-damage M-S interfaces. Atomic force microscopy (AFM) measurements first confirmed that

Step-Eva offers clear advantages over Cont-Eva in precisely controlling film thickness and maintaining surface flatness (figs. S2 and S3). Plan-view STEM images showed that Step-Eva Bi exhibited more uniform nucleation and enhanced lateral epitaxial growth compared with those of Cont-Eva (Fig. 1G). At 7 nm, the domains had already fully coalesced without the formation of disordered grains. The SAED pattern shows sharp diffraction spots with a well-defined Bi–MoS ${2}$ orientation relationship, further confirming the single-crystalline nature of Step-Eva Bi and its vdW epitaxial registry with the MoS ${2}$ lattice (Fig. 1H). Large-area and high-resolution atomic images further verified the formation of single-crystal Bi (fig. S4). Ultralarge-area plan-view STEM images further demonstrated the advantages of Step-Eva over a broad spatial scale (fig. S5). Moreover, we found that Step-Eva substantially improved the crystallinity of Bi even on amorphous SiO $_{2}$ .

We further investigated the growth mechanism of Step-Eva using kinetic Monte Carlo simulations (fig. S6). For 4-nm-thick Bi deposition, Step-Eva produced a uniform and flat morphology both during and after deposition (fig. S7A). Compared with Cont-Eva, Step-Eva yielded a much greater surface coverage of $\sim 0.9$ , approaching full coverage and consistent with our experimental observations. The surface coverage continued to increase during the pause periods (Fig. II), whereas the surface roughness continued to decrease (fig. S7B). These trends suggest that adatoms can continue to migrate laterally during the pauses, which helped suppress secondary nucleation and accelerate domain coalescence. Moreover, the simulations further showed that Step-Eva yielded a lower nucleation density and a longer diffusion length than those of Cont-Eva (Fig. 1, J and K), both of which are beneficial for single-crystal growth. Although these two parameters are primarily determined by metal-substrate interactions, Step-Eva effectively modulated them during growth. This kinetic advantage became more pronounced as the film thickness increased, indicating that Step-Eva regulated the growth kinetics throughout the deposition process. These simulation-derived quantities should be presented as mechanistic support rather than direct experimental proof of nucleation density and adatom diffusion length.

Mechanistically, Step-Eva provided a distinct kinetic window for vdW epitaxy by reducing secondary nucleation, promoting effective adatom diffusion, accelerating domain coalescence, and suppressing disordered grain formation, which enabled the formation of single-crystal films. The selected step thickness of 0.5 nm and pause time of 5 min were result-oriented parameters for Step-Eva rather than the only conditions for single-crystal growth. Further experiments showed that single-crystal formation for Bi was maintained within a process window of <0.6 nm per step and >3 min pause time (fig. S8); outside this window, high-quality growth became difficult to achieve. Also, the actual film quality may vary slightly depending on the deposition platform and operational control (fig. S9); nevertheless, the overall improvement achieved with Step-Eva remains substantial. In addition, a clean 2D surface is also critical for achieving high-quality growth.

sc-metal contacts on 2D semiconductors

To better visualize the morphologies of metals prepared with Step-Eva, we performed atomic-resolution cross-sectional STEM and imaging analyses. For Cont-Eva Bi (Fig. 2A), the metal consisted of small grains and amorphous particles with numerous defects and grain boundaries, resulting in a disordered polycrystalline metal (pc-metal). Severe issues—including amorphization, breakage, diffusion, and gaps—were also observed within MoS $_{2}$ .

By contrast, Step-Eva effectively avoided these issues, producing long-range ordered metals while preserving an intact $MoS_{2}$ lattice. The Bi atoms were precisely aligned in close contact with $MoS_{2}$ , forming a highly ordered interface (Fig. 2B, I and II). Additional bright- and dark-field atomic images confirmed the formation of sc-metals and clean interfaces (fig. S10, A to C). Selected-area fast Fourier transform (FFT) patterns extracted from sc-Bi confirmed its crystallinity and crystal planes, with Bi growing along the [0001] direction, which is consistent with the plan-view SAED analysis (Fig. 2B, III). Large-scale atomic images in both vertical and horizontal directions demonstrated the uniform growth of sc-Bi on MoS $_2$ (Fig. 2B, IV and V). Large-scale atomic images and FFT patterns further verified the structural perfection of the single crystal (fig. S10D).

At the fractured edge of monolayer $MoS_{2}$ , sc-Bi grew seamlessly onto the adjacent $SiO_{2}$ substrate while maintaining the same atomic arrangement as on $MoS_{2}$ (Fig. 2C). This result indicates that metal epitaxy could extend from $MoS_{2}$ to amorphous $SiO_{2}$ , highlighting the robustness of the Step-Eva epitaxial growth. This feature may enable well-defined edge contacts for 2D semiconductors and also provide insights into the growth of 2D metals (31). Large-area electron backscatter diffraction (EBSD) mapping of Bi grown on chemical vapor deposition (CVD) monolayer $MoS_{2}$ further revealed its single-crystal

sc-Bi via Step-Eva
A

B

C

D

E

G

Fig. 2. Characterization and analysis. (A) Atomic-resolution images of polycrystalline Bi (pc-Bi) by means of Cont-Eva and contact interfaces (I to IV), where the metal exhibits numerous grain boundaries and defects, causing damage to MoS₂. Scale bars, 5 nm (I and III) and 10 nm (II and IV). (B) Atomic-resolution images of the single-crystal Bi (sc-Bi)–MoS₂ interface (I and II), showing single-crystal characteristics and atomically clean interfaces. Local FFT pattern (III) confirms the single-crystal nature of Bi, with a [0001] growth direction normal to the substrate. Large-area atomic-resolution images (IV and V) demonstrate sc-Bi growth in both vertical and horizontal dimensions. Scale bars, 2 nm (I and II) and 5 nm (IV and V). (C) Atomic-resolution imaging at a fractured MoS₂ region shows Bi growing epitaxially from the edge of MoS₂ onto SiO₂. Scale bar, 2 nm. (D) EBSD characterization of sc-Bi on MoS₂. (I) Optical image of CVD-grown monolayer MoS₂ on SiO₂. (II) Inverse pole figure (IPF)–EBSD map of sc-Bi indicating a highly uniform [0001] orientation across the entire region. Scale bars, 50 μm (I) and 20 μm (II). (E) Large-scale STEM images of 8-nm Bi films. Scale bar, 50 nm. (F) Electrical measurements of 8-nm Bi films on MoS₂ fabricated with the two methods. The Step-Eva sc-Bi film was highly conductive, whereas the Cont-Eva pc-Bi film showed no obvious metallic conduction. (Inset) Schematic of the device structure. (G) XRD analyses of 8-nm Step-Eva Bi films.

nature and highly uniform [0001] orientation over a large scale (Fig. 2D). We further investigated the thickness-dependent evolution of the crystal domains using Step-Eva Bi films with different thicknesses, which maintained the same crystallographic orientation, and at 50 nm, the average domain size reached $\sim31.8\ \mu m$ (fig. S11, A and B). The results indicate that Step-Eva enables stable vdW epitaxy without disordered grains as the thickness increases. In addition, we confirmed that single-crystal growth was independent of the 2D material thickness (fig. S11, C and D). One immediate advantage of sc-metals is dimensional scaling, including thickness reduction for 3D integration and width reduction for reducing contacted poly pitch. Reducing metal dimensions is challenging in pc-metals, in which the grain size and arrangement cannot be controlled. For thickness reduction, we prepared pc- and sc-metals on monolayer $MoS_{2}$ using the two evaporation methods, with thicknesses down to 8 nm. The sc-Bi film retained an ultraflat and uniform morphology over a large area, whereas the pc-Bi film became discontinuous because of disordered grains (Fig. 2E). Despite its ultrathin thickness, the 8-nm sc-Bi film carried a current density as high as $\sim4\ mA\ \mu m^{-1}$ , whereas the pc-Bi film showed no obvious metallic conduction and exhibited only the underlying $MoS_{2}$ channel current (Fig. 2F). To evaluate width reduction, we fabricated corresponding $MoS_{2}$ transistor devices with a reduced metal width of 50 nm (fig. S12). The device showed no substantial degradation in performance compared with devices that use conventional 500-nm-wide electrodes. In addition, XRD of the sc-Bi film showed three distinct single-crystal peaks at (0003), (0006), and (0009), which is consistent with our STEM results and previous studies (Fig. 2G) (32–34).

Generality, work functions, and Schottky–Mott behavior

Using atomic-resolution imaging, we further showed that sc-Ag, sc-In, sc-Au, and sc-Pd grew well on monolayer $MoS_{2}$ with clean interfaces (Fig. 3A). Extensive atomic-resolution images, additional diffraction patterns, and elemental analyses for each metal (figs. S13 to S16), together with EBSD mapping (fig. S17), further confirmed this conclusion. The Step-Eva method was also compatible with other 2D materials, such as monolayer $WSe_{2}$ (fig. S18). In principle, this method could be extended to a wide range of metals and 2D materials. However, the early-stage growth behavior varied slightly among different metals, as shown by our detailed study of Au epitaxial growth (fig. S19). For such high-melting-point metals, lateral growth was weaker and island-like growth was more pronounced at the early stage, mainly because of the balance between metal cohesive energy and adsorption energy. Despite these differences in early-stage growth, the kinetic modulation enabled by Step-Eva remained effective in suppressing secondary nucleation and promoting lateral coalescence. The local FFT analysis further showed that early-stage metal islands, such as Au islands, still retained a consistent single-crystalline nature and epitaxial orientation with respect to the underlying $MoS_{2}$ lattice (fig. S20). In addition, the Step-Eva process parameters, particularly the pause time, may vary depending on the metal species and the specific evaporation system. For example, for Au, high-quality growth was maintained within a process window of <0.6 nm per step and >5 min pause time (fig. S21). Despite these variations, the conditions used in this study, namely 0.5 nm per step and a 5-min pause time, fell within the applicable process window for most of the metals examined here and therefore served as generally applicable parameters in this study. Regarding the metal growth orientation, because the single crystals prepared by Step-Eva followed a vdW epitaxy mechanism, their growth obeyed thermodynamic principles and preferentially occurred along the lowest-energy planes regardless of the substrate: Bi grew along the (0001) plane, whereas In,

A
B

C

D

E

Fig. 3. Generality, work functions and Schottky–Mott behavior. (A) Atomic-resolution images of other sc-metals—including sc-Ag, sc-In, sc-Au, and sc-Pd—on monolayer MoS ${2}$ . All metals exhibited long-range ordered structures and atomically clean interfaces. Scale bars, 1 nm (I and IV) and 2 nm (II and III). (B) Statistical comparison of the work functions of the metals (In, Bi, Ag, Au, and Pd) prepared by means of Step-Eva and Cont-Eva, in which sc-metals prepared with Step-Eva exhibited stable work functions close to those of their bulk single-crystal counterparts, and pc-metals prepared with Cont-Eva exhibited large dispersion and instability. Error bars indicate the standard deviation from three independent measurements, and data points indicate mean values. (C) KPFM potential maps of sc-Bi and pc-Bi films on MoS ${2}$ , showing a more uniform surface potential distribution for the sc-Bi contact than for the pc-Bi contact. (D) I ${DS}$ -V ${GS}$ curves of MoS $_{2}$ transistors with sc-Ag and sc-Pd contacts at various temperatures, in which n- and p-type transfer characteristics were achieved through low- and high-work-function sc-metals. (E) Extracted Schottky barrier heights as a function of the work functions of sc-metals. The extracted Schottky barrier heights vary linearly with the work functions of various sc-metal contacts, yielding a pinning factor of S = 0.92. Error bars indicate the standard deviation from five independent measurements, and data points indicate mean values.

Ag, Au, and Pd grew along the (111) plane. In addition, we also investigated the minimum conductive thickness of different ultrathin sc-metals (fig. S22). All examined sc-metals remained conductive below 10 nm, and Bi and Pd were conductive even at 3 nm, suggesting the potential of Step-Eva for fabricating ultrathin electrodes in future process design and practical applications.

Another important advantage of these sc-metals is their well-defined and stable work functions, which arise from their uniform crystal orientations and clean surface states. For example, Step-Eva sc-Bi exhibited a work function of 3.98 eV, which is consistent with its bulk single-crystal value, whereas Cont-Eva pc-Bi showed a higher work function of 4.13 eV with a large dispersion of 0.1 to 0.2 eV (fig. S23). We extracted the mean work function values and standard deviations for the two methods from three independent measurements, confirming that Step-Eva sc-metals consistently exhibited well-defined and stable work functions (Fig. 3B). In addition, these sc-metals effectively suppressed local potential fluctuations and work-function inhomogeneity, as revealed by the spatially resolved Kelvin probe force microscopy (KPFM) measurements of Bi (Fig. 3C and fig. S24, A and B). Similar improvement was also observed for Au (fig. S24C). The stable and spatially uniform work functions make sc-metal contacts more advantageous and reliable.

Building on the above advantages, it is worth further evaluating the Schottky–Mott behavior of sc-metal contacts, which is important for pushing the limits of contact performance. By using sc-metals with different work functions to contact $MoS_{2}$ , we realized controllable switching between n-type and p-type transport characteristics in intrinsic $MoS_{2}$ channel transistors. Here, the low-work-function metals [such as In, Ag, and copper (Cu)] led to n-type characteristics, and high-work-function metals (such as Au and Pd) led to p-type characteristics (Fig. 3D and fig. S25). The extracted Schottky barriers for different metals showed a high linear correlation with the work functions (Fig. 3E). The fitted pinning factor was 0.92, indicating pronounced Schottky–Mott behavior, which was previously thought to be attainable mainly with transferred metal electrodes (15). Interface analysis of the sc-metal–2D semiconductor contacts revealed that the interfaces fall within the weakly coupled vdW-type contact regime, with intermediate interfacial distances (fig. S26). Such interfaces provide sufficient electronic coupling for efficient carrier injection while suppressing the strong hybridization responsible for FLP, enabling Schottky-Mott behavior.

Low-resistance n- and p-type contacts to 2D semiconductors

The single-crystal metal–2D semiconductor contacts—with clean, low-damage vdW interfaces and well-defined, spatially uniform metal work functions—are expected to improve contact performance. We comprehensively evaluated sc-metals for n- and p-type 2D contacts. For n-type contacts, monolayer MoS ${2}$ transistors with sc-Bi contacts showed an ultrahigh on/off ratio of $>10^{10}$ in the transfer characteristics ( $I{DS}-V_{GS}$ ) (Fig. 4A), which was approximately two orders of magnitude higher than that of pc-Bi devices. The devices also exhibited highly linear output characteristics ( $I_{DS}-V_{DS}$ ) (Fig. 4B). Temperature-dependent measurements and analysis revealed a clear metal-insulator transition behavior and a near-zero Schottky barrier ( $\Phi_{B}$ ) (fig. S27, A and B). We further used the transmission line method (TLM) to extract the contact resistance ( $R_{C}$ ) (fig. S27, C and D). The $2R_{C}$ value was as low as 72 ohm·μm at a carrier density of $n_{2D} = 1.6 \times 10^{13} \, cm^{-2}$ (Fig. 4C), approaching the quantum limit of 28 ohm·μm and \~3.5 times lower than that of the reported pc-Bi device (12, 20). Short-channel devices further confirmed the ultralow $R_{C}$ . When the channel length ( $L_{CH}$ ) was scaled down to \~50 nm, the devices maintained an on/off ratio of $>10^{8}$ (fig. S27E), and the maximum current density reached 1.31 mA μm $^{-1}$ at $V_{DS} = 1.5 \, V$ (Fig. 4D). Statistical analysis across 60 devices further demonstrated the high reproducibility and superiority of sc-Bi contacts (fig. S28).

A

B

C
D

G

E
F

H

J p-type contacts with 1L-WSe $_{2}$
K

I n-type contacts with 1L-MoS $_{2}$

Fig. 4. Low-resistance n- and p-type contacts to 2D semiconductors. (A) $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{GS}}$ curves of 1L-MoS $2$ field-effect transistors (FETs) with sc-Bi and pc-Bi contacts. (B) $I{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{DS}}$ curves of the sc-Bi device at various $V_{\mathrm{GS}}$ . (C) $R_{\mathrm{C}}$ extracted by using TLM for sc-Bi/1L-MoS $2$ FET. (Inset) SEM image of the TLM device. Scale bar, 500 nm. (D) $I{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{DS}}$ curves of a short-channel sc-Bi/1L-MoS $2$ FET ( $L{\mathrm{CH}} \approx 50$ nm). (Inset) SEM image of the short-channel device. Scale bar, 200 nm. (E) $I_{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{GS}}$ curves of 1L-WSe $2$ FETs with sc-Pd and pc-Pd contacts. (F) $I{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{DS}}$ curves of the device at various $V_{\mathrm{GS}}$ . (G) $R_{\mathrm{C}}$ extracted by using TLM for sc-Pd/1L-WSe $2$ FET. (Inset) SEM image of the TLM device. Scale bar, 500 nm. (H) $I{\mathrm{DS}} - V_{\mathrm{DS}}$ curves of a short-channel sc-Pd/1L-WSe $2$ FET ( $L{\mathrm{CH}} \approx 50$ nm). (Inset) SEM image of the short-channel device. Scale bar, 200 nm. (I and J) Comparison of (I) n-type and (J) p-type $R_{\mathrm{C}}$ across state-of-the-art contact technologies for 1L-MoS $2$ and 1L-WSe $_2$ , plotted as a function of $n{2\mathrm{D}}$ or $p_{2\mathrm{D}}$ . The black solid line indicates the quantum limit of $2R_{\mathrm{C}}$ , according to $\pi h / (4q^2 k_F) \approx 0.036(n_{2\mathrm{D}})^{-0.5}$ kilohms·μm, where $h$ is Planck's constant, $q$ is the unit charge, $k_{\mathrm{F}}$ is the Fermi wave vector, and $n_{2\mathrm{D}}$ and $p_{2\mathrm{D}}$ are 2D sheet carrier densities. (K) Temperature-dependent normalized $I_{\mathrm{ON}}$ of devices with pc-Bi (squares) and sc-Bi (circles) contacts.

For p-type contacts, monolayer WSe $_2$ transistors with sc-Pd contacts also showed an ultrahigh on/off ratio of $>10^{10}$ (Fig. 4E). For the same

device geometry, the current of the sc-Pd device was approximately one order of magnitude higher than that of the pc-Pd device, which could be attributed to the fluctuating metal work function of pc-Pd and strong FLP at the pc-Pd-WSe $2$ interface. The room-temperature $I{\text{DS}}$ - $V_{\text{DS}}$ characteristics showed high linearity, further demonstrating the formation of a high-quality ohmic contact (Fig. 4F). The low-temperature $I_{\text{DS}}$ - $V_{\text{DS}}$ characteristics remained highly linear and were accompanied by clear metal-insulator transition behavior (fig. S29, A and B). The extracted Schottky barrier for the sc-Pd contact was only 16 meV and was nearly negligible (fig. S29C). The $R_{\text{C}}$ value was as low as 145 ohm·μm at a carrier density of $p_{2\text{D}} = 7.5 \times 10^{12} \text{ cm}^{-2}$ (Fig. 4G and fig. S29, D and E). For short-channel WSe $2$ devices with sc-Pd contacts ( $L{\text{CH}} \approx 50 \text{ nm}$ ), the devices also maintained an on/off ratio of >10 $^8$ (fig. S29F), and the maximum current density reached 1.1 mA μm $^{-1}$ at $V_{\text{DS}} = -1.5 \text{ V}$ (Fig. 4H).

We benchmarked the n- and p-type contact resistance values against existing state-of-the-art contact technologies. For n-type contacts to monolayer $MoS_{2}$ , the sc-Bi contact exhibited an $R_{C}$ value among the lowest reported for existing contact technologies (Fig. 4I) (12, 20, 35–41). Although semimetal contacts can generally achieve low $R_{C}$ , our sc-Bi contact still showed the most competitive contact performance. For p-type contacts to monolayer $WSe_{2}$ , the sc-Pd contact also showed highly competitive performance among reported metal-contact and doping strategies (Fig. 4J) (42–47). Last, we found that sc-metal contacts endowed the devices with enhanced thermal stability. The temperature-ramping measurements show that the maximum temperature tolerance of sc-Bi devices reached $\sim705$ K, which is substantially higher than that of pc-Bi devices ( $\sim510$ K) (Fig. 4K and fig. S30, A and B). In addition, thermal durability measurements showed that the devices could operate continuously at 650 K for several hours (fig. S30). This enhanced thermal stability was mainly attributed to the highly ordered, low-defect structure of the sc-metal compared with its polycrystalline counterpart, which suppressed thermally induced rapid electrical failure and thereby broadened the high-temperature operating window.

Conclusions

Growing sc-metal contacts on atomically thin and dangling bond-free 2D semiconductors is highly challenging but critical for the advancement of electronic applications. Our work presented a simple and general step-by-step evaporation technique that enabled the direct growth of sc-metals on monolayer 2D semiconductors. We demonstrated that these sc-metal contacts offer several distinctive advantages, including clean and low-damage interfaces, stable and spatially uniform work functions, and near-ideal Schottky-Mott behavior, as well as additional advantages such as scalable metal dimensions and enhanced thermal stability. These coupled effects enable sc-metal contacts to provide a high-performance contact solution for both n- and p-type 2D semiconductors, marking an important step toward the transition from laboratory demonstration to scalable fabrication and eventual industrialization. We further anticipate that this deposition method could be extended to prepare various 2D metals, semimetals, or semiconductors, potentially driving further scientific exploration and technological innovation. Last, our findings may have important practical implications for guiding the development of next-generation metal deposition technologies.

2. B. Radisavljevic, A. Radenovic, J. Brivio, V. Giacometti, A. Kis, Nat. Nanotechnol. 6, 147–150 (2011).

REFERENCES AND NOTES

1. M. Chhowalla, D. Jena, H. Zhang, Nat. Rev. Mater. 1, 16052 (2016).

2. D. Akinwande et al., Nature 573, 507–518 (2019).

3. S. Das et al., Nat. Electron. 4, 786–799 (2021).

4. J. Baringhaus et al., Nature 506, 349–354 (2014).

5. K. K. H. Smithe, C. D. English, S. V. Suryavanshi, E. Pop, 2D Mater. 4, 011009 (2017).

6. P. C. Shen et al., Nature 593, 211–217 (2021).

7. Y. Liu et al., Nature 557, 696–700 (2018).

8. Y. Zhang et al., Data from: Direct evaporation of single-crystal metal contacts for 2D semiconductors. Dryad (2026); https://doi.org/10.5061/dryad.xwdbrv1tz.

9. Y. Wang et al., Rep. Prog. Phys. 84, 056501 (2021).

10. L. Liu et al., Nat. Electron. 4, 342–347 (2021).

11. K. P. O'Brien et al., Nat. Commun. 14, 6400 (2023).

12. D. Akinwande, C. Biswas, D. Jena, Nat. Electron. 8, 96–98 (2025).

13. C. M. Went et al., Sci. Adv. 5, eaax6061 (2019).

14. Y. Wang et al., Nature 568, 70–74 (2019).

15. A. Allain, J. Kang, K. Banerjee, A. Kis, Nat. Mater. 14, 1195–1205 (2015).

16. Y. Jung et al., Nat. Electron. 2, 187–194 (2019).

17. C. C. Chiang, H. Y. Lan, C. S. Pang, J. Appenzeller, Z. Chen, IEEE Electron Device Lett. 43, 319–322 (2022).

18. L. Kong et al., Nat. Commun. 14, 1014 (2023).

19. K. S. Kim et al., Nat. Nanotechnol. 19, 895–906 (2024).

20. R. Kappera et al., Nat. Mater. 13, 1128–1134 (2014).

21. G. Kwon et al., Nat. Electron. 5, 241–247 (2022).

22. L. Kumari, J.-H. Lin, Y.-R. Ma, J. Phys. D Appl. Phys. 41, 025405 (2008).

23. W. Li et al., Nature 613, 274–279 (2023).

24. L. Ma, Y. Wang, Y. Liu, Chem. Rev. 124, 2583–2616 (2024).

25. L. Gao et al., Science 390, 813–818 (2025).

26. Y. Liu, P. Stradins, S.-H. Wei, Sci. Adv. 2, e1600069 (2016).

27. Y. Wang, M. Chhowalla, Nat. Rev. Phys. 4, 101–112 (2021).

28. Y. Wang et al., Nature 610, 61–66 (2022).

29. Y.-J. Lu et al., Science 337, 450–453 (2012).

30. C. D. English, G. Shine, V. E. Dorgan, K. C. Saraswat, E. Pop, Nano Lett. 16, 3824–3830 (2016).

31. J.-S. Huang et al., Nat. Commun. 1, 150 (2010).

32. J. Jiang et al., Nat. Commun. 16, 10233 (2025).

33. B.-T. Chou et al., Sci. Rep. 6, 19887 (2016).

34. Y. Wang, S. Sarkar, H. Yan, M. Chhowalla, Nat. Electron. 7, 638–645 (2024).

35. Y. Tolstova, S. T. Omelchenko, A. M. Shing, H. A. Atwater, Sci. Rep. 6, 23232 (2016).

36. S. Chen, Y. Zhang, W. P. King, R. Bashir, A. M. van der Zande, Adv. Electron. Mater. 11, 2400843 (2025).

37. F. Cemin et al., Sci. Rep. 7, 1655 (2017).

38. E. Lotfi et al., Eur. Phys. J. D 66, 207 (2012).

39. J. Zhao et al., Nature 639, 354–359 (2025).

40. A. Kumar et al., "Sub-200 $\Omega$ - $\mu$ m alloyed contacts to synthetic monolayer MoS $_{2}$ " in 2021 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM), 11 to 16 December 2021 (2021), pp. 7.3.1–7.3.4; https://doi.org/10.1109/IEDM19574.2021.9720609.

41. H.-Y. Lan et al., Nat. Commun. 16, 4160 (2025).

42. C. D. English, K. K. H. Smithe, R. L. Xu, E. Pop, "Approaching ballistic transport in monolayer MoS $_{2}$ transistors with self-aligned 10 nm top gates" in 2016 IEEE International Electron Devices Meeting (IEDM), 3 to 7 December 2016 (2016), pp. 5.6.1–5.6.4; https://doi.org/10.1109/IEDM.2016.7838355.

43. J. Xie et al., Nano Lett. 24, 5937–5943 (2024).

44. N. Z. El-Sayed, Vacuum 80, 860–863 (2006).

45. L. Kumari et al., Appl. Surf. Sci. 253, 5931–5938 (2007).

46. H. Y. Lan, R. Tripathi, X. Liu, J. Appenzeller, Z. Chen, “Wafer-scale CVD monolayer WSe $_{2}$ p-FETs with record-high 727 $\mu$ A/ $\mu$ m ion and 490 $\mu$ S/ $\mu$ m gmax via hybrid charge transfer and molecular doping” in 2023 International Electron Devices Meeting (IEDM), 9 to 13 December 2023 (2023), pp. 1–4; https://doi.org/10.1109/IEDM45741.2023.10413736.

47. X. Shi et al., "High-performance bilayer WSe $2$ pFET with record $I{\text{ds}} = 425 \mu\text{A}/\mu\text{m}$ and $G_{\text{m}} = 100$ at $\mu\text{S}/\mu\text{m} V_{\text{ds}} = -1$ V by direct growth and fabrication on SiO $_2$ substrate" in 2022 International Electron Devices Meeting (IEDM), 3 to 7 December 2022 (2022), pp. 7.1.1–7.1.4; https://doi.org/10.1109/IEDM45625.2022.10019404.

ACKNOWLEDGMENTS

Funding: National Natural Science Foundation of China grant 62588101 (J.C.); National Key Research and Development Program in the 14th Five Year Plan grant 2021YFA1200700 (J.W.); Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences grant XDB0580000 (X.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62535018 (X.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62334001 (X.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62431025 (J.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62561160113 (J.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62404231 (C.L.); National Natural Science Foundation of China grant 62025405 (J.W.); National Natural Science Foundation of China grant U24A20302 (L.L.); National Natural Science Foundation of China grant 62134001 (L.L.); National Natural Science Foundation of China grant 92577001 (L.L.); National Natural Science Foundation of China grant 62575074 (Y.C.); National Natural Science Foundation of China grant 62405061 (S.W.); National Natural Science Foundation of China grant 62404232 (B.W.); Department of Science and Technology of Yunnan Province grant 202402AC080002 (X.M.); National Research Foundation Professorship Singapore grant NRF-P2025-002 (L.-J.L.); Ministry of Education Singapore grant A-8004854-00-00 (L.-J.L.); Fudan University Nano Information Science Innovation Support Center Project, Ministry of Education of China (J.W.); Fudan Kunpeng & Ascend Center of Cultivation (J.W.); 111 Center grant B25033 (C.L.). Author contributions: Conceptualization: J.W., L.-J.L., L.L., X.W., C.L.; Methodology: Y.Z., C.L., X.W., J.W. Investigation: Y.Z., G.T., H.W., Y.Q., C.L., X.W. Formal analysis: Y.Z., C.L., Y.Q., X.W., J.W., L.-J.L. Funding acquisition: J.C., J.W., X.W., L.-J.L., L.L., C.L., Y.C., S.W., B.W., X.M. Supervision: J.W., X.W., L.-J.L., L.L., C.L. Writing – original draft: Y.Z., C.L., X.W., Y.Q., J.W., L.-J.L. Writing – review & editing: Y.Z., C.L., H.W., G.T., Y.Q., W.N., S.D., B.W., S.W., Y.C., N.Y., T.L., H.S., X.M., Y.L., X.Z., X.W., L.L., J.C., L.-J.L., J.W. Competing interests: X.W., C.L., Y.Z., S.W., H.S., T.L., X.M., J.C., and J.W. are inventors on Chinese invention patent ZL202510983258.6, held by the Shanghai Institute of Technical Physics, Chinese Academy of Sciences, that covers certain methodological aspects relevant to the preparation of sc-metal contacts. The authors declare that they have no other competing interests. Data, code, and materials availability: The data underlying the figures in this study are available at Dryad (48). All other data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the supplementary materials. No new materials were generated for this study. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse

SUPPLEMENTARY MATERIALS

science.org/doi/10.1126/science.aee3132

Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S32; References (49–53)

Submitted 28 November 2025; accepted 25 June 2026

10.1126/science.aee3132

SciLine helps journalists bring scientific evidence to midterm election news coverage

CARMEN NOBEL

Throughout the 2026 midterm election season, AAAS's SciLine program is offering an array of resources to help journalists understand and explain what science can tell voters about the issues at stake in local elections across all 50 states.

Science is on the ballot this year. Political candidates are debating issues such as how to manage the energy and water demands of data centers; whether to abolish property taxes; and what to do about the costs of prescription drugs, fuel, and housing—topics that social scientists have studied in-depth. And the outcome of this year's election may also influence how scientific research will be funded in the future. In a year like this, election stories are also science stories.

SciLine's midterm elections project includes evidence-based guides and programming that serve SciLine's singular mission to enhance the amount and quality of scientific evidence in news stories.

That mission has never been more important. Journalists must make sense of an onslaught of policy changes and major news events amid a wave of newsroom layoffs; a sea of false claims about election fraud, vaccines, and other timely issues; and a deeply politically polarized electorate that is increasingly turning to social media for information.

"There's a bit of a perfect storm of challenges out there for journalists with this election," said SciLine Director Matt

DeRienzo. “Resources are a challenge as always, issues that didn’t used to be controversial are now politicized, and disinformation is moving at the speed and sophistication of AI.”

Using SciLine's election coverage toolkit and access to its free on-deadline services, journalists can ground their reporting and their audiences in science. The journalists who read these guides will learn how to step back from the political back-and-forth of campaigns and learn to turn the findings of scientific research to explain how, when, and whether similar policies have worked historically. They'll get story ideas from scientists who have studied specific aspects of these topics for decades. They'll discover online databases full of local statistics on national issues. And they'll receive expert advice on how to cover polarizing topics with scientific accuracy and nuance.

The election coverage toolkit, freely available on SciLine's website (www.sciline.org) and distributed to thousands of local journalists across the country, comprises two tracks:

One track addresses policy topics that local, state, and national candidates are debating as Election Day approaches, as well as topics appearing in state-level ballot proposals across the country. This track tackles issues such as AI data centers, housing affordability, fuel costs, and pharmaceutical prices. SciLine is also helping local journalists cover the future of federal research funding and oversight, recently producing a comprehensive reporting guide on proposed OMB changes and the impact they could have on individual states and communities.

The other track covers the science underlying the nuts and bolts of elections themselves, focusing on topics that are frequent targets of misinformation and false narratives. These guides help journal-

...SciLine's singular mission [is] to enhance the amount and quality of scientific evidence in news stories.

ists evaluate political claims about election security, exploring, for example, what scientific evidence shows about the prevalence of mail voting fraud (it's very, very rare) and shedding light on revived claims of voting machine fraud in the 2020 election (multiple studies have examined these claims and found no evidence to support them).

In addition to publishing these reporting guides, SciLine will support election news coverage with training on how to cover politics through the lens of scientific evidence, live briefings with scientists on election-related issues, and access to the organization's unique Expert Matching service, which connects journalists, on deadline, with scientists to interview about specific local stories that can be enriched by scien-

tific evidence and expertise.

Importantly, SciLine is also supporting scientists through a fraught time. Its matching service connects them with opportunities to speak about their work and share their knowledge with vetted journalists. SciLine also offers a range of research-backed training programs that help scientists build confidence in speaking about their work with the media and navigate talking about areas of research and science that have become increasingly politicized.

Founded in 2017 and based at AAAS, SciLine is philanthropically funded. Its work is made possible through support from the Quadrivium Foundation, The Eucalyptus Foundation, MAC3 Impact Philanthropies, the Walton Family Foundation, the Simons Foundation, Lyda Hill Philanthropies, Daniel Pinkel, Ersen Arseven, the Leo Model Foundation, The Marc Haas Foundation, and individual donations.

Features include:

■ Assessments of your skills, interests and values.

■ Predictions of which career paths suit you best.

■ Reminders of your strategic goals.

Start planning your future today! myIDP.sciencecareers.org

In partnership with:

TENURE-TRACK FACULTY POSITION Houston Methodist/Rice Center for Neural Systems Restoration

The Center for Neural Systems Restoration is conducting a search for an open-rank faculty member at the Assistant, Associate, or Professor level with joint appointments at Houston Methodist Research Institute, Rice University, and Weill Cornell Medical College. Strong candidates with relevant training and experience in non-invasive or invasive approaches to examine the human brain, including but not limited to electrophysiology, imaging, ultrasound, TMS, and computational approaches, are strongly encouraged to apply. The ideal candidate will have a track record of discovery and application of basic science approaches that can potentially offer insight into developing innovative therapies for brain dysfunction. The successful candidate will be a driving force in advancing our research capabilities, with a commitment to innovative and groundbreaking research in collaboration with other investigators and taking advantage of the innovative research and translational environment at the Texas Medical Center. Candidates must have a PhD, MD/PhD, or MD degree, have completed relevant postdoctoral experience, have a strong publication record, and a history of scientific discovery.

To apply, send a letter of application, CV, and the names of three references to: hmairecruitment@houstonmethodist.org and amchime@houstonmethodist.org

HOUSTON Methodist® LEADING MEDICINE

LOOKING FOR A JOB IN SCIENCE? WE HAVE THE SOLUTION.

Find your next job at ScienceCareers.org

ScienceCareers

FROM THE JOURNAL SCIENCE NAAAS

Caring for myself while caring for others

Breana Griffin

M

My dream of becoming a psychologist was becoming a nightmare. After being diagnosed with two chronic conditions during the second year of my Ph.D., I was caught endlessly cycling from doctor's appointments to research meetings, late-night studying to late-morning crashing, physical therapy to office hours, hospital visits to practicum training. I could no longer meet my expectations of what it meant to be an academic: productive, efficient,

capable. Was this career even possible for me? The question weighed heavily. Even heavier was my reaction: Maybe it wasn't. I had been trained to recognize what I was going through: grief. And yet, I felt lost.

My academic training had gone smoothly until early in my second year of graduate school, when I started to experience fatigue, chronic pain, and occasional fainting. As my peers pulled all-nighters to complete their first papers, I struggled just to make it to class on a full night's sleep. Imposter syndrome flared. Because of pain, I had difficulty spending extended amounts of time at my desk. When I got up to stretch, my heart raced and my head spun. What started as a 15-minute break would sometimes turn into an entire day off. I missed deadlines. Absences accumulated. To save energy for school, I opted out of social and leisure activities that were critical for managing my stress, sending me into a major depressive episode. The more I forced myself to achieve the way I was used to, the worse my symptoms became.

After copious testing, I was eventually diagnosed with postural orthostatic tachycardia syndrome and hypermobile Ehlers-Danlos syndrome. I had to finally face the fact that I would never be able to push my mind and body too hard without pushing myself over the edge. I registered with my university's disability resource center, but hesitated to use its support systems or explore ways to make my work more manageable. Instead, I muddled through another year on my own, alternating between feeling uncomfortably different from most of my colleagues and trying to practice self-compassion.

Then, in the fourth year of my program, I began a practicum experience—as a therapist at the same disability resource center. I noticed that nearly all of my clients faced the same internal struggle I did, wondering whether they were worthy of the accommodations they sought. I found myself echoing a phrase: "Just because your cup is different doesn't mean you can't pour from it. But no one can pour from an empty cup." I realized what a hypocrite I was. I finally acknowledged I deserved the support to refill my own cup, too.

I learned about what assistance was available to me: practical and financial tools I hadn't even considered, such as funding to support basic needs and medical supply costs, and connection to people with experiences very similar to mine. I began to see a therapist to manage the stress of my studies and my conditions, and I stopped letting self-care become secondary to school. I consulted with the faculty in my program to make my workspace more functional and accessible, for example by using tall stools when I teach and creating open spaces in my work areas for my mobility aids. I workshopped my hours with my advisers to make sure I was working when I felt better and resting when I felt worse.

It wasn't all smooth sailing. When the elevator to my training clinic broke down for multiple months, the first suggestion from my faculty was not to find an alternative way for me to do my work, but to find alternative students to do the work for me. But, through persistent conversation and collaboration with the faculty, I advocated for the accommodation to work remotely and demonstrated to myself and my mentors that I could still do quality work, even if it looked a little different from everyone else's.

Through this journey, I discovered I'm not alone, and that asking for help is a sign of insight and confidence in myself that is invaluable to the work I do. In all I lost to my illnesses, I gained in my voice and agency to decide not only that, yes, I will be a psychologist, but also the kind of academic I want to be: compassionate, determined, and balanced in my science, my service, and myself.

Breana Griffin is a Ph.D. student at the University of Illinois Urbana-Champaign.

Let Science Careers help advance your career.

■ Register for a free online account on ScienceCareers.org.

■ Search hundreds of job postings.

■ Sign up to receive job alerts that match your criteria.

■ Upload your resume into our database to connect with employers.

■ Watch one of our many webinars on different career topics such as job searching, networking, and more.

■ Download our career booklets, including Career Basics, Careers Beyond the Bench, and Developing Your Skills.

■ Complete a personalized career plan at "my IDP."

- Read relevant career advice articles from our library of thousands.

Visit ScienceCareers.org today — all resources are free

The Chen Institute & Science Prize for AI Accelerated Research celebrates outstanding early-career researchers who are advancing interdisciplinary breakthroughs at the intersection of artificial intelligence and natural sciences. By recognizing bold ideas and elevating innovative work across diverse scientific domains, the Prize highlights the next generation of thinkers driving discovery in the AI era. Young scientists from around the world are invited to submit a 1,000-word essay describing their AI-driven projects.

An independent panel of judges will select a Grand Prize winner, who will receive \$30,000, have their essay published in Science, and be awarded a complimentary five-year subscription to the journal. Two finalists will each receive \$10,000, along with the same five-year subscription and publication of their essays in Science Online.

Apply Today

Deadline: December 13